專利名稱：：使用rna干擾控制線蟲(chóng)的組合物和方法使用RNA干擾控制線蟲(chóng)的組合物和方法本發(fā)明的領(lǐng)域是線蟲(chóng)控制，特別是大豆胞囊線蟲(chóng)的控制。本發(fā)明還涉及將遺傳材料引入易感線蟲(chóng)的植物，從而增加對(duì)線蟲(chóng)的抗性。
背景技術(shù)：
：線蟲(chóng)是以超過(guò)2，000種行間作物、蔬菜、水果和觀賞植物的根、葉及莖為食，造成世界范圍估計(jì)一千億美元作物損失的微小線蟲(chóng)。多種寄生線蟲(chóng)物種感染作物植物，包括根結(jié)線蟲(chóng)(RKN)、形成胞囊及形成損傷的線蟲(chóng)。以造成采食部位處根癭形成為特征的根結(jié)線蟲(chóng)具有相對(duì)廣泛的宿主范圍并且因此對(duì)種類繁多的作物物種是致病性的。形成胞囊和形成損傷的線蟲(chóng)物種具有更有限的宿主范圍，不過(guò)依舊在易感作物中造成巨大損失。致病性線蟲(chóng)存在于美國(guó)各地，在南部和西部的溫暖濕潤(rùn)地區(qū)及在沙土中密度最大。大豆植物的最嚴(yán)重病蟲(chóng)-大豆胞囊線蟲(chóng)(Heteroderaglycines)在1卯4年首次于美國(guó)的北卡萊羅納州發(fā)現(xiàn)。某些地區(qū)嚴(yán)重遭受大豆胞囊線蟲(chóng)(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，則大豆生產(chǎn)不再可能是經(jīng)濟(jì)的。盡管大豆是受SCN侵襲的主要經(jīng)濟(jì)作物，然而SCN寄生包括大田作物、蔬菜、觀賞植物和雜草的總計(jì)約50種宿主。線蟲(chóng)損傷的跡象包括在炎熱時(shí)期矮化與葉子發(fā)黃及植物萎蔫。然而，線蟲(chóng)侵染可以引起嚴(yán)重產(chǎn)量損失，而無(wú)任何明顯的地上部分發(fā)病癥狀。產(chǎn)量減少的主要原因歸咎于地下的根損傷。受SCN感染的根矮縮或矮化。線蟲(chóng)侵染也可以減少根上固氮結(jié)節(jié)的數(shù)目，并且可以使根更易受其他土源性植物病原體侵襲。線蟲(chóng)的生命周期具有三個(gè)主要階段卵、幼體和成體。該生命周期在線蟲(chóng)物種之間不同。例如，SCN的生命周期在最適條件下通?？梢杂趯?duì)-30日內(nèi)完成，而其他物種可能經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)一年或更長(zhǎng)時(shí)間以完成生命周期。當(dāng)溫度和濕度水平在春季變得適宜時(shí)，蠕蟲(chóng)形狀的幼體在土壤中從卵孵化出來(lái)。僅幼體發(fā)育階段的線蟲(chóng)能夠感染大豆根。SCN的生命周期已經(jīng)成為眾多研究的主題，并且因此是理解線蟲(chóng)生命周期的有用實(shí)例。在穿透大豆根后，SCN幼體通過(guò)根移動(dòng)直至它們接觸維管組織，此時(shí)SCN幼體停止遷移并開(kāi)始采食。借助口針，線蟲(chóng)注射了調(diào)節(jié)某些根細(xì)胞并將它們轉(zhuǎn)化成特化采食部位的分泌物。這些根細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上轉(zhuǎn)化成巨大的多核合胞體(或在RKN情況中為巨細(xì)胞)，這種合胞體被用作線蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)物來(lái)源。主動(dòng)采食的線蟲(chóng)因此從植物竊取必要的營(yíng)養(yǎng)物，導(dǎo)致產(chǎn)量損失。當(dāng)雌性線蟲(chóng)采食時(shí)，它們膨脹并最終變得如此巨大，以至于它們的身體突破根組織并暴露在根的表面。在采食一段時(shí)間后，作為成體不膨脹的雄性SCN線蟲(chóng)從根遷移至土壤內(nèi)并使膨大的雌性成體受精。雄性線蟲(chóng)隨后死亡，而雌性線蟲(chóng)仍附著于根系統(tǒng)并繼續(xù)采食。膨大雌性線蟲(chóng)中的卵開(kāi)始發(fā)育，最初在身體外的團(tuán)塊或卵囊(amassoreggsac)中并隨后在線蟲(chóng)體腔內(nèi)發(fā)育。雌性成體的整個(gè)體腔最終充滿卵，并且雌線蟲(chóng)死亡。正是充滿卵的死亡雌線蟲(chóng)身體才稱作胞囊。最后胞囊釋放并游離存在于土壤中。胞囊的璧變得極堅(jiān)韌，從而為胞囊內(nèi)所含大約200-400粒卵提供良好的保護(hù)作用。SCN卵在胞囊內(nèi)存活直至適宜的孵化條件出現(xiàn)。盡管眾多的卵可以在第一年中孵化，然而很多卵也會(huì)在保護(hù)性胞囊內(nèi)存活幾年。線蟲(chóng)依賴其自身力量在土壤中每年只能穿行幾英寸。然而，線蟲(chóng)侵染可以以多種方式傳播相當(dāng)遠(yuǎn)的距離?？梢砸苿?dòng)受侵染土壤的任何事物，包括農(nóng)場(chǎng)機(jī)械、車輛和工具、風(fēng)、水、動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)工人，都能夠傳播這種侵染。種子大小的土壤顆粒往往污染收獲的種子。因此，當(dāng)來(lái)自受侵染田地的污染種子在非侵染田地中播種時(shí)，可以傳播線蟲(chóng)侵染。甚至還存在某些線蟲(chóng)種類可以通過(guò)鳥(niǎo)類傳播的證據(jù)。僅可以預(yù)防這些起因中的某些起因。防治線蟲(chóng)侵染的常規(guī)方法包括在線蟲(chóng)侵染的土地中保持合理的土壤養(yǎng)分和土壤PH水平；控制其他的植物疾病以及昆蟲(chóng)與雜草病害；使用消毒措施，如僅在處理完線蟲(chóng)非侵染田地后才翻耕、播種和中耕線蟲(chóng)侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高壓水或蒸汽徹底清潔設(shè)備；不使用在侵染田地中生長(zhǎng)的種子播種非侵染田地，除非這種種子已經(jīng)得到正確地清潔；輪作受侵染田地并且用非宿主作物替換宿主作物；使用殺線蟲(chóng)劑；和播種抗性植物品種。已經(jīng)提出方法用于遺傳轉(zhuǎn)化植物以便賦予植物對(duì)寄生線蟲(chóng)增加的抗性。美國(guó)專利號(hào)5，589，622和5，824，876涉及線蟲(chóng)附著后在采食植物的部位內(nèi)或其附近特異性表達(dá)的植物基因的鑒定。這些植物靶基因的啟動(dòng)子然后能夠用于指導(dǎo)有害蛋白質(zhì)或酶的特異性表達(dá)，或指導(dǎo)對(duì)靶基因或?qū)σ话慵?xì)胞基因反義的RNA的表達(dá)。這些植物啟動(dòng)子也可以用于通過(guò)用含有與其產(chǎn)物被攝取后誘導(dǎo)線蟲(chóng)致死的基因連接的植物靶基因的啟動(dòng)子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物來(lái)在采食部位特異性賦予線蟲(chóng)抗性。最近，已提出用RNA干擾(RNAi)(也稱作基因沉默)作為控制線蟲(chóng)的方法。當(dāng)與靶基因或mRNA的序列基本上相關(guān)的雙鏈RNA(dsRNA)引入細(xì)胞中時(shí)，靶基因的表達(dá)會(huì)被抑制(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6，506，559)。美國(guó)專利號(hào)6，506，559證明了RNAi抗秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)中已知基因的有效性，但沒(méi)有披露RNAi用于控制植物寄生的線蟲(chóng)的用途。對(duì)于RNAi的作用已提出了許多的模型。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，大于30個(gè)核苷酸的雙鏈RNA以一種非序列特異性方式引發(fā)誘導(dǎo)合成干擾素以及蛋白質(zhì)合成的總體停止。但是，美國(guó)專利號(hào)6，506，559揭示，在線蟲(chóng)中，對(duì)應(yīng)于靶基因序列的雙鏈RNA的長(zhǎng)度可為至少25、50、100、200、300或400堿基，甚至更長(zhǎng)的雙鏈RNA也能有效誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲(chóng)中的RNAi。已知當(dāng)用包含98邪4個(gè)核苷酸的雙鏈區(qū)的發(fā)夾RNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化許多植物品種時(shí)，能有效沉默靶植物基因。一般認(rèn)為在包括線蟲(chóng)和植物的許多有機(jī)體中，大片的雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被裂解19-個(gè)核苷酸的片段(siRNA)，這些siRNA是RNAi現(xiàn)象的實(shí)際介質(zhì)。在植物中，通過(guò)名為“Dicer”的RNA酶III將長(zhǎng)的dsRNA加工成21個(gè)核苷酸的siRNA雙鏈體。植物中的21個(gè)核苷酸的siRNA雙鏈體可以包括19個(gè)核苷酸的雙鏈部分和位于每條RNA鏈的3’端的2個(gè)核苷酸的突出部分。已顯示，2個(gè)核苷酸的突出部分不引起序列特異性的基因沉默，而19個(gè)核苷酸的雙鏈部分實(shí)際上介導(dǎo)了序列特異性的基因沉默(Elbashir(2001)Nature411:494-498)。在例如PCT公開(kāi)WO01/96584、WO01/17654、US2004/0098761、US2005/0091713、US2005/0188438、US2006/0037101、US2006/0080749、US2007/0199100和US2007/0250947中，已經(jīng)提出使用RNAi靶向關(guān)鍵的線蟲(chóng)基因。雖然已經(jīng)有多種使用RNAi控制植物寄生線蟲(chóng)的嘗試，但是迄今為止，尚無(wú)任何國(guó)家解除對(duì)線蟲(chóng)-抗性轉(zhuǎn)基因植物的管制。因此，導(dǎo)致需要鑒別安全且有效的組合物和方法，用于使用RNAi控制植物寄生線蟲(chóng)；以及用于生產(chǎn)具有對(duì)植物寄生線蟲(chóng)增加的抗性的植物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了核酸、轉(zhuǎn)基因植物和方法，來(lái)克服或減輕有價(jià)值的農(nóng)業(yè)作物(例如，大豆)的線蟲(chóng)感染。本發(fā)明的核酸能夠通過(guò)RNAi降低寄生線蟲(chóng)靶基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，寄生線蟲(chóng)的靶基因選自寄生線蟲(chóng)的innexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ροδS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)tCp-l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼^S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。本發(fā)明的核酸編碼這樣的雙鏈RNA，所述RNA包括(a)第一鏈，其具有與靶基因的19至約400或500個(gè)連續(xù)核苷酸基本相同的序列，所述靶基因具有選自SEQIDNO=USEQIDNO5,SEQIDNO11；SEQIDNO:19、SEQIDNO23、SEQIDN0:104、SEQIDNO:39和SEQIDN0:57的序列；和(b)第二鏈，其具有與第一鏈基本互補(bǔ)的序列。本發(fā)明還涉及雙鏈RNA分子的庫(kù)，所述庫(kù)包括多數(shù)的短干擾RNA分子，每個(gè)RNA分子包括具有長(zhǎng)度為19至M個(gè)核苷酸的雙鏈區(qū)，其中所述RNA分子源自選自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO1所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO5所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDNO=Il所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO39所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO57所述序列的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗寄生線蟲(chóng)感染的轉(zhuǎn)基因植物，植物包括編碼能夠特異性降低寄生線蟲(chóng)靶基因的dsRNA或siRNA的核酸構(gòu)建體，所述靶基因選自寄生線蟲(chóng)的irmexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ροδS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-Ι樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt_l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能夠表達(dá)dsRNA分子的庫(kù)的轉(zhuǎn)基因植物，其中每個(gè)dsRNA分子包括具有長(zhǎng)度為19至M個(gè)核苷酸的雙鏈區(qū)，其中RNA分子源自與寄生線蟲(chóng)靶基因的一部分基本相同的多核苷酸，所述靶基因選自寄生線蟲(chóng)的irmexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(polSS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-Ι樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。本發(fā)明還涵蓋了產(chǎn)生能夠表達(dá)與寄生線蟲(chóng)的靶基因的一部分基本相同的dsRNA或siRNA的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟(a)從寄生線蟲(chóng)的irmexin-樣基因、編碼聚合酶S小亞基(polSS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-1基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼^S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因中選擇靶基因；(b)制備核酸序列，所述核酸序列包括與選定的靶基因的一部分基本相同的區(qū)域，其中核酸一旦在植物中表達(dá)就能夠形成雙鏈轉(zhuǎn)錄物；(C)用所述核酸轉(zhuǎn)化受體植物；(d)生產(chǎn)所述受體植物的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因后代；和(e)針對(duì)線蟲(chóng)抗性選擇后代。本發(fā)明還提供了賦予植物線蟲(chóng)抗性的方法，所述方法包括以下步驟(a)從寄生線蟲(chóng)的irmexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ροδS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-Ι樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt_l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼^S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因中選擇靶基因；(b)制備核酸序列，所述核酸序列包括與選定的靶基因的一部分基本相同的區(qū)域，其中核酸一旦在植物中表達(dá)就能夠形成雙鏈RNA；(c)用所述核酸轉(zhuǎn)化受體植物；(d)生產(chǎn)所述受體植物的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因后代；和(e)針對(duì)線蟲(chóng)抗性選擇后代。本發(fā)明還提供了表達(dá)盒和表達(dá)載體，其包括與植物寄生線蟲(chóng)靶基因的一部分基本相同的序列，所述靶基因選自寄生線蟲(chóng)的innexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ρ01δS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-1基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-Ι樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt_l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。附圖簡(jiǎn)介圖Ia-Ic顯示了分配與來(lái)自大豆胞囊線蟲(chóng)(H.glycines)和其它線蟲(chóng)物種相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列的SEQIDNOs的表格。SEQIDNO:1、5、11、19、23、104、39和57對(duì)應(yīng)以下基因的全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)核苷酸序列inneXin-樣(inx，SEQIDNO1),pas-1(SEQIDNO:5)、T-復(fù)合體蛋白l(tcp-l,SEQIDNO:11)、snurportinl(SEQIDNO:19)、聚合酶δ小亞基(PolδS,SEQIDNO:23)、蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs_4，SEQIDNO:104)、ATP酶樣蛋白酶體調(diào)節(jié)顆粒(rpt-1，SEQIDNO:39)和非ATP酶的蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基5(rpn-5，SEQIDNO57)基因。用SEQIDNO:3(innexin-樣)、SEQIDNO7(pas-1),SEQIDNO:13(tcp-l)、SEQIDNO:21(snurportinl)、SEQIDNO:25(PolδS)、SEQIDNO:29(蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4，prs-4)、SEQIDNO:41(rpt-1)和SEQIDNO59(rpn-5)表示如實(shí)施例2所述的合成到發(fā)夾表達(dá)構(gòu)建體中的正義核苷酸片段。SEQIDNO:69(來(lái)自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的TPP-樣啟動(dòng)子)、SEQIDN0:70(來(lái)自大豆(Glycinemax)的MtN3_樣啟動(dòng)子)和SEQID而71(來(lái)自擬南芥的基因座4丨5812170的啟動(dòng)子)給出了誘導(dǎo)合胞體的啟動(dòng)子序列。列舉了pas-1(SEQIDNO72-78),rpn-5(SEQIDN079—85)、tcp_l(SEQIDNO86-91)、prs-4(SEQIDNO92、93、106、和107)和rpt_l(SEQIDNO94-103)的保守核苷酸基序。圖2顯示了pas-1樣序列的氨基酸比對(duì)全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)pas-1(SEQIDNO:6)；由二元載體RTP1095靶向的大豆胞囊線蟲(chóng)pas-1片段(SEQIDNO8)；和來(lái)自Genbank登錄號(hào)BM355389的馬鈴薯金線蟲(chóng)(Globoderarostochiensis)部分長(zhǎng)度的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)(SEQIDNO:10)，使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=10.，空位延伸罰分=0.05，空位分離罰分=8)。圖3顯示了以下的氨基酸比對(duì)來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)Genbank登錄號(hào)AAA93233的tcp-Ι樣序列(SEQIDNO18)；全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)tcp_l(SEQIDNO:12)；由二元載體RSA131靶向的大豆胞囊線蟲(chóng)tcp-Ι片段(SEQIDNO14)；來(lái)自Genbank登錄號(hào)CF100567的甜菜胞囊線蟲(chóng)(Heteroderaschachtii)部分長(zhǎng)度的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)(SEQIDNO:16)，使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=10.，空位延伸罰分=0.05，空位分離罰分=8)。圖4顯示了以下的氨基酸比對(duì)來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)Genbank登錄號(hào)016368的prs-4樣序列(SEQIDNO34)；C.briggsaeEMBL登錄號(hào)CAE64528(SEQIDNO32)；通過(guò)5，RACEPCR產(chǎn)生的全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)prs-4(SEQIDNO:105)；通過(guò)二元載體RTPl169靶向的合成大豆胞囊線蟲(chóng)prs-4片段(SEQIDNO30)；由北方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogynehapla)EST聚集成的部分Contig526(SEQIDNO:36)；和由南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)EST聚集成的部分Contig2153(SEQIDNO:38)；使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=10.，空位延伸罰分=0.05，空位分離罰分=8)。圖^1-顯示了以下的氨基酸比對(duì)來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)EMBL登錄號(hào)CAB01414的rpt-Ι樣序列(SEQIDNO54)；C.briggsaeEMBL登錄號(hào)CAE75362(SEQIDNO56)；全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)rpt-l(SEQIDNO:40)；來(lái)自Genbank登錄號(hào)CB376265的大豆胞囊線蟲(chóng)EST序列(SEQIDNO44)；通過(guò)二元載體RSA012靶向的大豆胞囊線蟲(chóng)rpt_l片段(SEQIDNO42)；來(lái)自Genbank登錄號(hào)CD750393的甜菜胞囊線蟲(chóng)EST(SEQIDNO:46)；來(lái)自Genbank登錄號(hào)EE269079的馬鈴薯金線蟲(chóng)EST(SEQIDNO:50)；來(lái)自Genbank登錄號(hào)EE269080的馬鈴薯金線蟲(chóng)EST(SEQIDNO:48)；和來(lái)自北方根結(jié)線蟲(chóng)EST的部分Contigl170(SEQIDNO:52)，使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=10，空位延伸罰分=0.05，空位分離罰分=8)。圖6a-m3顯示了以下的氨基酸比對(duì)來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)Genbank登錄號(hào)AAA81U6的rpn-5樣蛋白質(zhì)(SEQIDNO66)；C.briggsaeEMBL登錄號(hào)CAE60648(SEQIDNO68)；全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)rpn-5(SEQIDNO:58)；來(lái)自Genbank登錄號(hào)CA940612的大豆胞囊線蟲(chóng)EST(SEQIDNO:62)；來(lái)自Genbank登錄號(hào)CA940612的部分大豆胞囊線蟲(chóng)EST(SEQIDNO62)；通過(guò)二元載體RTP1269靶向的大豆胞囊線蟲(chóng)rpn-5片段(SEQIDNO60)；和來(lái)自Genbank登錄號(hào)EE266903的馬鈴薯金線蟲(chóng)EST(SEQIDNO:64)；使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=10，空位延伸罰分=0.05，空位分離罰分=8)。圖7a_7b顯示了以下的核苷酸比對(duì)全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)pas_l編碼區(qū)(SEQIDNO5)；在二元載體RTP1095-1中使用的合成大豆胞囊線蟲(chóng)pas-Ι片段(SEQIDNO7)；和部分的馬鈴薯金線蟲(chóng)BM355389EST(SEQIDNO:9)。用粗體表示保守基序，并列舉在圖12中。比對(duì)使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=15，空位延伸罰分=6.66，空位分離罰分=8)。圖8a-8c顯示了以下的核苷酸比對(duì)全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)tcp_l編碼區(qū)(SEQIDNO11)；和部分的甜菜胞囊線蟲(chóng)CF100567EST(SEQIDNO:15)。用粗體表示保守基序，并列舉在圖12中。比對(duì)使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=15，空位延伸罰分=6.66，空位分離罰分=8)。圖9a_9b顯示了以下的核苷酸比對(duì)全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)prs-4編碼區(qū)(SEQIDNO104)；北方根結(jié)線蟲(chóng)Contig526的部分EST匯編(SEQIDNO35)；和南方根結(jié)線蟲(chóng)Contig2153的全長(zhǎng)EST匯編(SEQIDNO:37)。用粗體表示保守基序，并列舉在圖12中。比對(duì)使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=15，空位延伸罰分=6.66，空位分離罰分=8)。圖IOa-IOe顯示了以下的核苷酸比對(duì)全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)rpt_l編碼區(qū)(SEQIDNO39)；部分大豆胞囊線蟲(chóng)CB376265EST(SEQIDNO43)；部分甜菜胞囊線蟲(chóng)CD750393EST(SEQIDNO:45)；部分馬鈴薯金線蟲(chóng)EE269079EST(SEQIDNO:49)；部分馬鈴薯金線蟲(chóng)EE^9080EST(SEQIDNO:47)；和北方根結(jié)線蟲(chóng)Contigll70的部分EST匯編(SEQIDNO51)。用粗體表示保守基序，并列舉在圖12中。比對(duì)使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=15，空位延伸罰分=6.66，空位分離罰分=8)。圖Ila-Ilb顯示了以下的核苷酸比對(duì)全長(zhǎng)大豆胞囊線蟲(chóng)rpn-5編碼區(qū)(SEQIDNO57)；部分馬鈴薯金線蟲(chóng)ESTEE266903(SEQIDNO:63)。用粗體表示保守基序，并列舉在圖12中。比對(duì)使用VectorNTI軟件包vlO.3.0(空位開(kāi)放罰分=15，空位延伸罰分=6.66，空位分離罰分=8)。圖12顯示了從pas-l、rpn-5、tcp-l、prs-4和rpt-Ι基因中鑒別的保守核苷酸基序的表格，如圖7-11中描述的。圖13a_13j顯示了示例性的pas-Ι樣序列(圖13a，氨基酸；圖13b，核苷酸)、tcp-Ι樣序列(圖13c，氨基酸；圖13d，核苷酸)、prs-4樣序列(圖13e，氨基酸；圖13f，核苷酸)、rpt-l樣序列(圖13g，氨基酸；圖13h，核苷酸)和rpn-5樣序列(圖13i，氨基酸；圖13j，核苷酸)的全局百分比同一性。使用VectorNTI軟件包vlO.3.0根據(jù)多重比對(duì)計(jì)算百分比同一性。圖14a-141通過(guò)核苷酸位置顯示了在SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67或104中可能的多個(gè)21mer堿基。發(fā)明詳述本發(fā)明可以通過(guò)參考以下詳細(xì)描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案及本文所包含實(shí)施例而更容易地理解。除非另外說(shuō)明，本文中所用術(shù)語(yǔ)將根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的習(xí)慣用法加以理解。除了下文提供的術(shù)語(yǔ)定義外，分子生物學(xué)中常用術(shù)語(yǔ)的定義也可以在Rieger等，1991Glossaryofgenetics:classical禾口molecular，第五片反，BerlinSpringer-Verlagjf^CurrentprotocolsinMolecularBiology，F(xiàn).Μ·Ausubel等編著，CurrentProtocols，GreenePublishingAssociates，Inc.與JohnWiley&Sons，Inc.的合資企業(yè)(1998增刊)中找到。應(yīng)當(dāng)理解如本說(shuō)明書及在權(quán)利要求書中所用，“一種(a)”或“一個(gè)(an)”可以意指一個(gè)或多個(gè)，這取決于該冠詞所用的上下文。因此，對(duì)“單數(shù)細(xì)胞”的稱謂可以意指可以使用至少一個(gè)細(xì)胞。還應(yīng)當(dāng)理解本文中使用的術(shù)語(yǔ)僅僅旨在描述具體實(shí)施方案而并非意味對(duì)其限制性。在本申請(qǐng)通篇范圍內(nèi)，參考了多種出版物。全部這些出版物及這些出版物中引用的那些參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容完整地并入本申請(qǐng)作為參考，旨在更充分地描述本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的現(xiàn)狀。用于克隆、DNA分離、擴(kuò)增和純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)、用于涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切核酸酶等的酶促反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以及多種分離技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和通常使用的。一些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述在Sambrook等人，1989MolecularCloning，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,N.Y.；Maniatis等人，1982MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,N.Y.；Wu(編著)1993Meth.Enzymo1.218，部分I;Wu(編著)1979MethEnzymo1.68;Wu等人，(編著)1983Meth.Enzymo1.100禾口101；Grossman禾口Moldave(編著)1980Meth.Enzymol.65；Miller(編著)1972ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.；Old禾口Primrose,1981PrinciplesofGeneManipulation,UniversityofCaliforniaPress,Berkeley；Schleif禾口Wensink,1982PracticalMethodsinMolecularBiology;Glover(編著)1985DNACloning卷I禾口II，IRLPress,Oxford,UK；Hames禾口Higgins(編著)1985NucleicAcidHybridization,IRLPress,Oxford,UK；以及Setlow禾口Hollaender1979GeneticEngineeringPrinciplesandMethods，卷1-4，PlenumPress,NewYork。當(dāng)使用時(shí)，縮寫和命名被認(rèn)為是本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的并且在專業(yè)雜志例如本文中引用的那些專業(yè)雜志中經(jīng)常使用的。此處使用的“RNAi”或“RNA干擾”指的是雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的線蟲(chóng)中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默方法。此處使用的“dsRNA”指部分或完全雙鏈的RNA。雙鏈RNA還指短的干擾RNA(siRNA)、短干擾核酸(siNA)、微小-RNA(miRNA)等等。在RNAi方法中，將包含與靶基因的一部分基本上相同的第一鏈和與第一鏈互補(bǔ)的第二鏈的dsRNA引入線蟲(chóng)中，優(yōu)選通過(guò)浸泡且更優(yōu)選通過(guò)飼喂。在引入線蟲(chóng)以后，該靶基因特異性dsRNA被加工成較小的片段(siRNA)，接著能夠從胃腸分布到線蟲(chóng)的其他部分，導(dǎo)致具有表型的失功能突變，這種表型在一代的時(shí)間內(nèi)可能會(huì)與靶基因的部分或完全缺失產(chǎn)生的表型非常接近?；蛘撸谢蛱禺愋詃sRNA被含有RNAi加工結(jié)構(gòu)的植物細(xì)胞加工為較小的片段，并且當(dāng)植物加工的較小dsRNA被寄生線蟲(chóng)攝取時(shí)，得到失功能表型。如本文中所用，考慮到比較RNA和DNA序列時(shí)尿嘧啶替換胸腺嘧啶，用于dsRNA的術(shù)語(yǔ)“基本上相同”意指dsRNA的一條鏈的核苷酸序列與靶基因的19個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸至少約80%-90%相同，更優(yōu)選地、與靶基因的19個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸至少約90-95%相同并且最優(yōu)選與靶基因的19個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸至少約95^^96^^97^^98%或99%相同或完全相同。術(shù)語(yǔ)“靶基因的19個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸”對(duì)應(yīng)于dsRNA的雙鏈部分，其與靶基因互補(bǔ)，是靶基因的至少約19、20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500個(gè)連續(xù)堿基或至多全長(zhǎng)。如此處所用，“互補(bǔ)的”多核苷酸是那些能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)沃森-克里克互補(bǔ)規(guī)則堿基配對(duì)的多核苷酸。具體而言，嘌呤會(huì)與嘧啶堿基配對(duì)形成鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶配對(duì)(G:C)、對(duì)于DNA是腺嘌呤與胸腺嘧啶(A:T)、或?qū)τ赗NA是腺嘌呤與尿嘧啶配對(duì)(A:U)的組合?？梢岳斫饧词共煌耆パa(bǔ)兩種多核苷酸也可以互相雜交，只要各自具有與對(duì)方基本上互補(bǔ)的至少一個(gè)區(qū)域。如此處所用，“基本上互補(bǔ)”指兩個(gè)核酸序列的核苷酸至少超過(guò)80%互補(bǔ)。優(yōu)選這兩個(gè)核酸序列至少超過(guò)85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或全部核苷酸互補(bǔ)?；蛘撸盎旧匣パa(bǔ)”指兩個(gè)核酸序列能夠在高度嚴(yán)格的條件下雜交。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“基本上相同”或“對(duì)應(yīng)于”指兩個(gè)核酸序列具有至少80%的序列同一性。優(yōu)選這兩個(gè)核酸序列具有至少85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^；100%的序列同一性。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”指線性或分支的、單鏈或雙鏈的RNA或DNA或其雜合體。該術(shù)語(yǔ)還包括RNA/DNA雜合體。當(dāng)合成制備雙鏈RNA時(shí)，不常見(jiàn)的堿基(例如肌酐、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤及其他)也可用于反義RNA、雙鏈RNA和核酶配對(duì)。例如含有尿苷和胞苷的C-5丙炔類似物的多核苷酸已表明能以高親和力結(jié)合RNA并作為基因表達(dá)的有效的反義抑制劑。也可以進(jìn)行其他修飾，例如對(duì)磷酸二酯骨架的修飾或?qū)NA的核糖糖基中的2’-羥基修飾。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“接觸”和“施用，，可互換使用，是指本發(fā)明的dsRNA被遞送到寄生線蟲(chóng)細(xì)胞中的過(guò)程，這是為了抑制線蟲(chóng)中的關(guān)鍵靶基因的表達(dá)。dsRNA可以以多種方式被施用，包括但不限于，直接導(dǎo)入細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi))；或細(xì)胞外導(dǎo)入腔中、胞間隙或?qū)刖€蟲(chóng)循環(huán)中；口服導(dǎo)入，dsRNA可以通過(guò)將線蟲(chóng)浸浴在包含dsRNA的溶液中來(lái)導(dǎo)入，或者dsRNA可以存在于食物源中。用于口服導(dǎo)入的方法包括直接將dsRNA與線蟲(chóng)食物混合，以及將用作食物的物種改造為表達(dá)dsRNA的改造方法，然后飼喂給待被感染的生物。例如，可以將dsRNA噴霧到植物中，或者可以將dsRNA應(yīng)用到根附近的土壤中，通過(guò)植物和/或寄生線蟲(chóng)攝取所述dsRNA，或者植物可以被遺傳改造成表達(dá)dsRNA，其量足以殺死或不利地影響一些或全部的植物所暴露的寄生線蟲(chóng)。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“控制”當(dāng)用于感染的上下文中時(shí)指感染的降低或預(yù)防。減低或預(yù)防線蟲(chóng)的感染會(huì)使植物具有對(duì)線蟲(chóng)增加的抗性；但是，這種增加的抗性并不意味著植物必須100%地抗線蟲(chóng)感染。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在抗性植物中對(duì)線蟲(chóng)感染的抗性比對(duì)線蟲(chóng)無(wú)抗性的野生型植物高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。優(yōu)選所述野生型植物是具有與線蟲(chóng)抗性增加的植物相似或更優(yōu)選相同的基因型，但是不包含針對(duì)靶基因的雙鏈RNA的植物。植物對(duì)線蟲(chóng)感染的抗性可以是由于當(dāng)暴露于對(duì)關(guān)鍵基因特異性的dsRNA時(shí)，線蟲(chóng)的死亡、不育、停止發(fā)育或移動(dòng)性受損造成的，所述雙鏈RNA特異性針對(duì)對(duì)于功能性采食部位、合胞體或巨細(xì)胞的發(fā)育或維持必須的基因。此處使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)線蟲(chóng)感染的抗性”或“具有線蟲(chóng)抗性的植物”指與野生型植物相比，植物避免線蟲(chóng)感染、殺死線蟲(chóng)或阻止、減少或停止線蟲(chóng)的發(fā)育、生長(zhǎng)或增殖的能力。這可以通過(guò)主動(dòng)過(guò)程達(dá)到，例如通過(guò)產(chǎn)出對(duì)線蟲(chóng)有害的物質(zhì)，或通過(guò)被動(dòng)過(guò)程達(dá)到，例如含有降低的線蟲(chóng)所需的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或不形成由線蟲(chóng)采食部位誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)例如合胞體或巨細(xì)胞。植物的線蟲(chóng)抗性水平可以以多種方法檢測(cè)，例如，計(jì)數(shù)能夠在植物上建立寄生的線蟲(chóng)數(shù)量，或測(cè)量線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間、雌雄線蟲(chóng)的比例，或?qū)τ诎揖€蟲(chóng)計(jì)數(shù)在感染的植物的根部或植物分析系統(tǒng)中產(chǎn)生的胞囊數(shù)量或線蟲(chóng)卵的數(shù)量。若非上下文中另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“植物”涵蓋植物發(fā)育或成熟的任何階段，以及取自任何這樣的植物的任何組織或器官(植物部分)。植物部分包括，但不限于莖、根、花、胚珠、雄蕊、種子、葉、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、花藥培養(yǎng)物、配子體、孢子體、花粉、微孢子、原生質(zhì)體、毛根培養(yǎng)物等等。本發(fā)明還包括用本發(fā)明的植物制備的種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，與植物種子的野生型變體相比，種子確實(shí)被育種為有提高的抗線蟲(chóng)感染的抗性。如此處所用，“植物細(xì)胞”包括但不限于，原生質(zhì)體、生產(chǎn)配子的細(xì)胞和再生為完整植株的細(xì)胞。植物多種組織的組織培養(yǎng)物和從這些組織培養(yǎng)物的植物再生為本領(lǐng)域所公知且已經(jīng)廣泛公開(kāi)。如此處使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指含有至少一個(gè)重組多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物細(xì)胞、愈傷組織、植物組織或植物部分。在許多情況下，重組多核苷酸的所有或部分被穩(wěn)定整合入染色體中，或是穩(wěn)定的染色體外元件，從而能夠傳遞至下一代。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“重組多核苷酸”指的是已經(jīng)由遺傳工程改變、重排或修飾的多核苷酸。其實(shí)例包括連接到或加入到異源序列的任何克隆多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“重組”并非指天然發(fā)生事件例如自發(fā)突變或通過(guò)選擇性育種導(dǎo)致的非自發(fā)誘變所導(dǎo)致的多核苷酸的改變。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“足以抑制表達(dá)的量”指足以降低從寄生線蟲(chóng)的靶基因產(chǎn)生的mRNA或蛋白質(zhì)的水平或穩(wěn)定性的dsRNA的濃度或量。如本文中使用的，“抑制表達(dá)”指靶基因的蛋白質(zhì)和/mRNA產(chǎn)物的水平的缺失或可觀察到的減少。抑制靶基因表達(dá)對(duì)寄生線蟲(chóng)可以是致死的，或者如果植物疾病與寄生線蟲(chóng)生活周期的特定階段相關(guān)，則此類抑制可以推遲或阻止進(jìn)入特定的發(fā)育步驟(例如，變態(tài))?？梢酝ㄟ^(guò)檢驗(yàn)線蟲(chóng)的外在性質(zhì)來(lái)驗(yàn)證抑制的結(jié)果(如下文實(shí)施例中所示)。根據(jù)本發(fā)明，將寄生線蟲(chóng)與dsRNA接觸，所述dsRNA特異性的抑制對(duì)線蟲(chóng)的存活、變態(tài)或繁殖關(guān)鍵性的靶基因的表達(dá)。優(yōu)選的，寄生線蟲(chóng)在進(jìn)入表達(dá)dsRNA的植物后與dsRNA接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA由轉(zhuǎn)化到受感染植物的祖先中的載體編碼。優(yōu)選的，表達(dá)所述dsRNA的核酸序列處于根特異性啟動(dòng)子、寄生線蟲(chóng)誘導(dǎo)的攝食細(xì)胞-特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。在一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是innexin-樣基因。Innexin包括一大家族的基因，認(rèn)為它們編碼無(wú)脊椎動(dòng)物的間隙連接通道-形成蛋白。這類通道形成蛋白允許在相鄰細(xì)胞之間運(yùn)輸離子和其它小分子。在秀麗隱桿線蟲(chóng)中，靶向irmexin的RNAi導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲(chóng)胚胎和幼蟲(chóng)致死。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)innexin基因家族的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)innexin-樣靶基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:1或3所述的序列，和(b)與SEQIDNO:1或3具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)irmexin-樣基因，并如SEQIDNO1所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是編碼聚合酶δ小亞基(ροδS)的基因。聚合酶S涉及DNA復(fù)制、修復(fù)和重組。小亞基是非催化性的。小亞基是催化亞基與增殖細(xì)胞核抗原的功能性相互作用和進(jìn)行的DNA合成所必需的。在秀麗隱桿線蟲(chóng)中，靶向聚合酶δ小亞基(F12F6.7)的RNAi導(dǎo)致胚胎致死。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)聚合酶δ小亞基基因的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)聚合酶δ小亞基靶基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:23或25所述的序列，和(b)與SEQIDNO:23或25具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)聚合酶S小亞基基因，并如SEQIDN0:23所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因T21B10.7(Genbank登錄號(hào)AAA9323!3)的同源物，其編碼真核細(xì)胞胞質(zhì)(“T復(fù)合體”)陪伴蛋白的假定的α亞基。該T復(fù)合體蛋白是前核-中心體旋轉(zhuǎn)、有絲分裂紡錘體的定位、減數(shù)分裂和遠(yuǎn)頂細(xì)胞遷移所必需的；也是秀麗隱桿線蟲(chóng)的能育性和存活所必需的。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)tcp-Ι靶基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:11或13所述的序列，和(b)與SEQIDNO:11或13具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)tcp-Ι樣基因，并如SEQIDNO11所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因T21B10.7(Genbank登錄號(hào)AAA93233)的同源物或序列片段基序，源自使用與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。如實(shí)施例1中公開(kāi)的，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)tcp-Ι樣基因，并如SEQIDN0:11所示。SEQIDNO:11描述的序列含有具有如SEQIDNO:12所公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。如實(shí)施例4中公開(kāi)的，使用SEQIDNO12描述的氨基酸序列鑒別同源基因的氨基酸序列。SEQIDNO:15描述了相應(yīng)的同源DNA序列。圖8a-c顯示了鑒別的SEQIDNO15所述同源物與SEQIDNO11的DNA序列比對(duì)。在圖8a-c中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高序列同源性區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序F。SEQIDNO:86-91描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序F的基序序列。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)tcp-Ι靶基因的同源序列或序列片段基序包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:15所述的序列，(b)與SEQIDNO:15具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO:86、87、88、89、90或91所述的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因的同源物，其編碼蛋白酶體α亞基。蛋白酶體α亞基是26S蛋白酶體的20S蛋白酶核心顆粒的一部分。它們作用為門，通過(guò)所述門標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)入蛋白酶體進(jìn)行降解。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)pas-Ι靶基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:5或7所述的序列，和(b)與SEQIDNO:5或7具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)pas-Ι基因，并如SEQIDNO5所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因的同源物或序列片段基序，源自使用與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。如實(shí)施例1中公開(kāi)的，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)pas-Ι樣基因轉(zhuǎn)錄物，并如SEQIDN0:5所示。SEQIDNO:5描述的序列含有具有如SEQIDNO:6所公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。如實(shí)施例4中公開(kāi)的，使用SEQIDNO:6描述的氨基酸序列鑒別同源基因的氨基酸序列。SEQIDNO:9描述了相應(yīng)的同源DNA序列。圖7a_b顯示了鑒別的SEQIDNO:9所述同源物與SEQIDNO5的DNA序列比對(duì)。在圖7a_b中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高序列同源性區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序G。SEQIDNO:72-78描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序G的基序序列。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)pas-Ι靶基因的同源序列或序列片段基序包括選自以下的序列(a)SEQIDNO9所述的序列，(b)與SEQIDNO9具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO72、73、74、75、76、77或78所述的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶是寄生線蟲(chóng)snurportin-Ι樣基因。Snurportin是核輸入受體，涉及將用于剪接的m3G_加帽的UsnRNP(小核核糖核蛋白)輸入到細(xì)胞核中。在秀麗隱桿線蟲(chóng)中，靶向snurportin-1(F23F1.5)的RNAi導(dǎo)致胚胎致死。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)snurportin-Ι基因F23G1.5(Genbank登錄號(hào)AAB70323)的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)snurportin-Ι靶基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:19或21所述的序列，和(b)與SEQIDN0:19或21具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)snurportin-Ι基因，并如SEQIDNO:19所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因的同源物，其編碼蛋白酶體19S調(diào)控復(fù)合體的預(yù)測(cè)的ATP酶亞基，影響能育性和胚胎存活。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因C52E4.4(EMBL登錄號(hào)CAB01414)的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)rpt-Ι靶基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:39,41或43所述的序列，和(b)與SEQIDNO:39、41或43具有至少80%序列同一性的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)rpt-Ι樣基因，并如SEQIDNO39所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因C52E4.4(EMBL登錄號(hào)CAB01414)的同源物或序列片段基序，源自使用與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因同源的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。如實(shí)施例1中公開(kāi)的，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)rpt-Ι樣基因轉(zhuǎn)錄物，并如SEQIDNO39所示。SEQIDNO39描述的序列含有具有如SEQIDNO40所公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。如實(shí)施例4中公開(kāi)的，使用SEQIDNO40描述的氨基酸序列鑒別同源基因的氨基酸序列。SEQIDN0:45、47、49、51、53和55描述了相應(yīng)的同源DNA序列。圖lOa-e顯示了SEQIDNO:45、47、49和51描述的已鑒別的植物寄生線蟲(chóng)同源物與SEQIDNO39的DNA序列比對(duì)。在圖10a_e中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高序列同源性區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序J。SEQIDNO:94-103描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序J的基序序列。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)rpt-Ι靶基因的同源序列或序列片段基序包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:45、47、49或51所述的序列，(b)與SEQIDNO:45、47、49或51具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO:94、95、96、97、98、99、100、101、102或103所述的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶是編碼寄生線蟲(chóng)^S蛋白酶體調(diào)控亞基4(prs_4)的基因。亞基4蛋白是^S蛋白酶體的19S調(diào)控復(fù)合體的一部分，含有ATP酶結(jié)構(gòu)域。用RNAi破壞寄生線蟲(chóng)中的該基因可以導(dǎo)致蛋白酶體的潛在缺陷和死亡。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)26S蛋白酶體調(diào)控亞基4基因——基因F29G9.5,Swiss-Prot登錄號(hào)016368的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)26S蛋白酶體調(diào)控亞基4靶基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:27、29或104所述的序列，(b)與SEQIDNO:27、29或104具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO27,29或104所述的序列雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)26S蛋白酶體調(diào)控亞基4基因序列，并如SEQIDNO:104所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是寄生線蟲(chóng)^S蛋白酶體調(diào)控亞基4(prs-4)或序列片段基序，源自使用與寄生線蟲(chóng)26S蛋白酶體調(diào)控亞基4(prs-4)序列同源的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。如實(shí)施例1中公開(kāi)的，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)^S蛋白酶體調(diào)控亞基4基因序列，并如SEQIDNO:104所示。SEQIDNO:104描述的序列含有具有如SEQIDNO105所公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。如實(shí)施例4中公開(kāi)的，使用SEQIDNO:105描述的氨基酸序列鑒別同源基因的氨基酸序列。SEQIDN0:31、33、35和37描述了相應(yīng)的同源DNA序列。圖9a-b顯示了SEQIDNO35和SEQIDNO37描述的已鑒別的同源物與SEQIDNO:104的DNA序列比對(duì)。在圖9a_b中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高序列同源性區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序D。SEQIDNO:92、93、106和107描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序D的基序序列。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)prs-4靶基因的同源序列或序列片段基序包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:35或37所述的序列，(b)與SEQIDNO35或37具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(C)SEQIDNO:92、93、106或107所述的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因的同源物，其編碼蛋白酶體調(diào)控顆粒。蛋白質(zhì)是26S蛋白酶體調(diào)控復(fù)合體的一部分，含有非ATP酶結(jié)構(gòu)域。在秀麗隱桿線蟲(chóng)采食測(cè)定中的RNAi研究已顯示了胚胎致死表型。優(yōu)選的，靶基因是秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因F10G7.8(Genbank登錄號(hào)AAA81126)的同源物，且源自植物寄生線蟲(chóng)。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)rpn-5基因包括選自以下的序列(a)SEQIDNO57、59或61所述的序列，(b)與SEQIDNO:57、59或61具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:57、59或61所述的序列雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。如實(shí)施例1所示，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)rpn-5基因，并如SEQIDNO57所示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)的靶基因是寄生線蟲(chóng)rpn-5基因或序列片段基序，源自使用與寄生線蟲(chóng)rpn-5基因同源的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的DNA序列。如實(shí)施例1中公開(kāi)的，分離了全長(zhǎng)的大豆胞囊線蟲(chóng)rpn-5基因，并如SEQIDN0:57所示。SEQIDNO57描述的序列含有具有如SEQIDNO:58所公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。如實(shí)施例4中公開(kāi)的，使用SEQIDNO:58描述的氨基酸序列鑒別同源基因的氨基酸序列。SEQIDNO:63描述了相應(yīng)的同源DNA序列。圖lla-b顯示了SEQIDNO63描述的已鑒別的同源物與SEQIDNO57的DNA序列比對(duì)。在圖1la-b中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高序列同源性區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序G。SEQIDNO:79-85描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序G的基序序列。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)rpn-5靶基因的同源序列或序列片段基序包括選自以下的序列(a)SEQIDNO:63所述的序列，(b)與SEQIDNO:63具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)SEQIDNO:79、80、81、82、83、84或85所述的序列。可以使用本文提供的信息和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員已知的技術(shù)，從大豆胞囊線蟲(chóng)以外的其它寄生線蟲(chóng)中分離與發(fā)明的寄生線蟲(chóng)靶基因?qū)?yīng)的完整cDNA。例如，可以從寄生線蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中分離來(lái)自寄生線蟲(chóng)的核酸分子，所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的核苷酸序列雜交。如本文中使用的，關(guān)于DNA與DNA印跡的雜交，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指在IOXDenhart氏溶液，6XSSC,0.5%SDS和100μg/ml變性鮭精DNA中，在60°C雜交過(guò)夜。然后，在62°C下，依次在3XSSC/0.1%SDSUXSSC/0.1%SDS和最后0.IXSSC/0.1%SDS中各洗滌印跡30分鐘。亦如本文使用的，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，詞組“嚴(yán)格條件”指在65°C下，在6XSSC雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“高嚴(yán)格條件”指在IOXDenhart氏溶液，6XSSC,0.5%SDS和100μg/ml變性鮭精DNA中，在65°C雜交過(guò)夜。然后，在65°C下，依次在3XSSC/0.1%SDSUXSSC/0.1%SDS和最后0.1XSSC/0.1%SDS中各洗滌印跡30分鐘。核酸雜交的方法描述在Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284中，是本領(lǐng)域普遍已知的?？蛇x的，可以從寄生線蟲(chóng)細(xì)胞中分離mRNA，可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA?？梢曰赟EQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的合成寡核苷酸引物?？梢允褂胏DNA或可選的基因組DNA作為模板，以及合適的寡核苷酸引物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增對(duì)應(yīng)本發(fā)明的寄生線蟲(chóng)靶基因的核酸分子?？梢詫⑷绱藬U(kuò)增的核酸分子克隆到合適的載體中，并通過(guò)DNA序列分析來(lái)表征。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的irmexin-樣靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自(a)具有SEQIDNO:1或3所述的序列的多核苷酸，(b)與SEQIDNO:1或3具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDNO:1或3所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的pas-Ι靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自:(a)具有SEQID而5、7、9、72、73、74、75、76、77或78所述的序列的多核苷酸，(13)與SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77或78具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77或78所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的tcp-Ι靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自:(a)具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90或91所述的序列的多核苷酸，(b)與SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90或91具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90或91所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的snurportin-1靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自(a)具有SEQIDNO:19或21所述的序列的多核苷酸，(b)與SEQIDNO19或21具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDNO19或21所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的聚合酶δ小亞基靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自(a)具有SEQIDNO:23或25所述的序列的多核苷酸，(b)與SEQIDNO23或25具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDNO23或25所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的prs-4靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自:(a)具有SEQID而27、104、四、92、93、106或107所述的序列的多核苷酸，(13)與SEQIDNO:27、104、四、92、93、106或107具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDN0:27、104J9、92、93、106或107所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的rpt-Ι靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自(a)具有SEQIDN0:39、41、43、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103所述的序列的多核苷酸，(b)與SEQIDNO:39、41、43、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDN0:39、41、43、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA包括與植物寄生線蟲(chóng)基因組的rpn-5靶基因的一部分基本相同的第一鏈，以及與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因選自:(a)具有SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84或85所述的序列的多核苷酸，(b)與SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84或85具有至少80%序列同一性的多核苷酸，和(c)在嚴(yán)格條件下與具有SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84或85所述的序列的多核苷酸雜交的、來(lái)自寄生線蟲(chóng)的多核苷酸。如上文討論的，長(zhǎng)度大于19-個(gè)核苷酸的dsRNA片段被線蟲(chóng)和植物在胞內(nèi)切割成長(zhǎng)度為19-個(gè)核苷酸的siRNA，這些siRNA是RNAi現(xiàn)象的實(shí)際介質(zhì)。圖Ha_141的表格提出了SCNinnexin-樣基因，SEQIDNO:1;pas_l基因，SEQIDNO:5;tcp_l基因，SEQIDNO:11;snurportin-l樣基因，SEQIDNO:19；polδS基因，SEQIDNO23；prs_4基因，SEQIDNO:104;rpt-l基因，SEQIDNO:39；和rpn_5基因，SEQIDNO:57；及其各自的片段和同源物(如表格所述的SEQIDNO所示)的示例性21-mer。該表格還可用于計(jì)算19、20、22,23或M-mer，通過(guò)從各21mer中添加或減去合適數(shù)量的核苷酸。因此，本發(fā)明的dsRNA的長(zhǎng)度范圍可以從19個(gè)核苷酸至約500個(gè)連續(xù)的核苷酸，或者直至靶基因的全長(zhǎng)。發(fā)明的dsRNA可以作為miRNA實(shí)施，所述miRNA靶向寄生線蟲(chóng)靶基因中的單個(gè)位點(diǎn)?？蛇x的，發(fā)明的dsRNA具有長(zhǎng)度約19個(gè)核苷酸至約600個(gè)連續(xù)的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的dsRNA具有長(zhǎng)度約20個(gè)核苷酸至約400個(gè)連續(xù)的核苷酸，或約21個(gè)核苷酸至約300個(gè)連續(xù)的核苷酸。如本文討論的，實(shí)踐本發(fā)明不需要dsRNA和靶基因之間100%的序列同一性。優(yōu)選的，發(fā)明的dsRNA包括19個(gè)核苷酸的部分，所述部分與靶基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本相同。而包含與發(fā)明的寄生線蟲(chóng)靶基因的一部分相同的核苷酸序列的dsRNA優(yōu)選的用于抑制，發(fā)明可以耐受序列差異，所述差異可以預(yù)期是由于基因操作或合成、遺傳突變、品系多態(tài)性或進(jìn)化分歧造成的。因此，發(fā)明的dsRNA還可以涵蓋這樣的dsRNA，其包括與靶基因至少1、2或更多個(gè)核苷酸的錯(cuò)配。例如，只要獲得的序列仍然干擾寄生線蟲(chóng)靶基因的功能，則本發(fā)明中可以認(rèn)為圖Ha-141例舉的21merdsRNA序列可以含有1、2或更多個(gè)核苷酸的添加、缺失或取代?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的序列比較和比對(duì)算法(參見(jiàn)Gribskov和Devereux，SequenceAnalysisPrimer,StocktonPress，1991，和其中引用的參考文獻(xiàn))，以及通過(guò)例如使用默認(rèn)參數(shù)的BESTFIT軟件程序(例如，UniversityofWisconsinGeneticComputingGroup)執(zhí)行Smith-Waterman算法來(lái)計(jì)算核苷酸序列之間的百分比差異，優(yōu)化發(fā)明的dsRNA和寄生線蟲(chóng)靶基因之間的序列同一性。在抑制性RNA和靶基因的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸之間大于80%序列同一性、90%序列同一性或甚至100%序列同一性是優(yōu)選的。當(dāng)發(fā)明的dsRNA具有大于約21個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度時(shí)，例如從約50個(gè)核苷酸至約1000個(gè)核苷酸，在植物或寄生線蟲(chóng)細(xì)胞中，可以被隨機(jī)的切割成約21個(gè)核苷酸的dsRNA，即siRNA。切割發(fā)明的較長(zhǎng)的dsRNA將產(chǎn)生源自較長(zhǎng)的dsRNA的21merdsRNA的庫(kù)。該21merdsRNA的庫(kù)也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不論是在植物或線蟲(chóng)的胞內(nèi)產(chǎn)生的，或者使用已知的寡核苷酸合成的方法合成產(chǎn)生的。發(fā)明的siRNA具有與寄生線蟲(chóng)靶基因完整序列中19-個(gè)連續(xù)核苷酸的片段相對(duì)應(yīng)的序列。例如，源自大豆胞囊線蟲(chóng)靶基因(如SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61所述)的發(fā)明的siRNA庫(kù)可以包括多個(gè)選自這樣的寡核苷酸的RNA分子，所述寡核苷酸與圖14a-141中發(fā)現(xiàn)的SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、104、29、39、41、43、57、59或61的21mer核苷酸基本相同。相似的，發(fā)明的siRNA庫(kù)還可以實(shí)施為圖14a-141的表中所述大豆胞囊線蟲(chóng)靶基因的片段和同源物的21mer庫(kù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到siRNA可具有與靶基因至少1、2或更多個(gè)核苷酸的錯(cuò)配。此外，本發(fā)明意圖將這類錯(cuò)配包括在內(nèi)。例如，本發(fā)明認(rèn)為，圖14a-141例舉的21merdsRNA序列可含有1、2或更多個(gè)核苷酸的添加、缺失或取代，且獲得的序列仍然干擾線蟲(chóng)基因的功能。源自SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的大豆胞囊線蟲(chóng)靶基因的發(fā)明的siRNA庫(kù)還可以包括任何特定RNA分子的組合，所述RNA分子具有源自圖14a-141中所述SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、104、29、39、41、43、57、59或61的任意21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。此外，由于植物中多個(gè)專門化的Dicer產(chǎn)生siRNA通常在大小范圍在19nt至24nt(參見(jiàn)Henderson等人，2006.NatureGenetics38:721-725)，本發(fā)明的siRNA的范圍可以在19個(gè)連續(xù)的核苷酸序列至約M個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。相似的，發(fā)明的siRNA庫(kù)可以包括多個(gè)RNA分子，所述RNA分子具有源自SEQIDN0:l、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的任意19、20、21、22、23或24個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。可選的，發(fā)明的siRNA庫(kù)可以包括多個(gè)RNA分子，所述RNA分子具有源自SEQIDNO:1、3、5、7、11、13、19、21、23、25、27、104、29、39、41、43、57、59或61的任意19、20、21、22、23和/或M個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的組合。本發(fā)明的dsRNA可任選地包括在一端或兩端的單鏈突出端。優(yōu)選的，單鏈突出端在dsRNA分子的每條鏈的3’端包含至少兩個(gè)核苷酸。合成siRNA可以在二-核苷酸突出部分包含2’-脫氧胸苷(TT)或核糖尿苷(UU)。該雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過(guò)單鏈自身互補(bǔ)RNA鏈形成(即形成發(fā)夾環(huán))或兩個(gè)互補(bǔ)的RNA鏈形成。RNA雙鏈體的形成可以在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外起始。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈RNA形成發(fā)夾環(huán)時(shí)，可任選地包括內(nèi)含子(如US2003/0180945A1中所述)或核苷酸間割區(qū)，該間割區(qū)是在互補(bǔ)的RNA鏈間的序列片段以穩(wěn)定細(xì)胞中的發(fā)夾轉(zhuǎn)基因。制備各種雙鏈RNA分子的方法記載于例如WO99/53050和美國(guó)專利No.6，506，559中。RNA可以允許每個(gè)細(xì)胞輸送至少一個(gè)拷貝的量引入。更高劑量的雙鏈材料會(huì)產(chǎn)生更有效的抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的重組表達(dá)載體，其包含編碼如上所述dsRNA的核酸，其中與宿主植物細(xì)胞的野生型品種相比，該載體在宿主植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)寄生線蟲(chóng)的抗性增加。如此處所用的術(shù)語(yǔ)“載體”指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其已經(jīng)連接的另一個(gè)核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，附加的DNA片段可以連接其中。另一種類型的載體是病毒載體，其中附加的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們導(dǎo)入的宿主植物細(xì)胞中自主復(fù)制。其他載體在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合入宿主植物細(xì)胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)其有效連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在此稱為“表達(dá)載體”，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體一般是質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。但是，本發(fā)明意欲包括具有等同功能的表達(dá)載體的其他形式，例如病毒載體(例如馬鈴薯病毒X，煙草rattle病毒和雙粒病毒組)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括以適宜在宿主植物細(xì)胞中表達(dá)核酸的形式的本發(fā)明的核酸，意思是該重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子，該調(diào)節(jié)序列基于待用于表達(dá)的宿主植物細(xì)胞進(jìn)行選擇，被有效連接至待表達(dá)的核酸序列。至于重組表達(dá)載體，術(shù)語(yǔ)“有效連接”和“有效結(jié)合”可以互換，意為以允許核苷酸序列表達(dá)的方式(即，當(dāng)載體被引入宿主植物細(xì)胞中時(shí)在宿主植物細(xì)胞中表達(dá))將目的核酸序列連接到調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸信號(hào))。例如這類調(diào)節(jié)序列記載于Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)已及GruberandCrosby的MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick禾口Thompson編著，第7章，89-108,CRCPress=BocaRaton，F(xiàn)lorida中，包括其參考文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)的那些和僅僅在某些宿主細(xì)胞中或在某些情況下指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需dsRNA的表達(dá)水平等因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可引入植物宿主細(xì)胞中進(jìn)而產(chǎn)生此處所述的核酸編碼的本發(fā)明的dsRNA分子。根據(jù)本發(fā)明，重組表達(dá)載體包括有效連接到核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列，該核苷酸序列是本發(fā)明dsRNA的一條或兩條鏈的模板。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子進(jìn)一步包括在所述核酸分子任何一端側(cè)翼的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)各個(gè)DNA鏈的表達(dá)，從而產(chǎn)生雜交形成dsRNA的兩個(gè)互補(bǔ)的RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子包含在一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元中轉(zhuǎn)錄成dsRNA的兩個(gè)鏈的核苷酸序列，其中正義鏈從轉(zhuǎn)錄單元的5’端開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，反義鏈從3’端開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，其中這兩個(gè)鏈被3到500個(gè)堿基對(duì)或更多堿基對(duì)隔開(kāi)，轉(zhuǎn)錄后，該RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物自身折疊形成發(fā)夾。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物中的間隔區(qū)可以是任何DNA片段。根據(jù)本發(fā)明，所引入的多核苷酸如果合并入非染色體自主復(fù)制子中或整合入植物染色體中，會(huì)在植物細(xì)胞中穩(wěn)定保持?；蛘?，所引入的多核苷酸可以存在于染色體外非復(fù)制載體上，并瞬時(shí)表達(dá)或瞬時(shí)有活性。不管存在于染色體外非復(fù)制載體中還是整合入染色體的載體中，該多核苷酸優(yōu)選位于植物表達(dá)盒中。植物表達(dá)盒優(yōu)選含有能夠驅(qū)動(dòng)在植物細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列得到有效地連接，從而使得每個(gè)序列都能夠發(fā)揮其功能，例如通過(guò)多聚腺苷酸信號(hào)終止轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的多聚腺苷酸信號(hào)是那些來(lái)自于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)t-DNA的信號(hào)，例如已知為Ti-質(zhì)粒pTiACH5的章魚(yú)堿合成酶的基因3(Gielen等人，1984，EMBOJ.3835)或其功能等同物，還有植物中的所有其他有功能活性的終止子都適用。因?yàn)橹参锘虻谋磉_(dá)通常不在轉(zhuǎn)錄水平限制，植物表達(dá)盒優(yōu)選包含其他有效連接的序列，例如像翻譯增強(qiáng)子的序列，例如來(lái)自煙草花葉病毒的含有5’-不翻譯前導(dǎo)序列的增速驅(qū)動(dòng)序列，可增加每個(gè)RNA產(chǎn)生的多肽比例(Gallie等人，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。植物表達(dá)載體的實(shí)例包括詳細(xì)描述于下列文獻(xiàn)中的載體Becker,D.等人，1992,Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder,PlantMol.Biol.20:1195-1197；Bevan,M.W.,1984,BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；禾口TransgenicPlants第1卷，EngineeringandUtilization中的VectorsforGeneTransferinHigherPlants;Kung禾口R.Wu編著，AcademicPress,1993，S.15-38。植物基因的表達(dá)應(yīng)該有效地連接至適當(dāng)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子以時(shí)間優(yōu)先、空間優(yōu)先、細(xì)胞類型優(yōu)先和/或組織優(yōu)先方式使該基因表達(dá)。用于本發(fā)明表達(dá)盒的啟動(dòng)子包括能夠起始存在于植物根部的植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的任何啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子包括但不限于，那些能夠從植物、植物病毒和含有在植物中表達(dá)的基因的細(xì)菌(如農(nóng)桿菌和根瘤菌)中得到的啟動(dòng)子。優(yōu)選本發(fā)明的表達(dá)盒包括根特異性啟動(dòng)子、病原體可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或線蟲(chóng)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。更優(yōu)選該線蟲(chóng)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是寄生線蟲(chóng)采食部位特異性啟動(dòng)子。寄生線蟲(chóng)采食部位特異性啟動(dòng)子可以對(duì)合胞體細(xì)胞或巨細(xì)胞具有特異性或?qū)@兩種細(xì)胞都具有特異性。如果一個(gè)啟動(dòng)子在其誘導(dǎo)狀態(tài)下的活性(通過(guò)其控制下產(chǎn)生的RNA量來(lái)測(cè)定)比未誘導(dǎo)狀態(tài)下的活性高至少30%、40%、50%，優(yōu)選至少60%、70%、80%、90%，更優(yōu)選至少100%、200%、300%，那么這個(gè)啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。如果一個(gè)啟動(dòng)子的活性(通過(guò)其控制下產(chǎn)生的RNA量來(lái)測(cè)定)在特定的細(xì)胞類型、組織或器官中比在同一個(gè)植物的其他細(xì)胞類型、組織中要高至少30%、40%、50%，優(yōu)選至少60%、70%、80%、90%，更優(yōu)選至少100%、200%、300%，那么這種啟動(dòng)子是細(xì)胞、組織或器官特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選所述其他的細(xì)胞類型或組織是相同植物器官(例如根)的細(xì)胞類型或組織。在器官特異性啟動(dòng)子的情況中，啟動(dòng)子活性應(yīng)該與其他植物器官中的啟動(dòng)子活性比較，例如葉、莖、花或種子。啟動(dòng)子可以是組成型的、可誘導(dǎo)的、發(fā)育階段優(yōu)先的、細(xì)胞類型優(yōu)先的、組織優(yōu)先的或器官優(yōu)先的。組成型啟動(dòng)子在大多數(shù)情況下都有活性。組成型啟動(dòng)子的非限制實(shí)例包括CaMV19S和35S啟動(dòng)子(Odell等人，1985，Nature313:810-812)、sXCaMV35S啟動(dòng)子(Kay等人，1987，kience236:1299-130工印1啟動(dòng)子、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等人，1990，PlantCell2:163-171)、擬南芥肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子(Christensen等人，1989，PlantMolec.Biol.18:675-689),pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81581-588)、玄參花斑病病毒35S啟動(dòng)子、Smas啟動(dòng)子(Velten等人，1984，EMBOJ.32723-2730)、GRP1-8啟動(dòng)子、肉桂醇脫氫酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，683，439)、來(lái)自農(nóng)桿菌屬T-DNA的啟動(dòng)子，例如甘露堿合成酶、胭脂堿合成酶和章魚(yú)堿合成酶、核酮糖磷酸氫鹽羧化酶(ssuRUBISCO)啟動(dòng)子的小亞基等。優(yōu)選在接觸寄生線蟲(chóng)的細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA的啟動(dòng)子?；蛘?，所述啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)dsRNA在遠(yuǎn)離接觸線蟲(chóng)的部位的植物組織中表達(dá)，然后該dsRNA可以由植物轉(zhuǎn)運(yùn)至下述細(xì)胞中，所述細(xì)胞在線蟲(chóng)采食部位的特定細(xì)胞中接觸寄生線蟲(chóng)，或接近線蟲(chóng)采食部位，例如合胞體細(xì)胞或巨細(xì)胞?？烧T導(dǎo)的啟動(dòng)子在特定環(huán)境條件下是有活性的，例如存在或缺乏營(yíng)養(yǎng)素或代謝產(chǎn)物、熱或冷、光照、病原體攻擊、缺氧條件等。例如，已經(jīng)表明啟動(dòng)子iTobRBTjtRPEjtPykKKGemini19和AtHMGl可以由線蟲(chóng)誘導(dǎo)(對(duì)于線蟲(chóng)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的綜述，請(qǐng)參見(jiàn)Arm.Rev.Phytopathol.(2002)40:191-219；還參見(jiàn)U.S.Pat.No.6，593，513)。優(yōu)選的線蟲(chóng)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子公開(kāi)在共同轉(zhuǎn)讓的共同未決申請(qǐng)PCT/EP2007/、PCT/EP2007/、PCT/EP2007/，和PCT/EP2008八最優(yōu)選的，具有SEQIDNO:69、70和71的線蟲(chóng)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在本發(fā)明的表達(dá)載體中使用。分離可以由線蟲(chóng)誘導(dǎo)的其他啟動(dòng)子的方法在美國(guó)專利5，589，622和5，824，876中列出。其他可以誘導(dǎo)的啟動(dòng)子包括蕓苔屬的hsp80啟動(dòng)子，其可由熱休克誘導(dǎo)；PPDK啟動(dòng)子，其由光誘導(dǎo)；煙草、擬南芥和玉蜀黍的PR-I啟動(dòng)子，其可以由病原體感染誘導(dǎo)；和Adhl啟動(dòng)子，其由缺氧和冷脅迫誘導(dǎo)。植物基因表達(dá)也可由可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子促進(jìn)(關(guān)于綜述參見(jiàn)Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)如果需要時(shí)間特異性基因表達(dá)，可化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子特別適用。這種啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例是可水楊酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)No.WO95/19443)、可四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(feitz等人，1992，PlantJ.2:397-404)和可乙醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)No.WO93/21334)。發(fā)育階段優(yōu)先的啟動(dòng)子在發(fā)育的特定階段優(yōu)先表達(dá)。組織和器官優(yōu)先的啟動(dòng)子包括那些在特定組織或器官優(yōu)先表達(dá)的啟動(dòng)子，例如葉、根、種子或木質(zhì)部。組織優(yōu)先和器官優(yōu)先啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于果實(shí)優(yōu)先、胚珠優(yōu)先、雄性組織優(yōu)先、種子優(yōu)先、珠被優(yōu)先、塊莖優(yōu)先、柄優(yōu)先、果皮優(yōu)先和葉子優(yōu)先、柱頭優(yōu)先、花粉優(yōu)先、花藥優(yōu)先、花瓣優(yōu)先、萼片優(yōu)先、花梗優(yōu)先、長(zhǎng)角果優(yōu)先、根優(yōu)先、莖優(yōu)先等等。種子優(yōu)先的啟動(dòng)子在種子發(fā)育和/或萌發(fā)時(shí)優(yōu)先表達(dá)。例如，種子優(yōu)先啟動(dòng)子可以是胚優(yōu)先、胚乳優(yōu)先和種皮優(yōu)先的。見(jiàn)Thompson等人，1989，BioEssays10:108。種子優(yōu)先的啟動(dòng)子包括但不限于纖維素合酶(eelA)、Ciml、Y-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(CZ19B1)等。其他適宜的組織優(yōu)先或器官優(yōu)先啟動(dòng)子包括但不限于油菜籽napin-基因啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5，608，152)、蠶豆(Viciafaba)USP-啟動(dòng)子(Baeumlein等人，1991，MolGenGenet.225(3):459-67)、擬南芥油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)No.WO98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)菜豆素啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5，504，200)、蕓苔屬Bce4-啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)No.WO91/13980)、或豆球蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4;Baeumlein等人，1992，PlantJournal,2(2):233-9)，以及在像玉蜀黍、大麥、小麥、黑麥、稻等單子葉植物中賦子種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。要關(guān)注的適宜啟動(dòng)子是大麥的lpt2或Iptl-基因啟動(dòng)子(PCT申請(qǐng)No.WO95/15389和PCT申請(qǐng)No.WO95/23230)，或在PCT申請(qǐng)No.WO99/16890中描述的那些啟動(dòng)子(大麥醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶谷蛋白基因、小麥的麥膠蛋白基因、小麥的谷蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麥的黑麥堿基因)。用于本發(fā)明的表達(dá)盒的其他啟動(dòng)子包括但不限于，主要葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動(dòng)子、組蛋白啟動(dòng)子、Ap3啟動(dòng)子、β-conglycin啟動(dòng)子、油菜籽蛋白啟動(dòng)子、大豆凝集素啟動(dòng)子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、22kD玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、27kD玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、g-玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、蠟質(zhì)基因(waxy)啟動(dòng)子、超甜基因(Shrunken)I啟動(dòng)子、超甜基因2啟動(dòng)子和bronze基因啟動(dòng)子、Zml3啟動(dòng)子、(美國(guó)專利號(hào)5，086，169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子(PG)(美國(guó)專利號(hào)5，412，085和5，545,546)和SGB6啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5，470，359)，以及合成的或其他天然啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明，所述表達(dá)盒包括與核苷酸序列有效連接的表達(dá)控制序列，該核苷酸序列是所述dsRNA的一條或兩條鏈的模板。該dsRNA模板包括(a)第一鏈，具有與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、104、29、35、37、39、41、43、45、47、49、51、57、59、61、63、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、106或107的19至大約400-500個(gè)或至多全長(zhǎng)的連續(xù)核苷酸基本上相同的序列；和(b)第二鏈，具有與第一鏈基本上互補(bǔ)的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子位于所述模板核苷酸序列任一端的側(cè)翼，其中所述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)各個(gè)單獨(dú)的DNA鏈的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生兩條互補(bǔ)的RNA，這兩條互補(bǔ)的RNA能夠雜交并形成所述dsRNA。在備選的實(shí)施方案中，核苷酸序列在一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元上被轉(zhuǎn)錄成dsRNA的兩條鏈，其中，正義鏈從轉(zhuǎn)錄單元的5’端轉(zhuǎn)錄，而反義鏈從3’端轉(zhuǎn)錄，其中這兩條鏈隔開(kāi)大約3大約500個(gè)堿基對(duì)，并且轉(zhuǎn)錄之后，該RNA轉(zhuǎn)錄物自身折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體含有雙向啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)兩個(gè)核酸分子的表達(dá)，由此一個(gè)核酸分子編碼與寄生線蟲(chóng)innexin-樣、pas_l、tcp_l、snurportin-1樣、polδS、prs-4、rtp-1或rpn_5靶基因的一部分基本上相同的序列，而另一個(gè)核酸分子編碼與第一鏈基本上互補(bǔ)的第二序列，并且當(dāng)兩個(gè)序列都轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠形成dsRNA。雙向啟動(dòng)子是能夠在兩個(gè)方向介導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體含有兩種啟動(dòng)子，一個(gè)介導(dǎo)與寄生線蟲(chóng)innexin-樣、pas_l、tcp-Ksnurportin-1樣、polδS、prs-4Λrtp-1或rpn-5革巴基因的一部分基本上相同的序列的轉(zhuǎn)錄，另一個(gè)啟動(dòng)子介導(dǎo)與第一鏈基本上互補(bǔ)的第二序列的轉(zhuǎn)錄，并且當(dāng)兩個(gè)序列都轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠形成dsRNA。第二啟動(dòng)子可以是不同的啟動(dòng)子。不同啟動(dòng)子指就細(xì)胞或組織特異性來(lái)說(shuō)具有不同活性，或?qū)χT如病原體、非生物脅迫或化學(xué)品等不同的誘導(dǎo)物呈現(xiàn)表達(dá)的啟動(dòng)子。例如，一個(gè)啟動(dòng)子可以是組成型的或組織特異性的，而另一個(gè)則可能是組織特異性或可被病原體誘導(dǎo)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)啟動(dòng)子介導(dǎo)與過(guò)表達(dá)innexin-樣、pas_l、tcp_l、snurportin-1樣、polδS、prs-4>rtp-1或rpn-5基因相適應(yīng)的核酸的轉(zhuǎn)錄，而另一個(gè)啟動(dòng)子介導(dǎo)互補(bǔ)核酸的組織或細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄或病原體誘導(dǎo)的表達(dá)。本發(fā)明還涉及能表達(dá)本發(fā)明的dsRNA、進(jìn)而抑制寄生線蟲(chóng)中innexin-樣、pas-1、tcp-1、snurportin-1樣、polδS、prs_4、rtp-1或rpn_5基因的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物或轉(zhuǎn)基因植物可以是諸如但不限于樹(shù)、切花(cutflowers)、觀賞植物、蔬菜或農(nóng)作物植物的任何植物。上述植物可來(lái)自選自由苜蓿屬(Medicago)、番茄屬(Lycopersicon)、蕓苔屬(Brassica)、香瓜屬(Cucumis)、^n屬(Solanum)、核桃屬(Juglans)、棉屬(Gossypium)、蘋果屬(Malus)、葡萄屬(Vitis)、金魚(yú)草屬(Antirrhinum)、楊屬(Populus)、草莓屬(Fragaria)、擬南芥屬(Arabidopsis)、云杉屬(Picea)、辣椒屬(Capsicum)、藜屬(Chenopodium)、菊屬(Dendranthema)、牽牛屬(Pharbitis)、松屬(Pinus)、豌豆屬(Pisum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zea)、小麥屬(Triticum)、黑小麥屬(Triticale)、黑麥屬(Secale)、黑麥草屬(Lolium)、大麥屬(Hordeum)、大豆屬(Glycine)、黃杉屬G^seudotsuga)、伽藍(lán)菜屬(Kalanchoe)、甜菜屬(Beta)、向日葵屬(Helianthus)、煙草屬(Nicotiana)、南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、草莓屬、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬、驢食草屬(Onobrychis)、車軸草屬(trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、蘿卜屬(fciphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、煙草屬、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、菊苣屬(Ciahorium)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚(yú)草屬、萱草屬(Heterocallis)、水仙屬(Nemesis)、天竺葵屬(Pelargonium)、黍?qū)?Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛莨屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、喇叭舌屬(Salpiglossis)、藍(lán)英花屬(Browaalia)、菜豆屬(Phaseolus)、燕麥屬(Avena)禾口蔥屬(Allium)組成的組中的屬。所述植物可以來(lái)自選自下列屬的屬擬南芥屬、苜蓿屬、番茄屬、蕓苔屬、香瓜屬、茄屬、核桃屬、棉屬、蘋果屬、葡萄屬、金魚(yú)草屬、Brachipodium、楊屬、草莓屬、擬南芥屬、云杉屬、辣椒屬、藜屬、菊屬、牽牛屬、松屬、豌豆屬、稻屬、玉蜀黍?qū)佟⑿←湆?、黑小麥屬、黑麥屬、黑麥草屬、大麥屬、大豆屬、黃杉屬、伽藍(lán)菜屬、甜菜屬、向日葵屬、煙草屬、南瓜屬、薔薇屬、草莓屬、百脈根屬、苜蓿屬、驢食草屬、車軸草屬、胡盧巴屬、豇豆屬、橘屬、亞麻屬、老鸛草屬、木薯屬、胡蘿卜屬、蘿卜屬、白芥屬、顛茄屬、曼陀羅屬、天仙子屬、煙草屬、碧冬茄屬、毛地黃屬、墨角綸屬、菊苣屬、萵苣屬、雀麥屬、天門冬屬、金魚(yú)草屬、萱草屬、水仙屬、天竺葵屬、黍?qū)?、狼尾草屬、毛莨屬、千里光屬、喇叭舌屬、藍(lán)英花屬、菜豆屬、燕麥屬和蔥屬組成的組中的屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。優(yōu)選地，所述植物是農(nóng)作物植物。農(nóng)作物植物是用于農(nóng)業(yè)的所有植物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述植物是單子葉植物，優(yōu)選禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或鳳梨科(Bromeliaceae)植物，優(yōu)選是禾本科植物。因此，在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍?qū)佟⑿←湆?、稻屬、大麥屬、黑麥屬、燕麥屬、甘蔗?Saccharum)、高粱屬(Sorghum)、狼尾草屬、狗尾草屬(Setaria)、黍?qū)?、糝屬(Eleusine)、芒屬(Miscanthus)、短柄草屬(Brachypodium)、羊茅屬(Festuca)或黑麥草屬植物。當(dāng)植物是玉蜀黍?qū)贂r(shí)，優(yōu)選物種是玉米(Zeamays)。當(dāng)該植物是小麥屬時(shí)，優(yōu)選物種是普通小麥(Triticumaestivum)、斯佩爾特小麥(Triticumspeltae)或圓柱小麥(Triticumdurum)。當(dāng)所述植物是稻屬時(shí)，優(yōu)選物種是稻(0.sativa)0當(dāng)所述植物是大麥屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是大麥(Hordeumvulgare)。當(dāng)所述植物是黑麥屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是黑麥(kcalecereale)。當(dāng)所述植物是燕麥屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是燕麥(Avenasativa)。當(dāng)所述植物是甘蔗屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是甘蔗(Saccharumofficinarum)。當(dāng)所述植物是高粱屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是高粱(Sorghumvulgare)、高粱(Sorghumbicolor)或蘇丹草(Sorghumsudanense)。當(dāng)所述植物是狼尾草屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是御谷(Permisetumglaucum)。當(dāng)所述植物是狗尾草屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是粱(Setariaitalica)。當(dāng)所述植物是黍?qū)僦参飼r(shí)，優(yōu)選物種是野生稷(Panieummiliaceum)或柳枝稷(Panieumvirgatum)。當(dāng)所述植物是糝屬(Eleusine)植物時(shí)，優(yōu)選物種是糝子(Eleusinecoracana)。當(dāng)所述植物是芒屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是芒(Miscanthussinensis).當(dāng)所述植物是羊茅屬O^estuca)植物時(shí)，優(yōu)選物禾中是Festucaarundinaria、紫羊茅(Festucarubra)或草甸草(Festucapratensis)。當(dāng)所述植物是黑麥草屬植物時(shí)，優(yōu)選物種是黑麥草(Loliumperenne)或多花黑麥草(Loliummultiflorum)。或者，所述植物是黑小麥(Triticosecale)。作為備選方案，在一個(gè)實(shí)施方案中，植物為雙子葉植物，優(yōu)選豆科(Fabaceae)、^jp禾斗(Solanaceae)、十字花禾斗(Brassicaceae)、薬禾斗(Chenopodiaceae)、菊禾斗(Asteraceae)、錦葵禾斗(Malvaceae)、亞麻禾斗(Linacea)、大卓戈禾斗(Euphorbiaceae)、方寵花禾斗(Convolvulaceae)、薔蔽禾斗(Rosaceae)、葫聲禾斗(Cucurbitaceae)、山茶禾斗(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Merculiaceae)或柑桔科(Citrus)植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是豆科、茄科或十字花科植物。所以，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是豆科植物，優(yōu)選的屬是大豆屬、豌豆屬、落花生屬(Arachis)、鷹嘴豆屬(Cicer)、蠶豆屬(Vicia)、菜豆屬(Phaseolus)、羽扇豆屬(Lupinus)、苜猜屬(Medicago)或兵豆屬(Lens)。豆科的優(yōu)選物種是蒺藜苜蓿(M.trimcatula)、紫花苜蓿(M.sativa)、大豆、豌豆、落花生(A.hypogaea)、鷹嘴豆(C.arietinum)、蠶豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、黃習(xí)習(xí)扇豆(Lupinusluteus)、|夾卩十習(xí)習(xí)扇豆(Lupinusangustifolius)>苜蓿(Msativa)或兵豆(Lensculinaris)0更優(yōu)選是大豆、落花生和紫花苜蓿。最24優(yōu)選的物種是大豆。當(dāng)所述植物是茄科時(shí)，優(yōu)選的屬是茄屬、番茄屬、煙草屬或辣椒屬。茄科的優(yōu)選物種是馬鈴薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)(也已知為Solanumlycopersicon)、煙草(N.tabaccum)或黃燈籠辣椒(C.chinense)。更優(yōu)選的是馬鈴薯。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是十字花科，優(yōu)選屬是蕓苔屬或蘿卜屬。十字花科的優(yōu)選物種是歐洲油菜(B.napus)、甘藍(lán)(B.oleracea)、芥(B.juncea)或蕪青(B.rapa)。更優(yōu)選的物種是歐洲油菜。當(dāng)所述植物是藜科植物時(shí)，優(yōu)選屬是甜菜屬植物。且優(yōu)選物種是甜菜(B.vulgaris)。當(dāng)所述植物是菊科植物時(shí)，優(yōu)選屬是向日葵屬，優(yōu)選物種是向日葵(H.armUUS)。當(dāng)所述植物是錦葵科植物時(shí)，優(yōu)選屬是棉屬或秋葵屬。當(dāng)所述屬是棉屬時(shí)，優(yōu)選物種是陸地棉(G.hirsutum)或海島棉⑷.bartadense)。最優(yōu)選的是陸地棉。秋葵屬的優(yōu)選物種是咖啡黃葵(A.esculentus)。當(dāng)所述植物是亞麻科時(shí)，優(yōu)選屬是亞麻屬，優(yōu)選物種是亞麻(Lusitatissimum)。當(dāng)所述植物是大戟科植物時(shí)，優(yōu)選的屬木薯屬、麻風(fēng)樹(shù)屬(Jatropa)、或蓖麻屬(Iihizinus)植物。優(yōu)選物種是木薯(M.esculenta)、麻風(fēng)樹(shù)(J.curcas)或蓖麻(R.commimis)。當(dāng)所述植物是旋花科植物時(shí)，優(yōu)選屬是番薯屬，優(yōu)選物種是甘薯(L.batatas)。當(dāng)所述植物是薔薇科時(shí)，優(yōu)選屬是薔薇屬、蘋果屬、梨屬、李屬、懸鉤子屬(Rubus)、茶薦子屬(Ribes)、越橘屬(Vaccinium)或草莓屬植物。優(yōu)選物種是雜交草莓(FragariaXananassa)。當(dāng)所述植物是葫蘆科植物時(shí)，優(yōu)選是香瓜屬、西瓜屬(Citrullus)或南瓜屬(Cucurbita)植物。優(yōu)選物種是黃瓜(Cucumissativus)、西瓜(Citrulluslanatus)或西葫蘆(Cucurbitaρ印ο)。當(dāng)所述植物是山茶科時(shí)，優(yōu)選屬是山茶屬，優(yōu)選物種是山茶(C.sinensis)。當(dāng)所述植物是茜草科植物時(shí)，優(yōu)選屬是咖啡屬，優(yōu)選物種是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。當(dāng)所述植物是梧桐科時(shí)，優(yōu)選屬是可可屬(Theobroma)，優(yōu)選物種是可可樹(shù)(T.cacao)。當(dāng)所述植物是柑桔屬時(shí)，優(yōu)選物種是甜橙(C.sinensis)、檸檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)，和柑桔屬物種的雜交品種，等等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植物是大豆、馬鈴薯或玉米植物。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染包括植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法在植物生物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知。任何方法都可以用于將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞中以獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化雙子葉植物的一般方法公開(kāi)于例如美國(guó)專利號(hào)4，940，838和5，464，763等中。轉(zhuǎn)化具體雙子葉植物(例如棉花)的方法在美國(guó)專利號(hào)5，004，863,5,159，135和5，846，797中列出。大豆轉(zhuǎn)化方法于美國(guó)專利號(hào)4，992，375,5,416，011,5,569，834,5,824，877和6，384，301中列出，也可以使用EP0301749B1中的方法。轉(zhuǎn)化方法可包括直接和間接轉(zhuǎn)化法。適當(dāng)?shù)闹苯臃òň垡叶颊T導(dǎo)的DNA攝取、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(US4，536，475)、用基因槍的生物發(fā)射技術(shù)(FrommME等人，Bio/technology.8(9):833-9,1990；Gordon-Kamm等人PlantCell2:603，1990)、電穿孔、在含DNA的溶液中孵育干胚的方法和微注入法。在直接轉(zhuǎn)化法的情況下，所用質(zhì)粒不需要滿足任何特殊要求。可以使用簡(jiǎn)單的質(zhì)粒，例如PUC系列的質(zhì)粒、pBR322、M13mp系列和pACYC184等等。如果要從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生完整的植物，優(yōu)選在質(zhì)粒中有一個(gè)附加的選擇性標(biāo)記基因。直接轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)雙子葉和單子葉植物都同等適用。還可以通過(guò)利用農(nóng)桿菌(例如EP0116718)的細(xì)菌感染、利用病毒載體(EP0067553,US4,407,956,WO95/34668,WO93/03161)的病毒感染來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化或借助花粉轉(zhuǎn)化(EP0270356；WO85/01856；US4，684，611)。農(nóng)桿菌類轉(zhuǎn)化技術(shù)(尤其是對(duì)于雙子葉植物)為本領(lǐng)域公知的技術(shù)。農(nóng)桿菌菌株(例如根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes))包括質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)和用農(nóng)桿菌感染之后轉(zhuǎn)移入植物的T-DNA元件。該T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)被整合到植物細(xì)胞的基因組中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-質(zhì)粒上，或者分開(kāi)包括在所謂的雙元載體中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法記載于例如HorschRB等人(1985)Science225:12中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適用于雙子葉植物，也已經(jīng)適用于單子葉植物。用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化記載于下列文獻(xiàn)中，例如WhiteFF,VectorsforGeneTransferinHigherPlants,TransgenicPlants,第1卷，EngineeringandUtilization,S.D.Kung禾口R.Wu編著，AcademicPress，1993，第15—38頁(yè)、JenesB等人TechniquesforGeneTransfer,TransgenicPlants,第1卷，EngineeringandUtilization,S.D.Kung禾口R.Wu編著，AcademicPress，1993，第128—143頁(yè)禾口Potrykus(1991)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolecBiol42:205-225中。轉(zhuǎn)化可能會(huì)導(dǎo)致瞬時(shí)或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。雖然本發(fā)明的核苷酸序列可以插入到屬于這些廣泛類別的任何植物和植物細(xì)胞中，但是它特別適用于農(nóng)作物植物細(xì)胞。利用植物育種中的已知方法，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以與相似的轉(zhuǎn)基因植物雜交，或與缺少本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因植物雜交，或與非轉(zhuǎn)基因植物雜交，來(lái)產(chǎn)生種子。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可包括、和/或與另一種含有一種或多種核酸的轉(zhuǎn)基因植物雜交，從而在該植物和/或其后代中形成轉(zhuǎn)基因的“垛疊”。然后種植種子來(lái)得到雜交的能育的含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因植物。該雜交能育的轉(zhuǎn)基因植物可以具有特定的通過(guò)母本或通過(guò)父本遺傳的表達(dá)盒。第二代植物可以是近交植物。雜交的能育轉(zhuǎn)基因植物可以是雜交種。本發(fā)明還包括任何這些雜交能育轉(zhuǎn)基因植物的種子。本發(fā)明種子可從能育轉(zhuǎn)基因植物收獲，并用于生長(zhǎng)包括含有所述DNA構(gòu)建體的雜交植物系的本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物的后代。“基因垛疊”也可以用植物轉(zhuǎn)化通過(guò)將兩個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中來(lái)實(shí)現(xiàn)。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中多個(gè)基因可以引入細(xì)胞核中，無(wú)論是依次引入還是一次引入。利用針對(duì)多個(gè)連鎖的部分目的序列的單次轉(zhuǎn)基因，可以通過(guò)基因沉默機(jī)制特別是RNAi下調(diào)植物中或目的病原體物種中的多個(gè)基因。在單獨(dú)啟動(dòng)子控制下的垛疊的多個(gè)基因也可以過(guò)表達(dá)，來(lái)得到所需的單個(gè)或多個(gè)表型。含有既包括過(guò)表達(dá)基因又包括沉默靶基因的基因垛疊的構(gòu)建體也可以引入植物中，獲得單個(gè)或多個(gè)農(nóng)藝學(xué)重要表型。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列可以與任何目的多核苷酸序列的組合垛疊，以形成所需的表型。這些組合可以產(chǎn)生具有多種性狀組合的植物，這些性狀包括但不限于，疾病抗性、除草劑耐受、產(chǎn)量升高、耐冷和抗旱。這些垛疊組合可以通過(guò)包括但不限于常規(guī)方法或遺傳轉(zhuǎn)化方法雜交育種植物的任何方法形成。如果通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化法垛疊所述性狀，目的多核苷酸可以以任何順序依次組合或同時(shí)組合。例如，如果要引入兩個(gè)基因，這兩個(gè)序列可以包含在分別的轉(zhuǎn)化盒中，或在同一個(gè)轉(zhuǎn)化盒中。這些序列的表達(dá)可以被同一個(gè)啟動(dòng)子或不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。根據(jù)本實(shí)施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物用包括如下步驟的方法生產(chǎn)提供寄生線蟲(chóng)innexin-樣、pas_l、tcp-Ksnurportin-1樣、polδS、prs_4、rtp-1或rpn-5革巴基因；制備具有與選擇的innexin-樣、pas_l、tcp_l、snurportin-1樣、polδS、prs_4、rtp-1或rpn-5基因的一部分基本上相同的第一區(qū)和與第一區(qū)互補(bǔ)的第二區(qū)的表達(dá)盒；將該表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入植物中；選擇表達(dá)本發(fā)明dsRNA構(gòu)建體的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的子代。對(duì)線蟲(chóng)感染的增加的抗性是希望能夠遺傳至廣泛的植物中的一般性狀。本發(fā)明可用于減少任何植物寄生線蟲(chóng)造成的農(nóng)作物破壞。優(yōu)選所述寄生線蟲(chóng)屬于誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合胞體細(xì)胞的線蟲(chóng)科。誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合胞體細(xì)胞的線蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)于長(zhǎng)針線蟲(chóng)科(Longidoridae)、毛刺線蟲(chóng)科CTrichodoridae)、異皮線蟲(chóng)科(Heteroderidae)、根結(jié)線蟲(chóng)科(Meloidogynidae)、短體線蟲(chóng)科(Pratylenchidae)或小墊刃科(Tylenchulidae)中。特別地，發(fā)現(xiàn)于異皮線蟲(chóng)科或根結(jié)線蟲(chóng)科中。所以，本發(fā)明所針對(duì)的寄生線蟲(chóng)屬于選自下列的一個(gè)或多個(gè)屬NaCCObUS、棘皮線蟲(chóng)屬(Cactodera)、長(zhǎng)形胞囊線蟲(chóng)屬(Dolichodera)、球胞囊線蟲(chóng)屬(Globodera)、胞囊線蟲(chóng)屬(Heterodera)、斑皮線蟲(chóng)屬(Punctodera)、長(zhǎng)針線蟲(chóng)屬(Longidorus)或根結(jié)線蟲(chóng)屬(Meloidogyne)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)屬于選自下組的一個(gè)或多個(gè)屬NaCCObus、棘皮線蟲(chóng)屬、長(zhǎng)形胞囊線蟲(chóng)屬、球胞囊線蟲(chóng)屬、胞囊線蟲(chóng)屬、斑皮線蟲(chóng)屬或根結(jié)線蟲(chóng)屬。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)屬于選自下組中的一個(gè)或多個(gè)屬球胞囊線蟲(chóng)屬、胞囊線蟲(chóng)屬或根結(jié)線蟲(chóng)屬。在進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)屬于選自球胞囊線蟲(chóng)屬或胞囊線蟲(chóng)屬中的一個(gè)或兩個(gè)屬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)屬于根結(jié)線蟲(chóng)屬。當(dāng)寄生線蟲(chóng)屬于球胞囊線蟲(chóng)屬時(shí)，其物種優(yōu)選選自蓍草球胞囊線蟲(chóng)(G.achilleae)、蒿球胞囊線蟲(chóng)(G.artemisiae)、枸杞球胞囊線蟲(chóng)(G.hypolysi)、G.mexicana、歐蓍草球胞囊線蟲(chóng)(G.millefolii)、喬巴特棘皮線蟲(chóng)(G.mali)、馬鈴薯白線蟲(chóng)(G.pallida)、馬鈴薯金線蟲(chóng)(G.rostochiensis)、煙草球胞囊線蟲(chóng)(G.tabacum)和弗吉亞球胞囊線蟲(chóng)(Globoderavirginiae)0在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生的球胞囊線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)包括物種馬鈴薯白線蟲(chóng)、煙草球胞囊線蟲(chóng)或馬鈴薯金線蟲(chóng)中的至少一個(gè)。當(dāng)所述寄生線蟲(chóng)屬于胞囊線蟲(chóng)屬時(shí)，所述物種優(yōu)選選自燕麥胞囊線蟲(chóng)(H.avenae)、胡蘿卜胞囊線蟲(chóng)(H.carotae)、鷹嘴豆胞囊線蟲(chóng)(H.ciceri)、十字花科胞囊線蟲(chóng)(H.cruciferae)、龍爪稷胞囊線蟲(chóng)(H.delvii)、褐藻胞囊線蟲(chóng)(H.elachista)、菲氏胞囊線蟲(chóng)(H.filipjevi)、岡比亞胞囊線蟲(chóng)(H.gambiensis)、大豆胞囊線蟲(chóng)(H.Glycines)、豌豆胞囊線蟲(chóng)(H.goettingiana)、蕎麥胞囊線蟲(chóng)(H.graduni)、啤酒花胞囊(H.humuli)、大麥胞囊線蟲(chóng)OLhordecalis)、麥類胞囊線蟲(chóng)(H.Iatipons)、燕麥胞囊線蟲(chóng)(H.major)、苜蓿胞囊線蟲(chóng)OLmedicaginis)、水稻同居胞囊線蟲(chóng)(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊線蟲(chóng)(H.pakistanensis)、玫瑰胞囊線蟲(chóng)(H.rosii)、甘蔗胞囊線蟲(chóng)(H.sacchari)、甜菜胞囊線蟲(chóng)(H.schachtii)、蜀黍胞囊線蟲(chóng)(H.sorghi)、三葉草胞囊線蟲(chóng)(H.trifolii)、蕁麻胞囊線蟲(chóng)OLurticae)、木豆胞囊線蟲(chóng)(H.vigni)和玉米胞囊線蟲(chóng)(H.zeae)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生胞囊線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)包括物種大豆胞囊線蟲(chóng)、燕麥胞囊線蟲(chóng)、木豆胞囊線蟲(chóng)(H.cajani)、豌豆胞囊線蟲(chóng)、三葉草胞囊線蟲(chóng)、玉米胞囊線蟲(chóng)或甜菜胞囊線蟲(chóng)中的至少一個(gè)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲(chóng)包括大豆胞囊線蟲(chóng)或甜菜胞囊線蟲(chóng)的至少一個(gè)物種。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲(chóng)是大豆胞囊線蟲(chóng)。當(dāng)所述寄生線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)時(shí)，所述寄生線蟲(chóng)可選自高粱根結(jié)線蟲(chóng)(Macronea)、小果咖啡線蟲(chóng)(Earabica)、花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.arenaria)、甘藍(lán)根結(jié)線蟲(chóng)(M.artiellia)、短尾根結(jié)線蟲(chóng)(M.brevicauda)、山茶根結(jié)線蟲(chóng)(M.camelIiae)、奇氏根結(jié)線蟲(chóng)(M.chitwoodi)、咖啡根結(jié)線蟲(chóng)(M.cofeicola)、短小根結(jié)線蟲(chóng)(M.esigua)、禾草根結(jié)線蟲(chóng)(M.graminicola)、北方根結(jié)線蟲(chóng)(M.hapla)、南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)、印度根結(jié)線蟲(chóng)(M.indica)、海濱根結(jié)線蟲(chóng)(M.inornata)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)、林氏根結(jié)線蟲(chóng)(M.Iini)、蘋果根結(jié)線蟲(chóng)(M.mali)、小頭根結(jié)線蟲(chóng)(M.microc印hala)、小突根結(jié)線蟲(chóng)(M.microtyla)、納西根結(jié)線蟲(chóng)(M.haasi)、薩拉斯根結(jié)線蟲(chóng)(Msalasi)和花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.thamesi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲(chóng)包括以下物種至少之一爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)或奇氏根結(jié)線蟲(chóng)。下列實(shí)施例并不意味著限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，而意在作為某些實(shí)施方案的示例性描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員所想到的對(duì)這些示例性方法的任何改變都應(yīng)落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1鑒別和分離大豆胞囊線蟲(chóng)RNAi靶基因利用分離自SCNJ2階段的總RNA，使用RT-PCR分離長(zhǎng)度約400_500bp的cDNA片段，用于構(gòu)建實(shí)施例2中討論的二元載體。將PCR產(chǎn)物克隆到TOPOpCR2.1載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證插入物。使用該方法分離所有八個(gè)靶基因的基因片段。為了獲得大豆胞囊線蟲(chóng)靶基因的全長(zhǎng)cDNA，使用基于存在于多種線蟲(chóng)物種中的高保守剪接前導(dǎo)序列(SLl)的RT-PCR方法。使用Superscript—步試劑盒(Invitrogen，Carlsbad,Calif.，貨號(hào)10928-034)和引物組進(jìn)行反應(yīng)。正向引物由22-merSLl序列組成，反向引物是基因特異性的，位于之前克隆的cDNA區(qū)域中。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4-T0P0載體(Invitrogen,Carlsbad,Calif)中，并測(cè)序。使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，貨號(hào)L1500-01)擴(kuò)增3，cDNA末端。使用全RNA和GeneRacerOligodT引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生第一鏈cDNA。用GeneRacer3’引物和基因特異性正向引物實(shí)施3’RACEPCR0然后使用GeneRacer3’嵌套式引物和基因特異性正向引物進(jìn)行嵌套PCR。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4-T0P0anvitrogen，Carlsl3ad，CA)中，并測(cè)序。將八種SCN靶基因各自的全長(zhǎng)序列組裝成各自八種基因靶對(duì)應(yīng)的cDNA，命名為SEQIDN0:1、SEQIDN0:5、SEQIDNO:11、SEQIDNO:19、SEQIDNO:23,SEQIDNO:39,SEQIDNO57和SEQIDNO:104。為了評(píng)估SCN靶在體內(nèi)是否有效，使用用于八種SCN靶基因的cDNA片段制造二元載體。載體由靶(例如，大豆胞囊線蟲(chóng)tcp-Ι)的反義片段、間隔區(qū)片段、靶(例如，大豆胞囊線蟲(chóng)tcp-Ι)的正義片段和載體骨架組成。在該載體中，靶基因的dsRNA在組成型Super啟動(dòng)子(參見(jiàn)US5955，646，通過(guò)引用整合到本文中)下表達(dá)。用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記是來(lái)自擬南芥的突變的乙酰羥酸合酶(AHAS)基因，產(chǎn)生對(duì)除草劑ARSENAL(Imazapyr，BASFCorporation,FlorhamPark,NJ)的抗性。通過(guò)泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)突變AHAS的表達(dá)。使用對(duì)應(yīng)SEQIDNO3的基因片段構(gòu)建二元載體RTP1030。使用對(duì)應(yīng)SEQIDNO7的基因片段構(gòu)建二元載體RTP1095。使用對(duì)應(yīng)SEQIDNO13的基因片段構(gòu)建二元載體RSA131。使用對(duì)應(yīng)SEQIDNO:21的基因片段構(gòu)建二元載體RSA123。使用對(duì)應(yīng)SEQIDN0:25的基因片段構(gòu)建二元載體RCB987。使用對(duì)應(yīng)SEQIDNO:29的基因片段構(gòu)建二元載體RTPl169。使用對(duì)應(yīng)SEQIDNO:41的基因片段構(gòu)建二元載體RSA012。使用對(duì)應(yīng)SEQIDN0:59的基因片段構(gòu)建二元載體RTPU69。實(shí)施例3靶向大豆胞囊線蟲(chóng)靶基因的dsRNA生物測(cè)定使用生根的外植體測(cè)定證實(shí)dsRNA表達(dá)和獲得的線蟲(chóng)抗性。該測(cè)定的細(xì)節(jié)可見(jiàn)于共同未決申請(qǐng)USSN12/001，234，其內(nèi)容通過(guò)引用整合到本文中。將實(shí)施例2中描述的二元載體RTP1030、RCB987、RSA131、RTP1095、RSA123、RSAO12,RTPl169、RTP1269轉(zhuǎn)染到卸甲(disarmed)的毛根農(nóng)桿菌菌株K599中，使用含有連接幼苗處的近端的大豆子葉作為轉(zhuǎn)化的外植體。根據(jù)USSN12/001，234的方法接種和根誘導(dǎo)兩至三周后，在外植體的切斷端形成了轉(zhuǎn)化的根。從生根的外植體上切出大豆根，傳代培養(yǎng)，在傳代培養(yǎng)1-5天后，在多孔板中用表面滅菌的SCNJ2幼體(juvenile)接種根，用于目標(biāo)基因構(gòu)建體測(cè)定。作為對(duì)照，使用大豆栽培種Williams82對(duì)照載體和Jack對(duì)照載體根。在接種線蟲(chóng)4周后，計(jì)算各個(gè)孔中的孢囊。構(gòu)建體RTP1030、RCB987、RSA131、RTP1095、RSA123、RSA012、RTP1169和RTP1269的生物測(cè)定結(jié)果導(dǎo)致在多個(gè)品系中具有降低的孢囊計(jì)數(shù)，顯示在所測(cè)試的多個(gè)品系中孢囊計(jì)數(shù)降低的普遍趨勢(shì)。實(shí)施例4同源物和DNA序列基序的描述如實(shí)施例3公開(kāi)的，當(dāng)與組成型啟動(dòng)子有效連接并在大豆根中表達(dá)時(shí)，構(gòu)建體RTP1095導(dǎo)致靶向SEQIDNO5的雙鏈RNA分子的表達(dá)，并導(dǎo)致降低的孢囊計(jì)數(shù)。如實(shí)施例1中公開(kāi)，SEQIDNO5描述的假定的全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)錄序列，含有具有SEQIDNO6公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。使用SEQIDNO:6描述的氨基酸序列鑒別同源基因。鑒別和通過(guò)SEQIDNO9和SEQIDNO10描述具有分別與SEQIDNO5和SEQIDNO6同源的DNA和氨基酸序列的樣品基因。圖2顯示了已鑒別的同源物與SEQIDNO:6的氨基酸比對(duì)。圖13a顯示的矩陣表格顯示了已鑒別的同源物和SEQIDNO:6相互的氨基酸百分比同一性。圖7a-b顯示已鑒別的同源物SEQIDNO:9與SEQIDNO:5的DNA序列比對(duì)。在圖7a_b中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高同源性比對(duì)區(qū)域被標(biāo)記為基序A至基序G。SEQIDNO:72-78描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序G的基序序列。圖1顯示的矩陣表格顯示了SEQIDNO:5和已鑒別的同源物SEQIDNO9相互的DNA序列百分比同一性。如實(shí)施例3公開(kāi)的，當(dāng)與組成型啟動(dòng)子有效連接并在大豆根中表達(dá)時(shí)，構(gòu)建體RSA131導(dǎo)致靶向SEQIDNO:11的雙鏈RNA分子的表達(dá)，并導(dǎo)致降低的孢囊計(jì)數(shù)。如實(shí)施例1中公開(kāi)，SEQIDNO:11描述的假定的全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)錄序列，含有具有SEQIDN0:12公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。使用SEQIDNO:12描述的氨基酸序列鑒別同源基因。鑒別和通過(guò)SEQIDNO15-18描述具有分別與SEQIDNO:11和SEQIDNO12同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生線蟲(chóng)基因。圖3顯示了已鑒別的同源物與SEQIDNO:12的氨基酸比對(duì)。圖13c顯示的矩陣表格顯示了已鑒別的同源物和SEQIDNO:6相互的氨基酸百分比同一性。圖8a-c顯示了由SEQIDNO15描述的已鑒別的同源物與SEQIDNO:11的DNA序列比對(duì)。在圖8a-c中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高同源性比對(duì)區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序G。SEQIDNO86-91描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序F的基序序列。圖13d顯示的矩陣表格顯示了SEQIDNO11和已鑒別的同源物相互的DNA序列百分比同一性。如實(shí)施例3公開(kāi)的，當(dāng)與組成型啟動(dòng)子有效連接并在大豆根中表達(dá)時(shí)，構(gòu)建體RTPl169導(dǎo)致靶向SEQIDNO27和SEQIDNO:104的雙鏈RNA分子的表達(dá)，并導(dǎo)致降低的孢囊計(jì)數(shù)。SEQIDNO:27描述的序列是部分的DNA序列，不代表相關(guān)基因的全長(zhǎng)編碼序列。該部分的DNA序列的氨基酸序列是由SEQIDNOJ8表示的。由SEQIDN0:27描述的相關(guān)基因的假定的全長(zhǎng)序列源自使用5，和3，RACE，并由SEQIDNO:104描述。假定的全長(zhǎng)序29列的氨基酸序列由SEQIDNO:105描述。由SEQIDNO105描述的氨基酸序列用于鑒別同源基因。鑒別和通過(guò)SEQIDNO:31-38描述具有分別與SEQIDNO:104和SEQIDNO:105同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生線蟲(chóng)基因。圖4顯示了已鑒別的SEQIDNO:105同源物的氨基酸比對(duì)。圖1顯示的矩陣表格顯示了已鑒別的同源物和SEQIDNO:105相互的氨基酸百分比同一性。圖9a-b顯示了由已鑒別的同源物與SEQIDNO:104的DNA序列比對(duì)。在圖9a-b中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高同源性比對(duì)區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序D。SEQIDNO:92、93、106和107描述了對(duì)應(yīng)基序A和基序B的基序序列。圖13f顯示的矩陣表格顯示了SEQIDNO:104和已鑒別的同源物相互的DNA序列百分比同一性。如實(shí)施例3公開(kāi)的，當(dāng)與組成型啟動(dòng)子有效連接并在大豆根中表達(dá)時(shí)，構(gòu)建體RSA012導(dǎo)致靶向SEQIDNO:39的雙鏈RNA分子的表達(dá)，并導(dǎo)致降低的孢囊計(jì)數(shù)。如實(shí)施例1中公開(kāi)，SEQIDNO:39描述的假定的全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)錄序列，含有具有SEQIDNO:40公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。使用SEQIDNO:40描述的氨基酸序列鑒別同源基因。鑒別和通過(guò)SEQIDNO43-56描述具有分別與SEQIDNO39和SEQIDNO40同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生線蟲(chóng)基因。圖如-b顯示了已鑒別的同源物與SEQIDNO:40的氨基酸比對(duì)。圖13g顯示的矩陣表格顯示了已鑒別的同源物和SEQIDNO:40相互的氨基酸百分比同一性。圖lOa-e顯示了已鑒別的同源物與SEQIDNO39的DNA序列比對(duì)。在圖10a_e中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高同源性比對(duì)區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序J。SEQIDNO:94-103描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序J的基序序列。圖1顯示的矩陣表格顯示了SEQIDNO39和已鑒別的同源物相互的DNA序列百分比同一性。如實(shí)施例3公開(kāi)的，當(dāng)與組成型啟動(dòng)子有效連接并在大豆根中表達(dá)時(shí)，構(gòu)建體RTP1269導(dǎo)致靶向SEQIDNO:57的雙鏈RNA分子的表達(dá)，并導(dǎo)致降低的孢囊計(jì)數(shù)。如實(shí)施例1中公開(kāi)，SEQIDNO:57描述的假定的全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)錄序列，含有具有SEQIDNO:58公開(kāi)的氨基酸序列的可讀框。使用SEQIDNO:58描述的氨基酸序列鑒別同源基因。鑒別和通過(guò)SEQIDNO61-68描述具有分別與SEQIDNO57和SEQIDNO58同源的DNA和氨基酸序列的植物寄生線蟲(chóng)基因。圖6a-b顯示了已鑒別的同源物與SEQIDNO:58的氨基酸比對(duì)。圖13i顯示的矩陣表格顯示了已鑒別的同源物和SEQIDNO:58相互的氨基酸百分比同一性。圖lla-b顯示了已鑒別的的同源物與SEQIDNO57的DNA序列比對(duì)。在圖lla_b中，覆蓋21個(gè)或更多個(gè)核苷酸的高同源性比對(duì)區(qū)域標(biāo)記為基序A至基序G。SEQIDNO:79-85描述了對(duì)應(yīng)基序A至基序G的基序序列。圖13j顯示的矩陣表格顯示了SEQIDNO57和已鑒別的同源物相互的DNA序列百分比同一性。權(quán)利要求1.雙鏈RNA分子，其包括(a)第一鏈，具有與植物寄生線蟲(chóng)靶基因的19至約400或500個(gè)連續(xù)核苷酸基本相同的序列，所述靶基因選自寄生線蟲(chóng)的innexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(polSS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)tCp-l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。2.權(quán)利要求1的雙鏈RNA，其中第一鏈具有與靶基因的19至約400或500個(gè)連續(xù)核苷酸基本相同的序列，所述靶基因具有選自NO:1、3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、104、29、35、37、39、41、43、45、47、49、51、57、59、61、63、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、106或107的序列，和(b)第二鏈，具有與第一鏈基本互補(bǔ)的序列。3.雙鏈RNA分子的庫(kù)，其包括多種短干擾RNA分子，各包括具有長(zhǎng)度為19至M個(gè)核苷酸的雙鏈區(qū)，其中所述RNA分子源自選自以下的多核苷酸寄生線蟲(chóng)的irmexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(polSS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。4.權(quán)利要求3的雙鏈RNA分子的庫(kù)，其中RNA分子源自選自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQID而11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。5.抗寄生線蟲(chóng)感染的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物包括編碼dsRNA的核酸構(gòu)建體，所述dsRNA能夠特異性的降低下述基因的表達(dá)寄生線蟲(chóng)的innexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ροδS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼^S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，或與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物，其中dsRNA靶向選自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO:19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、29、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。7.能夠表達(dá)dsRNA分子的庫(kù)的轉(zhuǎn)基因植物，其中各dsRNA分子包括具有長(zhǎng)度為19-個(gè)核苷酸的雙鏈區(qū)，且其中RNA分子源自與選自以下基因的寄生線蟲(chóng)靶基因的一部分基本相同的多核苷酸寄生線蟲(chóng)的innexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ροδS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt_l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼^S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中dsRNA的庫(kù)靶向選自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQID而11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；⑷具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。9.產(chǎn)生能夠表達(dá)與寄生線蟲(chóng)中的靶基因基本相同的dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟(a)從寄生線蟲(chóng)的irmexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ρ01δS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt_l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因中選擇靶基因；(b)制備核酸序列，所述核酸序列包括與選定的靶基因的一部分基本相同的區(qū)域，其中核酸一旦在植物中表達(dá)就能夠形成雙鏈轉(zhuǎn)錄物；(c)用所述核酸轉(zhuǎn)化受體植物；(d)生產(chǎn)所述受體植物的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因后代；和(e)針對(duì)線蟲(chóng)抗性選擇后代。10.權(quán)利要求9的方法，其中dsRNA靶向這樣的多核苷酸，所述多核苷酸選自(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDNO:11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。11.賦予植物線蟲(chóng)抗性的方法，所述方法包括以下步驟(a)從寄生線蟲(chóng)的innexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(polSS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-Ι樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼沈5蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn-5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因中選擇靶基因；(b)制備核酸序列，所述核酸序列包括與選定的靶基因的一部分基本相同的區(qū)域，其中核酸一旦在植物中表達(dá)就能夠形成雙鏈轉(zhuǎn)錄物；(c)用所述核酸轉(zhuǎn)化受體植物；(d)生產(chǎn)所述受體植物的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因后代；和(e)針對(duì)線蟲(chóng)抗性選擇后代。12.權(quán)利要求11的方法，其中靶基因是選自以下的多核苷酸(a)具有SEQIDN0:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDN0:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQIDN0:ll、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸;(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。13.表達(dá)盒，其包括與植物寄生線蟲(chóng)靶基因的一部分基本相同的序列，所述靶基因選自寄生線蟲(chóng)的innexin-樣基因、編碼聚合酶δ小亞基(ροδS)的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)tcp-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)pas-Ι基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、寄生線蟲(chóng)的snurportin-1樣基因、與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpt_l基因同源的寄生線蟲(chóng)基因、編碼26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4(prs-4)的寄生線蟲(chóng)基因，以及與秀麗隱桿線蟲(chóng)rpn_5基因同源的寄生線蟲(chóng)基因。14.權(quán)利要求13的表達(dá)盒，其中靶基因是這樣的多核苷酸，所述多核苷酸選自(a)具有SEQIDNO:1和3所述序列的多核苷酸；(b)具有SEQIDNO:5、7、9、72、73、74、75、76、77和78所述序列的多核苷酸；(c)具有SEQID而11、13、15、86、87、88、89、90和91所述序列的多核苷酸；(d)具有SEQIDNO19和21所述序列的多核苷酸；(e)具有SEQIDNO23和25所述序列的多核苷酸；(f)具有SEQIDNO:104、27、四、35、37、92、93、106和107所述序列的多核苷酸；(g)具有SEQIDNO:39、41、43、45、47、49、51、94、95、96、97、98、99、100、101、102和103所述序列的多核苷酸；(h)包括SEQIDNO:57、59、61、63、79、80、81、82、83、84和85所述序列的多核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了能夠抑制寄生線蟲(chóng)中的關(guān)鍵基因表達(dá)的雙鏈RNA組合物和轉(zhuǎn)基因植物，以及與其相關(guān)的方法。特別地，發(fā)明涉及RNA干擾在抑制靶向關(guān)鍵的線蟲(chóng)基因表達(dá)中的用途，所述基因是線蟲(chóng)innexin-樣、pas-1、tcp-1、snurportin-1樣、polδS、prs-4、rtp-1或rpn-5基因，以及涉及產(chǎn)生具有增加的對(duì)寄生線蟲(chóng)抗性的植物。文檔編號(hào)C12N15/113GK102203260SQ200980115495公開(kāi)日2011年9月28日申請(qǐng)日期2009年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日發(fā)明者R·佩鋒,S·莫蒂卡,T·勞文斯溫菲爾德,J·麥克米蘭,B·麥克凱格申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司