專利名稱：用放射性同位素標(biāo)記物標(biāo)記的抗cdh3抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
優(yōu)先權(quán)本申請要求2008年6月30日提交的美國臨時申請流水號61/076，982的權(quán)益，并 通過提述將其全部內(nèi)容并入本文。本發(fā)明涉及使用綴合有放射性同位素標(biāo)記物的抗CDH3抗體來破壞癌細胞的方 法，或涉及用于此目的的組合物。
背景技術(shù)：
鈣粘蛋白是細胞-細胞粘附糖蛋白，它們形成鈣依賴性細胞間連接點，而且在系 統(tǒng)發(fā)生中及在成年組織和器官的發(fā)育和維持中發(fā)揮至關(guān)重要的作用(Conacci-Sorrell M 等，J Clin Invest, 109 :987-91,2002).在胚胎發(fā)生期間，特定鈣粘蛋白的細胞表達導(dǎo)致 嗜同性相互作用，這些相互作用在細胞分選和組織分層的過程中是至關(guān)重要的(NoseA等， Cell,54 :993-1001,1988 ；Steinberg MS 等，Proc Natl Acad Sci USA,91 :206_9，1994 及 Takeichi M, Science, 251 1451-5，1991)。這些細胞附著的改變在細胞失穩(wěn)中發(fā)揮重要作 用，而且可改變受到細致調(diào)節(jié)的上皮結(jié)構(gòu)分化過程(Daniel CW等，Dev Biol, 169 :511-9, 1995 及 Nose A 和 Takeichi M, J Cell Biol, 103 :2649-58,1986) 因為這個原因，已經(jīng)有 人暗示鈣粘蛋白的功能喪失或過表達以及編碼這些蛋白的基因的背后的控制分子機制與 癌發(fā)生有關(guān)(Behrens, J. Cancer MetastasisRev, 18 15—30，1999)。鈣粘蛋白家族細分成多個亞家族，包括經(jīng)典的E-、P_、和N-鈣粘蛋白，每個亞家族 表現(xiàn)出獨特的組織分布(Takeichi M, Development, 102 =639-55,1988) 雖然E-鈣粘蛋 白在所有上皮組織中表達，但是P-鈣粘蛋白(⑶H3)的表達僅僅局限于分層的上皮的基底 層或下層，包括前列腺和皮膚，而且還局限于乳腺肌上皮細胞(Takeichi M，J Cell Biol, 103 :2649-58,1986 及 ShimoyamaY 等，Cancer Res, 49 :2128-33,1989)?，F(xiàn)在有大量的證據(jù)也揭示異常P-鈣粘蛋白表達與細胞增殖及與結(jié)腸、乳腺、 肺、甲狀腺、和宮頸的腫瘤有關(guān)(Gamallo, Modern Pathology, 14 =650-654, 2001 ；及 Mefansson 等，J. Clin. Oncol. ,22(7) 1242-1252，2004)。人 P-鈣粘蛋白據(jù)報告是被針對 外陰表皮樣癌生成的NCC-CAD-299單克隆抗體識別的抗原(Shimoyama等，Cancer Res., 49 :2128-2133,1989)。預(yù)期對P-鈣粘蛋白介導(dǎo)的粘附和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的調(diào)控會導(dǎo)致體 內(nèi)腫瘤細胞增殖和存活降低。因而，鑒于P-鈣粘蛋白似乎在細胞增殖和實體瘤進展中擁有 關(guān)鍵作用，期望生成針對P-鈣粘蛋白的抗體，它能給具有多種癌癥的患者提供治療效益。針對癌癥特異性分子的單克隆抗體已經(jīng)證明在癌癥治療中是有用的(Harris Μ, Lancet Oncol, 5, 292-302, 2004) 0除了用于乳腺癌、惡性淋巴瘤和結(jié)腸癌的人源化或嵌合 抗體諸如曲妥單抗(Baselga, J. Oncology，61，增刊2，14-21，2004)、利妥昔單抗(Maloney DG 等，Blood，90 :2188-2195,1997)和貝伐單抗(Ferrara N 等，Nat Rev Drug Discov,3 391-400，2004)等臨床應(yīng)用的成功例子之外，有若干針對其它分子靶標(biāo)的單克隆抗體正處 于開發(fā)中，而且人們正在評估它們的抗腫瘤活性。預(yù)期這些單克隆抗體會給具有沒有有效療法的腫瘤的患者帶來希望。關(guān)于這些單克隆抗體的其它重要問題之一，是實現(xiàn)針對癌細 胞的選擇性治療效果，而避免由于它們對表達靶分子的細胞的特異性反應(yīng)而造成的嚴重毒 性(Crist WM 等，J Clin Oncol, 19 :3091-3102,2001 ；Wunder JS 等，J Bone Joint Surg Am,80 :1020-1033,1998 ；Ferguson WS 禾口 Goorin AM, Cancer Invest, 19 :292-315,2001 ； W02002/097395 ；W02004/110345 ；W02006/114704 ；W02007/102525)。發(fā)明概述本發(fā)明提供針對⑶H3的單克隆抗體，它們特異性識別具有SEQ ID NO :3所示氨基 酸序列的多肽。除了利用放射性核素進行的常規(guī)方法之外，借助利用近紅外熒光的熒光體 內(nèi)成像系統(tǒng)證明了這種抗體的體內(nèi)腫瘤結(jié)合活性。本發(fā)明提供了攜帶數(shù)種癌細胞系的異種 移植物小鼠中顯著抗腫瘤效果的證據(jù)，其中用9°Y標(biāo)記的抗CDH3單克隆抗體(克隆#6)及 其嵌合物(ch-#6)施用一次或兩次來處理所述小鼠。具體而言，本發(fā)明涉及下面各項[1] 一種抗體或其片段，其特異性識別具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的多肽。 在典型的實施方案中，本發(fā)明的抗體或片段包含H(重)鏈V(可變)區(qū)和L(輕)鏈V區(qū)， 所述H鏈V區(qū)包含具有SEQ ID NO :13、14和15所示氨基酸序列的互補決定區(qū)(OTR)或與 其功能上等同(即結(jié)合相同抗原決定簇)的⑶R，所述L鏈V區(qū)包含具有SEQ ID NO 16,17 和18所示氨基酸序列的CDR或與其功能上等同(即結(jié)合相同抗原決定簇)的CDR，且其能 夠特異性結(jié)合CDH3蛋白或其部分肽。在更典型的實施方案中，所述抗體選自下組小鼠抗 體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、抗體片段、和單鏈抗體。[2]本發(fā)明的抗體或其片段可以用放射性同位素標(biāo)記物標(biāo)記。在典型的實施方案 中，所述放射性同位素標(biāo)記物選自下組9°釔(90Y)嚴碘(125I)和111銦(111In)0[3] 一種用于治療或預(yù)防癌癥的組合物，其包含藥學(xué)有效量的本發(fā)明的抗體或其 片段。在典型的實施方案中，所述癌癥是胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌。[4] 一種用于在受試者中治療或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括給所述受試者施用 藥學(xué)有效量的本發(fā)明的抗體或其片段。在典型的實施方案中，所述癌癥是胰腺、肺、結(jié)腸、前 列腺、乳腺、胃或肝癌。[5] 一種用于受試者中與CDH3有關(guān)的疾病或發(fā)生該疾病的傾向的診斷或預(yù)后的 方法，其包括(a)使來自所述受試者的樣品或標(biāo)本接觸本發(fā)明的抗體或片段；(b)檢測所述樣品或標(biāo)本中CDH3蛋白的有無；并(c)基于與對照相比CDH3蛋白的相對豐度來確定所述受試者是否患有或有風(fēng)險 發(fā)生所述疾病。在典型的實施方案中，所述癌癥是胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌細胞。[6] 一種用于與CDH3有關(guān)的疾病的診斷或預(yù)后的試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體或 片段。在典型的實施方案中，所述癌癥是胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌。附圖簡述

圖1顯示細胞系中⑶H3表達的結(jié)果。上部小圖顯示使用每一種抗體進行的流式細 胞術(shù)分析。KLM-I和H358是CDH3陽性癌細胞系。MIAPaCa_2是陰性對照細胞系?？筫rbB2 用作陽性對照。所有所公開的抗CDH3抗體克隆都能特異性識別表達CDH3的細胞。下部小
4圖是描繪癌細胞系中CDH3基因的半定量RT-PCR分析的結(jié)果的照片。[圖2A-B]圖2A顯示攜帶腫瘤的小鼠在注射每一種Alexa647標(biāo)記的抗體克隆后 的體內(nèi)熒光成像。熒光標(biāo)記的抗體克隆是靜脈內(nèi)施用的。所有熒光圖像是在注射后3、24、 48和72小時時獲取的。來自Alexa 647的熒光信號是假著色的，其表示紅色是高強度。圖 2B分別顯示EBCl人肺癌異種移植物小鼠中m^標(biāo)記的抗CDH3抗體的生物分布(B 克隆 1)。[圖2C-D]圖2C-D顯示EBCl人肺癌異種移植物小鼠中111M標(biāo)記的抗⑶H3抗體 各自的生物分布(C 克隆3，D 克隆4)。[圖2E-F]圖2E-F顯示EBCl人肺癌異種移植物小鼠中111M標(biāo)記的抗⑶H3抗體 各自的生物分布(E:克隆5，F(xiàn):克隆6)。[圖3A-B]圖3A-B顯示111M標(biāo)記的克隆#6抗體或?qū)φ湛贵w的生物分布。注射后 48小時分離移植的腫瘤(A =EBC-I, B :SW948)、肝、腎、腸、胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨，并測 量放射性。黑框顯示抗⑶H3抗體向每一種組織的累積。[圖3C-D]圖3C-D顯示111M標(biāo)記的克隆#6抗體或?qū)φ湛贵w的生物分布。注射后 48小時分離移植的腫瘤(C =KLM-I, D :H1373)、肝、腎、腸、胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨，并測 量放射性。黑框顯示抗⑶H3抗體向每一種組織的累積。[圖3E]圖3E顯示111M標(biāo)記的抗⑶H3嵌合抗體或小鼠抗體#6，或者作為對照的 正常人IgG或小鼠IgGl的生物分布。注射后48小時分離移植的腫瘤(H137;3)、肝、腎、腸、 胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨，并測量放射性。黑框顯示抗⑶H3嵌合抗體向每一種組織的累 積。白框顯示抗⑶H3小鼠抗體向每一種組織的累積。[圖4A-B]圖4顯示9°Y標(biāo)記的抗⑶Η3抗體(克隆#6)對腫瘤生長的影響。圖4Α 顯示了單次施用9°Υ標(biāo)記的抗⑶Η3抗體(克隆#6)遏制裸鼠中移植的EBC-I細胞的生長。 圖4Β顯示注射后腫瘤組織的HE染色。如右部小圖所示，腫瘤組織替代被曙紅(紅色)染 色的纖維組織。[圖5Α-Β]圖5Α顯示單次施用9°Υ標(biāo)記的抗⑶Η3抗體(克隆#6)遏制裸鼠中移 植的SW948細胞的生長。圖5Β顯示腫瘤外觀的照片。注射9°Υ標(biāo)記的抗⑶Η3抗體后，腫瘤 明顯縮小。[圖6]圖6顯示單次施用9°Υ標(biāo)記的抗⑶Η3抗體(克隆#6)遏制裸鼠中移植的 KLM-I細胞的生長。[圖7]圖7顯示單次和兩次施用9°Υ標(biāo)記的抗⑶Η3抗體(克隆#6)都遏制裸鼠 中移植的SW948細胞的生長。[圖8]圖8顯示了單次施用9°Υ標(biāo)記的抗⑶Η3嵌合抗體(ch_#6)遏制裸鼠中移 植的 KLM-I 細胞的生長。CHX 和 SCN 分別代表 p-SCN-Bn-CHX-A“ -DTPA 和 p-SCN-Bn-DTPA。 將抗體與這些雙功能螯合劑綴合以便用9°Y放射性標(biāo)記。實施方案詳述本發(fā)明涉及抗⑶Η3抗體和組合物及它們在治療或預(yù)防癌癥中的用途。在一個典 型的實施方案中，所述抗體是用放射性同位素標(biāo)記物標(biāo)記的。已經(jīng)報告了用于對自胰腺癌患者收集的胰腺癌細胞和正常細胞進行基因表達分 析的cDNA微陣列(Nakamura等，Oncogene, 23 =2385-400,2004) 隨后鑒定了在胰腺癌細胞中表達特異性增強的多種基因。在胰腺癌細胞中表達改變的這些基因中，選擇一種基 因，即編碼在主要器官中表達水平低的細胞質(zhì)膜蛋白的胎盤鈣粘蛋白(P-鈣粘蛋白；CDH3) (Genbank登錄號No. ΝΜ_001793 ；SEQ ID NO :1、2)基因作為胰腺癌療法的靶基因。通過選 擇在主要器官中表達水平低的基因，避免副作用的危險。另外，在其它癌細胞系中確認了類 似的⑶H3過表達，諸如肺、結(jié)腸直腸、前列腺、乳腺、胃和肝癌細胞系(W0/2007/102525)。如本文中使用的，術(shù)語“抗體”意圖包括與指定蛋白質(zhì)或其肽特異性起反應(yīng)的免疫 球蛋白及其片段?？贵w可以包括人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗 體、融合至其它蛋白質(zhì)或放射性標(biāo)記物的抗體、和抗體片段。另外，本文中的抗體以最廣義 使用，而且明確覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、自至少兩種完整抗體形成的多特異性 抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性?！翱贵w”指所有 類(例如 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM)?！翱贵w片段”指完整抗體的一部分，一般包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。因 而，在本發(fā)明中，抗體片段可以包含完整抗體的抗原結(jié)合部分。如本文中使用的，術(shù)語抗體 的“抗原結(jié)合部分”(或僅僅簡單地說“抗體部分”或“抗體片段”)指抗體保留特異性結(jié)合 抗原(例如CDH3)的能力的一種或多種免疫學(xué)活性片段。已經(jīng)顯示抗體的抗原結(jié)合功能可 以由全長抗體的片段來實施?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2、和Fv片段；線 性抗體；和單鏈抗體分子。不管結(jié)構(gòu)如何，抗體片段結(jié)合被完整抗體識別的同一抗原。術(shù)語 “抗體片段”還包括結(jié)合特定抗原的合成的或遺傳工程改造的多肽，諸如由輕鏈可變區(qū)組成 的多肽、由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段、其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽接頭相連接 的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白”)、和由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單位。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，包含基本上與本發(fā)明抗體的序列對應(yīng)的可變區(qū)(包括互 補決定區(qū))的抗體可以相對于所指序列有所變異且仍特異性識別相同抗原決定簇。這種相 對于序列的變異可以就序列內(nèi)相同氨基酸的百分比而言來陳述。在一些實施方案中，這種 百分比是約90%至約100%，例如95，96，97，98，99，或100%。在兩個或更多個多肽序列的語境中，術(shù)語“相同”或百分比“同一性”是指兩個或更 多個序列或子序列相同或具有規(guī)定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即當(dāng)它們進行比 較和比對，以實現(xiàn)在比較窗口或指定區(qū)域上的最大對應(yīng)度時，規(guī)定區(qū)域上90 %，91 %，92 %， 93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，或更高的同一性)，如使用 BLAST 或 BLAST 2. 0 序 列比較算法及缺省參數(shù)(如下文描述的)，或通過手工比對和目測檢查(參見例如ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/處的NCBI網(wǎng)站等等)而測量的。然后說這樣的序列“基本上相同”。 這種定義也指，或者也適用于測試序列的互補物。該定義還包括具有刪除和/或添加的序 列，以及具有替代的序列。如下所述，優(yōu)選的算法可以考慮缺口等等。優(yōu)選的是，在長度為 至少約25個氨基酸的區(qū)域上存在同一性，或更優(yōu)選的是，在長度為50-100個氨基酸的區(qū)域 上存在同一性。為了序列比較，通常由一個序列充當(dāng)參照序列，將測試序列與之比較。在使用序列 比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機，在必要時指派子序列坐標(biāo)，并指派序列算法程 序參數(shù)。優(yōu)選地，可使用默認程序參數(shù)，或者可指派其他參數(shù)。然后由序列比較算法基于程 序參數(shù)來計算測試序列相對于參照序列的百分比序列同一性。
如本文中使用的，“比較窗口”包括援引具有選自下組的任一個數(shù)的連續(xù)位置的 區(qū)段20個至600個，通常是約50至約200個，更通常的是約100個至約150個，其中可 以將某個序列與具有相同個數(shù)的連續(xù)位置的參照序列進行最優(yōu)比對，然后比較這兩個序 列。為了比較而比對序列的方法是本領(lǐng)域公知的。用于比較的最優(yōu)序列比對可以通過例 如 Smith & Waterman，Adv. Appl. Math. 2 :482(1981)的局部同源性算法、通過 Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性比對算法、通過 Pearson & Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85 =2444(1988)的相似性搜索法、通過這些算法的計算機化實現(xiàn) (Wisconsin 遺傳學(xué)軟件包(Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI) 中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)、或通過手工比對和目測檢查(參見例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等編，1987-2005, Wiley Interscience)來進 行。適合于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一個優(yōu)選例子是BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別記載于 Altschul 等，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)及 Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)。BLAST 和 BLAST 2. 0 與本文中描述的參數(shù) 一起使用來確定本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的百分比序列同一性。用于實施BLAST分析的軟件是 公眾經(jīng)由(美國)國家生物技術(shù)信息中心可得的?？贵w的牛成本發(fā)明使用針對⑶H3的抗體。這些抗體將通過已知方法來提供。描述了用于生成依照本發(fā)明使用的抗體的例示技術(shù)。( )多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原(例如 SEQ ID NO 3)和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲?；腔?酰亞胺酯(經(jīng)半胱氨酸殘基的偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(經(jīng)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀 酸酐、SOCl2、或R1N = C = NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關(guān)抗原與在待免疫的物種中 有免疫原性的蛋白質(zhì)，例如匙孔i威血藍蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰 蛋白酶抑制劑，加以偶聯(lián)，可能是有用的。用抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進行免疫動物，方法是通過將例如IOOyg或 5 μ g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，并將該溶 液皮內(nèi)注射于多個部位。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用含1/5-1/10初始量的肽 或偶聯(lián)物的弗氏完全佐劑對動物進行強化免疫。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的 抗體滴度。對動物進行強化直到滴度達到穩(wěn)定的高水平。優(yōu)選地，用抗原相同但偶聯(lián)于不 同蛋白質(zhì)和/或經(jīng)由不同交聯(lián)劑的偶聯(lián)物對動物進行強化免疫。偶聯(lián)物還可在重組細胞培 養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。此外，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體單克隆抗體是從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，基本上同質(zhì)即構(gòu)成群體的各個抗 體是相同的，除了可能以極小量存在的天然突變外。因此，修飾語“單克隆”表示抗體的這 樣的特征，即其不是分立(discrete)抗體的混合物。例如，單克隆抗體可通過最初由Kohler等，Nature 256 :495(1975)描述的雜交瘤 方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利4，816，567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物，諸如倉鼠，以引發(fā)出 生成或能夠生成會特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)抗體的淋巴細胞?；蛘撸梢栽隗w外免 疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形 f^^^'^MM (Goding，《MonoclonalAntibodies :Principles and Practice》，59—103， Academic Press,1986)。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑 制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺 乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將含有 次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細胞生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩(wěn)定的高水平生 成抗體、并對諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。在這些細胞中，優(yōu)選的骨髓 瘤細胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如可從Institute CellDistribution Center (San Diege，California, USA)獲得的M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生鼠源骨髓瘤系，及 nj /Λ American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA) 1 # ^ SP-2 X63-Ag8-653細胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也 已有描述(Kozbor, J. Immunol. 133 :3001 (1984) ；Brodeur 等人，《Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications》，51-63, Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)。對于其中生長著雜交瘤細胞的培養(yǎng)基，可以測定培養(yǎng)基中針對抗原的單克隆抗體 的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶 聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson等，Anal. Biochem. 107 :220 (1980) 的30 katchard分析來測定。在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，所 述克隆可通過有限稀釋流程進行亞克隆，并通過標(biāo)準方法進行培養(yǎng)(Goding，((Monoclonal Antibodies Principles and Practice》，59-103, AcademicPress, 1986)。適于這一目的的 培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPML-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進 行體內(nèi)培養(yǎng)。可通過常規(guī)免疫球蛋白純化流程，諸如例如蛋白A-kpharose、羥磷灰石層析、凝 膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規(guī)流程分離并測序(例如使用能夠特異性結(jié)合 編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是所述DNA的優(yōu)選來源。一 旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，諸如原本不產(chǎn)生 免疫球蛋白蛋白質(zhì)的大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞， 以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的 綜述性論文包括 Skerra 等，Curr. Opinion in Immunol. 5 :256-262(1993)和 Pluckthun， Immunol. Revs. 130 :151-188(1992)。另一種生成針對CDH3反應(yīng)性的特異性抗體或抗體片段的方法是用CDH3蛋白或 肽篩選在細菌中表達的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫。例如，可以使用噬菌體表達文庫在細菌中表達整個Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)。參見例如Ward等，Nature, 341 544-546 (1989) ；Huse 等，kience，246 1275-1281 (1989)；及 McCafferty 等，Nature，348 552-554(1990)。用例如⑶H3肽篩選此類文庫能鑒定出與⑶H3反應(yīng)性的免疫球蛋白片段。 或者，可使用SCID-hu小鼠(可得自Genpharm)來生成抗體或其片段。在另一個實施方案中，可從使用McCafferty 等，Nature 348 =552-554(1990) 所述技術(shù)構(gòu)建的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature352 624-628 (1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)分別描述了使用噬菌體 文庫分離鼠源和人源抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology 10 :779-783(1992)),以及作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略的組合感染和體內(nèi)重組 (Waterhouse 等，Nuc. Acids Res. 21 :2265-2266 (1993))，生成高親和力(nM 范圍)的人源 抗體。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方 法。還可以修飾DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列替代同源鼠源序列 (美國專利 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851 (1984))，或通過共 價偶聯(lián)免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列。通常，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個 抗原結(jié)合位點的可變域，以產(chǎn)生這樣的嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一 個抗原結(jié)合位點，和對另一種不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。任何可結(jié)合具有氨基酸序列SEQ ID NO 3的⑶H3蛋白胞外域的抗體均可用于本 發(fā)明。因而，只要抗體識別SEQ ID NO :3，此類抗體就可用于本發(fā)明的方法或組合物。在優(yōu) 選的實施方案中，識別氨基酸序列SEQ ID NO :3的抗體可結(jié)合表達至少包含其跨膜和胞外 結(jié)構(gòu)域的⑶H3的細胞。同時，本發(fā)明還提供適合于治療或診斷CDH3相關(guān)疾病的抗體。特別地，以下面的 特性限定的抗體優(yōu)選有意用于此類用途。本發(fā)明抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域個包括由框架區(qū)分隔開的三個⑶R，稱作⑶Rl、 ⑶R2、和⑶R3。⑶R的氨基酸序列不受特別限制，只要抗體能特異性結(jié)合⑶H3。優(yōu)選的⑶R 氨基酸序列的例子包括但不限于VH CDRl =SYffIH (SEQ ID NO 13),VH CDR2 :EIDPSDNYTYYNQNFKG(SEQ ID NO :14)，VH CDR3 :SGYGNLFVY(SEQ ID NO :15)，VL CDRl :SATSSVTYMY(SEQ ID NO :16)，VL CDR2 :RTSNLAS (SEQ ID N0:17)，禾口VL CDR3 QHYHIYPRT (SEQ ID NO 18)CDR 的預(yù)測方法之一記載于 Kabat Ε. A.等(1991) Sequence of Proteins oflmmunological Interest,第 5 版，NIH Publication No. 91-3242。在一個更優(yōu)選的實施方案中，VH對應(yīng)于氨基酸序列SEQ ID NO :11，而VL對應(yīng)于氨 基酸序列SEQ ID NO :12ο依照本發(fā)明，單克隆抗體及其結(jié)合片段可表征為i)包含由氨基酸序列SEQ ID NO 11和12限定的可變區(qū)的抗體；
ii)能夠與由本文所述CDR氨基酸序列限定的單克隆抗體結(jié)合相同抗原決定簇的 抗體；iii)由所述氨基酸序列限定的單克隆抗體的結(jié)合片段；或iv)能夠與由所述氨基酸序列限定的單克隆抗體結(jié)合相同抗原決定簇的單克隆抗 體的結(jié)合片段?？墒褂贸Ｒ?guī)分子生物學(xué)技術(shù)來制備編碼嵌合產(chǎn)物和CDR移植產(chǎn)物的DNA序列。 編碼感興趣抗體的CDR的基因可例如通過使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)自抗體生成細胞的 RNA 合成可變區(qū)來制備(參見例如 Larrick 等，“Methods :a Companion to Methods in Enzymology “,第 2 卷，第 106 頁，1991 ;Courtenay-Luck, “ Genetic Manipulation of Monoclonal Antibody " inMonoclonal Antibody Production, Engineering and Clinical Application, Ritter 等編，第 166 頁，Cambridge University Press,1995, 及 Ward 等，"GeneticManipulation and Expression of Antibody " in Monoclonal Antibody Principlesand Applications,Birch 等編，第 137 頁，Wiley-Liss, Inc. , 1995)。 可以使用寡核苷酸合成技術(shù)來完全地或部分地合成編碼嵌合和⑶R移植產(chǎn)物的DNA序列。 可以視情況適宜使用定點誘變和聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)。例如，可以使用如Jones等，(1986) Nature, 321 :522-5描述的寡核苷酸指導(dǎo)的合成。還有，可以使用寡核苷酸指導(dǎo)對已存在的 可變區(qū)的誘變，如例如 Verhoeyen 等，(1988) Science, 239 =1534-6 或 Iiiechmann 等，見上文 記載的。還有，可以使用T4DNA聚合酶進行帶缺口的寡核苷酸的酶促填平，如例如Queen等， (1989)Proc NatlAcad Sci USA, 86 :10029-33 ；PCT 公開文本 WO 90/07861 記載的。任何合適的宿主細胞/載體系統(tǒng)均可用于表達編碼⑶R移植的重鏈和輕鏈的DNA 序列?？墒褂眉毦?例如大腸桿菌)和其它微生物系統(tǒng)，特別是用于表達抗體片段，諸如 FAb和(Fab' )2片段，尤其是Fv片段和單鏈抗體片段，例如單鏈Fv?？墒褂谜婧?例如哺 乳動物)宿主細胞表達系統(tǒng)，特別是用于生成較大的CDR移植的抗體產(chǎn)物，包括完整抗體分 子。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞和骨髓瘤或雜交瘤細胞系。(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已經(jīng)描述了用于將非人抗體人源化的方法。優(yōu)選的是，人源化抗體具有一 個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們 通常是從“輸入”可變域取出的。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法進行(Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Reichmann 等，Nature 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science 239 1534-1536 (1988))，通過用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此 類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中實質(zhì)上少于整個的人可變區(qū)被替 代為來自非人物種的相應(yīng)序列。在實踐中，人源化抗體通常是這樣的人抗體，其中一些高變 區(qū)殘基，可能還有一些FR殘基，被替代為來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基。用于制備人源化抗體的人可變域(包括輕鏈和重鏈)的選擇，對于降低抗原性非 常重要。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變域序列對整個已知人可 變域序列文庫進行篩選。然后接受與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū) (FR) (Suns 等，J. Immunol. 151 :2296 (1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol. 196 :901 (1987))。另 一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框 架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 =4285(1992)；Presta 等，J. Immunol. 151 :2623 (1993))。另外，重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學(xué)特 性。為了實現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析 親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是 可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序 列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。通過檢查這些顯示圖像可以分析殘基在候選免疫球 蛋白序列功能行使中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。 這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如更高 的對靶抗原的親和力。通常，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)的涉及對抗原結(jié)合的影響。(iv)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成這樣的轉(zhuǎn)基因動 物(如小鼠)，其能夠在被免疫后生成完整的人抗體庫，而沒有內(nèi)源免疫球蛋白生成。例 如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗 體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原 攻擊后生成人抗體。參見例如 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551 (1993)； Jakobovits 等，Nature 362:255-258 (1993) ；Bruggermann 等，Year in Immuno. 7 33 (1993)；及美國專利 5，591，669,5, 589，369 和 5，545，807?；蛘?，可以利用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348:552-553(1990)) 在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫生成人抗體和抗體片段。按照 這種技術(shù)，將抗體V區(qū)基因合框克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白 基因中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組 的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進行選擇，也就會導(dǎo)致選擇編碼展示那些特性 的抗體的基因。于是，噬菌體可模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以采取多種形式 進行；有關(guān)綜述參見例如 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinion inStructural Biology 3:564-571(1993)。數(shù)種來源的V基因區(qū)段可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature 352 =624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠的脾的小型V 基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體?？蓪嵸|(zhì)上依照Marks等，J. Mol. Biol. 222 :581-597(1991)或 Griffith 等，EMBO J. 12 :725-734(1993)所述技術(shù)，由未免疫 人供體構(gòu)建V基因全集，并分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美 國專利 5，565，332 和 5，573，905。還可通過體外激活B細胞(參見美國專利5，567，610和5，229，275)來生成人抗 體。一種使用SCID小鼠生成人抗體的優(yōu)選手段披露于共同所有的、共同未決的申請。(V)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了多種生成抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來得 至Ij這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods M :107-117(199 及 Brennan 等，Science 229 :81(1985)) 然而，現(xiàn)在可直接由重組宿 主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫分離抗體片段?；蛘?，可直接從 大腸桿菌回收Fab' -SH片段，并通過化學(xué)方法偶聯(lián)形成F(ab' )2片段(Carter等，Bio/ Technology 10 :163-167 (199 )。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離
11F(ab' )2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對從業(yè)人員是顯而易見的。在其它實施方 案中，優(yōu)選的抗體是單鏈Fv片段(scFv) 0參見WO 93/16185 ；美國專利5，571，894 ；和美國 專利5，587，458?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利5，641，870中所述。所 述線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。(vi)雙特異件抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例如，可以將抗癌 細胞標(biāo)志物臂與可結(jié)合白細胞上的觸發(fā)分子諸如T細胞受體分子(如CD2或CD3)或IgG 的 Fc 受體(Fe y R)，諸如 Fc y RI (CD64), FcyRII (CD32)和 Fc γ RIII (CD16)的臂組合，使 得細胞防御機制聚焦于癌細胞。雙特異性抗體還可用于將胞毒劑定位于癌細胞。這些抗體 擁有癌細胞標(biāo)志物結(jié)合臂及結(jié)合胞毒劑(如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物堿、 蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長 抗體或抗體片段(如F(ab‘ )2雙特異性抗體)。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)的全長雙特異性抗體制備， 當(dāng)兩種鏈具有不同的特異性時，是基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(Millstein 等，Nature 305 =537-539 (1983)) 0由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤 (四源雜交瘤(quadroma))生成可能有10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正 確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化，其通常通過親和層析步驟進行，相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量 低。TO 93/088 及 Traunecker 等，EMBO J. 10:3655-3659(1991)中公開了類似的流程。按照一種不同的方法，將具有所需的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體 可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。融合優(yōu)選是與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的 免疫球蛋白重鏈恒定域融合。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的 位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白 輕鏈的DNA插入各別的表達載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多 肽鏈比例不等時可提供最優(yōu)產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了 很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈的同比例表達可導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特 別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個載體是可能的。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特 異性)構(gòu)成。人們發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將所需雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白 鏈組合分開，這是由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了分離的便利 途徑。該方法公開于W094/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的其它細節(jié)參見例如Suresh等， Methods inEnzymology 121:210(1986)。依照美國專利5，731，168中描述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界 面，從而使得從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體 恒定域的至少一部分Ch3域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè) 鏈用較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)替換。在第二抗體分子的界面上通過用較小氨基酸側(cè) 鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈而產(chǎn)生針對大側(cè)鏈的相同或相似大小的補償性 “空腔”。這提供了提高異二聚體相對于其它非期望的終產(chǎn)物諸如同二聚體的產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)”抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想 要的細胞(美國專利4，676，980)，和用于治療HIV感染(W0 91/00360,WO 92/200373和EP 03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周 知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國專利4，676，980。文獻中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來 制備雙特異性抗體。Brerman等，Science 229 =81(1985)描述了通過蛋白水解切割完整抗 體以生成F(ab' )2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原， 以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼?基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成 Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生 的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最近的進展使得從大腸桿菌中直接回收Fab' -SH片段變得更加容易，這些片段 可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med. 175 :217-225(1992)描述了生成 完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子。由大腸桿菌各別分泌每個Fab'片段，并在體 外進行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。還描述了從重組細胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技 術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。(Kostelny等，J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992))。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體 的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗體異 二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替代機制。該 片段包含通過接頭相連的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(Vh)，所述接頭太短使得同一條鏈 上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的Vh和\結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的 互補八和Vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv (sFv) 二 聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J. Immunol. 152 :5368(1994)。涵蓋具有效價高于2的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol. 147 :60(1991)?？贵w偶聯(lián)物和其它修飾本文中方法中使用的或制品中包括的抗體任選偶聯(lián)至細胞毒劑或治療劑。如本文中使用的，治療劑包括任何可用于治療癌癥的化療劑?；焺┑睦?包括烷化劑類，諸如噻替哌(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸 酯類，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮 丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和 烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine), 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphaoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥類，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘 氮芥(chlornaphazine)、膽磷酉先胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷 酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留酉享 (phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥 (uracil mustard)；硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀 (ranimustine)；抗生素類，諸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、方文線菌素(actinomycin)、 氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、力口利車霉素(calicheamicin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、方文線菌素 D(dactinomycin)、柔紅霉 素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星 (doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、{衣索比星(esorubicin)、{衣達比星(idambicin) >
(marcellomycin) > ^(mitomycin) >β )(mycophenolic acid) 力口霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來霉素(ρ印lomycin)、poffiromycin、 嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌 素(str印tonigrin)、鏈脲霉素(str印tozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨喋呤 和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨 酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、 6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(anc i tab ine)、阿扎胞 苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧 尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿唆(doxif luridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟 尿苷(floxuridine)、5-FU ；雄激素類，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、表硫雄酉享(epitiostanol)、美雄燒(mepitiostane)、 睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦 (mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯(aceglatone)； 酸磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)； 氨苯口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)； defofamine ；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)； 醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香 菇多糖(Ientinan)；氯尼達明(Ionidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽 醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol) ； 二 胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋氛氣芥(phenamet) ；口比柔比星(pirarubicin)；鬼白酸(podophyllinic acid) ；2-乙基酰胼；丙卡巴胼(procarbazine) ；PSK&commat ；雷佐生(razoxane)；西索菲 蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺 醌(triaziquone) ；2,2'，2〃 _ 三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)； 達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露酉享氮芥(mannomustine) ；二溴甘露酉享(mitobronitol) ；二 溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴燒(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞昔(arabinoside) (“Ara-C")；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌；類紫杉醇(taxoid)，例如帕立他塞 (paclitaxel) ( TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)禾口多西他 塞(doxetaxel) ( TAXOTERE , Rh6ne_Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine) ；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉬類似物， 諸如順鉬和卡鉬；長春堿(vinblastine)、鉬(platinum)；依托泊苷(etoposide) (VP-16)； 異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；絲裂霉素C(mitomycinC)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新 喊(vincristine)；長春瑞賓(vinorelbine)；諾維本(navelbine)；諾安托(novantrone)； 替尼泊苷(teniposide)；柔紅霉素(daimomycin)；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊拜膦 酸鹽(ibandronate) ；CPT-11 ；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視 黃酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine)；及上述任何物質(zhì)的藥學(xué) 可接受的鹽、酸或衍生物。在此治療劑中還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的 抗激素劑，諸如抗雌激素類，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)， 芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、奧那司 酮(onapristone)、和托瑞米芬(toremifene) (Fareston)；和抗雄激素類，諸如氟他米特 (flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、尼魯米特(nilutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、 和戈舍瑞林(goserelin)；及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。本文還設(shè)想了抗體與一個或多個小分子毒素(如加利車霉素、美登木素(美國專 利5，208，020)、單端孢霉素和01065)的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將抗 體偶聯(lián)至一個或多個美登木素分子(例如約1個至約10個美登木素分子每個抗體分子)。 例如可以將美登木素轉(zhuǎn)變成May SS-Me,May SS-Me可以還原成May_SH3并與經(jīng)修飾的抗體 反應(yīng)(Chari等，CancerResearch 52 :127-131 (1992))以生成美登木素生物堿-抗體偶聯(lián) 物?；蛘?，可以將抗體偶聯(lián)至一個或多個加利車霉素分子。加利車霉素抗生素家 族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂?？捎玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限 于 γ II、α 21、α 31、N-乙?；? γ II、PSAG 禾口 0Il(Hinman 等，CancerResearch 53 3336-3342(1993)及 Lode 等，Cancer Research 58 :2925-2928(1998))?？墒褂玫拿富疃舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外 毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌O^seudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋 白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii) 毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(PhytolacaAmericana)毒蛋白(PAPI, PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋 白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素 (mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酷霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin) 和單端孢菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的WO 93/21232。本發(fā)明進一步涵蓋偶聯(lián)有多種放射性同位素的抗體。例子包括m^K211Al131L 125I、9°Y、186Re、_Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素。在本發(fā)明中，本發(fā)明的抗體可 以在即將使用前用放射性核素標(biāo)記，或者作為放射性標(biāo)記的抗體來提供。熟練從業(yè)人員 會認識到有多種放射性核素和化療細胞毒劑可通過公知技術(shù)偶聯(lián)至腫瘤特異性抗體并 投遞至某部位以特異性破壞腫瘤細胞和組織(參見例如W A. Blattler等的美國專利 4，542，225，1985 年 9 月 17 日公告；及 Pastan 等，1986，Cell，47 :641-648)。例如，適合于使 用的成像和細胞毒性試劑包括125I、123I、mIn (例如Sumerdon等，1990，Nucl. Med. Biol.， 17 :247-2 )、和99mTc ；熒光標(biāo)記物，諸如熒光素和羅丹明；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，諸如螢光素；和用于磁共振成像的順磁性離子(Lauffer等，1991，Magnetic Resonance in Medicine, 22 :339-342)?？梢允褂迷诒绢I(lǐng)域已知的并得到實踐的方案和技術(shù)用此類試劑標(biāo)記抗體?？?以從例如 Wenzel 禾口 Meares，Radioimmunoimaging and Radio immunotherapy，Elsevier，New York，1983 ；Colcer 等，1986，Meth. Enzymo1.，121 :802-816 ；及 Monoclonal Antibodyfor Cancer Detection and Therapy, Baldwin 等編，Academic Press，1985，pp. 303-316 中參 考放射性標(biāo)記抗體的技術(shù)。釔-90(9°Υ)標(biāo)記的單克隆抗體已有記載用于使投遞至腫瘤或 癌細胞和/或組織的劑量最大化，同時限制對正常組織的毒性(例如Goodwin和Meares， 1997，Cancer Supplement，80 :2675-2680)。其它細胞毒性放射性核素，包括但不限于 碘-131(131I)和錸-186也可用于標(biāo)記本發(fā)明的單克隆抗體。在放射性核素中，釔-90 (9°Y) 可適合于放射免疫療法，這是由于釔-90 (9°Υ)提供勝過碘-131 (131I)的優(yōu)點，因為前者可 對腫瘤投予更高的貝塔能(2. 3MeV比0. 6IMeV)，且具有5_10mm的路徑長度，從而具有更 好的殺死靶細胞及鄰近細胞的能力，這一點在大體積或顯影不良的腫瘤中是特別有利的。 依照要使用的成像模式來選擇所使用的可檢測/檢測標(biāo)記物。例如，放射性標(biāo)記物，諸如 銦-111 (111 )、锝-99m(99mTc)、或碘-131 (131I)可用于平面掃描或單光子發(fā)射計算機斷層 照相術(shù)(SPECT)。還有，發(fā)射正電子的標(biāo)記物，諸如氟-19可用于正電子發(fā)射斷層照相術(shù) (PET)。順磁性離子，諸如釓(III)或錳(II)可用于磁共振成像(MRI)。單克隆抗體還可 用不透射線的標(biāo)記物標(biāo)記以在注射后通過例如X射線、CATscan、或MRI來顯現(xiàn)癌細胞。特 別地，對于CDH3相關(guān)疾病(例如癌癥)，通過對標(biāo)記物在癌癥內(nèi)的定位，可以確定疾病的擴 散。例如，表達CDH3的癌癥內(nèi)存在的和可檢測的標(biāo)記物的量容許確定要診斷的受試者中癌 癥或腫瘤的有無?？贵w與細胞毒劑的偶聯(lián)物的制備可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑，諸如3-(2-吡 啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4_ (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己胺-1-羧酸琥珀 酰亞胺酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞胺二甲酯)、活性酯類(諸如辛 二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲酰基) 己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2， 6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。 例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14 標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷 酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO 94/11(^6。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒 性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫 化物接頭(Charm 等，Cancer Research 52:127-131 (1992))?；蛘?，可例如通過重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。在另一個實施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)，用于腫瘤的預(yù) 定位，其中對患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物， 然后施用與細胞毒劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(例如親合素)?？梢詫⒈景l(fā)明的抗體與前體藥物活化酶偶聯(lián)，所述前體藥物活化酶將前體藥物 (例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚钥拱┧帯⒁娎鏦O 88/07378和美國 專利 4，975，278。此類偶聯(lián)物的酶組分包括任何這樣的酶，其能夠以一定的方式作用于前體藥物從
16而將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦谢钚缘?、具有細胞毒性的形式?？捎糜诒景l(fā)明方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛?離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酯酶； 可將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榭拱┧幏蜞奏さ陌奏っ摪泵?；可將含肽的前體藥物 轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜熱菌蛋白酶 (thermolysin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶 B和L)；可用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸替代物的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可將糖基化前體 藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的碳水化合物切割酶，諸如13-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可用于將 13-內(nèi)酰胺衍生藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的13-內(nèi)酰胺酶；及可用于將氨基氮分別被苯氧乙酰 基或苯乙?；苌乃幬镛D(zhuǎn)變成游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉 素G酰胺酶?；蛘?，可使用具有酶活性的抗體，本領(lǐng)域也稱作“抗體酶”，將本發(fā)明的前體藥 物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x活性藥物(參見例如Massey，Nature328 :457-458 (1987))。可如本文所述制 備抗體-抗體酶偶聯(lián)物，用于將抗體酶遞送至腫瘤細胞群?？赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將本發(fā)明的酶與抗體共價結(jié)合，諸如使用上文所討 論的異雙功能交聯(lián)劑?；蛘?，可使用本領(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建這樣的融合蛋白， 其包含與本發(fā)明酶的至少功能活性部分連接的本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)(參見例如 Neuberger 等，Nature 312 :604-608 (1984))。本文還涵蓋抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性聚合物中的一種， 例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物連接。本文公開的抗體還可配制成脂質(zhì)體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來制備包含抗體的 脂質(zhì)體，諸如 Epstein 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 82 :3688(1985) ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4030 (1980)；美國專利 4，485，045 和 4，544，545 ；及 1997 年 10 月 23 日 公布的WO 97/38731中描述的。美國專利5，013，556中公開了循環(huán)時間延長的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)法生成。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器，以產(chǎn)生 具有所需直徑的脂質(zhì)體。可如Martin等，J. Biol. Chem. 257 :286-288 (1982)中所述，將本發(fā) 明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參 見 Gabizon 等，J. National Cancer Inst. 81(19) :1484(1989)。涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可以改進抗體的結(jié)合親和力和/或 其它生物學(xué)特性。通過將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円肟贵w編碼核酸或者通過肽合成來制備抗體 的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列中的殘基刪除和/或插入和/或替 代。只要最終的構(gòu)建物具有所需特性，可進行刪除、插入和替代的任何組合以獲得最終的構(gòu) 建物。氨基酸變化還可改變抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。一種可用于鑒定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的方法稱作“丙氨酸 掃描突變”，如 Cunningham and Wells, Science 244 :1081-1085(1989)所述。這里，鑒定一 個或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)， 并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的 相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c引入更多或其它變體，推敲那些顯示出對替代的功能 敏感性的氨基酸位置。因此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進 行丙氨酸掃描誘變或隨機突變，并從所表達的抗體變體中篩選所需活性。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，長度范圍從一個殘基至包 含上百或更多殘基的多肽，還包括單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子 包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插 入變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶或提高抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個氨基酸殘基被 替換成不同的殘基?？贵w中最有興趣進行替代誘變的位點包括高變區(qū)，但FR改變也在考慮 之內(nèi)。通過選擇替代來實現(xiàn)對抗體生物學(xué)特性的實質(zhì)性修飾，這些替代在保持(a)被替 代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)分子的靶位點處的電荷或疏水 性，或(c)側(cè)鏈的大小等方面的效果上顯著不同。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ；(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr ；(3)酸性的Asp、Glu ；(4)堿性的Asn、Gin、His、Lys、Arg ；(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro ；和(6)芳香族的Ι ρ、Τγι·、Ρ1 Θ。非保守替代將需要用這些類別之一中的成員交換另一類別的成員。對任何不涉及抗體正確構(gòu)象的維持的半胱氨酸殘基也可加以替代，通常替換成絲 氨酸，以改善分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善 其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體是片段諸如Fv片段時)。特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個或多個 高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進一步開發(fā)的所得變體相對于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改 進的生物學(xué)特性。產(chǎn)生此類替代變體的一種便利方法是使用噬菌體展示的親和力成熟。簡 而言之，將數(shù)個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)突變，產(chǎn)生各個位點上所有可能的氨基酸替 代。將如此產(chǎn)生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個顆粒內(nèi)包裝 的Μ13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活 性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑒 定對抗原結(jié)合具有重要貢獻的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié) 構(gòu)，以鑒定抗體和抗原之間的接觸點可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文 詳述的技術(shù)進行替代的候選者。產(chǎn)生這樣的變體后，如本文所述對該組變體進行篩選，可選 擇在一種或多種相關(guān)測定法中具有優(yōu)良特性的抗體進行進一步的開發(fā)?？贵w的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式?！案淖儭币馕吨鴦h除在抗 體中出現(xiàn)的一個或多個碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個或多個糖基化位 點ο多肽的糖基化通?；蚴荖-連接的或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊連接 于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-χ-絲氨酸和天冬酰胺-χ-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促連接于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，這些三肽序列其中任一者在多肽中的存在產(chǎn)生潛在的糖基化位點。0-連接 的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一連接于羥基氨基酸，最常見的是絲 氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸?？贵w中糖基化位點的添加可便利地通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個如 上所述的三肽序列而實現(xiàn)(用于N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始抗體的 序列中加入或替入一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(xiàn)(用于0-連接的糖基化位點)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方 法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的場合)，或者通過對早先 制備的變體或非變體型抗體進行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來 制備?？梢孕揎棻景l(fā)明中使用的抗體以改善效應(yīng)器功能，以便例如增強抗體的抗體依賴 性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fc區(qū) 中弓I入一個或多個氨基酸替代來實現(xiàn)?；蛘?另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而容 許該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)化能力和/或提高的 補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J. Exp. Med. 176 1191-1195(1992)和 Shopes, B.，J. Immunol. 148 :2918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff等，CancerResearch 53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來制備?；蛘撸晒こ谈脑斐鲞@樣的抗 體，其具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Mevenson等， Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國專利5，739，277中所述將補救受體結(jié) 合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時，術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”指IgG分 子(如IgGp IgG2, IgG3或IgG4)Fc區(qū)中負責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。與 CDH3 ^^m^mm^^.immmiimmim本發(fā)明的抗CDH3抗體可用作診斷與CDH3有關(guān)的疾病的標(biāo)志物。更具體地，可通過用本發(fā)明的抗⑶H3抗體檢測樣品中的⑶H3蛋白診斷與⑶H3有 關(guān)的疾病。據(jù)此，本發(fā)明提供通過用本發(fā)明的抗CDH3抗體檢測受試者中的CDH3蛋白來診 斷受試者中與CDH3有關(guān)的疾病或發(fā)生與CDH3有關(guān)的疾病的傾向的方法。該方法包括下述 步驟(a)使來自受試者的樣品或標(biāo)本接觸本發(fā)明的抗體或片段；(b)檢測樣品或標(biāo)本中的⑶H3蛋白；并(c)基于CDH3蛋白與對照相比的相對豐度來判斷受試者是否患有或有風(fēng)險發(fā)生疾病。在一個典型的實施方案中，與CDH3有關(guān)的疾病是胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃 或肝癌?；蛘?，在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗CDH3抗體可用于活體中癌癥的檢測或成 像。更具體地，本發(fā)明提供癌癥檢測或成像的方法，其包括下述步驟(1)給受試者施用抗CDH3抗體或其結(jié)合片段；
(2)檢測活體中抗體的累積或定位；并(3)確定患者中抗體或其結(jié)合片段的位置。或者，依照本發(fā)明，可檢測患者中的癌細胞或組織。例如，本發(fā)明提供用于檢測患 者中CGH3在腫瘤組織中表達的癌癥的方法，包括給受試者施用抗體或抗體片段，容許抗 體或抗體片段特異性結(jié)合細胞或組織中的CDH3 ；使細胞或組織中結(jié)合的抗體可視化；并將 細胞或組織中結(jié)合的抗體的水平與正常對照細胞或組織比較，其中結(jié)合于患者細胞或組織 的抗體的水平相當(dāng)于正常對照細胞或組織升高指示患者中有癌癥。優(yōu)選地，為了追蹤施用入活體的抗體，可以用可檢測分子標(biāo)記抗體。例如，可以追 蹤用熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、或放射性同位素標(biāo)記的抗體的體內(nèi)行為。用此類分子標(biāo)記抗體的 方法是本領(lǐng)域公知的?？梢杂^察(例如使用內(nèi)窺鏡或腹腔鏡)用熒光物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗體。在使 用放射性同位素時，抗體的定位可通過放射性同位素的放射性示蹤來成像。在本發(fā)明中，抗 CDH3抗體體內(nèi)定位證明癌細胞的存在。或者，本發(fā)明的抗⑶H3抗體可用于體內(nèi)成像。具體而言，可使用為檢測而標(biāo)記過 的本發(fā)明抗CDH3抗體以使活體中的CDH3蛋白可視化。例如，可以體內(nèi)追蹤用熒光物質(zhì)、發(fā) 光物質(zhì)、或放射性同位素標(biāo)記的抗體的行為。用熒光物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗體可使用生 物成像系統(tǒng)來觀察。在使用放射性同位素時，抗體的定位可通過免疫閃爍成像術(shù)來成像。本發(fā)明的另一個實施方案提供用于表達CDH3的癌癥和腫瘤的診斷劑、診斷方法 和成像方法，其中使用本發(fā)明的單克隆抗體或結(jié)合片段。本發(fā)明抗體的診斷用途涵蓋原發(fā) 性腫瘤和癌癥，以及轉(zhuǎn)移。在優(yōu)選的實施方案中，表達CDH3的癌癥可選自下組胰腺、肺、結(jié) 腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌。依照本發(fā)明的診斷方法包括施用、導(dǎo)入、或輸注如本文所述的單克隆抗體或其結(jié) 合片段，其偶聯(lián)或未偶聯(lián)可檢測模塊，諸如放射性同位素。在施用或輸注時，抗體或結(jié)合片 段結(jié)合腫瘤或癌細胞，之后檢測結(jié)合的抗體或片段的位置。對于經(jīng)可檢測標(biāo)記的抗體或片 段，例如那些用放射性同位素標(biāo)記的，可使用成像設(shè)備來鑒定身體中試劑的位置。對于未標(biāo) 記的抗體或片段，可施用第二可檢測試劑，其可定位結(jié)合的抗體或片段，使得它們能被合適 地檢測。相似的方法已經(jīng)被用于其它抗體，熟練從業(yè)人員會知道適合于身體內(nèi)結(jié)合的抗體 或片段的位置成像的多種方法。作為非限制性指導(dǎo)，施用約10-1000微克(meg.)、優(yōu)選約 50-500meg、更優(yōu)選約100_300meg、更優(yōu)選約200_300meg純化的抗體。例如，人的可應(yīng)用劑 量包括約100_200mcg/kg體重或350-700mg/m2體表面積。依照本發(fā)明，可提供檢查受試者狀況的中間結(jié)果。此類中間結(jié)果可以與別的信息 組合來幫助醫(yī)生、護士、或其它從業(yè)人員確定受試者患有與CDH3有關(guān)的疾病、或者，本發(fā)明 可用于檢測來源于受試者的組織中的癌性細胞，及給醫(yī)生提供有用的信息來確定受試者患 有胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌。與CDH3有關(guān)的疾病的監(jiān)測和預(yù)后評估治療功效差異表達的⑶H3基因還容許監(jiān)測和評估與⑶H3有關(guān)的疾病，例如胰腺癌細胞 (PaC細胞)、肺癌細胞(LuC細胞)、結(jié)腸癌細胞(CC細胞)、前列腺癌細胞(例如PrC細胞)、 乳腺癌細胞(BC細胞)、胃癌細胞(GC細胞)、或肝癌細胞(LiC細胞)的治療過程。或者，依照本發(fā)明，可提供監(jiān)測I^aC、LuC, CC、PrC, BC、GC、或LiC治療過程的中間結(jié)果。此類中間 結(jié)果可以與別的信息組合以幫助醫(yī)生、護士、或其它從業(yè)人員確定受試者患有胰腺、肺、結(jié) 腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌。如此，⑶H3基因或由其編碼的蛋白質(zhì)是用于監(jiān)測hC、LuC、CC、 ft~C、BC、GC、或LiC臨床結(jié)果的有用的預(yù)后標(biāo)志物?；蛘撸景l(fā)明可用于檢測來源于受試者 的組織中的癌性細胞，及給醫(yī)生提供有用的信息來評估I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC的 治療過程。在這種方法中，提供來自正在接受I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC治療的受試 者的測試細胞群。如果需要，在處于治療之前、期間、和/或之后的各種時間點從受試者獲 得測試細胞群。然后測定測試細胞群中的CDH3基因的表達，并與參照細胞群中同一基因的 表達比較，所述參照細胞群包括I^C^LuC^CC^PrC^BC^GC、或LiC狀態(tài)已知的細胞。在本發(fā) 明的語境中，參照細胞應(yīng)尚未暴露于感興趣治療。在監(jiān)測和評估I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC具體治療過程的語境中，生物學(xué)樣 品應(yīng)衍生自正在接受胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌治療的受試者。優(yōu)選地，在治療 之前、期間或之后的多個時間點從受試者獲得多份測試生物學(xué)樣品。如果參照細胞群含有非PaC細胞、非LuC細胞、非CC細胞、非PrC細胞、非BC細 胞、非GC細胞、或非LiC細胞，那么測試細胞群和參照細胞群中CDH3基因表達相似指示感 興趣治療是有效的。然而，測試細胞群和正常對照參照細胞群中CDH3基因表達差異指示不 太有利的臨床結(jié)果或預(yù)后。類似地，如果參照細胞群含有PaC細胞、LuC細胞、CC細胞、PrC 細胞、BC細胞、GC細胞、或LiC細胞，那么測試細胞群和參照細胞群中CDH3基因表達差異 指示感興趣治療是有效的，而測試群和I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC對照參照細胞群中 CDH3基因表達相似指示不太有利的臨床結(jié)果或預(yù)后。另外，可以將在治療后獲得的來自受試者的生物學(xué)樣品中測定到的CDH3基因表 達水平(即治療后水平)與在治療開始前獲得的來自受試者的生物學(xué)樣品中測定到的CDH3 基因表達水平(即治療前水平)比較。治療后樣品中表達水平的降低指示感興趣治療是有 效的，而治療后樣品中表達水平的升高或維持指示不太有利的臨床結(jié)果或預(yù)后。如本文中使用的，術(shù)語“有效”指示治療導(dǎo)致受試者中CDH3基因表達降低或I^aC、 LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC的大小、普遍性(prevalence)、或轉(zhuǎn)移潛力降低。當(dāng)感興趣治 療是預(yù)防性地應(yīng)用時，術(shù)語“有效”意味著治療可延遲或預(yù)防肺癌和/或食道癌的形成或延 遲、預(yù)防、或緩解臨床I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC癥狀。對胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳 腺、胃或肝腫瘤的評估可使用標(biāo)準臨床方案來進行。另外，可結(jié)合用于1^(、1^(、0、？比、8(、6(、或1^(診斷或治療的任何已知方法來 確定有效性?？衫缤ㄟ^組織病理學(xué)或者通過鑒定癥狀異常(例如體重減輕、食欲減退、腹 痛、背痛、食欲缺乏、惡心、嘔吐和全身不適、虛弱、和黃疸)來診斷I^aC^LuC^CClrCjC^GC、 或 LiC0jffeJl^fii CDH3有關(guān)的疾病的警i式者的予頁后本發(fā)明還提供評估具有與CDH3有關(guān)的疾病(例如I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或 LiC)的受試者預(yù)后的方法，此類方法包括比較測試細胞群中的⑶H3基因表達與來自一系 列疾病階段的患者的參照細胞群中的CDH3基因表達的步驟。通過比較測試細胞群和參照 細胞群中的CDH3基因的基因表達，或通過比較來自受試者的測試細胞群中基因表達隨時 間的樣式，可以評估受試者的預(yù)后。
或者，依照本發(fā)明，可提供評估具有I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC的受試者的
預(yù)后的中間結(jié)果。此類中間結(jié)果可以與別的信息組合來幫助醫(yī)生、護士、或其它從業(yè)人員確 定受試者患有肺癌或食道癌。或者，本發(fā)明可用于檢測來源于受試者的組織中的癌性細胞， 及給醫(yī)生提供有用的信息來評估具有I^aC、LuC、CC、PrC, BC、GC、或LiC的受試者的預(yù)后。例如，與正常對照樣品相比測試樣品中⑶H3基因的表達升高指示不太有利的預(yù) 后。相反，與正常對照樣品相比測試樣品中CDH3基因表達的相似性指示受試者更有利的預(yù) 后。用干與CDH3有關(guān)的疾病的i金斷、予頁后、或治療的i式劑盒和i式劑本發(fā)明提供用于與CDH3有關(guān)的疾病的診斷或預(yù)后的試劑盒。具體而言，試劑盒包 括用于檢測⑶H3蛋白的試劑。用于檢測⑶H3蛋白的合適試劑包括針對⑶H3蛋白的抗體。 優(yōu)選地，為了追蹤施用入活體的抗體，可以用可檢測分子標(biāo)記抗體。例如，可以用熒光物質(zhì)、 發(fā)光物質(zhì)、或放射性同位素標(biāo)記抗體。標(biāo)記抗體和檢測帶標(biāo)記抗體的方法是本領(lǐng)域公知的， 本發(fā)明可采用任何標(biāo)記物和方法。另外，試劑盒可包括陽性和陰性對照試劑和用于檢測針對CDH3蛋白的抗體的第 二抗體。例如，自預(yù)后好或差的受試者獲得的組織樣品可充當(dāng)有用的對照試劑。本發(fā)明的 試劑盒可進一步包括從商業(yè)和用戶立場看可取的其它材料，包括緩沖劑、稀釋劑、濾器、針 頭、注射器、和印有使用說明的包裝插頁(例如書面的、磁帶、CD-ROM等)。這些試劑和此類 可以裝在帶有標(biāo)簽的容器中。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以由各種材料制 成，諸如玻璃或塑料。在其它實施方案中，本發(fā)明進一步提供用于要診斷的受試者內(nèi)癌癥的檢測、成像 或治療的試劑盒，其包括針對CDH3蛋白的抗體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體可以 用放射性同位素標(biāo)記。例如，本發(fā)明的試劑盒可以含有識別CDH3的抗體，其經(jīng)過螯合劑和 放射性物質(zhì)的修飾。MX-DOPA是用于修飾抗體的優(yōu)選螯合劑。同時，銦-111 (111In)可用作 用于生物成像的示蹤劑?；蛘撸瑸榱吮磉_CDH3的癌癥的放射免疫療法，可以用貝塔核素例 如釔-90ΓΥ)標(biāo)記抗體。在本發(fā)明中，也可以以其鹽或溶液的形式提供銦-Ill(111In)或 釔-90ΓΥ)。銦-111 (111In)或釔-90 (90Y)的合適的鹽是氯化物。在一個優(yōu)選的實施方案中，與CDH3有關(guān)的疾病是胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃 或肝癌。治療用途下面描述的是使用本發(fā)明的抗體來治療和/或預(yù)防癌癥的方法和藥物組合物。癌 癥包括但不限于胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌細胞。具體而言，依照本發(fā)明在受試者中治療和/或預(yù)防癌癥的方法包括給有所需要的 受試者施用上文所述抗體或片段。術(shù)語“受試者”在本文中指患有癌癥的受試者，包括但不限于胰腺、肺、結(jié)腸、前列 腺、乳腺、胃或肝癌細胞。本發(fā)明中的受試者可以是動物，包括哺乳類和鳥類動物。例如，哺 乳動物可以包括人、小鼠、大鼠、猴、家兔、和犬。本文所述抗體或其片段能特異性結(jié)合CDH3蛋白，所以當(dāng)給受試者施用抗體或其 片段時，它結(jié)合受試者中的CDH3蛋白，而且表達CDH3的細胞的生長可受到遏制?；蛘?，當(dāng)抗 體或其片段可偶聯(lián)有治療性模塊并施用于受試者時，它被投遞至受試者中表達CDH3蛋白的區(qū)域(即患病區(qū)域)，從而治療性模塊可以被選擇性地投遞到患病區(qū)域并作用于它。這樣 的治療性模塊可以是已知的或?qū)婚_發(fā)的對癌癥具有治療功效的任何治療劑，包括但不 限于放射性同位素標(biāo)記物和化療劑?？筛鶕?jù)多種因素來選擇可用作治療劑的放射性同位素 標(biāo)記物，這些因素包括貝塔射線能及其發(fā)射效率、發(fā)射的伽馬射線的有無、其能量和發(fā)射效 率、物理半衰期、和標(biāo)記方法。一般地，可使用基于釔(諸如9°Y)和碘(諸如125I和131I)的 放射性同位素標(biāo)記物。化療劑可以是已知的或?qū)婚_發(fā)的用于治療癌癥的任何試劑，包 括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、順鉬、卡鉬、絲裂霉素、博來霉素、多柔比星、 伊達比星、柔紅霉素、放線菌素D、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、帕立他塞、和多西他賽。本文 所述抗體或其片段能選擇性結(jié)合CDH3蛋白且不結(jié)合正常細胞，所以能有效避免由抗體或 其片段或者放射性同位素或化療劑引起的副作用，因此可以有高的治療功效?？梢砸杂行е委熁蝾A(yù)防CDH3相關(guān)疾病的劑量將本文所述抗體或其片段施用于受 試者。有效劑量指抗體或其片段足以在所治療受試者中產(chǎn)生有益健康的好處的量。下文描 述了藥物組合物含有本發(fā)明抗體時可采用的制劑和施用方法。要進一步理解，在必要或想要時，可施用不同單克隆抗體的雞尾酒(cocktail)， 諸如本文中描述的具體的單克隆抗體或其結(jié)合片段的混合物，以緩解癌癥。確實，在雞尾 酒中使用單克隆抗體或其結(jié)合片段的混合物來靶定癌細胞上的數(shù)種抗原或不同表位是一 種有利的辦法，特別是用于預(yù)防由于腫瘤細胞和/或癌細胞因抗原之一的下調(diào)所致的逃逸 (evasion)0依照本發(fā)明使用的藥物組合物可以以常規(guī)方式使用一種或多種藥學(xué)可接受載體 或賦形劑來配制。抗體或其片段可配制成供通過注射進行的胃腸外施用(即靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi))，經(jīng) 由例如推注注射或連續(xù)輸注。供注射用的配制劑可以以單位劑量形式與添加的防腐劑一起 在例如安瓿或多劑量容器中提供。組合物可采取油性或水性媒介中的懸浮液、溶液、或乳狀 液等形式，而且可含有配方劑，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，抗體可以是凍干粉 形式，以便于在使用前用合適的媒介例如無菌無熱原水構(gòu)建?？贵w或片段、或其偶聯(lián)的治療性模塊的毒性和治療功效，可按照標(biāo)準藥學(xué)規(guī)程在 細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游?例如用于測定LD50 (使群體的50%致死的劑量)和ED50 (在群體 的50%中有治療效果的劑量))中確定。毒性和治療性效果之間的劑量之比為治療指數(shù)，其 可表述為比值LD/ED。表現(xiàn)大的治療指數(shù)的抗體或治療性模塊是優(yōu)選的。雖然可使用表現(xiàn)毒性副作用的 抗體或模塊，但是應(yīng)小心設(shè)計使該抗體或模塊靶向患病組織部位的投遞系統(tǒng)，以使對未受 感染的細胞的潛在破壞最小化，由此降低副作用。自細胞培養(yǎng)物測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于確定供人體使用的劑量范圍。這 樣的抗體的劑量優(yōu)選在包括ED50在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍之內(nèi)，毒性很小或沒有毒性。根 據(jù)所采用的劑量形式、所利用的施用路徑及所偶聯(lián)的治療性模塊的類型和量，劑量可以在 此范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明的方法中使用的任何抗體，有效劑量首先可以根據(jù)細胞培養(yǎng)物 測定來估算?？梢栽趧游锬Ｐ椭信渲茖崿F(xiàn)包括IC50(即測試抗體實現(xiàn)癥狀抑制最大值半數(shù) 的濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍的劑量，如在細胞培養(yǎng)物中測定的。可以利用這樣的信 息更準確地確定在人體中有用的劑量。血漿中的水平可通過例如高效液相層析來測量。
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根據(jù)受試者的狀況和年齡和/或施用路徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇本發(fā)明藥物組 合物的適宜劑量。例如，以如下的量施用本發(fā)明的藥物組合物，使得在1天中依照本發(fā)明的 抗體被施用于受試者的量為約3至約15mcg每kg受試者體重，優(yōu)選約10至約15mcg每kg 受試者體重?？梢钥紤]受試者的狀況和年齡、施用路徑、及對藥物組合物的響應(yīng)來選擇施用 間隔和時間。例如，藥物組合物可以施用于受試者1至5次，優(yōu)選1次1天，持續(xù)5至10天。在另一個方面，當(dāng)胃腸外施用包含放射性同位素標(biāo)記的抗體的組合物時，單個成 人一次施用劑量為 0. lmCi/kg 至 1. OmCi/kg,優(yōu)選 0. lmCi/kg 至 0. 5mCi/kg,更優(yōu)選 0. 4mCi/
kg ο藥物組合物可系統(tǒng)地或局部地施用。優(yōu)選以靶向投遞方式施用，以便將活性成分 投遞至患病部位。在具體的實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物與一種或一組化療劑一起用于治療 或預(yù)防癌癥，所述化療劑包括但不限于甲氨蝶呤、泰素、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、順鉬、卡鉬、絲裂 霉素、博來霉素、多柔比星、伊達比星、柔紅霉素、長春堿、長春新堿、長春瑞濱、帕立他塞、和 多西他賽。關(guān)于放射療法，根據(jù)要治療的癌癥的類型，可使用任何放射療法方案。例如，但非 限制，可施用X射線照射。也可施用發(fā)射伽馬射線的放射性同位素，諸如鐳、鈷、和其它的元 素的放射性同位素以暴露組織。在另一個實施方案中，施用化學(xué)療法或放射療法，優(yōu)選在使用含有本發(fā)明抗體的 方法和組合物之后至少1小時、5小時、12小時、1天、1周、1個月、更優(yōu)選幾個月(例如長至 3個月)。在使用依照本發(fā)明的方法和組合物的治療之前、同時、或之后施用的化學(xué)療法或 放射療法可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體在制造用于治療或預(yù)防與CDH3 有關(guān)的疾病的藥物組合物中的用途。特別地，本發(fā)明進一步提供放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體 在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物中的用途?；蛘撸景l(fā)明進一步提供供治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病用的本發(fā)明抗體。特別 地，還提供供癌癥放射性免疫療法中使用的放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體?；蛘?，本發(fā)明進一步提供制造用于治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病的藥物組合物 的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將作為活性組分的本發(fā)明抗體與藥學(xué)或生理學(xué)可接 受的載體一起配制的步驟。特別地，本發(fā)明進一步提供制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組 合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將作為活性組分的放射性標(biāo)記的本發(fā)明抗體與 藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體一起配制的步驟。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供制造用于治療或預(yù)防與CDH3有關(guān)的疾病的 藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將活性組分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載 體混合的步驟，其中所述活性組分是本發(fā)明的抗體。特別地，本發(fā)明進一步提供制造用于治 療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將放射性標(biāo)記的本發(fā)明 抗體與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體混合的步驟。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供用于要診斷的受試者體內(nèi)癌癥的生物成像或免 疫閃爍成像術(shù)的本發(fā)明抗體?；蛘?，本發(fā)明提供本發(fā)明抗體在制造用于受試者體內(nèi)癌癥的 生物成像或免疫閃爍成像術(shù)的診斷劑中的用途。本發(fā)明進一步提供制造用于受試者體內(nèi)癌癥的生物成像或免疫閃爍成像術(shù)的診斷劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將本發(fā)明 的抗體與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體混合的步驟。通過述及完整并入本文中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)參考文獻。實施例下面，基于實施例來進一步解釋本發(fā)明。材料和方法抗體牛成從來源于癌細胞的cDNA池擴增CDH3基因編碼的胞外域(SEQ ID NO :3)。將產(chǎn)物 克隆入pcDNA3. 1 (Invitrogen,CA)。為了生成⑶H3特異性抗體，每兩周給小鼠皮下免疫接 種域表達載體(17.5mcg/次注射)，持續(xù)一個月。確認抗血清的滴度后，自小鼠提取脾細胞 并與骨髓瘤細胞融合以制備雜交瘤。我們篩選了能識別癌細胞表面上的天然CDH3抗原的 雜交瘤。通過篩選表明，雜交瘤克隆#6以高水平生成抗原特異性抗體，因此選擇了這個克 隆來生成抗體供進一步實驗用。使用雜交瘤克隆#6腹膜內(nèi)注射小鼠。2至3周后回收腹 水。最后，使用蛋白A柱(GE Healthcare, NJ)自腹水純化抗體。細胞培養(yǎng)使用了六種癌細胞系EBC-1，H1373和H358，作為非小細胞肺癌系；KLM-11111111 和MIAPaCa-2，作為胰腺癌系；SW948，作為結(jié)腸直腸癌系。所有細胞系都得自美國典型培養(yǎng) 物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassasm，VA)，而且在補充有 10%胎 牛血清(FBS)和 青霉素 / 鏈霉素的 EMEM(EBC-l、MIAPaCa-2)、RPMI(H;358、KLM-l、H1373) 和L-15(SW948)中于37°C在5% CO2的增濕氣氛中維持。流式細胞儀H358、KLM-I和MIAPaCa_2維持在各自的推薦培養(yǎng)基中直至匯合早期 (early-confluency)。隨后用細胞解離液(SIGMA，M0)解離細胞以避免細胞表面抗原變性。 用PBS懸浮細胞(IxlO7細胞/mL)并于4°C與測試抗體(50mcg/mL) —起溫育1小時。用 PBS清洗兩次后，將細胞與含有7AAD (2. 5mcg/mL)的20mcg/mL Alexa Fluor488山羊抗小鼠 IgG(H+L) (Invitrogen，CA)混合并在黑暗中于4°C溫育30分鐘。通過FACS Calibur (Becton Dickinson, NJ)依照制造商的用法說明來評估測試抗體的結(jié)合模式和特異性。放射性標(biāo)記用兩種不同同位素即銦-111 (111In)和釔_90 (9°Y)標(biāo)記由雜交瘤克隆#6生成的抗 CDH3小鼠單克隆抗體(克隆6)、由生成的克隆6的嵌合抗體(ch_#6)和對照抗體即 正常小鼠 IgGl (Nordic immunological laboratories, Tiburg, The Netherlands)禾口正常 人 IgG。藉由雙功能金屬離子螯合劑 p-SCN-Bn-DTPA 或 p-SCN-Bn-CHX-A〃 -DTPA (Macrocyc liCS，Dallas，TX，USA)用111^i和9°Y標(biāo)記抗體。在二甲基甲酰胺中以1 5的摩爾比將一 毫克抗體與這些螯合劑綴合。于37°C溫育20小時后，使用Biospin柱6 (Bio-Rad, Tokyo, Japan)純化抗體-螯合劑復(fù)合物。分別將 111MCl3(Nihon Medi-Physics,Hyogo, Japan)和 90YCl3 (QSA Global, Brauschweig, Germany)與 0· 25M 乙酸(pH 5. 5) 一起于室溫平行預(yù)溫育 5分鐘。為了獲得和9°Y標(biāo)記的抗體，分別將抗體-螯合劑復(fù)合物與經(jīng)預(yù)溫育的1111HCl3 和9°YC13溶液一起于37°C溫育1小時。使用Biospin柱6依照制造商的用法說明純化經(jīng)標(biāo) 記的抗體。確認了在標(biāo)記過程期間沒有觀察到這些抗體的降解。
異種移棺物樽型依照群馬大學(xué)動物使用和動物委員會的規(guī)定實施動物護理和處理。將IOOmcL EBCl、SW948、KLM-I和H1373細胞懸浮液(IxlO7細胞)皮下接種入雌性3_5周齡裸鼠 (Charles River Laboratories Japan Inc. Yokohama, Japan)的右脅。飼養(yǎng)這些小鼠數(shù)周 以形成腫瘤。自攜帶腫瘤的小鼠分離建立的腫瘤，并切割成邊長2mm的立方體組織碎塊。將 這些碎塊陸續(xù)移植入裸鼠。移植后，飼養(yǎng)這些小鼠直至平均腫瘤體積達到100-600mm3。牛物分布研究隨機選擇攜帶建立的人肺癌腫瘤EBC-I的裸鼠并指派至兩組。給小鼠靜脈內(nèi)注射 Alexa647標(biāo)記和111^i標(biāo)記的(0. 5mCi/mg)抗體。對于基于熒光的研究，處理后48小時用 IVIS 200生物成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences，ΜΑ)評估Alexa647標(biāo)記的抗體的生物 分布。對于基于放射性同位素的研究，注射后3、24、48和72小時分別分離移植的腫瘤、以 及血液、肝、腎、腸、胃、脾、胰、肺、心、肌肉和骨。對所有組織稱重，并在伽馬井式計數(shù)器上對 放射性計數(shù)，并確定百分比注射劑量每克(％ ID/g)。具體而言，在48小時時，分別使用攜 帶建立的腫瘤(EBC-1、SW948、KLM-I和H1373)的裸鼠分析了 111M標(biāo)記的克隆6。放療(單次施用)將異種移植物小鼠隨機指派至三個不同處理組。如上所述制備9°Y標(biāo)記的抗體 (4-10mCi/mg)。給小鼠靜脈內(nèi)注射9°Υ標(biāo)記的克隆6或作為對照的9°Υ標(biāo)記的正常小鼠IgGl。 將所注射抗體的放射性調(diào)整至IOOmcCi每只動物。在注射9°Y標(biāo)記的抗體后的4周時間里 監(jiān)測經(jīng)處理的異種移植物小鼠的體重和腫瘤體積。使用下面的公式計算腫瘤體積(mm3) (最短的直徑)2x (最長的直徑)xO. 5。放療(兩次施用)將SW948異種移植物小鼠隨機指派至四個不同處理組。為了用9°Υ放射性標(biāo)記，將 抗體綴合于P-SCN-Bn-DTPA。如上所述制備9°Υ標(biāo)記的抗體(4-10mCi/mg)。給小鼠靜脈內(nèi) 注射9°Y標(biāo)記的克隆6或作為對照的9°Υ標(biāo)記的正常IgGl。第一次注射14天后用9°Y標(biāo)記 的克隆6實施第二次注射。所注射的抗體的放射性調(diào)整至IOOmcCi每只動物。在第一次注 射9°Υ標(biāo)記的抗體后7周時間內(nèi)監(jiān)測經(jīng)處理異種移植物小鼠的體重和腫瘤體積。使用下面 的公式計算腫瘤體積(mm3):(最短的直徑)2x(最長的直徑)x0.5。HE 染餼在干冰上用Lab-Tek OCT化合物(Sakura Finetek USA，CA)包埋分離的腫瘤以 制備冷凍組織切片。用蒸餾水清洗冷凍切片以除去OCT化合物，并用二甲苯處理5分鐘，兩 次。為了洗去過量的二甲苯和復(fù)水，將切片分別用100%、90%、80%、70%和50%乙醇漂洗 10秒鐘。將切片載玻片在Mayer氏蘇木精(Muto Pure Chemicals, Japan)中浸泡5分鐘， 并用流水洗去過量的蘇木精。接著，用曙紅Y(Mut0 Pure Chemicals, Japan)處理后， 使用50^^70%,80^^90%和100%乙醇實施脫水。最后，將切片用二甲苯處理5分鐘，三 次,用 Malinol (DAID0 SANGYO, Japan)依次封裝。氨基酸序列使用RNeasy迷你試劑盒OiIAGEN)自雜交瘤克隆#6提取總RNA。使用SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶Gnvitrogen)自總RNA合成cDNA。使用NovaTaq DNA聚合酶(Novagen)和小 鼠Ig引物集(Novagen)擴增單克隆抗體可變區(qū)的序列。使用5'引物和3'引物擴增單克隆抗體可變區(qū)的序列；用于克隆#6重鏈的MuIgVH5 ‘ -B ；5' -GGGAATTCATGRAATGSASCTGGG TYWTYCTCTT-3 ‘ (SEQ ID NO 4)，和用于輕鏈的 MuIg κ VL5' -G ；5' -ACTAGTCGACATGAAGT TGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3‘ (SEQ ID NO 5),5' -ACTAGTCGACATGGATTTffCARGTGCAGATTffT CAGCTT-3‘ (SEQ ID NO 6),5' -ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3‘ (SEQ ID N0:7)和 5' -ACTAGTCGACATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3' (SEQ ID NO :8)；用于重鏈 的 MuIgGVH3' -2 ；5' -CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3 ‘ (SEQ ID NO :9)和用 于輕鏈的 MuIg κ VL3' -1 ；5' -CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3' (SEQ ID NO 10)。 將PCR產(chǎn)物克隆入pCR2. I-TOPO(Invitrogen)。對插入物區(qū)域測序并確定克隆#6的可變區(qū) (信號序列除外)的序列。以下面的符號表示引物序列中的不同核苷酸；B為C、G或T，D為A、G或T，H為A、C或T，I為肌苷，K為G或T，M為A或C，R為 A或G，S為C或G，V為A、C或G，W為A或T，Y為C或T。嵌合小鼠/人抗體使用GS基因表達系統(tǒng)(Lonza，Switzerland)制備基于小鼠單克隆抗體克隆#6的 嵌合小鼠/人抗體ch-#6。通過交疊延伸聚合酶鏈式反應(yīng)擴增重鏈和輕鏈。使用引物SEQ ID NO :23和M通過PCR擴增重鏈可變區(qū)。使用引物SEQID NO :27和觀通過PCR擴增人 IgGl恒定區(qū)。這兩種PCR產(chǎn)物在末端含有用于交疊延伸的共同序列。然后用這兩種PCR 產(chǎn)物，使用引物SEQ ID NO :31和觀通過交疊延伸PCR擴增重鏈基因。同樣，使用引物SEQ ID NO :25和沈通過PCR擴增輕鏈可變區(qū)。使用引物SEQ ID NO : 和30通過PCR擴增 人κ恒定區(qū)。利用這兩種在末端含有共同序列的PCR產(chǎn)物，使用引物SEQ ID N0:32和30 通過交疊延伸PCR擴增輕鏈基因。通過PCR分別擴增帶有人κ (SEQ IDNO 19，其編碼SEQ ID NO 21)和人IgGl (SEQ ID NO :20，其編碼SEQID NO 22)的恒定區(qū)的與輕鏈和重鏈可變 區(qū)各自的相應(yīng)基因，并使用限制酶HindIII和EcoRI分別克隆入抗體表達載體pEE12. 4和 PEE6. 4。用限制酶NotI和PvuI消化這兩種單一基因載體(SGV)。經(jīng)消化的重鏈SGV DNA 含有hCMV-MIE啟動子-重鏈-SV40轉(zhuǎn)錄單元，而經(jīng)消化的輕鏈SGV DNA含有GS轉(zhuǎn)錄單元 和hCMV-MIE啟動子-輕鏈表達盒。連接這兩種經(jīng)純化的片段以構(gòu)建雙重基因表達載體。將 載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，然后分離。將表達H鏈和L鏈二者的載體轉(zhuǎn)染入細胞。用無血 清培養(yǎng)基(DMEM ；GIBC0,11965-092)更換培養(yǎng)基，并經(jīng)蛋白A柱純化培養(yǎng)物上清液中含有的 嵌合抗體。表 1用于制備ch#6的引物組
2權(quán)利要求
1.一種抗體或其片段，其特異性識別具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的多肽。
2.依照權(quán)利要求1的抗體或其片段，其包含H(重)鏈V(可變)區(qū)和L(輕)鏈V區(qū)， 所述H鏈V區(qū)包含具有SEQ ID N0:13、14和15所示氨基酸序列的互補決定區(qū)(OTR)或與 其功能上等同的⑶R，所述L鏈V區(qū)包含具有SEQ IDNO :16、17和18所示氨基酸序列的⑶R 或與其功能上等同的CDR，且能夠結(jié)合CDH3蛋白或其部分肽。
3.依照權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述抗體選自下組小鼠抗體、嵌合抗體、人 源化抗體、抗體片段、和單鏈抗體。
4.依照權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述抗體包含具有SEQID N0:11所示氨基 酸序列的H鏈和/或具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的L鏈。
5.依照權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述嵌合抗體包含具有SEQIDN0:11所示氨 基酸序列的H鏈V區(qū)。
6.依照權(quán)利要求3的抗體或其片段，其中所述嵌合抗體包含具有SEQIDNO :12所示氨 基酸序列的L鏈V區(qū)。
7.依照權(quán)利要求4的抗體或其片段，其中所述嵌合抗體包含具有SEQIDN0:11所示氨 基酸序列的H鏈V區(qū)和具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的L鏈V區(qū)。
8.依照權(quán)利要求2的抗體或其片段，其中所述抗體是人源化抗體。
9.依照權(quán)利要求8的抗體或其片段，其中所述人源化抗體還包含人抗體FR(框架)區(qū) 和/或人抗體C區(qū)。
10.依照權(quán)利要求1-9中任一項的抗體或其片段，其與細胞毒劑、治療劑、放射性同位 素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物綴合。
11.依照權(quán)利要求10的抗體或其片段，其中所述放射性同位素標(biāo)記物選自9(1釔(9°Y) 和 111 銦(111In)。
12.一種用于治療或預(yù)防受試者中與CDH3有關(guān)的疾病的方法，其包括給所述受試者施 用有效量的依照權(quán)利要求10或11中任一項的抗體或片段。
13.一種用于受試者中與CDH3有關(guān)的疾病或發(fā)生該疾病的傾向的診斷或預(yù)后的方法， 其包括(a)使來自所述受試者的樣品或標(biāo)本接觸依照權(quán)利要求1-11中任一項的抗體或片段；(b)檢測所述樣品或標(biāo)本中的CDH3蛋白；并(c)基于與對照相比CDH3蛋白的相對豐度來判斷所述受試者是否患有或有風(fēng)險發(fā)生 所述疾病。
14.一種用于治療或預(yù)防與⑶H3有關(guān)的疾病的藥物組合物，其包含依照權(quán)利要求10或 11中任一項的抗體或片段和藥學(xué)可接受載體或賦形劑。
15.一種用于與CDH3有關(guān)的疾病的診斷或預(yù)后的試劑盒，其包含依照權(quán)利要求1-11中 任一項的抗體或片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗CDH3抗體，其能用放射性同位素標(biāo)記。此外，本發(fā)明提供包含抗CDH3抗體作為活性組分的藥物組合物和方法。由于CDH3在胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌細胞中強烈表達，本發(fā)明在胰腺、肺、結(jié)腸、前列腺、乳腺、胃或肝癌治療中是有用的。
文檔編號C07K16/18GK102137929SQ200980133688
公開日2011年7月27日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者中村佑輔, 吉岡弘樹, 富樫亮, 柴康弘, 勝正和, 遠藤啟吾, 高柳惠美, 黃寶星 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司