專(zhuān)利名稱(chēng)：牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫法檢測(cè)技術(shù)，具體是一種牛奶過(guò)敏酶聯(lián)免疫法檢測(cè)模式，尤其是運(yùn)用雙抗原夾心法的原理，將別牛奶過(guò)敏原包被于反應(yīng)板和標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，對(duì)牛奶過(guò)敏患者血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
食物過(guò)敏是當(dāng)今重大的衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題，對(duì)人們的身體健康、生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響，對(duì)食物過(guò)敏的致病機(jī)理、檢測(cè)、防治的研究日益受到重視。牛奶過(guò)敏是食物過(guò)敏中的主要類(lèi)型之一，在嬰幼兒中高發(fā)，嚴(yán)重威脅患兒的健康和生長(zhǎng)發(fā)育。在牛奶中含有一種叫β-乳球蛋白質(zhì)的物質(zhì)是強(qiáng)過(guò)敏原，某些過(guò)敏體質(zhì)的人，飲用牛奶后就會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏表現(xiàn)。及早檢測(cè)和確診食物過(guò)敏，是該疾病防控的關(guān)鍵。食物過(guò)敏的致病機(jī)理主要為I 型超敏反應(yīng)，機(jī)體對(duì)某種食物過(guò)敏時(shí)，會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體(主要為IgE型)，能特異性結(jié)合食物中導(dǎo)致過(guò)敏的成份——過(guò)敏原。目前，臨床上常采用檢測(cè)食物過(guò)敏特異性抗體來(lái)確定患者食物過(guò)敏的類(lèi)型，而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)是最為常用的體外檢測(cè)方法，該方法中用于標(biāo)記的酶通常是堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶，國(guó)內(nèi)應(yīng)用以后者居多。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)根據(jù)原理分為雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法等類(lèi)型。目前，國(guó)內(nèi)外食物過(guò)敏ELISA檢測(cè)方法普遍采用間接法，即將過(guò)敏原成份包被于固相載體，用其識(shí)別和捕獲患者血清中的特異性抗體，再通過(guò)特異性抗體進(jìn)一步結(jié)合酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行顯色反應(yīng)來(lái)判斷結(jié)果，從而確定患者是否對(duì)該成份過(guò)敏。首先，此類(lèi)間接法食物過(guò)敏檢測(cè)模式，只能在一定程度上保證結(jié)果的特異性，由于使用的酶標(biāo)抗體能識(shí)別食物過(guò)敏特異性抗體所屬的一類(lèi)抗體，比如IgE型抗體，而血清中的IgE型抗體種類(lèi)很多，與食物過(guò)敏有關(guān)的只是其中一部分，一旦無(wú)關(guān)的IgE抗體由于種種原因非特異地結(jié)合在固相載體上，就會(huì)同特異性抗體一道被抗IgE的酶標(biāo)抗體所識(shí)別和結(jié)合，造成顯色結(jié)果偏高，使檢測(cè)本底偏高并產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。另一方面，由于間接法檢測(cè)模式需要用到酶標(biāo)抗體，其制備過(guò)程需要飼養(yǎng)、免疫動(dòng)物、并采血收集抗體，這一過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，消耗大量的試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，提高了成本和工作量。雙抗原夾心法是ELISA的檢測(cè)模式之一，其原理是通過(guò)包被抗原和酶標(biāo)記的抗原構(gòu)成雙抗原夾心結(jié)構(gòu)，識(shí)別和捕獲待測(cè)標(biāo)本中能結(jié)合該抗原的特異性抗體。與間接法相比， 雙抗原夾心法不需要酶標(biāo)記的抗體，而是換成了酶標(biāo)記的抗原，因而省去了抗體制備的過(guò)程。同時(shí)，由于酶標(biāo)抗原只識(shí)別特異性抗體而不與該抗體同一類(lèi)型的其他抗體結(jié)合，從而提高了檢測(cè)的特異性。但是，目前雙抗原夾心法只見(jiàn)于人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)等生物活性分子的檢測(cè)中，還未見(jiàn)有將其用于食物過(guò)敏檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了克服食物過(guò)敏檢測(cè)間接法的不足，而提供一種雙抗原夾心法檢測(cè)牛奶過(guò)敏的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明旨在建立一種雙抗原夾心法ELISA檢測(cè)牛奶過(guò)敏的模式，通過(guò)購(gòu)買(mǎi)或自行提取獲得高純度的牛奶過(guò)敏原，用于包被微孔反應(yīng)板和標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，制成包被抗原和酶標(biāo)抗原，檢測(cè)時(shí)用這兩種抗原識(shí)別和捕獲患者血清中的牛奶過(guò)敏的特異性抗體，形成“微孔板-包被抗原-特異性抗體-酶標(biāo)抗原”的雙抗原“夾心”，再通過(guò)酶催化底物的顯色反應(yīng)來(lái)判斷結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中過(guò)敏特異性抗體的檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程中不需要酶標(biāo)抗體而使用酶標(biāo)記的過(guò)敏原(抗原)，且用于標(biāo)記酶的抗原和用于包被的抗原相同，大大簡(jiǎn)化了試劑的制備過(guò)程。本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括顯色液A，顯色液B，終止液，以及牛奶過(guò)敏的陰性和陽(yáng)性質(zhì)控血清；其特點(diǎn)是還包括
a.包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板是用0.2mol/L的碳酸鹽緩沖液，將β-乳球蛋稀釋為50ug/ml，按150ul/孔的量加入96空聚苯乙烯微孔板中包被，室溫包被過(guò)夜；加入封閉液ISOul/孔4°C過(guò)夜，封閉微孔板中的未結(jié)合位點(diǎn)，拍干后通風(fēng)晾干備用；
b.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記乳球蛋白抗原采用改良的過(guò)碘酸鈉法，具體為將乳球蛋白0.3 mol/L碳酸鹽緩沖液中于4°C透析過(guò)夜，取出所得抗原加入已活化的β -乳球蛋白標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，反應(yīng)1 h后用NaBH4溶液終止，將所得酶結(jié)合物粗品于平衡液4°C 透析過(guò)夜，取出已透析酶結(jié)合物，上樣于已平衡好的kphadex G-200凝膠柱，用平衡液洗脫，收集，用0.45 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，分裝，4 °C保存?zhèn)溆?。所述牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的制備方法，其封閉液是含洲牛血清白蛋白，5%蔗糖的磷酸鹽緩沖液。所述牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的制備方法，其平衡液是0. 01 mol/L磷酸鹽緩沖液。所述牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的制備方法，將牛奶過(guò)敏原進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。一種如權(quán)利要求1所述方法制備的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒，包括顯色液A、顯色液 B，終止液，以及牛奶過(guò)敏的陰性和陽(yáng)性質(zhì)控血清；而該試劑盒還包括包被β -乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的β -乳球蛋白抗原。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，采用雙抗原夾心法檢測(cè)牛奶過(guò)敏血清中的特異性抗體，與間接法相比，由于使用了酶標(biāo)抗原而非酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗原不再識(shí)別和結(jié)合與特異性抗體同屬一型的其他無(wú)關(guān)抗體，從而使檢測(cè)的特異度進(jìn)一步提高有利于降低假陽(yáng)性結(jié)果和檢測(cè)本底；另一方面，由于不需要酶標(biāo)抗體，省去了飼養(yǎng)、免疫、采血、處死動(dòng)物等制備抗體的過(guò)程， 從而降低了成本和工作量；由于檢測(cè)時(shí)患者血清不需要預(yù)先稀釋?zhuān)?jiǎn)化了檢測(cè)步驟。


圖1為雙抗原夾心法牛奶過(guò)敏ELISA體外診斷方法的原理示意圖； 圖2為雙抗原夾心法檢測(cè)牛奶過(guò)敏的操作方法示意圖。其中1.聚苯乙烯微孔板
2.固相于微孔板的牛奶過(guò)敏原(包被抗原)
3.待檢者血清中的牛奶過(guò)敏特異性抗體4.標(biāo)記了辣根過(guò)氧化物酶的牛奶過(guò)敏原(酶標(biāo)抗原)
5.辣根過(guò)氧化物酶
6.顯色底物
I過(guò)敏原包被
II加入待測(cè)血清
III加入酶標(biāo)記過(guò)敏原
IV加入底物顯色。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。1.高純度牛奶過(guò)敏原的獲得
牛奶中的乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白等成分是引起過(guò)敏反應(yīng)的主要過(guò)敏原， 目前這些組分都有市售的高純度的標(biāo)注品，可進(jìn)行訂購(gòu)獲得，也可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的純化方法通過(guò)自行提取的方法獲得，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)摸索出成熟的提取乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白等高純度單一過(guò)敏原的純化工藝?，F(xiàn)以乳球蛋白為例對(duì)提取工藝進(jìn)行介紹。1.1材料和試劑 1. 1. 1所需材料
新鮮未加工牛奶；低溫高速離心機(jī)；水浴鍋；真空泵；葡聚糖凝膠(S印hadex-G200， kphadex-DEAE-A50，美國(guó)DPC生物公司)；Mini p-4垂直凝膠電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司);電泳儀及轉(zhuǎn)膜電泳槽(美國(guó)BIO-RAD公司);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；蛋白純化設(shè)備(紫外檢測(cè)儀、蛋白收集器、恒流蠕動(dòng)泵上海滬西分析儀器廠)；蛋白超濾裝置(Stirred Ultrafiltration Cells 8010 Millipore)酶標(biāo)分析儀(DNM - 9602，北京普朗新技術(shù)有限公司) 1. 1. 2相關(guān)試劑配方 1. 1. 2. 1 磷酸緩沖液(PB 0. 01mol/L) PB 0.lmol/L
權(quán)利要求
1.一種牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括顯色液A，顯色液B，終止液，以及牛奶過(guò)敏的陰性和陽(yáng)性質(zhì)控血清；其特征在于a.包被β-乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板是用0.2mol/L的碳酸鹽緩沖液，將β-乳球蛋稀釋為50ug/ml，按150ul/孔的量加入96空聚苯乙烯微孔板中包被，室溫包被過(guò)夜；加入封閉液ISOul/孔4°C過(guò)夜，封閉微孔板中的未結(jié)合位點(diǎn)，拍干后通風(fēng)晾干備用；b.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的β-乳球蛋白抗原，是將β-乳球蛋白0.3mol/L碳酸鹽緩沖液中于4°C透析過(guò)夜，取出所得抗原加入已活化的β -乳球蛋白標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，反應(yīng)1 h后用NaBH4溶液終止，將所得酶結(jié)合物粗品于平衡液4°C透析過(guò)夜，取出已透析酶結(jié)合物，上樣于已平衡好的kphadex G-200凝膠柱，用平衡液洗脫，收集，用0.45 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，分裝，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于封閉液是含 2%牛血清白蛋白，5%蔗糖的磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于平衡液是 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液。
4.一種如權(quán)利要求1所述的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒，包括顯色液A、顯色液B，終止液， 牛奶過(guò)敏的陰性和陽(yáng)性質(zhì)控血清，其特征在于該試劑盒還包括包被乳球蛋白的聚苯乙烯微孔板，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的β -乳球蛋白抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒及其制備方法，屬于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明包括顯色液A，顯色液B，終止液，以及牛奶過(guò)敏的陰性和陽(yáng)性質(zhì)控血清；另將牛奶過(guò)敏原分別包被微孔板制成包被抗原和標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶制成酶標(biāo)抗原。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明改變傳統(tǒng)的間接法ELISA檢測(cè)模式，采用雙抗原夾心法ELISA構(gòu)建牛奶過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒。用于識(shí)別和捕獲患者血清中的牛乳過(guò)敏特異性抗體，再通過(guò)催化底物顯色來(lái)判斷結(jié)果?？朔藗鹘y(tǒng)的間接法檢測(cè)模式諸多不足，能降低檢測(cè)本底、減少假陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)操作時(shí)血清不需要預(yù)先稀釋?zhuān)虿恍枋褂脵z測(cè)抗體，簡(jiǎn)化了制備方法。提高了檢測(cè)特異度，同時(shí)節(jié)省了試劑和操作成本。
文檔編號(hào)G01N33/559GK102331497SQ201110160488
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者任杰, 常艷敏, 李會(huì)強(qiáng), 李嬋, 許順連, 陳寅 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)