專利名稱：抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使用抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物和種子增強(qiáng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，以及制備此類 植物和種子的方法。
背景技術(shù)：
線蟲是以2000多種行栽作物、蔬菜、水果和觀賞植物為食的微小線蟲動物，在全 世界引起大約1千億美元的作物損失。多種寄生線蟲物種感染作物植物，包括根癌線蟲 (root-knot nematode) (RKN)、胞囊形成線蟲(cyst-forming nematode)禾口病變形成線蟲 (lesion-forming nematode) 0以在進(jìn)食位點引起根蟲癭形成為特征的根癌線蟲，具有相對 廣的宿主范圍并因此寄生在多種作物物種上。胞囊形成線蟲和病變形成線蟲具有較為有限 的宿主范圍，但是仍在易感作物中引起相當(dāng)大的損失。寄生線蟲目前遍及整個美國，在南部和西部的溫暖、潮濕區(qū)域以及在沙質(zhì)土壤中 發(fā)生最為密集。1%4年，首次在美國北卡羅萊納州發(fā)現(xiàn)了大豆胞囊線蟲(Soybean cyst nematode) (Heterodera glycines)，其是大豆植物最嚴(yán)重的害蟲。一些地區(qū)受到大豆胞囊 線蟲(SCN)侵染太嚴(yán)重，以至于不采取控制措施，大豆產(chǎn)量將不再是經(jīng)濟(jì)上可行的。盡管 大豆是受到SCN攻擊的主要經(jīng)濟(jì)作物，但是SCN總共寄生大約50種宿主，包括大田作物、蔬 菜、觀賞植物和雜草。線蟲損害的病征包括在炎熱時期葉子的矮化和黃化，以及植物枯萎。然而，線蟲感 染可以在沒有任何明顯的地上疾病癥狀的情況下引起顯著的產(chǎn)量損失。產(chǎn)量降低的主要原 因是由于地下的根損傷。受到SCN感染的根會矮化或者發(fā)育不良。線蟲感染也可以減少根 上固氮根瘤的數(shù)量，并可以使根更易于受到其他土傳植物線蟲的攻擊。線蟲的生活史具有三個主要的階段卵、幼體和成體。線蟲物種之間生活史不同。 SCN的生活史類似于其他植物寄生線蟲的生活史。在最佳的條件下，SCN的生活史通?？梢?在M到30天內(nèi)完成，然而其他物種可能需要1年或者更長以完成生活史。在春天，當(dāng)溫度 和濕度水平變得有利的時候，在土壤中，蟲狀的幼體從卵中孵化。只有在幼體發(fā)育階段的線 蟲能感染大豆根。在滲透入大豆根后，SCN幼體移動穿過根直到它們接觸到維管組織，在那時，它們 停止遷移并開始進(jìn)食。通過口針，線蟲注射修飾某些根細(xì)胞的分泌物并將它們轉(zhuǎn)變成專門 的進(jìn)食位點。根細(xì)胞在形態(tài)上被轉(zhuǎn)化成作為線蟲的營養(yǎng)來源的大型多核合胞體(或者在 RKN的情況下為巨大細(xì)胞)。因此，主動進(jìn)食線蟲從植物中盜取基本營養(yǎng)物質(zhì)，造成了產(chǎn)量 損失。隨著雌性線蟲進(jìn)食，它們開始膨大并最終變得太大以至于它們的身體突破了根組織 并暴露于根的表面。在一段時間的進(jìn)食后，沒有如成年雌性膨大的雄性SCN，遷移到根的外面進(jìn)入土壤 中并使增大的成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍依附于根系統(tǒng)并繼續(xù)進(jìn)食。在膨大的 雌性內(nèi)的卵開始發(fā)育，最初在體外的團(tuán)塊(mass)或卵囊內(nèi)，并然后隨后在線蟲體腔內(nèi)。最 終，整個成年雌性體腔都充滿了卵，且線蟲死去。死亡雌性的充滿卵的身體稱為胞囊。胞囊 最終擴(kuò)散并在土壤中可隨意發(fā)現(xiàn)。胞囊的壁變得非常堅硬，為包含在其中的大約200至400個卵提供良好的保護(hù)。SCN的卵在胞囊中存活直到合適的孵化條件出現(xiàn)。盡管許多卵可以 在第一年內(nèi)孵化，但是許多卵也會在保護(hù)性胞囊中存活幾年。線蟲在土壤中以其自身的能力每年僅可以移動幾英寸。然而，線蟲感染可以以多 種方式傳播到相當(dāng)遠(yuǎn)的距離。任何移動受感染土壤的東西都能傳播感染，包括農(nóng)業(yè)機(jī)械、車 輛和工具、風(fēng)、水、動物和農(nóng)場工人。土壤的種子大小顆粒常常污染收獲的種子。因此，當(dāng)從 受感染的田地的受污染的種子播種在未受感染的田地的時候，線蟲感染可以傳播。甚至有 證據(jù)表明，某些線蟲物種可以通過鳥類傳播。這些原因中僅有一些可以預(yù)防。用于管理線蟲感染的常規(guī)方法包括在受線蟲感染的土地中保持合適的土壤營養(yǎng) 和土壤PH水平；控制其他植物疾病，以及昆蟲和雜草害蟲；僅在耕種了未感染田地后使用 衛(wèi)生實踐，如線蟲感染田地的耕作、種植和栽培；在受感染的田地作業(yè)后，用高壓水或者蒸 汽徹底清潔設(shè)備；不使用在受感染的土地上生長的種子用于種植未感染的田地，除非種子 已經(jīng)適當(dāng)?shù)厍鍧?；輪作受感染的田地并用非宿主作物替換宿主作物；使用殺線蟲劑；和種 植抗性植物品種。已經(jīng)提出了用于植物的基因轉(zhuǎn)化的方法以賦予對植物寄生線蟲增加的抗性。例 如，美國專利號5，589，622和5，824，876涉及在受到線蟲附著后在植物的進(jìn)食位點內(nèi)或者 附近特異表達(dá)的植物基因的鑒定。許多方法涉及用能抑制基本線蟲基因的雙鏈RNA來轉(zhuǎn)化 植物。其他農(nóng)業(yè)生物技術(shù)方法提出過表達(dá)編碼對線蟲有毒性的蛋白質(zhì)的基因。當(dāng)受到根瘤菌屬的共生土壤細(xì)菌感染的時候，豆科植物例如大豆和苜蓿產(chǎn)生了特 化的根瘤。一旦在根瘤內(nèi)建立，根瘤菌固定大氣氮，使其可以為植物所用。由于氮作為植物 營養(yǎng)的基本作用，在根瘤中的氮固定對于農(nóng)業(yè)是重要的。許多植物基因，稱為“根瘤蛋白”優(yōu) 先地表達(dá)在根瘤中。根瘤蛋白基因編碼多種蛋白質(zhì)，包括豆血紅蛋白、尿酸酶、谷氨酰胺合 成酶、蔗糖合成酶和大量未知功能的其他蛋白質(zhì)。一類蒺藜苜蓿(Medicago trunculata)根瘤蛋白基因編碼富含氨基酸半胱氨酸的 小蛋白質(zhì)，稱為“半胱氨酸簇蛋白質(zhì)”或者“CCP”。CCP的一種亞類以N末端信號肽；小的、 高電荷的極性成熟肽；以及在成熟肽內(nèi)形成兩個二硫鍵的4個半胱氨酸殘基的特征性排列 為特征。這種CCP亞類通過半胱氨酸殘基的數(shù)目與其他蒺藜苜蓿(M. trunculata) CCP亞類 區(qū)別其他CCP在成熟肽中含有6個、8個或者10個半胱氨酸殘基，且在成熟肽中可能形成 多于2個二硫鍵。除了每一亞類的成員都共有的半胱氨酸的特征性排列外，CCP表現(xiàn)出相 對低水平的氨基酸同一性。含有多于4個半胱氨酸殘基的蒺藜苜蓿CCP成熟肽的二硫橋模式與植物防衛(wèi)素 的二硫橋模式類似，所述植物防衛(wèi)素是低分子量半胱氨酸富集的抗微生物和抗真菌蛋白 質(zhì)。植物防衛(wèi)素包含形成4個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化二硫橋的8個半胱氨酸。植物防衛(wèi)素的三維結(jié)構(gòu) 以“半胱氨酸穩(wěn)定的α β ”或者“CS α β ”基序為特征，所述“半胱氨酸穩(wěn)定的α β ”或者 "CSa β ”基序為來自昆蟲、蝎子、蜜蜂和蜘蛛毒液的毒素所共有。短鏈毒素例如蝎子毒素與 K+通道或者Cl—通道結(jié)合。美國專利號6，121，436 ；6, 316，407和6，916，970公開了蒺藜苜蓿防衛(wèi)素AFPl和 AFP2。將AFPl基因轉(zhuǎn)化入馬鈴薯中處于組成型FMV啟動子的控制下，得到的轉(zhuǎn)基因植物在 溫室中和田間試驗中都表現(xiàn)出對真菌大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)增加的抗性。 (Gao等(2000) Nat. Biotechnol. 18，1307)。盡管有這些積極的結(jié)果，但是到目前為止還沒有商業(yè)化的包含編碼AFPl防衛(wèi)素的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。美國專利號6，911，577和7，396，980公幵了編碼來自稻(Oryza sativa)、玉蜀黍 (Zea mays)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、舌甘菜(Beta vulgaris)、常
(Hedera helix) λ^ΜΜ^ΙΡ^^ (Tulipafosteriana)(Tulipa gesneriana) Λ
苦瓜(Momordica charantia)、本氏煙草(Nicotiana benthamiana)、檢膠草(Taraxacum kok-saghyz)、Picramnia pentandra、Amaranthus retroflexux、韭蔥(Allium porrum)、瓜 爾豆(Cyamopsis tetragonoloba)、歐洲油菜(Brassica napus)、Vernoniamespilifolia、 灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)、Licania michauxii、蓖麻(Ricinus communis)、巨 按(Eucalyptus grandis)、葡萄(Vitis yinifera)禾口花生(Arachis hypogaea)的防衛(wèi)素 的植物基因。公開于美國專利號6，911，577和7，396，980的植物防衛(wèi)素基因據(jù)說賦予了對 寄生蟲，包括線蟲的抗性。到目前為止，在任何國家中還沒有解除了對包含能賦予線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因的基因 修飾植物的管制。因此，仍然存在使用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)來鑒定用于控制植物寄生線蟲的安全 且有效的組合物和方法的需要。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含編碼含有不多于4個半胱氨酸殘基的蒺藜苜蓿CCP成熟 肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因可以使得大豆植物抗SCN感染。因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物和 種子，以及克服或者至少減輕線蟲感染有價值的農(nóng)作物的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用包含編碼至少一種蒺藜苜蓿基因的分離的多 核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述蒺藜苜蓿基因編碼含有不多于4個半胱氨酸殘 基的CCP成熟肽。本發(fā)明的另一個實施方案提供了通過上述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子。該種子對于包 含至少一種編碼含有不多于4個半胱氨酸殘基的CCP成熟肽的至少一種蒺藜苜蓿基因是純 合等位基因的，并且一種或多種CCP基因的表達(dá)賦予了生長自轉(zhuǎn)基因種子的植物增加的線 蟲抗性。本發(fā)明的另一個實施方案涉及表達(dá)載體，其包含與編碼含有不多于4個半胱氨酸 殘基的至少一種蒺藜苜蓿CCP成熟肽的多核苷酸有效連接的啟動子。優(yōu)選地，啟動子是組 成型啟動子。更優(yōu)選地，啟動子能特別地指導(dǎo)在植物根中表達(dá)。更優(yōu)選地，啟動子能特別地 指導(dǎo)在受線蟲感染的植物的合胞體位點中表達(dá)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述 方法包括以下步驟a)用包含與編碼含有不多于4個半胱氨酸殘基的至少一種蒺藜苜蓿 CCP成熟肽的多核苷酸有效連接的啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型植物細(xì)胞；b)從轉(zhuǎn)化的植 物細(xì)胞中再生轉(zhuǎn)基因植物；和c)選擇與相同物種的對照植物相比具有增加的線蟲抗性的 轉(zhuǎn)基因植物。附圖簡述

圖1顯示了分配給對應(yīng)的基因和啟動子的SEQ ID NO的表。圖 2 顯示了 MtCCPl (SEQ ID NO 2)、MtCCP3 (SEQ ID NO 4)、MtCCP4 (SEQ ID NO 6)、MtCCP5(SEQ ID NO :8)、MtCCP8(SEQID NO 10)、MtCCP2(SEQ ID NO 12)、MtCCP7(SEQ ID NO :14)、MtCCP9(SEQ ID NO :16)和 MtCCP6 (SEQ ID NO :18)的氨基酸比對。比對在 Vector NTI軟件套件中進(jìn)行(空位開放罰分=10，空位延伸罰分=0. 05，空位間隔罰分=8)。
圖 3 顯示了 MtCCP基因MtCCPl(SEQ ID NO 1)、MtCCP3 (SEQID NO :3)、MtCCP4 (SEQ ID NO :5)、MtCCP5(SEQ ID NO :7)、MtCCP8 (SEQ ID NO :9)、MtCCP2 (SEQ ID NO :11)、 MtCCP7 (SEQID NO 13)、MtCCP9 (SEQ ID NO :15)和 MtCCP6 (SE ID NO :17)之間的總體核苷 酸百分比同一性。使用 Needle of EMBOSS-4. 0. 0 (Needleman，S. B.和 Wunsch，C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)計算成對比對和百分比同一性。圖 4顯示了 MtCCP基因MtCCPl (SEQ ID NO :2)、MtCCP3 (SEQID NO :4)、MtCCP4(SEQ ID NO :6)、MtCCP5(SEQ ID NO :8)、MtCCP8 (SEQ ID NO : 10)、MtCCP2 (SEQ ID NO :12)、 MtCCP7 (SEQ ID NO : 14)、MtCCP9 (SEQ ID NO :16)禾口MtCCP6 (SEQ IDNO :18)之間的總體氨基 酸百分比同一性。使用 Needle of EMBOSS-4. 0. 0 (Needleman, S. B.和 Wunsch，C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)計算成對比對和百分比同一性。優(yōu)選實施方案詳述通過參考以下詳細(xì)的說明和本文中所包含的實施例可以更容易地理解本發(fā)明。在 本申請中，參考了多種出版物。因此，所有這些出版物的公開和在那些出版物中引用的那些 參考文獻(xiàn)以其整體都引入本申請中作為參考，以便更充分地說明本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域。 本文中所用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，且并不意為限制。如本文中所用，“個 可以意為一個或者多個，取決于在其中使用它的上下文。因此，例如，提到“一個細(xì)胞”可以 指可以使用至少一個細(xì)胞。如本文中所用，詞語“或者”意為具體列表的任意一個成員且也 包括該列表成員的任意組合。如本文中所定義，“轉(zhuǎn)基因植物”是已經(jīng)用重組DNA技術(shù)改變的植物，以含有否則在 植物中不存在的分離的核酸。如本文中所用，術(shù)語“植物”包括整個植物、植物細(xì)胞和植物 部分。植物部分包括但不限于，莖、根、胚珠、雄蕊、葉、胚、分生組織區(qū)、胼胝體組織、配子體、 孢子體、花粉、小孢子等。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是雄性不育的或者雄性可育的，并且可 以進(jìn)一步包括除本文中所述的包含分離的多核苷酸的那些轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因。如本文中所定義，術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”是可互換的并指線性的或者分枝的、 單鏈或者雙鏈的RNA或者DNA或者它們的雜合物。該術(shù)語也包括RNA/DNA雜合物?！胺蛛x 的”核酸分子是基本上與在該核酸的天然來源中存在的其他核酸分子(如，編碼其他多肽的 序列)分離的一種核酸分子。例如，認(rèn)為克隆的核酸是分離的。如果核酸已經(jīng)通過人為干 預(yù)改變、或者已經(jīng)將核酸放置于其非天然位點的基因座或位置、或者如果通過轉(zhuǎn)化將它引 入細(xì)胞中，那么也認(rèn)為核酸是分離的。此外，分離的核酸分子，例如cDNA分子，可以沒有一 些其天然結(jié)合的其他細(xì)胞物質(zhì)、或者當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時，沒有培養(yǎng)基、或者當(dāng)化學(xué)合成 時沒有化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。盡管它可以任選地包括位于基因的編碼區(qū)的3’和5’末 端的非翻譯序列，但是它可以優(yōu)選地除去天然地位于其天然發(fā)生的復(fù)制子中的編碼區(qū)側(cè)的 序列。術(shù)語“基因”廣泛地用于指與生物學(xué)功能相關(guān)的核酸的任意區(qū)段。因此，當(dāng)在基因 組序列中時，基因包括內(nèi)含子和外顯子，或者當(dāng)在cDNA和/或它們的表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)序 列中時，基因僅包括編碼序列。例如，基因指表達(dá)mRNA或功能RNA、或者編碼特定蛋白質(zhì)的 核酸片段，并且包括調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語“有效連接”和“有效地連接”可互換并在本文中用于指分離的多核苷酸在單個核酸片段上連接，使得一個分離的多核苷酸的功能受到另一個分離的多核苷酸影響。例 如，如果兩個DNA所處的位置使得調(diào)節(jié)DNA影響了編碼DNA的表達(dá)，那么就稱調(diào)節(jié)DNA與表 達(dá)RNA或者編碼多肽的DNA “有效連接”。術(shù)語“啟動子”在本文中使用時指當(dāng)與目的核苷酸序列連接時，DNA序列能控制目 的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA。盡管不是必需的，但啟動子一般位于目的核苷酸的5’(例如， 上游)(例如，接近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點)，啟動子控制所述目的核苷酸向mRNA的轉(zhuǎn)錄， 并且提供了 RNA聚合酶和其他用于起始轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的特定結(jié)合位點。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”在本文中用于指能調(diào)節(jié)有效連接的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的多核 苷酸。它包括但不限于，增強(qiáng)子、內(nèi)含子、5’ UTR和3，UTR0如本文中所用，術(shù)語“載體”指能運輸已經(jīng)與其連接的另一核酸的核酸分子。載體 的一種類型是“質(zhì)?！?，其指在其中可以連接額外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在本說明 書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換地使用，因為質(zhì)粒是載體最常見的使用形式。載體可以是 雙元載體或者包括T-DNA，其包含左邊界和右邊界并且可以在其間包含目的基因。如本文中 所用，術(shù)語“表達(dá)載體”與術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”可互換，并意為能指導(dǎo)特定的核苷酸在合適的宿主 細(xì)胞中表達(dá)的載體。核苷酸的表達(dá)可以是過表達(dá)。表達(dá)載體包括與目的核酸有效連接的調(diào) 節(jié)核酸元件，其-任選地-與終止信號和/或其他調(diào)節(jié)元件有效連接。如本文中所用，術(shù)語“同源物”指通過從共同的祖先DNA序列遺傳而來的與另一 基因有關(guān)的基因。術(shù)語“同源物”可以應(yīng)用于由于物種形成事件而分離的基因之間的關(guān)系 (如，直向同源物)或者應(yīng)用于由于基因復(fù)制事件而分開的基因之間的關(guān)系(例如，旁系同 源物)。如本文中所用，術(shù)語“直向同源物”指來自不同物種的基因，但是通過物種形成從 共同的祖先基因進(jìn)化。在進(jìn)化過程中，直向同源物保留了相同的功能。直向同源物編碼具 有相同或者類似的功能的蛋白質(zhì)。如本文中所用，術(shù)語“旁系同源物”指通過在基因組內(nèi)復(fù) 制而相關(guān)的基因。旁系同源物通常具有不同的功能或者新的功能，但是這些功能可能是相 關(guān)的。如本文中所用，術(shù)語“保守區(qū)域”或者“保守結(jié)構(gòu)域”指在異源多核苷酸或者多肽 序列中的區(qū)域，在所述區(qū)域中不同的序列之間存在的相對高度序列同一性。例如，可以使用 Clustal W比對，從多序列比對來鑒定“保守區(qū)域”。如本文中所用，術(shù)語“細(xì)胞”或者“植物細(xì)胞”指單個細(xì)胞，并且也包括細(xì)胞群體。 群體可以是包含一種細(xì)胞類型的純?nèi)后w。此外，群體可以包含多于一種的細(xì)胞類型。本發(fā) 明含義中的植物細(xì)胞可以是分離的(例如，懸浮培養(yǎng)中的)或者是包含于植物組織、植物器 官或者任一發(fā)育階段的植物中的。如本文中所用，術(shù)語“純合等位基因”指對于特定性狀的植物的變種，如果其對于 該性狀是基因上純和的，那么當(dāng)純合等位基因變種自花授粉時，在后代中將觀察不到性狀 的顯著量的獨立分離。如本文所用，術(shù)語“無效分離子(null segregant)”指由于孟德爾分離，轉(zhuǎn)基因植 物的不含有轉(zhuǎn)基因的后代(或者衍生自后代的株系)。如本文中所用，術(shù)語“野生型”指在實驗意義上沒有被遺傳修飾或者處理的植物細(xì) 胞、種子、植物組分、植物組織、植物器官或者整個植物。
如本文中所用，術(shù)語“對照植物”指為了在轉(zhuǎn)基因或者遺傳修飾植物中鑒定增強(qiáng)的 表型或者想要的性狀而用于與轉(zhuǎn)基因或者遺傳修飾的植物比較的植物細(xì)胞、外植體、種子、 植物組分、植物組織、植物器官或者整個植物?！皩φ罩参铩痹谀承┣闆r下可以是包含空載體 或者標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物株系，但是并不含有在待評價的轉(zhuǎn)基因或者遺傳修飾的植物中 存在的重組目的多核苷酸。對照植物可以是與待檢測的轉(zhuǎn)基因或遺傳修飾植物相同株系或 變種的植物，或者它可以是另一株系或者變種，例如已知具有特定表型、特性或者已知基因 型的植物。合適的對照植物將包括用于產(chǎn)生本文中的轉(zhuǎn)基因植物的親代株系的遺傳上未改 變的或者非轉(zhuǎn)基因的植物。如本文中所用，術(shù)語“合胞體位點”指線蟲感染后在植物根中形成的進(jìn)食位點。該 位點用作為線蟲的營養(yǎng)來源。合胞體是胞囊線蟲的進(jìn)食位點并且巨細(xì)胞是根癌線蟲的進(jìn)食 位點。作物植物和對應(yīng)的寄生線蟲列于美國植物疾病索引andex of PlantDiseases in the United Mates)(美國農(nóng)業(yè)部手冊號165，1960)；植物寄生線蟲物種在北美的分 布(Distribution of Plant-Parasitic NematodeSpecies in North America)(線蟲學(xué) 家協(xié)會，1985)；和美國植物和植物產(chǎn)品上的真菌(Fungi on Plants and Plant Products in the United Mates)(美國植物病理學(xué)協(xié)會，1989)。例如，本發(fā)明靶向的植物寄生 線蟲包括但不限于，胞囊線蟲和根癌線蟲。本發(fā)明靶向的具體植物寄生線蟲包括但不限 于，大豆異皮線蟲、甜菜異皮線蟲(Heterodera schachtii)、燕麥異皮線蟲(Heterodera avenae)、7jC 稻異皮線蟲(Heterodera oryzae)、木豆異皮線蟲(Heterodera cajani)、 車軸草異皮線蟲(Heterodera trifolii)、馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida)、馬鈴 薯金線蟲(G. rostochiensis)或煙草球異皮線蟲(Globodera tabacum)、南方根結(jié)線 蟲(Meloidogyne incognita)、花生根結(jié)線蟲(M. arenaria)、北方根結(jié)線蟲(M. hapla)、 爪哇根結(jié)線蟲(M. javanica)、納西根結(jié)線蟲(M. naasi)、短小根結(jié)線蟲(M. exigua)、起 絨草莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)、窄小莖線蟲(Ditylenchus angustus)、相似穿孔 線蟲(Radopholus similis)、柑橘穿孔線蟲(Radopholus citrophilus)、多帶螺旋線蟲 (Helicotylenchus multicinctus)、口力口口非失豆f本_& (Pratylenchus coffeae), MMJ^M 體線蟲(Pratylenchus brachyurus)、傷殘短體線蟲(Pratylenchusvulnus)、彎曲短體 線蟲(Paratylenchus curvitatus)、玉米短體線蟲(Paratylenchus zeae)、腎形小盤旋 線蟲(Rotylenchulus reniformis)、銀蓮花擬毛刺線蟲(Paratrichodorus anemones)、 較zj、 毛束Il線蟲(Paratrichodorus minor) > Paratrichodorus christiei、麥f立|§線蟲 (Anguinatritici)、Bidera avenae、小麥根瘦線蟲(Subanguina radicicola)、塞氏紐帶線 蟲(Hoplolaimus seinhorsti)、哥倫比亞紐帶線蟲(HoplolaimusColumbus)、帽狀紐帶線 蟲(Hoplolaimus galeatus)、半穿刺小墊刃線蟲(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘線 ji, (Hemicyc 1 iophora arenaria)、 〒細(xì)If刃(Rhadinaphelenchus cocophilus) >/jC 平對朿 1J線蟲(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛朿Ij線蟲(Trichodorus primitivus)、 異常珍珠線蟲(Nacobbus aberrans)、貝氏滑刃線蟲(Aphelenchoides besseyi)、卡納 亞擬鞘線蟲(Hemicriconemoides kanayaensis)、克萊頓矮化線蟲(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲劍線蟲(Xiphinema americanum)、癌疫壞死線蟲(Cacopaurus pestis)、玉 米異皮線蟲(Heterodera zeae)、菲利普異皮線蟲(Heterodera filipjevi)等。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用包含編碼至少一種蒺藜苜?；虻姆蛛x的多 核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物，所述蒺藜苜蓿基因編碼含有不多于4個半 胱氨酸殘基的CCP成熟肽。優(yōu)選地，在本實施方案中，分離的多核苷酸具有如在SEQ ID NO
1、3、5、7、9、11、13、15或者17中所定義的序列。備選地，多核苷酸編碼具有如在SEQIDNO
2、4、6、8、10、12、14、16或者18中所定義的序列的多肽。根據(jù)本發(fā)明，植物可以選自單子葉植物和雙子葉植物。植物可以是選自玉米、小 麥、稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱、香蕉和裸麥草的屬。植物可以是選自豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿
卜、芹菜、西紅柿、馬鈴薯、棉花、煙草、胡椒、油籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、綠花椰菜、萵 苣和擬南芥(Arabidopsis thaliana)的屬。本發(fā)明也提供了植物、來自此種植物的種子和部分，以及來自此種植物的后代植 物，包括雜交系和自交系。本發(fā)明也提供了植物育種的方法，例如，以制備雜交的可育轉(zhuǎn)基 因植物。該方法包括將包含本發(fā)明的特定表達(dá)載體的可育轉(zhuǎn)基因植物自交或者與第二植 物，例如一種缺乏該特定的表達(dá)載體的植物雜交，以制備包含特定表達(dá)載體的雜交可育轉(zhuǎn) 基因植物的種子。然后，將種子種植以獲得雜交可育轉(zhuǎn)基因植物。植物可以是單子葉植物。 雜交可育轉(zhuǎn)基因植物可以具有從母代親本或者從父代親本遺傳而來的特定表達(dá)載體。第二 植物可以是近交系植物。雜交可育轉(zhuǎn)基因(植物)可以是雜交的。任一這些雜交可育轉(zhuǎn)基 因植物的種子也包括于本發(fā)明中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是使用已知的植物育種方法，用類似的轉(zhuǎn)基因植物或者 用缺乏本發(fā)明的核酸的轉(zhuǎn)基因植物或者用非轉(zhuǎn)基因植物雜交來制備種子。此外，本發(fā)明的 轉(zhuǎn)基因植物可以包含，和/或是與另一種包含一種或者多種核酸的轉(zhuǎn)基因植物雜交，因此 在植物和/或其后代中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的“堆積”。然后，將種子種植以獲得包含本發(fā)明核酸的 雜交可育轉(zhuǎn)基因植物。雜交可育轉(zhuǎn)基因植物可以具有從母代親本或者從父代親本遺傳而來 的特定表達(dá)盒。第二植物可以是近交系植物。雜交可育轉(zhuǎn)基因植物可以是雜種。任一這些 雜交可育轉(zhuǎn)基因植物的種子也包括于本發(fā)明中。本發(fā)明的種子可以收獲自可育轉(zhuǎn)基因植物 并用于種植本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的后代，包括包含DNA構(gòu)建體的雜交植物株系。“基因堆積”也可以通過植物轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)移兩種或多種基因到細(xì)胞核中來完成。在轉(zhuǎn) 化期間，可以將多個基因依次或者同時引入到細(xì)胞核中。根據(jù)本發(fā)明，可以堆積多個編碼包 含不多于4個半胱氨酸殘基的CCP成熟肽的蒺藜苜蓿基因以提供增強(qiáng)的線蟲抗性。這些堆 積的組合可以通過任一方法產(chǎn)生，所述方法包括但不限于通過常規(guī)方法雜交育種植物或者 通過基因轉(zhuǎn)化。如果通過基因轉(zhuǎn)化堆積性狀，那么蒺藜苜?；蚩梢砸匀我豁樞蛞来位蛘?同時組合。例如，如果要引入兩種基因，那么兩種序列可以包含于分開的轉(zhuǎn)化盒中或者在相 同的轉(zhuǎn)化盒上。序列的表達(dá)可以通過相同或者不同的啟動子驅(qū)動。本發(fā)明的另一個實施方案涉及包含與本發(fā)明的一種或多種多核苷酸有效連接的 啟動子的表達(dá)載體，其中多核苷酸的表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因植物增加的線蟲抗性。在一個實施方 案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是能調(diào)節(jié)有效連接的多核苷酸組成型表達(dá)的啟動子?！敖M成型啟動子” 指能表達(dá)可讀框的啟動子或者在植物的所有或者幾乎所有發(fā)育階段在所有或者幾乎所有 植物組織中其控制的調(diào)節(jié)元件。組成型啟動子包括但不限于，來自植物病毒的35S CaMV 啟動子(Franck 等，Cell 21 :285-294,1980), Nos 啟動子(An G.等，The Plant Cell 3 225-233，1990)、泛素啟動子(Christensen 等，Plant Mol. Biol. 12 :619-632,1992 和 18 581-8，1991)、MAS 啟動子(Velten 等，EMBO J. 3 :2723_30，1984)、玉米 H3 組蛋白啟動子 (L印etit 等，Mol Gen. Genet 231 :276_85，1992)、ALS啟動子(W096/30530) U9S CaMV啟動 子(US 5，352，605)、超級啟動子(US 5，955，646)、玄參鑲嵌病毒啟動子(US 6，051，753)、 稻肌動蛋白啟動子(US 5，641，876)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亞基啟 動子(US 4，962，028)。在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是調(diào)節(jié)型啟動子?！罢{(diào)節(jié)型啟動子”指非組成 型而是以時間和/或空間的方式指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動子，并且包括組織特異性和誘導(dǎo)型啟 動子二者。不同的啟動子可以在不同的組織或者細(xì)胞類型中、或者在發(fā)育的不同階段、或者 在應(yīng)答不同的環(huán)境條件時指導(dǎo)基因或者調(diào)節(jié)元件的表達(dá)。“組織特異性啟動子”或者“組織優(yōu)選的啟動子”指并不表達(dá)于所有的植物細(xì)胞中， 而僅僅表達(dá)于特定器官(例如葉子或者種子)、特定的組織(例如胚或者子葉)、或者特定 的細(xì)胞類型(例如葉實質(zhì)細(xì)胞或者種子貯藏細(xì)胞)中的一種或多種細(xì)胞類型中的調(diào)節(jié)型啟 動子。這些也包括短期調(diào)節(jié)，例如在早期或者晚期胚發(fā)生時、在果實成熟期間、在發(fā)育的種 子或者果實中、在完全分化的葉子中、或者在序列起始的時候的啟動子。合適的啟動子包括 來自油菜籽的油菜籽蛋白基因啟動子(us 5，608，152)、來自蠶豆(Vicia faba)的USP啟動 子(Baeumlein等，Mol Gen Genet. 225(3) :459_67，1991)、來自擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動子 (W0 98/45461)、來自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白啟動子(US 5，504，200)、來 自蕓苔的Bce4啟動子(W0 91/13980)或者豆球蛋白B4啟動子(LeB4 ；Baeumlein等，Plant Journal, 2 (2) =233-9,1992)以及在單子葉植物如同玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等中賦予種 子特異性表達(dá)的啟動子。值得注意的合適的啟動子是來自大麥的lpt2或者Iptl基因啟動 子(W0 95/15389和W095/23230)或者是在WO 99/16890中描述那些(來自大麥醇溶蛋白 基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麥麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白 基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麥裸麥醇溶蛋白基因的 啟動子)。適合于在植物根組織優(yōu)先表達(dá)的啟動子包括，例如，源自玉米煙酰胺合酶基因的 啟動子(US 20030131377)和稻RCC3啟動子(US 11/075,113)。用于在植物綠色組織中優(yōu) 先表達(dá)的合適啟動子包括來自基因例如玉米醛縮酶基因FDA(US 20040216189)、醛縮酶和 丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK) (Taniguchi 等，Plant Cell Physiol. 41(1) :42-48,2000)的 啟動子?！罢T導(dǎo)型啟動子”指可以通過外部刺激，例如，化學(xué)、光、激素、脅迫或者線蟲例如線 蟲類在一種或者多種細(xì)胞類型中打開的那些調(diào)節(jié)型啟動子。如果希望基因表達(dá)以時間特異 的方式發(fā)生，那么化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子是特別合適的。這類啟動子的例子是水楊酸誘導(dǎo)的啟 動子(W0 95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子(feitz等，Plant J. 2 :397_404，1992)、來自核 酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亞基的光誘導(dǎo)啟動子和乙醇誘導(dǎo)的啟動子(W0 93/21334)。此外，對生物的或者非生物的脅迫條件起反應(yīng)的合適啟動子是例如線蟲誘導(dǎo) 的PRPl基因啟動子(Ward等，Plant. Mol. Biol. 22 =361-366,1993)、來自西紅柿的熱誘導(dǎo) 的hsp80啟動子(US5187267)、來自馬鈴薯的冷誘導(dǎo)的α淀粉酶啟動子(W0 96/12814), 玉米的干旱誘導(dǎo)的啟動子(Busk等，Plant J. 11 :1285_1四5，1997)、來自馬鈴薯的冷、干 旱和高鹽誘導(dǎo)的啟動子(Kirch, Plant Mol. Biol. 33 =897-909,1997)或者來自擬南芥的 RD29A 啟動子(Yamaguchi-Shinozalei 等，Mol. Gen. Genet. 236 :331-340,1993)、許多冷誘導(dǎo)的啟動子例如來自擬南芥的cor 1 fe啟動子(Genbank檢索號UO1377)、來自大麥的 bltlOl 和 blt4. 8 (Genbank 檢索號 AJ310994 和 U63993)、來自小麥的 wcsl20 (Genbank 檢索 號AF031235)、來自谷物的mlipl5 (Genbank檢索號擬6563)、來自蕓苔的bnll5 (Genbank檢 索號U01377)和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的pinll啟動子(歐洲專利號375091)。本發(fā)明中特別的應(yīng)用是合胞體位點優(yōu)選的、或者線蟲進(jìn)食位點誘導(dǎo)的啟動子，包 括但不限于來自在PCT/EP2008/051328中公開的Mtn3樣啟動子、在PCT/EP2007/051378 中公開的Mtn21樣啟動子、在PCT/EP2007/064356中公開的過氧化物酶樣啟動子、在PCT/ EP2007/063761中公開的海藻糖_6_磷酸磷酸酶樣啟動子和在PCT/EP2008/051329中公開 的At5gl2170樣啟動子。所有前述的應(yīng)用在此處引用作為參考。本發(fā)明的再一個實施方案涉及產(chǎn)生抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中該方法包括 以下步驟a)用包含編碼a的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型植物；和c)選擇增加了線蟲 抗性的轉(zhuǎn)基因植物。用于引入多核苷酸到植物基因組中和用于從植物組織或者植物細(xì)胞中再生植物 的多種方法在，例如，Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC 出版社，Boca Raton，佛羅里達(dá))，第 6/7 章，第 71-119 頁(1993) ；White FF(1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ;TransgenicPlants,第 1卷，Engineering and Utilization, Kung 禾口 Wu R 編輯，AcademicPress，第 15—38 頁 Jenes B 等(1993) Techniques for Gene Transfer ；Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization, Kung 禾口 R. Wu 編
Academic Press,H 128-143M ；Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol Plant Molec Biol 42 :205-225 ；Halford NG, Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1) :62-73 中是已知的。轉(zhuǎn)化方法可以包括直接的和間接的轉(zhuǎn)化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導(dǎo) 的DNA攝取、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(US 4，536，475)、使用基因槍的生物射彈方法(Fromm ME 等，Bio/technology. 8(9) :833_9，1990 ;Gordon-Kamm 等，Plant Cell 2 :603，1990)、電穿 孔、在含DNA的溶液中溫育干胚和顯微注射。在這些直接轉(zhuǎn)化方法的情況下，使用的質(zhì)粒不 需要滿足任何具體的要求?？梢允褂煤唵钨|(zhì)粒，例如PUC系列的那些、pBR322、M13mp系列、 PACYC184等。如果要從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中再生完整的植物，那么額外的選擇標(biāo)記基因優(yōu)選地定位 在質(zhì)粒上。直接轉(zhuǎn)化技術(shù)等同地適合于雙子葉和單子葉植物。 轉(zhuǎn)化也可以通過借助土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細(xì)菌感染(例如EP 0116718)、借助病毒載體的病毒感染(EP 0067553 ；US 4，407, 956 ；WO 95/34668 ；WO 93/03161)或者借助花粉(EP 0270356 ；WO 85/01856 ；US 4, 684,611)來實施?；谕寥罈U 菌屬的轉(zhuǎn)化技術(shù)(特別對于雙子葉植物)是本領(lǐng)域熟知的。土壤桿菌屬菌株(例如根瘤土壤 桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或者發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes))包 含質(zhì)粒(Ti或者Ri質(zhì)粒)和用土壤桿菌屬感染后轉(zhuǎn)移到植物中去的T-DNA元件。T-DNA (轉(zhuǎn) 移DNA)整合到植物細(xì)胞的基因組中。T-DNA可以定位在Ti或者Ri質(zhì)粒上或者單獨地包 含在所謂的雙元載體中。土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的方法描述于，例如，Horsch RB等(1985) Science 225 :12 中。土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適合于雙子葉植物，但是也已經(jīng)適應(yīng)于 單子葉植物。通過土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物描述于，例如，White FF, Vectors for GeneTransfer in Higher Plants, Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering andUtilization, S. D. Kung 禾口 R.Wu 編輯，Academic Press, 1993,第 15—38 頁 Jenes B 等 Techniques for GeneTransfer, Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization, S. D. Kung 禾口 R. Wu He Academic Press,1993, % 128-143 M ；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42 :205-225 中。本文中所述的核苷酸可以直接轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中。質(zhì)體表達(dá)相對于核表達(dá)基因 利用大量拷貝數(shù)的優(yōu)勢以允許高表達(dá)水平，在質(zhì)體表達(dá)中，通過同源重組將基因插入到每 一植物細(xì)胞中的環(huán)狀質(zhì)體基因組的幾千個拷貝中。在一個實施方案中，將核苷酸插入到質(zhì) 體靶向的載體中并轉(zhuǎn)化到想要的植物宿主的質(zhì)體基因組中。獲得了對于含有核苷酸序列的 質(zhì)體基因組同質(zhì)的植物，并且其優(yōu)先地能夠高水平表達(dá)所述核苷酸。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)詳細(xì)描述于例如美國專利號5，451，513,5, 545，817,5, 545，818和 5，877，462 中、WO 95/16783 和 WO 97/32977 中，以及McBride 等(1994)PNAS 91,7301-7305 中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以用于控制受到植物線蟲感染的作物的方法，其包括培養(yǎng) 來自包含表達(dá)載體的種子的所述作物的步驟，所述表達(dá)載體包含與編碼含有不多于4個半 胱氨酸殘基的至少一種蒺藜苜蓿CCP成熟肽的多核苷酸有效連接的啟動子，其中表達(dá)載體 穩(wěn)定整合在種子的基因組中。本發(fā)明通過以下的實施例進(jìn)行進(jìn)一步說明，并非以任一方式解釋作為對其范圍施 加限制。實施例1 從蒺藜苜?？寺tCCP基因和載體構(gòu)建將蒺藜苜蓿Jemalong A17的種子在溫室中萌發(fā)并培養(yǎng)。將基因組DNA從這些植 物的苗中分離，并且使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將MtCCP基因從該基因組DNA PCR擴(kuò)增。 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到TOPO進(jìn)入載體(Invitrogen，Carlsbad, CA)中。將克隆的MtCCP基因測序并亞克隆到含有來自歐芹的泛素啟動子的植物表達(dá)載 體(W0 03/102198 ；圖1中的p-PcUbi4-2啟動子(SEQ ID NO :19))中。轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記 是來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的乙酰羥酸合酶(AHAS)選擇基因的突變形式 (Sathasivan 等，Plant Phys. 97 1044-50，1991)，賦予了對除草劑 ARSENAL(Imazapyr， BASF公司，Mount Olive, NJ)的抗性。AHAS2的表達(dá)受到來自歐芹的泛素啟動子 (W003/102198) (SEQ ID NO 19)的驅(qū)動。表1描述了含有蒺藜苜蓿CCP的構(gòu)建體，所述蒺 藜苜蓿CCP在其成熟肽中包含不多于4個半胱氨酸殘基。表 權(quán)利要求
1.用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達(dá)載體包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸 編碼至少一種蒺藜苜蓿(M. trunculata)基因，所述蒺藜苜?；蚓幋a含有不多于4個半胱 氨酸殘基的CCP成熟肽。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述分離的多核苷酸選自a)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定義的序列的多核苷酸；和b)編碼具有如在SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定義的序列的多肽的多 核苷酸。
3.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物選自玉米、大豆、馬鈴薯、棉花、油籽油菜和小麥。
4.種子，所述種子對于編碼至少一種蒺藜苜?；虻闹辽僖环N多核苷酸是純合等位基 因的，所述蒺藜苜?；蚓幋a含有不多于4個半胱氨酸殘基的CCP成熟肽。
5.權(quán)利要求1的種子，其中所述分離的多核苷酸選自a)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定義的序列的多核苷酸；和b)編碼具有如在SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定義的序列的多肽的多核苷酸。
6.表達(dá)載體，其包含與分離的多核苷酸有效連接的啟動子，所述分離的多核苷酸編碼 至少一種蒺藜苜?；颍鲚疝架俎；蚓幋a含有不多于4個半胱氨酸殘基的CCP成熟 肽。
7.權(quán)利要求6的表達(dá)載體，其中所述多核苷酸選自a)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定義的序列的多核苷酸；和b)編碼具有如在SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定義的序列的多肽的多核苷酸。
8.產(chǎn)生抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括以下步驟a)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含編碼至少一種蒺藜苜蓿基因的分離的 多核苷酸，所述蒺藜苜?；蚓幋a含有不多于4個半胱氨酸殘基的CCP成熟肽；b)從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生轉(zhuǎn)基因植物；和c)選擇具有增加的線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述多核苷酸選自i)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定義的序列的多核苷酸；和ii)編碼具有如在SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定義的序列的多肽的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含編碼蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)半胱氨酸簇蛋白質(zhì)的多核苷酸的抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物和種子，所述蒺藜苜蓿半胱氨酸簇蛋白質(zhì)在各自的成熟肽中包含不多于4個半胱氨酸殘基。本發(fā)明也提供了產(chǎn)生具有對大豆胞囊線蟲增加的抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法以及用于此類方法中的表達(dá)載體。
文檔編號C07K14/415GK102124025SQ200980131816
公開日2011年7月13日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者D·P·羅哈, S·希爾 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司