專(zhuān)利名稱：抗線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)一般涉及控制植物寄生蟲(chóng)的組合物和促進(jìn)根系生長(zhǎng)的組合物，更特別涉及控制線蟲(chóng)病或促進(jìn)根系生長(zhǎng)的核酸組合物。
2.相關(guān)技術(shù) 線蟲(chóng)類(lèi)是無(wú)脊椎動(dòng)物的一個(gè)很大的群體，通常指蛔蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、線蟲(chóng)(eelworm)或線蟲(chóng)(nema)。某些線蟲(chóng)類(lèi)是植物寄生蟲(chóng)，以莖、芽、葉為食，特別是根。植物寄生線蟲(chóng)類(lèi)的一個(gè)重要的屬是根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne spp.)。這些寄生線蟲(chóng)類(lèi)感染了大范圍的重要領(lǐng)域、蔬菜、水果和觀賞植物。2001年，僅棉花一項(xiàng)，根結(jié)線蟲(chóng)就導(dǎo)致了兩億零50萬(wàn)美元的損失。
治療或預(yù)防根結(jié)線蟲(chóng)病害的已有方法包括使用化學(xué)品、殺蟲(chóng)劑和煙熏劑。播種前使用土壤煙熏劑控制根結(jié)線蟲(chóng)和其它植物寄生線非常有效。但是，大多數(shù)煙熏型殺線蟲(chóng)劑不再能夠獲得，而且也昂貴，難以適合流行條件下的應(yīng)用。
作物輪作也用于控制線蟲(chóng)病害。如果經(jīng)濟(jì)可行的話，洋蔥、胡蘿卜或萵苣與非寄主型作物如甜玉米和其它谷物輪作，能有效控制北方根結(jié)線蟲(chóng)。不幸的是，目前作物輪作對(duì)有機(jī)土壤的價(jià)值有限，因?yàn)槎鄶?shù)生長(zhǎng)的作物，包括土豆、豆類(lèi)、芹菜、萵苣、洋蔥和胡蘿卜均易感疾病。
也嘗試過(guò)用覆蓋作物控制線蟲(chóng)病害。生長(zhǎng)在主要作物之間的覆蓋作物可以提供替代的管理策略。已經(jīng)表明黑麥草、大麥、燕麥、蘇丹草、高羊茅、一年生黑麥草和小麥不是該線蟲(chóng)的宿主或者是很難寄生的宿主。但是，用覆蓋作物的耗費(fèi)高，因?yàn)楦采w作物占用了可以用來(lái)生長(zhǎng)更有價(jià)值的作物的空間。
也試圖用生物控制生物體控制作物的線蟲(chóng)病害。市場(chǎng)上可以得到的生物控制生物體制劑有限，因?yàn)樵谀苤С衷摽刂粕矬w生長(zhǎng)的區(qū)域才能應(yīng)用。況且，用一種生物體控制另一種的結(jié)果不可預(yù)測(cè)，并受到多種因素如天氣和氣候的影響。
另外，根結(jié)線蟲(chóng)(RKN)是作物由于植物寄生性線蟲(chóng)而減產(chǎn)的最主要原因。最重要的種類(lèi)(南方根結(jié)線蟲(chóng)[M.incognita]，爪哇根結(jié)線蟲(chóng)[M.javanica]，花生根結(jié)線蟲(chóng)[M.arenaria]，北方根結(jié)線蟲(chóng)[M.hapla]，馬鈴薯根結(jié)線蟲(chóng)[M.chitwoodi])有廣泛的宿主范圍，限制了非宿主輪作的選擇。雖然在各種作物中存在若干宿主抗性基因的實(shí)例，但宿主植物抗性的可用性明顯受限于大多數(shù)我們的作物缺少適當(dāng)?shù)目剐曰蜃?Roberts，P.A.1992.Journal of Nematology 24213-227)。另外，抗性還僅限于一些RKN種類(lèi)或類(lèi)群以及某些抗性基因有熱敏感性，因而不適合炎熱的產(chǎn)地。天然抗性基因的另一個(gè)局限性在于抗性的持久性，因?yàn)槌掷m(xù)暴露于抗性栽培種如根結(jié)抗性番茄后，會(huì)發(fā)展出RKN打破抗性的種群。
因此，需要控制、預(yù)防或減少植物中線蟲(chóng)病害的組合物和方法。
還有一個(gè)影響作物的問(wèn)題與根系發(fā)育差有關(guān)。植物的根系是植物的重要部分，提供了植物生存至關(guān)重要的許多功能。例如，根系為植物儲(chǔ)存養(yǎng)分，過(guò)濾毒素，幫助調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，提供吸收水和養(yǎng)料的網(wǎng)絡(luò)，并提供支撐植物和強(qiáng)化土壤的機(jī)械結(jié)構(gòu)。根系較大的植物生長(zhǎng)加快，耐逆性增加。增加或提高作物的根系生長(zhǎng)特別有利，因?yàn)樵黾痈瞪L(zhǎng)將增加作物產(chǎn)量。
在多年生作物中，增加根系生長(zhǎng)將增加再生長(zhǎng)率，增加產(chǎn)量潛能，并增加植物越冬存活的可能性。一年生作物中，增加根系大小將在變化的環(huán)境條件下確保產(chǎn)量潛能。塊根作物，增加根系生長(zhǎng)意味著更高的產(chǎn)量。
現(xiàn)有的根刺激劑通常包括肥料或植物激素，其用到植物上或植物附近的土壤中時(shí)，必須混合或配成特定濃度。過(guò)度應(yīng)用這類(lèi)刺激劑對(duì)植物有副作用，過(guò)少應(yīng)用則達(dá)不到所需的結(jié)果。另外，應(yīng)用植物激素有不想要的后果。例如，一種用作生根劑的植物激素是植物生長(zhǎng)激素(auxin)或吲哚-3-乙酸(IAA)。IAA在植物的許多活性中發(fā)揮著重要作用，包括胚發(fā)育、葉子形成、向光性、向重力性、頂端優(yōu)勢(shì)、果實(shí)發(fā)育、脫離以及生根。
因此，需要新的組合物和方法刺激或增強(qiáng)根系生長(zhǎng)或發(fā)育。
發(fā)明概述 本發(fā)明的各個(gè)方面總體提供了抑制植物寄生蟲(chóng)分泌的蛋白質(zhì)的表達(dá)的核酸構(gòu)建體。在某些方面，蛋白質(zhì)由線蟲(chóng)分泌，和任選調(diào)節(jié)植物或細(xì)胞的基因表達(dá)，巨細(xì)胞的形成，線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移，職務(wù)的細(xì)胞代謝，在植物細(xì)胞中引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或形成取食管確保線蟲(chóng)從植物形成的巨細(xì)胞中取食。一方面，提供了對(duì)線蟲(chóng)，尤其是根結(jié)線蟲(chóng)分泌的食道腺細(xì)胞蛋白質(zhì)特異的抑制性核酸。另一方面，提供了表達(dá)或含有一種或多種抑制性核酸(例如抑制性雙股或單股RNA)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物，抑制或減少線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)。
另一方面，提供了包含抑制性RNA的轉(zhuǎn)基因植物，其在3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多的線蟲(chóng)種類(lèi)中，例如RKN種類(lèi)，下調(diào)靶線蟲(chóng)寄生基因的轉(zhuǎn)錄。因此，本公開(kāi)提供了對(duì)抗多個(gè)RKN種類(lèi)導(dǎo)致的疾病的轉(zhuǎn)基因植物。
被公開(kāi)的抑制性核酸所靶向的代表性食道腺細(xì)胞蛋白包括，一種或多種由SEQ ID NOs.1、2和5-51編碼的蛋白質(zhì)。在某些方面，當(dāng)線蟲(chóng)進(jìn)入轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，以轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞為食，或與轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞產(chǎn)生物理接觸時(shí)，一種或多種抑制性核酸被遞送至寄生線蟲(chóng)上。一旦抑制性核酸被寄生的線蟲(chóng)內(nèi)化，抑制性核酸就干擾、減少或抑制靶食道腺細(xì)胞蛋白的表達(dá)，例如，通過(guò)直接或間接干擾、減少或抑制一種或多種編碼一種或多種食道腺細(xì)胞蛋白的mRNA的翻譯。
還有一個(gè)方面提供了用異源核酸轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞，所述異源核酸編碼對(duì)于一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白特異的抑制性核酸，其中異源核酸表達(dá)的量足以減少或預(yù)防線蟲(chóng)病。在一個(gè)方面，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)了抑制性核酸，并且抑制性核酸遞送到以轉(zhuǎn)基因植物為食或嘗試以轉(zhuǎn)基因植物為食的線蟲(chóng)中。通常，抑制性核酸被線蟲(chóng)內(nèi)化。示例的抑制性核酸內(nèi)化的方法包括攝取核酸或吸收核酸。
還有一個(gè)方面提供了包含抑制性核酸的轉(zhuǎn)基因植物，所述核酸對(duì)于一種或多種線蟲(chóng)寄生多肽具有特異性，其中抑制性核酸提供了對(duì)兩種或多種線蟲(chóng)種類(lèi)的抗性，例如兩種或多種根結(jié)線蟲(chóng)。
其它方面提供了刺激、促進(jìn)或增強(qiáng)植物或樹(shù)木根系生長(zhǎng)或發(fā)育的組合物。某些方面提供了編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體，其中所述蛋白或其片段當(dāng)被遞送或與植物接觸時(shí)，刺激或增強(qiáng)了根系發(fā)展。其它方面提供了含有一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段的組合物，當(dāng)與植物或植物細(xì)胞接觸時(shí)，刺激根系生長(zhǎng)。還有的其它方面提供了轉(zhuǎn)基因植物，其包含一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段、或者編碼一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段的核酸，與非轉(zhuǎn)基因植物或?qū)φ罩参锉容^，足以刺激、增強(qiáng)或促進(jìn)根系生長(zhǎng)。
代表性的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白(也稱作食道蛋白)，包括一種或多種由SEQ ID NOs.1、2和5-51編碼的蛋白或其組合。
還有另一方面提供了被編碼一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白的異源核酸轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞，其中異源性核酸表達(dá)的量足以刺激、增強(qiáng)或促進(jìn)根系生長(zhǎng)或發(fā)育。
下文伴隨附圖，提出了一種或多種實(shí)施方案的詳細(xì)資料。本公開(kāi)的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)從說(shuō)明書(shū)、附圖和權(quán)利要求將更為顯見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A顯示表達(dá)16D10 dsRNA的擬南芥(A.thaliana)接種南方根結(jié)線蟲(chóng)。注意到表達(dá)16D10 dsRNA的擬南芥的根上沒(méi)有根結(jié)病(蟲(chóng)癭)。
圖1B顯示接種南方根結(jié)線蟲(chóng)的對(duì)照植物。
圖2顯示表達(dá)16D10的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的照片，與對(duì)照植物(空載體)比較，根系生長(zhǎng)增強(qiáng)。
圖3顯示了四種轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis)T2純合株L7、L10、L11、L17與對(duì)照株(L2，L3)比較，表明根系生長(zhǎng)增強(qiáng)的柱狀圖。
圖4顯示了用16D10 dsRNA(RNA1和RNA2)處理過(guò)的根結(jié)線蟲(chóng)的二期幼蟲(chóng)的RT-PCR分析，表明在處理過(guò)的線蟲(chóng)內(nèi)，寄生基因16D10的轉(zhuǎn)錄本明顯減少。間苯二酚(Res)用于幫助刺激dsRNA的攝取。單用dsRNA或res，轉(zhuǎn)錄本沒(méi)有減少。Mi-act-內(nèi)部轉(zhuǎn)錄對(duì)照。
圖5顯示了凝膠的照片，表明RNAi涉及線蟲(chóng)中的寄生基因8H11或31H06的8H11或31H06的下調(diào)表達(dá)。
圖6顯示四種根結(jié)線蟲(chóng)用DIG標(biāo)記的16D10探針進(jìn)行的限制性內(nèi)切酶消化的基因組DNA的DNA點(diǎn)雜交。Mi，南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)；Mj，爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)；Ma，花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.arenaria)；Mh，北方根結(jié)線蟲(chóng)(M.hapla)。E，EcoRI；B，SamHI.M，80ng DIG-標(biāo)記的分子量標(biāo)記物(kb) 圖7是柱狀圖，顯示了在表達(dá)16D10 dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥上，四種線蟲(chóng)(Mi，南方根結(jié)線蟲(chóng)；Mj，爪哇根結(jié)線蟲(chóng)；Ma，花生根結(jié)線蟲(chóng)；Mh，北方根結(jié)線蟲(chóng))的繁殖(每克根上的卵)相對(duì)于對(duì)照植物減少了。
發(fā)明詳述 1.定義 在解釋本公開(kāi)的各種實(shí)施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明其應(yīng)用不受下文的說(shuō)明中文法結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)和的內(nèi)容安排的限制。其它實(shí)施方案也能以各種方式實(shí)施或進(jìn)行。同樣，也要體會(huì)本文所用的措辭和術(shù)語(yǔ)是為了敘述的目的，不應(yīng)作為限制。
貫穿本公開(kāi)文本，參考了各種出版物、專(zhuān)利和已發(fā)表的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)。在容許的情況下，這些出版物、專(zhuān)利和發(fā)表的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)文本在此以全文引作為參考全文，更完整地說(shuō)明本領(lǐng)域的狀況。除了另有說(shuō)明，本公開(kāi)文本包括屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍的植物育種、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。參見(jiàn)，例如Sambrook和Russell編著的，Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd edition(2001)；Current Protocols In Molecular Biology[(F.M.Ausubel，等eds.，(1987)]；Plant BreedingPrinciples and Prospects(Plant Breeding，VoI 1)M.D.Hayward，N.O.Bosemark，I.Romagosa；Chapman & Hall，(1993.)；Coligan，Dunn，Ploegh，Speicher和Wingfeld編著的(1995)CURRENT Protocols in Protein Science(John Wiley &Sons，Inc.)；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)PCR 2A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編著(1995)]，Harlow和Lane編著的(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，and Animal Cell Culture[R.I.Freshney，編著.(1987)]. 除非另有說(shuō)明，技術(shù)術(shù)語(yǔ)根據(jù)其常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)中普通術(shù)語(yǔ)的定義可以在下列文獻(xiàn)中找到Lewin撰寫(xiě)的Genes VII(OxfordUniversity Press出版，2000)；Kendrew等人編著的The Encyclopedia ofMolecular Biology(Wiley-Interscience.出版，1999)；Robert A.Meyers編著的Molecular Biology and Biotechnology，a Comprehensive DeskReference(VCH Publishers，Inc.出版，1995)；Ausubel等人(1987)Protocols in Molecular Biology，Green Publishing；Sambrook和Russell.(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual 3rd.edition。
為了促進(jìn)理解本公開(kāi)文本，特提供下列定義 “改變”靶基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)，意思是應(yīng)用本發(fā)明的方法后，靶基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)水平不同于其在應(yīng)用該方法前的表達(dá)水平。改變基因表達(dá)優(yōu)選意味著靶基因在植物中的表達(dá)降低了，優(yōu)選大大降低了，更優(yōu)選該基因的表達(dá)檢測(cè)不到。必需基因的表達(dá)改變，可以導(dǎo)致在植物細(xì)胞中或從其起源的植物的敲除突變表型?；蛘?，改變表達(dá)可包括植物基因的表達(dá)上調(diào)。
“反義RNA”是與靶基因mRNA具有互補(bǔ)序列的RNA鏈，并據(jù)認(rèn)為通過(guò)與靶基因mRNA結(jié)合誘導(dǎo)RNAi?！坝辛xRNA”具有與反義RNA互補(bǔ)的序列，并退火至其互補(bǔ)的反義RNA上形成siRNA。這些反義和有義RNA通常用RNA合成儀合成。在本發(fā)明中，這些DNA是用siRNA表達(dá)體系，從分別編碼反義和有義RNA的DNA(反義和有義編碼DNA)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的。
術(shù)語(yǔ)“生物樣品”指來(lái)自任何動(dòng)物的身體樣品，如哺乳動(dòng)物，舉例，人。生物樣品可以得自例如血管病、糖尿病或癌癥患者。生物樣品可以是生物體液如血清、血漿、玻璃體液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊膜液、乳汁、全血、尿液、腦脊液、唾液、痰液、淚液、汗液、粘液和組織培養(yǎng)介質(zhì)，以及組織提取物如組織勻漿、細(xì)胞提取物，或全細(xì)胞或組織。生物樣品可以是，例如，血清、血漿或尿。
用在本文中，“緩沖物”指緩沖溶液，通過(guò)其酸-堿共軛組分的作用對(duì)抗pH的改變。
當(dāng)提到表達(dá)時(shí)，“控制序列”是指在特定宿主有機(jī)體中，表達(dá)可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合原核生物的控制序列，例如，包括啟動(dòng)子、任選操縱子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多聚腺苷酸信號(hào)和增強(qiáng)子。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”指能復(fù)制或分裂的膜包圍生物學(xué)單位。
術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”指包含本發(fā)明的一或多種多核苷酸序列的重組基因分子。
用于在宿主生物體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的基因構(gòu)建體，以5′-3′方向包括啟動(dòng)子序列；編碼本文公開(kāi)的抑制性核酸的序列；和終止序列。開(kāi)放閱讀框可以按照有義或反義的方向。構(gòu)建體還可以包括可選擇的標(biāo)記基因和其它用于表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“控制元件”或“調(diào)節(jié)元件”這里可互換使用，意思是位于啟動(dòng)子序列內(nèi)部或與其鄰接，從而影響啟動(dòng)子活性的序列。控制元件可以是正和負(fù)控制元件。正控制元件需要結(jié)合調(diào)節(jié)元件，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。已知有很多這種正和負(fù)控制元件。如本文所述，在異源性控制元件加入到啟動(dòng)子，改變啟動(dòng)子活性的情況下，它們位于啟動(dòng)子序列內(nèi)部或與其鄰接，從而有助于啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的表達(dá)可操作地連接的多核苷酸序列的活性。
術(shù)語(yǔ)“異源性”指元件出現(xiàn)在它們通常不會(huì)出現(xiàn)的情況下。例如，啟動(dòng)子可以與異源性核酸序列連接，比如一個(gè)通常不與啟動(dòng)子可操作地連接的序列。當(dāng)用于本文描述啟動(dòng)子元件時(shí)，異源性指啟動(dòng)子元件與通常在天然啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的不同，可以是序列、種類(lèi)，或者是數(shù)量不同。例如，啟動(dòng)子序列中的異源性控制元件，可以是加入的不同啟動(dòng)子的控制/調(diào)節(jié)元件以增強(qiáng)啟動(dòng)子的控制，或者是相同啟動(dòng)子的附加控制元件。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同源性”分類(lèi)為“直向同源(orthologues)”和“平行同源(paralogues)”。
術(shù)語(yǔ)“宿主植物”指易患線蟲(chóng)病的植物。
本文所用的短語(yǔ)“誘導(dǎo)表達(dá)”意思是通過(guò)將含有特定基因的細(xì)胞暴露在效應(yīng)劑或誘導(dǎo)劑或相應(yīng)條件下，增加特定基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的量或速率。
“誘導(dǎo)劑”是化學(xué)或物理試劑，當(dāng)用于細(xì)胞群落時(shí)，將增加特定基因的轉(zhuǎn)錄量。它們通常是小分子，其作用對(duì)于具體的操縱子或基因群是特異性的，它們可以包括糖類(lèi)、磷酸鹽、醇、金屬離子、激素、熱、冷等。例如，異丙基(β)-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和乳糖是tadI啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑，L-阿拉伯糖是阿拉伯糖啟動(dòng)子的適用誘導(dǎo)劑。
術(shù)語(yǔ)“分離的”，用于描述本文公開(kāi)的各種組合物時(shí)，是指物質(zhì)已從其天然環(huán)境的成分中被鑒別和分離和/或回收。例如，分離的多肽或多核苷酸不再與至少一種其天然結(jié)合的成分相結(jié)合。其天然環(huán)境的污染成分是通常干擾多肽或多核苷酸的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶和其它蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。分離的物質(zhì)包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位物質(zhì)。但是，通常，分離的物質(zhì)將通過(guò)至少一個(gè)提純步驟而制備。
“分離的”核酸分子或多核苷酸是已鑒定的與至少一種污染的核酸分子分離的核酸分子，所述污染核酸分子在天然來(lái)源中通常與其結(jié)合。分離的核酸可以是，例如，不與其天然結(jié)合的所有成分相結(jié)合。分離的核酸分子在形式或裝配上與天然發(fā)現(xiàn)的不同。
″IPTG″是化合物“異丙基(β)-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”，這里用作乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑。IPTG與lac阻遏蛋白結(jié)合，在lac操縱子種產(chǎn)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致lac阻遏蛋白從乳糖操縱子上解離。由于不結(jié)合lac阻遏蛋白，可操作地連接的啟動(dòng)子被激活，下游基因被轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語(yǔ)“乳糖操縱子”指能被lac阻遏蛋白lad結(jié)合的核酸序列，如Jacob等，1961，J.MoI.Biol.，3318-356所描述。當(dāng)lac阻遏蛋白與乳糖操縱子結(jié)合時(shí)，啟動(dòng)子不激活。當(dāng)lac阻遏蛋白被誘導(dǎo)從操縱子上解離時(shí)，啟動(dòng)子激活。
術(shù)語(yǔ)“前導(dǎo)序列”指位于所關(guān)注的編碼序列上游的核酸序列。本文描述的前導(dǎo)序列含有已知用于有效結(jié)合到核糖體上的特定序列，從而對(duì)某些多核苷酸提供了更高的啟動(dòng)翻譯的效率。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”指任何歸類(lèi)為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)和牧養(yǎng)動(dòng)物，和動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的動(dòng)物或?qū)櫸飫?dòng)物，如狗、馬、貓、牛等。哺乳動(dòng)物可以是，舉例，人。
術(shù)語(yǔ)“線蟲(chóng)食道腺或線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞”指位于線蟲(chóng)的食道的三種大型的轉(zhuǎn)錄活性腺細(xì)胞，一種為背部的，兩種為側(cè)腹部的，是與植物被植物寄生線蟲(chóng)感染和寄生有關(guān)的主要的分泌(寄生蛋白)來(lái)源，所述植物寄生線蟲(chóng)為墊刃目(Tylenchida)和滑刃目(Aphelenchida)。
核酸序列或多核苷酸當(dāng)其與其他核酸序列有功能聯(lián)系時(shí)，是“可操作地連接”。例如，前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA如果被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則其與多肽的DNA可操作地連接；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序列可操作地連接；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)如果其位置能使得促進(jìn)翻譯，則與編碼序列可操作地連接。通常，“可操作地連接”意思是被連接的DNA序列是鄰近的，并且在分泌性前導(dǎo)序列的情況下，是鄰近的和在閱讀框中的。連接可以通過(guò)在便利的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則依照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸適配子(adaptor)或接頭(linker)。
術(shù)語(yǔ)“直向同源(orthologues)”指相同基因在多個(gè)物種中獨(dú)立出現(xiàn)。獨(dú)立出現(xiàn)的基因具有雖然相似但不一致的氨基酸序列，序列相似性的程度部分取決于物種從具有相同基因的共同祖先進(jìn)化的距離。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“平行同源(paralogues)”指基因在同一物種中獨(dú)立出現(xiàn)。獨(dú)立出現(xiàn)的基因具有雖然相似但不一致的氨基酸序列，序列相似性的程度部分取決于產(chǎn)生獨(dú)立出現(xiàn)的基因的基因復(fù)制事件的進(jìn)化距離。
術(shù)語(yǔ)“寄生蛋白，寄生多肽，食道多肽，或線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌多肽”指與植物的線蟲(chóng)寄生有關(guān)的主要分子；在植物寄生的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞表達(dá)、并通過(guò)其口針注射到宿主組織中介導(dǎo)植物寄生的寄生基因的產(chǎn)物。
“核酸序列一致性百分比(％)”定義為，在比對(duì)序列并在必要時(shí)引入缺口以達(dá)到最大的序列一致性百分率后，候選核酸序列的核苷酸與參比核酸序列的核苷酸相一致的百分率。為判定核酸序列一致性的百分比的目的而進(jìn)行的比對(duì)，可以用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種途徑完成，例如，用可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。測(cè)定序列比對(duì)的適用參數(shù)，包括為了實(shí)現(xiàn)與待比較序列的最大限度全長(zhǎng)比對(duì)所需的任何算法，可通過(guò)已知方法測(cè)定。
為本文的目的，給定的核酸序列C與給定的核酸序列D相一致或相對(duì)的核酸序列一致性％(或者也可表達(dá)為給定的核酸序列C與給定的核酸序列D具有或包含一致或相對(duì)的一定的核酸序列一致性％)，計(jì)算如下 100乘以W/Z的分?jǐn)?shù) 其中W是通過(guò)序列比對(duì)程序在C和D的程序比對(duì)中被評(píng)價(jià)為相同匹配的核苷酸數(shù)量，其中Z是D中核苷酸的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)了解核酸序列C的長(zhǎng)度并不等于核酸序列D的長(zhǎng)度，C與D的核酸序列一致性％并不等于D與C的核酸序列一致性％。
術(shù)語(yǔ)“植物”用的是其最寬的含義。它包括但不僅限于，任何種類(lèi)木本的、觀賞或裝飾性的、農(nóng)作物或谷物、水果或蔬菜植物、和光合綠藻(如萊因衣藻[Chlamydomonas reinhardtii])。它也指主要分化為存在于植物發(fā)育任何階段的結(jié)構(gòu)的多個(gè)植物細(xì)胞。所述結(jié)構(gòu)包括但不僅限于，水果、芽、莖、葉、花瓣等。術(shù)語(yǔ)“植物組織”包括分化和未分化的植物組織，包括存在于根、芽、葉、花粉、種子和根瘤，以及培養(yǎng)細(xì)胞(如單細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚、愈傷組織等)中的植物組織。植物組織可以是在植物(planta)中，在器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)中。術(shù)語(yǔ)“植物部分”用在本文中指植物結(jié)構(gòu)、植物器官、或植物組織。
非天然存在的植物指沒(méi)有人類(lèi)干預(yù)不會(huì)自然出現(xiàn)的植物。非天然存在的植物包括轉(zhuǎn)基因植物和以非轉(zhuǎn)基因方法如植物育種產(chǎn)生的植物。
術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”指植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是分離的單細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的形式，或者作為更高組織單位的一部分，如舉例，植物組織、植物器官或整株植物。
術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞培養(yǎng)”指植物單位的培養(yǎng)，如舉例原生質(zhì)體，細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞，植物組織、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各個(gè)發(fā)育階段的胚的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“植物材料”指葉、莖、根、花或花的各部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、合子、種子、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其它部分或產(chǎn)物。
“植物器官”指植物清楚可見(jiàn)的結(jié)構(gòu)和分化部分，如根、莖、葉、花蕾或胚。
“植物組織”指構(gòu)成結(jié)構(gòu)和功能單位的植物細(xì)胞群。包括不管是植物中或是培養(yǎng)中的任何植物組織。該術(shù)語(yǔ)包括但不僅限于，整株植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)以及構(gòu)成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的植物細(xì)胞的任何群。該術(shù)語(yǔ)結(jié)合或不結(jié)合以上列舉或者其它被本定義包含的任何特定類(lèi)型的植物組織的應(yīng)用，并沒(méi)有意欲排除任何其它類(lèi)型的植物組織。
“質(zhì)?！钡拿切?xiě)“p”前綴和/或跟著大寫(xiě)字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘哂惺惺郏梢圆皇芟拗频毓_(kāi)得到，或者能從已有質(zhì)粒依照發(fā)表的程序構(gòu)建。另外，與所述質(zhì)粒等同的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的，并且對(duì)普通技術(shù)人員而言是顯見(jiàn)的。
本文所用的“多肽”通常指具有超過(guò)大約十個(gè)氨基酸的肽和蛋白。多肽可以是“外源性的”，意味著它們是“異源性的”，即對(duì)于要用的宿主細(xì)胞是外來(lái)的，如通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的人類(lèi)多肽。
“靈長(zhǎng)類(lèi)”釋義為表示哺乳動(dòng)物一個(gè)目的任何動(dòng)物，包括人類(lèi)、猿、猴、和相關(guān)形式，如狐猴(lemurs)和跗猴(tarsiers)。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指調(diào)節(jié)性核酸序列，通常位于基因或蛋白編碼序列的上游(5’)，其與各種元件結(jié)合，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)基因或編碼蛋白的序列的表達(dá)。適合用于本公開(kāi)的構(gòu)建體中的啟動(dòng)子，在所用的植物中和宿主中的功能是表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。很多植物啟動(dòng)子是公眾所知的。其包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織-和細(xì)胞-特異的啟動(dòng)子、以及發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。示例的啟動(dòng)子和融合啟動(dòng)子描述于例如美國(guó)專(zhuān)利6,717,034中，在此全文引入作為參考。
“純化”意思是通過(guò)從組合物中除去(完全或部分)至少一種污染物，提高組合物中物質(zhì)的純度?！凹兓襟E”可以是產(chǎn)生“基本純凈”的組合物的整個(gè)提純過(guò)程的一部分。以組合物的總重量計(jì)，基本純凈的組合物含有至少約90重量％的所關(guān)注的物質(zhì)，并能含有至少約95重量％。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”或“控制元件”指控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的DNA序列?？刂苹蛘{(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括但不限于，TATA盒、操縱子、增強(qiáng)子等。控制或調(diào)節(jié)元件包括負(fù)控制元件和正控制元件。負(fù)控制元件是為了激活要除去的。已知有很多這類(lèi)負(fù)控制元件，例如操縱子/阻遏蛋白體系。例如，將IPTG與lac阻遏蛋白結(jié)合，從lac操縱子上解離，激活并許可轉(zhuǎn)錄。其它負(fù)控制元件包括大腸桿菌(E.coli)trp和λ系統(tǒng)。正控制元件是為了激活要添加的。已知有很多這類(lèi)正控制元件。
天然含有正負(fù)調(diào)節(jié)元件二者的啟動(dòng)子很罕見(jiàn)。metE啟動(dòng)子是一個(gè)例子。參見(jiàn)例如，Neidhardt，Ed.，1996，Escherishia coli and Salmonella，第二版，p1300-1309。已知的正和負(fù)控制元件的描述可以在，舉例，該參考文獻(xiàn)中找到。正和負(fù)控制元件在啟動(dòng)子內(nèi)部或鄰近啟動(dòng)子的位置安排以達(dá)到對(duì)啟動(dòng)子增加的調(diào)節(jié)是已知的，這記述在例如Escherishiacoli and Salmonella(Supra)，p1232-1245中。
小RNA分子通常是長(zhǎng)度少于200個(gè)核苷酸的單鏈或雙鏈RNA分子。這樣的分子通常少于100個(gè)核苷酸，并且長(zhǎng)度通常在10-100個(gè)核苷酸內(nèi)變化。在優(yōu)選的形式中，小RNA分子具有11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個(gè)核苷酸。小RNA包括微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNAs)。miRNA是由Dicer-like酶裂解短的莖環(huán)狀前體而生成；而siRNA是通過(guò)裂解長(zhǎng)的雙鏈RNA分子而產(chǎn)生。MiRNA是單鏈，而siRNA是雙鏈。
術(shù)語(yǔ)″siRNA″意思是小干擾RNA，其是無(wú)毒性、長(zhǎng)度短的雙鏈RNA。一般而言，只要它沒(méi)有表現(xiàn)出毒性，對(duì)siRNA的長(zhǎng)度沒(méi)有具體限制。″siRNAs″長(zhǎng)度可以是15至49bp，優(yōu)選15至35bp，更優(yōu)選21至30bp?；蛘?，要表達(dá)的siRNA的終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雙鏈RNA部分可以是，例如，長(zhǎng)度為15至49bp，優(yōu)選15至35bp，更優(yōu)選21至30bp。SiRNA的雙鏈RNA部分，其中兩條RNA鏈的配對(duì)并不限于完全配對(duì)的鏈，可以含有由于錯(cuò)配(相應(yīng)的核苷酸不互補(bǔ))、膨出(在一條鏈上缺少相應(yīng)的互補(bǔ)核苷酸)等而沒(méi)有配對(duì)的部分。可以含有不配對(duì)部分至它們不干擾siRNA形成的程度。本文用的“膨出”優(yōu)選包含1-2個(gè)不配對(duì)核苷酸，并且siRNA中兩條RNA鏈配對(duì)的雙鏈RNA區(qū)優(yōu)選含有1-7個(gè)膨出，更優(yōu)選1-5個(gè)。另外，這里用的“錯(cuò)配”包含在siRNA中兩條RNA鏈配對(duì)的雙鏈RNA區(qū)，優(yōu)選數(shù)目有1-7個(gè)，更優(yōu)選1-5個(gè)。在優(yōu)選的錯(cuò)配中，核苷酸之一為鳥(niǎo)嘌呤，另一個(gè)是尿嘧啶。這種錯(cuò)配是由于編碼有義RNA的DNA中，C至T、G至A或其混合的突變，但并不特別限于這些。另外，在本發(fā)明中，siRNA中兩條RNA鏈配對(duì)的雙鏈RNA區(qū)，可以含有膨出和錯(cuò)配二者，其總數(shù)優(yōu)選1-7，更優(yōu)選1-5。
只要siRNA由于它的RNAi作用而能沉默、減少或抑制靶基因表達(dá)，則siRNA的末端結(jié)構(gòu)可以是平頭或粘性(突出)的。粘性(突出)的末端結(jié)構(gòu)不僅限于3’突出端，也可以包括5’突出結(jié)構(gòu)，只要其能誘導(dǎo)RNAi作用。另外，突出的核苷酸的數(shù)量不限于已經(jīng)報(bào)道的2或3個(gè)，只要該突出端能誘導(dǎo)RNAi作用，可以是任何數(shù)目。例如，突出端由1-8個(gè)，優(yōu)選2-4個(gè)核苷酸組成。在此，有粘性末端結(jié)構(gòu)的siRNA的總長(zhǎng)度表示為，配對(duì)雙鏈部分和兩端含有的一對(duì)突出單鏈的長(zhǎng)度總和。例如，在有19bp雙鏈RNA部分并在兩段帶有4個(gè)核苷酸突出端的情況下，總長(zhǎng)度表示為23bp。另外，由于該突出序列對(duì)靶基因的特異性低，它并不必然與靶基因互補(bǔ)(反義)或相同(有義)。還有，只要siRNA能對(duì)靶基因保持其基因沉默作用，siRNA可以在，例如其一端的突出部分，含有低分子量RNA(可以是天然RNA分子如tRNA、rRNA或病毒RNA，或者人工RNA分子)。
另外，″siRNA″的末端結(jié)構(gòu)并不必然如上所述在兩端是截?cái)嘟Y(jié)構(gòu)，而是可以有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中雙鏈RNA一側(cè)的兩端通過(guò)接頭RNA而連接。雙鏈RNA區(qū)(莖-環(huán)部分)的長(zhǎng)度可以是，例如，15-49bp，優(yōu)選15-35bp，更優(yōu)選21-30bp長(zhǎng)。或者，作為要表達(dá)的siRNA終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雙鏈RNA區(qū)長(zhǎng)度為，例如15-49bp，優(yōu)選15-35bp，更優(yōu)選21-30bp長(zhǎng)。此外，對(duì)接頭的長(zhǎng)度沒(méi)有具體限制，只要其長(zhǎng)度不妨礙莖部分的配對(duì)。例如，為了莖部分的穩(wěn)定配對(duì)和抑制編碼該部分的DNA之間的重組，連接部分可以具有三葉草tRNA結(jié)構(gòu)。即使該接頭的長(zhǎng)度妨礙了莖部分的配對(duì)，但也可能，例如，構(gòu)建該接頭部分包括內(nèi)含子，使內(nèi)含子在前體RNA加工為成熟RNA期間被切除，從而使莖部分配對(duì)。在莖-環(huán)siRNA的情況下，沒(méi)有環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA的任一端(頭或尾)可以具有低分子量RNA。如上所述，該低分子量RNA可以是天然RNA分子如tRNA、rRNA或病毒RNA，或者人工RNA分子)。
“信號(hào)肽”指引導(dǎo)蛋白翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)的短(15-60個(gè)氨基酸長(zhǎng)度)肽鏈；通常引導(dǎo)該肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。
“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”、“轉(zhuǎn)染的”和“重組的”指宿主生物體如細(xì)菌或植物，其中引入了異源核酸分子。核酸分子可以穩(wěn)定整合在宿主的基因組中，或者核酸分子也能作為染色體外的分子存在。這樣的染色體外分子可以自我復(fù)制。應(yīng)理解轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物不僅包括了轉(zhuǎn)化過(guò)程的最后產(chǎn)物，也包括了其轉(zhuǎn)基因的后代。“非轉(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”或“非重組的”宿主指野生型生物體，如細(xì)菌或植物，其不含有異源核酸分子。
“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”指通過(guò)例如分子生物技術(shù)，在細(xì)胞內(nèi)引入了核酸分子的細(xì)胞。用在這里，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)化包括了可能將核酸分子引入所述細(xì)胞，植物或動(dòng)物細(xì)胞的所有技術(shù)，包括用病毒載體轉(zhuǎn)染、用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化、用質(zhì)粒載體、用電穿孔引入裸DNA、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、和粒子槍轟擊，并包括瞬時(shí)的以及穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”指含有通常不會(huì)在這種類(lèi)型的植物或樹(shù)木中發(fā)現(xiàn)的重組基因材料，并通過(guò)人類(lèi)的操作將其引入所述植物(或植物的親本)中的植物或樹(shù)木。因此，從通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入了重組DNA的植物細(xì)胞生長(zhǎng)而成的植物，是轉(zhuǎn)基因植物，還有含有該引入的轉(zhuǎn)基因(不管是有性產(chǎn)生或是無(wú)性產(chǎn)生)的該植物所有后代。應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因植物包括整株植物或樹(shù)木以及植物或樹(shù)木的部分，例如谷粒、種子、花、葉、根、果實(shí)、花粉、莖等。
術(shù)語(yǔ)“翻譯起始增強(qiáng)子序列”，用在這里，指能確定基因的翻譯起始部位和效率的核酸序列(參見(jiàn)，例如，McCarthy等，1990，Trends inGenetics，678-85)。翻譯起始增強(qiáng)子序列可延伸包括結(jié)合到相對(duì)于核糖體結(jié)合位點(diǎn)5’和3’方向的序列。核糖體結(jié)合位點(diǎn)定義為至少包括Shine-Dalgarno區(qū)和起始密碼子，以及之間的任何堿基。另外，翻譯起始增強(qiáng)子序列可以包括未翻譯的前導(dǎo)序列和上游順?lè)醋拥哪┒耍⑦M(jìn)而含有翻譯終止密碼子。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,840,523。
術(shù)語(yǔ)“載體”指用于把多核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的核酸分子?！拜d體”除了上述基因構(gòu)建體之外，還可以包括遺傳材料，例如，使其在一種或多種宿主細(xì)胞中復(fù)制的一種或多種核酸序列如復(fù)制起點(diǎn)、可選擇的標(biāo)記基因和其它本領(lǐng)域已知的遺傳元件(如，將遺傳材料整合在宿主細(xì)胞基因組中的序列，等)。
2.
具體實(shí)施例方式 抗線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)下調(diào)一種或多種線蟲(chóng)寄生基因來(lái)打斷線蟲(chóng)的進(jìn)食周期，是減少、預(yù)防或治療植物線蟲(chóng)病的有效方法。線蟲(chóng)寄生基因指在食道腺細(xì)胞表達(dá)、編碼從腺細(xì)胞運(yùn)送并要通過(guò)線蟲(chóng)口針釋入宿主組織的分泌蛋白的基因。特別是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，干擾線蟲(chóng)分泌的與宿主植物中專(zhuān)門(mén)的取食細(xì)胞的形成有關(guān)的蛋白的表達(dá)，是減少、處理或治療植物線蟲(chóng)病的有效方法。能夠作為目標(biāo)的(例如帶有抑制性RNA)、編碼分泌蛋白的代表性寄生基因包括，包括但不限于表2中列舉的基因，或其片段。
線蟲(chóng)病導(dǎo)致有價(jià)值的農(nóng)作物的重大損失。根結(jié)線蟲(chóng)，根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne)種類(lèi)，是在自然界最成功的寄生蟲(chóng)之一。它們寄生于各科植物的超過(guò)2000種植物，并代表著對(duì)世界范圍內(nèi)農(nóng)作物產(chǎn)量的巨大威脅。這些活體營(yíng)養(yǎng)病原體已經(jīng)發(fā)展出了與其宿主高度相關(guān)的專(zhuān)門(mén)化的和復(fù)雜的取食關(guān)系。成功的線蟲(chóng)-宿主相互作用需要來(lái)自寄生蟲(chóng)的分子信號(hào)，以直接或間接修改植物根細(xì)胞成為精制的取食細(xì)胞，稱為巨大細(xì)胞，這是線蟲(chóng)發(fā)育和繁殖所需營(yíng)養(yǎng)的唯一來(lái)源。植物-寄生線蟲(chóng)在取食時(shí)通過(guò)能伸出的中空口針釋放蛋白樣的分泌物進(jìn)入植物細(xì)胞。這些分泌物，共稱為寄生蟲(chóng)質(zhì)(parasitome)，由在大的、轉(zhuǎn)錄活性食道腺細(xì)胞表達(dá)的寄生基因編碼(Davis，E.L.，R.Allen，和R.S.Hussey.1994.Developmental expression of esophageal gland antigens and theirdetection in stylet secretions of Meloidogyne incognita.Fundam.Appl.Nematol.17255-262.；Hussey，R.S.，E.L.Davis，和T.J.Baum.2002.Secrets in secretionsgenes that control nematode parasitism of plants.Braz.J.Plant Physiol.14183-194.)。根結(jié)線蟲(chóng)類(lèi)誘發(fā)以形成巨細(xì)胞的復(fù)雜的細(xì)胞修改，是宿主根細(xì)胞基因表達(dá)改變以及被通過(guò)線蟲(chóng)口針?lè)置诘姆肿有盘?hào)所引發(fā)的表現(xiàn)型改變的結(jié)果。
一種實(shí)施方案提供了包含一種或多種抑制性RNA的植物或細(xì)胞，所述RNA對(duì)一種或多種線蟲(chóng)寄生基因的一種或多種mRNA特異。例如，本公開(kāi)提供了表達(dá)一種或多種抑制性RNA的轉(zhuǎn)基因植物，所述RNA在一種或多種抑制性RNA被線蟲(chóng)吸收或攝取時(shí)，下調(diào)線蟲(chóng)寄生基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物可以設(shè)計(jì)為表達(dá)抑制性RNA，所述RNA至少在兩種不同的線蟲(chóng)種類(lèi)中，例如，兩種不同的RKN種類(lèi)中，下調(diào)靶寄生基因的轉(zhuǎn)錄。另一種實(shí)施方案提供了含有抑制性RNA的轉(zhuǎn)基因植物，所述RNA在3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多的線蟲(chóng)種類(lèi)中，例如RKN種類(lèi)中，下調(diào)靶寄生基因的轉(zhuǎn)錄。因此，本公開(kāi)提供了對(duì)抗多種RKN種類(lèi)導(dǎo)致的疾病的轉(zhuǎn)基因植物。
另一種實(shí)施方案，提供了含有抑制性RNA的轉(zhuǎn)基因植物，所述RNA對(duì)于一種或多種線蟲(chóng)寄生基因特異，其含量能有效提供植物對(duì)抗所有的RKN種類(lèi)的抗性，例如在Jepson，S.B.1987.Identification ofroot-knot nematodes(Meloidogyne species).C.A.B.International，Oxford，United Kingdom.p1-265中提到的RKN種類(lèi)，在許可的情況下，全文引入作為參考。
另一種實(shí)施方案提供了含有或表達(dá)一種或多種抑制性核酸的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述核酸對(duì)于至少一部分編碼寄生線蟲(chóng)的一種或多種分泌性多肽的核酸是特異的。抑制性核酸通常是抑制性小RNA或微小RNA，其對(duì)編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或多肽的mRNA特異。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該體會(huì)，抑制性核酸可以是RNA、DNA或其組合。抑制性核酸可以是單鏈或多鏈，并可以是反義的或酶的。在一種實(shí)施方案中，抑制性核酸干擾、抑制或減少靶mRNA的翻譯。例如，抑制性核酸可以與靶mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)或促進(jìn)靶mRNA的降解或物理性阻止細(xì)胞翻譯機(jī)器將靶mRNA翻譯成功能蛋白。對(duì)分泌性多肽的抑制可以與對(duì)照比較，例如，不含或不表達(dá)抑制性核酸的植物或細(xì)胞?！皩?duì)照”指材料的樣品，已知其與含有本公開(kāi)的抑制性核酸的樣品在各方面都相同，只除了對(duì)照樣品不含有或不表達(dá)抑制性核酸。
術(shù)語(yǔ)“食道腺細(xì)胞蛋白或多肽”指由線蟲(chóng)寄生基因編碼的分泌性多肽。在一種實(shí)施方案中，要被下調(diào)的食道腺細(xì)胞蛋白或多肽通常是調(diào)節(jié)至少一種宿主植物基因表達(dá)的分泌蛋白。在公開(kāi)的組合物和方法中被下調(diào)的示例性線蟲(chóng)多肽，包括但不限于由SEQ ID NOs 1、2或5-51或者其片段編碼的多肽或其片段。分泌性多肽可以直接或間接增加或減少宿主基因的表達(dá)。例如，當(dāng)食道腺細(xì)胞蛋白或多肽結(jié)合到宿主植物核酸(包括基因組DNA，RNA和mRNA)上時(shí)，可發(fā)生直接調(diào)節(jié)。例如，當(dāng)多肽與一種或多種其它蛋白或因子結(jié)合，形成復(fù)合體時(shí)，可以發(fā)生間接調(diào)節(jié)。然后，該復(fù)合體可以與宿主植物核酸結(jié)合，或者促進(jìn)或者抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯。分泌蛋白的下調(diào)緩解或減少了至少一種與線蟲(chóng)病有關(guān)的癥狀。線蟲(chóng)病的示例性癥狀包括但不限于，產(chǎn)生蟲(chóng)癭、巨細(xì)胞、枯斑(lesion)、矮小(stunting)、養(yǎng)分和水分缺乏、梢枯(diebaek)、以及植物感染的線蟲(chóng)數(shù)量。轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中，線蟲(chóng)病水平的減少或抑制可以與對(duì)照植物或細(xì)胞中線蟲(chóng)病的水平相比較。在一種實(shí)施方案中，抑制性核酸減少、抑制、減輕、治療或預(yù)防了線蟲(chóng)病。
在另一種實(shí)施方案中，待下調(diào)的食道腺細(xì)胞蛋白或多肽由與巨細(xì)胞形成有關(guān)的寄生基因所編碼。在另外的實(shí)施方案中，靶寄生基因編碼涉及線蟲(chóng)通過(guò)根組織遷移的的多肽或核酸，改變細(xì)胞代謝、在受體細(xì)胞中引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、或形成能使線蟲(chóng)從巨細(xì)胞取食的取食管。另外，食道腺細(xì)胞蛋白或多肽能導(dǎo)致細(xì)胞壁改變，并可能在細(xì)胞外空間與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體相互作用，影響細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、選擇性蛋白降解、局部防御反應(yīng)以及在植物細(xì)胞核內(nèi)部調(diào)節(jié)活性。
食道腺細(xì)胞蛋白或多肽調(diào)節(jié)的植物基因?qū)嵗?，包括但不限于與已知稱為巨細(xì)胞的線蟲(chóng)專(zhuān)門(mén)取食細(xì)胞的形成有關(guān)的基因。例如，線蟲(chóng)寄生基因16D10編碼與稻草人樣(scarecrowlike)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子結(jié)合的蛋白。能被線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽調(diào)節(jié)的代表性植物基因，包括但不限于WUN1，POX，CAT，GST，Mia-1，Mia-2，Mia-3，Mia-4，CHS1-CHS3，LOX，幾丁質(zhì)酶，胰蛋白酶抑制劑，甜味誘發(fā)蛋白(Miraculin)，HMGR，TSW12，LEAU，LEMMI9，C6-19，C27-45，TASU，UBC DB#103，RPE，ISDGh，IPPP，LPPL，mUCp，內(nèi)膜蛋白，20s蛋白酶體，DAP脫羧酶，GRP，ENOD40，ATA01或其組合(Gheysen，G.and Fenoll，C.2002.Annual Review of Phytopathology 40191，許可的情況下，全文引入作為參考)。通常，植物基因直接或間接涉及根細(xì)胞生長(zhǎng)、根細(xì)胞分裂或被寄生線蟲(chóng)攝取的特定營(yíng)養(yǎng)物的產(chǎn)生?；蚩梢栽诟?xì)胞或植物的任何其它細(xì)胞中表達(dá)。
一種實(shí)施方案中，當(dāng)抑制性核酸遞送到線蟲(chóng)中時(shí)，與對(duì)照比較，線蟲(chóng)的靶分泌蛋白的表達(dá)被減少、受抑或阻斷。遞送抑制性核酸可以，舉例，由于線蟲(chóng)食用轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞而使線蟲(chóng)與抑制性核酸接觸的時(shí)候完成。線蟲(chóng)可以在取食期間攝取抑制性核酸，或者核酸可以通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸或被動(dòng)擴(kuò)散跨越線蟲(chóng)的細(xì)胞膜而運(yùn)輸。應(yīng)該理解，抑制性核酸可以與誘導(dǎo)或促進(jìn)線蟲(chóng)攝取抑制性核酸的藥劑組合或交替遞送。誘導(dǎo)劑的實(shí)例包括但不限于間苯二酚(3-羥基苯酚)。
在一種實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)抑制性核酸的量足以在抑制性核酸遞送到線蟲(chóng)中時(shí)，在線蟲(chóng)中調(diào)節(jié)線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或蛋白的表達(dá)。抑制性核酸在轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中的表達(dá)水平，可以用本領(lǐng)域已知的方法控制，例如用帶有強(qiáng)啟動(dòng)子或組成型活性啟動(dòng)子、高拷貝數(shù)載體等。植物或細(xì)胞可以是被穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
寄生線蟲(chóng)的實(shí)例包括但不限于，根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne spp.)類(lèi)的成員，也稱作根結(jié)線蟲(chóng)(root-knot nematode)。代表性的種包括但不限于花生根結(jié)線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)、馬鈴薯根結(jié)線蟲(chóng)和禾谷類(lèi)根結(jié)線蟲(chóng)(M.naasi)。
代表性的宿主植物的系統(tǒng)科包括爵床科(Acanthaceae)，槭樹(shù)科(Aceraceae)，獼猴桃科(Actinidiaceae)，龍舌蘭科(Agavaceae)，番杏科(Aizoaceae)，莧科(Amaranthaceae)，番荔枝科(Annonaceae)，傘形科(Apiaceae)，夾竹桃科(Apocynaceae)，天南星科(Araceae)，五加科(Araliaceae)，棕櫚科(Arecaceae)，馬兜鈴科(Aristolochiaceae)，鳳仙花科(Balsaminaceae)，金刀木科(Barringtoniaceae)，落葵科(Basellaceae)，小檗科(Berberidaceae)，樺木科(Betulaceae)，紫葳科(Bignoniaceae)，紅木科(Bixaceae)，木棉科(Bombacaceae)，紫草科(Boraginaceae)，黃楊科(Buxaceae)，刺果藤科(Byttneriaceae)，仙人掌科(Cactaceae)，云實(shí)科(Caesalpiniaceae)，美人蕉科(Cannaceae)，山柑科(Capparaceae)，忍冬科(Caprifoliaceae)，番木瓜科(Caricaceae)，石竹科(Caryophyllaceae)，木麻黃科(Casuarinaceae)，木麻黃科(Casuarinaceae)，衛(wèi)予科(Celastraceae)，藜科(Chenopodiaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，金粟蘭科(Chloranthaceae)，鴨跖草科(Commelinaceae)，旋花科(Convolvulaceae)，山茱萸科(Cornaceae)，榛木科(Corylaceae)，景天科(Crassulaceae)，葫蘆科(Cucurbitaceae)，柏科(Cupressaceae)，桫欏科(Cyatheaceae)，莎草科(Cyperaceae)，四數(shù)木科(Datiscaceae)，五椏果科(Dilleniaceae)，薯蕷科(Dioscoreaceae)，川續(xù)斷科(Dipsacaceae)，柿科(Ebenaceae)，杜鵑花科(Ericaceae)，大戟科(Euphorbiaceae)，蝶形花科(Fabaceae)，大風(fēng)子科(Flacourtiaceae)，荷包牡丹科(Fumariaceae)，龍膽科(Gentianaceae)，牻牛兒苗科(Geraniaceae)，苦苣苔科(Gesneriaceae)，銀杏科(Ginkgoaceae)，草海桐科(Goodeniaceae)，藤黃科(Guttiferae)，血皮草科(Haemodoraceae)，金縷梅科(Hamamelidaceae)，蝎尾蕉科(Heliconiaceae)，田基麻科(Hydrophyllaceae)，金絲桃科(Hypericaceae)，鳶尾科(Iridaceae)，胡桃科(Juglandaceae)，燈心草科(Juncaceae)，唇形科(Labiatae)，唇形科(Lamiaceae)，樟科(Lauraceae)，百合科(Liliaceae)，亞麻科(Linaceae)，半邊蓮科(Lobeliaceae)，馬錢(qián)科(Loganiaceae)，干屈菜科(Lythraceae)，木蘭科(Magnoliaceae)，金虎尾科(Malpighiaceae)，錦葵科(Malvaceae)，竹芋科(Marantaceae)，野牡丹科(Melastomataceae)，楝科(Meliaceae)，防己科(Menispermaceae)，含羞草科(Mimosaceae)，?？?Moraceae)，芭蕉科(Musaceae)，苦檻藍(lán)科(Myoporaceae)，楊梅科(Myricaceae)，肉豆蔻科(Myristicaceae)，桃金娘科(Myrtaceae)，紫茉莉科(Nyctaginaceae)，木犀科(Oleaceae)，柳葉菜科(Onagraceae)，蘭科(Orchidaceae)，Othnaceae，酢漿草科(Oxalidaceae)，芍藥科(Paeoniaceae)，露兜樹(shù)科(Pandanaceae)，罌粟科(Papaveraceae)，胡麻科(Pedaliaceae)，商陸科(Phytolaccaceae)，松科(Pinaceae)，胡椒科(Piperaceae)，海桐花科(Pittosporaceae)，車(chē)前科(Plantaginaceae)，懸鈴木科(Platanaceae)，白花丹科(Plumbaginaceae)，禾本科(Poaceae)，川薹草科(Podostemaceae)，花荵科(Polemoniaceae)，遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)，馬齒莧科(Portulacaceae)，報(bào)春花科(Primulaceae)，山龍眼科(Proteaceae)，石榴科(Punicaceae)，毛茛科(Ranunculaceae)，木犀草科(Resedaceae)，鼠李科(Rhamnaceae)，薔薇科(Rosaceae)，茜草科(Rubiaceae)，蕓香科(Rutaceae)，楊柳科(Salicaceae)，檀香科(Santalaceae)，無(wú)患子科(Sapindaceae)，瓶子草科(Sarraceniaceae)，虎耳草科(Saxifragaceae)，玄參科(Scrophulariaceae)，菝葜科(Smilacaceae)，茄科(Solanaceae)，梧桐科(Sterculiaceae)，安息香科(Styracaceae)，檉柳科(Tamaricaceae)，杉科(Taxodiaceae)，堅(jiān)果番杏科(Tetragoniaceae)，山茶科(Theaceae)，假輪葉科(Theophrastaceae)，瑞香科(Thymelaeaceae)，椴樹(shù)科(Tiliaceae)，旱金蓮科(Tropaeolaceae)，時(shí)鐘花科(Turneraceae)，香蒲科(Typhaceae)，榆科(Ulmaceae)，蕁麻科(Urticaceae)，敗醬科(Valerianaceae)，馬鞭草科(Verbenaceae)，堇菜科(Violaceae)，葡萄科(Vitaceae)，澤米蘇鐵科(Zamiaceae)，姜科(Zingiberaceae)，或蒺藜科(Zygophyllaceae)。
根結(jié)本公開(kāi)能被抑制性核酸轉(zhuǎn)染的宿主植物的通用名，包括但不限于番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆(甜瓜、西瓜等)、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類(lèi)、紫花苜蓿、煙草、柑桔、苜蓿、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本公開(kāi)包括五十種或更多種已知的根結(jié)線蟲(chóng)的任何種類(lèi)。
另一種實(shí)施方案提供了具有抑制性核酸的組合物，所述核酸對(duì)于編碼由一種或多種SEQ ID NOs.1、2或5-51或其片段或同源物的多肽的mRNA或其片段有特異性，當(dāng)遞送到線蟲(chóng)時(shí)，例如當(dāng)線蟲(chóng)以表達(dá)或含有抑制性核酸的植物或細(xì)胞為食時(shí)，核酸的量足以抑制由一種或多種SEQ ID NOs.1、2或5-51編碼的多肽或其同源片段。組合物可以含有一種或多種殺線蟲(chóng)劑、殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑或其組合。代表性的殺線蟲(chóng)劑包括但不限于三氯硝基甲烷、溴代甲烷、1，3-二氯丙烯、甲基二硫代氨基甲酸鈉、四硫代碳酸鈉；以及氨基甲酸鹽如2-甲基-2-(甲基硫代)丙醛O-甲基氨基甲?；?aldicarb)、2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃酚(benzofuranol)甲基氨基甲酸鹽(carbofuran)、甲基2-(二甲基氨基)-N-[[(甲基氨基)羰基]氧基]-2-氧代硫代乙烷亞胺(oxamyl)、2-甲基-2-(甲基磺?；?丙醛O-[(甲基氨基)羰基]肟(aldoxycarb)、0，0-二乙基O-[4-(甲基亞硫?；?苯基]硫代磷酸酯(fensulfothion)、O-乙基S.S-二丙基二硫代磷酸酯(ethoprop)、和乙基-3-甲基-4-(甲基硫代)苯基(1-甲基乙基)氨基磷酸酯(phenamiphos)。
另一種實(shí)施方案提供了含有編碼對(duì)mRNA或其片段特異性的抑制性核酸的核酸的細(xì)胞，所述核酸，其中mRNA編碼的食道腺細(xì)胞蛋白或多肽能夠直接或間接調(diào)節(jié)根細(xì)胞基因表達(dá)、線蟲(chóng)通過(guò)根組織的遷移、細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者與線蟲(chóng)從巨細(xì)胞取食的取食管的形成有關(guān)，或者至少一種與巨細(xì)胞形成有關(guān)的植物基因。另外，食管腺細(xì)胞蛋白或多肽或食道多肽能導(dǎo)致細(xì)胞壁改變，并與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體在細(xì)胞外間隙中可能相互作用，影響細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、選擇性蛋白降解、局部防御反應(yīng)以及調(diào)節(jié)植物細(xì)胞核內(nèi)部活性。該細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞，并且通常是植物細(xì)胞，尤其是根細(xì)胞。
另一種實(shí)施方案提供了為植物提供線蟲(chóng)抗性的方法，是將植物與對(duì)于一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白特異的一種或多種抑制性核酸接觸，所述核酸的量足以減少線蟲(chóng)病，其中一種或多種食道腺細(xì)胞蛋白調(diào)節(jié)植物或細(xì)胞的基因表達(dá)、巨細(xì)胞的形成、線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移、植物的細(xì)胞代謝、在植物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、或形成能使線蟲(chóng)從植物中形成的巨細(xì)胞取食的取食管。一個(gè)方面提供了對(duì)線蟲(chóng)尤其是根結(jié)線蟲(chóng)分泌的食道腺細(xì)胞蛋白特異的抑制性核酸。抑制性核酸可以噴灑到植物上或以其它方式遞送到植物，使得抑制性核酸能與寄生線蟲(chóng)接觸。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了含有抑制性核酸例如siRNA或微小RNA的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，當(dāng)所述抑制性核酸遞送到取食植物或植物細(xì)胞的線蟲(chóng)中時(shí)，其下調(diào)根結(jié)線蟲(chóng)的食道腺細(xì)胞蛋白。RNA干涉是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如，Kreutzer等的國(guó)際PCT公開(kāi)WO 00/44895；Zernicka-Goetz等的國(guó)際PCT公開(kāi)WO 01/36646；Fire的國(guó)際PCT公開(kāi)WO 99/32619；Plaetinck等的國(guó)際PCT公開(kāi)WO 00/01846；Mello和Fire的國(guó)際PCT公開(kāi)WO 01/29058；Deschamps-Depaillette的國(guó)際PCT公開(kāi)WO 99/07409；Li等的國(guó)際PCT公開(kāi)WO 00/44914；和Trick等的US20040098761。
在一種實(shí)施方案中，線蟲(chóng)不是大豆胞囊線蟲(chóng)。
另一種實(shí)施方案中，抑制性核酸并不直接致死胚胎或成年線蟲(chóng)，或者并不與線蟲(chóng)繁殖能力有關(guān)，反而是抑制線蟲(chóng)從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞取食或獲取養(yǎng)分的能力。
在一些實(shí)施方案中，抑制性雙鏈RNA(dsRNA)來(lái)自“外源模板”。這樣的模板可以是植物或線蟲(chóng)核苷酸序列的全部或部分，它可以是DNA基因序列，或者是從寄生線蟲(chóng)中分離的mRNA通過(guò)例如逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的cDNA。當(dāng)該模板是DNA基因序列的全部或部分時(shí)，優(yōu)選其來(lái)自基因的一個(gè)或多個(gè)或所有的外顯子。當(dāng)dsRNA來(lái)自內(nèi)源性或外源性模板時(shí)，對(duì)于可以合成其的方式?jīng)]有限制。例如，siRNA可以化學(xué)合成，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；用RNase III家族的酶(如Dicer，RNase III)消化長(zhǎng)鏈dsRNA產(chǎn)生；從siRNA表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；或者從PCR衍生的siRNA表達(dá)盒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
然后，體外制備的SiRNA通過(guò)轉(zhuǎn)染、電穿孔或其它方法，被直接導(dǎo)入細(xì)胞?；蛘撸梢赞D(zhuǎn)染在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的基于DNA的載體和盒。RNAi可以用手工和/或自動(dòng)程序，在體外或體內(nèi)合成。體外合成可以是化學(xué)或酶法，例如采用克隆的RNA聚合酶(如T3，T7，SP6)，用于轉(zhuǎn)錄內(nèi)源性DNA(cDNA)模板、或二者的混合物。
在體內(nèi)，dsRNA可以用本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)合成(例見(jiàn)，Sambrook，等，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Third Edition(2001))。例如，細(xì)菌細(xì)胞可以用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，所述載體包含dsRNA將從其衍生的DNA模板?；蛘?，可以用表達(dá)載體或其它方式轉(zhuǎn)化需要抑制基因的表達(dá)的細(xì)胞，例如植物細(xì)胞。模板的一個(gè)或多個(gè)拷貝的雙向轉(zhuǎn)錄，可以通過(guò)該表達(dá)載體或不同的表達(dá)載體編碼的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的內(nèi)源性RNA聚合酶，或者克隆的RNA聚合酶(T3，T7，SP6)來(lái)編碼。表達(dá)構(gòu)建體的使用和生產(chǎn)是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)WO98/32016；美國(guó)專(zhuān)利5,593,874，5,698,425，5712,135，5,789,214和5,804,693)?；虮磉_(dá)的抑制可以通過(guò)以下來(lái)靶定器官、組織或細(xì)胞類(lèi)型中的特定轉(zhuǎn)錄；環(huán)境條件(如溫度，化學(xué)品)；和/或在發(fā)育階段或年齡的工程化的轉(zhuǎn)錄，特別是例如dsRNA在植物細(xì)胞體內(nèi)合成時(shí)。dsRNA還可以用已知的基因遞送系統(tǒng)遞送到特定組織或細(xì)胞類(lèi)型中。這些系統(tǒng)的成分包括種子特異性凝集素啟動(dòng)子和來(lái)自APETALA3的花特異性的啟動(dòng)子。列舉這些載體只是為了說(shuō)明有很多市售的和公知的載體可為本領(lǐng)域技術(shù)人員所用。
如果在細(xì)胞之外合成，RNA可以在導(dǎo)入細(xì)胞之前提純。提純可以是用溶劑(如苯酚/氯仿)或樹(shù)脂提取、沉淀(例如在乙醇中)、電泳、色譜或其組合。但是，提純可導(dǎo)致dsRNA的丟失，并因此可能完全不能進(jìn)行或只能最低限度進(jìn)行。RNA可干燥儲(chǔ)存或溶解在水溶液中，水溶液可含有緩沖液或鹽以促進(jìn)退火和/或穩(wěn)定RNA鏈。
適用的dsRNA也能含有一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基，或有修飾的主鏈，以增加穩(wěn)定性或?yàn)榱似渌?。例如，可以修飾天然RNA的磷酸二酯連接以包含至少一個(gè)氮或硫雜原子。此外，也能用含有稀有堿基如肌苷或修飾堿基如三苯甲基化堿基的dsRNA，只提這兩例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)了解，在RNA上已經(jīng)進(jìn)行了各種各樣的修飾，用于多種目的。此處使用的術(shù)語(yǔ)dsRNA包括這種化學(xué)、酶或代謝修飾的dsRNA形式，前提是前從內(nèi)源性模板衍生得到。
雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過(guò)自身互補(bǔ)的RNA單鏈或兩條分開(kāi)互補(bǔ)的RNA鏈形成。RNA雙鏈體的形成可以在植物細(xì)胞之內(nèi)或之外啟動(dòng)。
dsRNA至少一條鏈的序列含有與靶mRNA的至少一部分互補(bǔ)的區(qū)，足以使dsRNA與靶mRNA特異性雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA與靶mRNA的至少一部分基本一致。“一致性”，如本領(lǐng)域所知，是兩種或多種多核苷酸(或多肽)序列之間根據(jù)序列比較確定的關(guān)系。本領(lǐng)域中，一致性也意味著多核苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)度，通過(guò)所述序列的鏈間匹配確定。一致性可以很容易地計(jì)算出(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，N.J.，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
由于有很多測(cè)定兩條核苷酸序列之間的一致性的方法，該術(shù)語(yǔ)已被技術(shù)人員所熟知(Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988).通常用于測(cè)定序列之間一致性的方法包括但不限于在Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988))中公開(kāi)的那些。設(shè)計(jì)優(yōu)選的測(cè)定一致性方法，在待測(cè)序列之間給予最大的匹配。測(cè)定一致性的方法在計(jì)算機(jī)程序中被編碼。測(cè)定兩條序列之間的計(jì)算機(jī)程序法包括但不限于，GCG程序包(Devereux，J.，等，NucleicAcids Research 12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN，and FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215403(1990))。本領(lǐng)域中執(zhí)行該方法的另一個(gè)廣為人知的軟件包是CLUSTAL程序。它比較兩條多核苷酸的序列，并通過(guò)在任一條適當(dāng)?shù)男蛄兄型ㄟ^(guò)插入間隔找出最佳比對(duì)。最佳比對(duì)的一致性也能用諸如BLASTx的軟件包計(jì)算。該程序比對(duì)了相似序列的最大的一段，并對(duì)匹配度(fit)分配了適合的值。對(duì)于任何一種比較模式，都可以找到數(shù)個(gè)相似的區(qū)域，每個(gè)都有不同的分值。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，長(zhǎng)度不同的兩條多核苷酸可以對(duì)較長(zhǎng)的片段進(jìn)行全長(zhǎng)比較?；蛘呖梢员容^小區(qū)域。通常比較同樣長(zhǎng)度的序列用于進(jìn)行有用的比較。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制性核酸與至少一部分靶mRNA具有100％序列一致性。但是，也可用具有70％、80％或超過(guò)90％或95％序列一致性的抑制性核酸。從而可容許由于基因突變、株系多態(tài)性或進(jìn)化趨異可以預(yù)期的序列變異。
RNA雙鏈體區(qū)域可以有能與靶基因基因轉(zhuǎn)錄體的一部分雜交的核酸序列(如400mM NaCI，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下雜交12-16小時(shí)；隨后清洗。) 雖然dsRNA的最佳長(zhǎng)度可根據(jù)靶基因和實(shí)驗(yàn)條件而變化，但RNA雙鏈區(qū)可至少是19，20，21-23，25，50，100，200，300，400或更多堿基長(zhǎng)度。
靶基因是編碼分泌蛋白的線蟲(chóng)基因，特別是調(diào)節(jié)下述作用的分泌蛋白植物或細(xì)胞的基因表達(dá)，巨細(xì)胞形成，線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移，植物的細(xì)胞代謝，引發(fā)植物細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或形成能讓線蟲(chóng)從在植物中形成的巨細(xì)胞取食的取食管。一個(gè)方面提供了對(duì)線蟲(chóng)，特別是根結(jié)線蟲(chóng)分泌的食道腺細(xì)胞蛋白特異的核酸。通常，dsRNA或抑制性核酸與靶基因整體基本一致，即基因的編碼部分。但是，dsRNA或抑制性核酸可以與靶基因的部分基本一致。該部分的大小取決于具體靶基因，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)改變dsRNA大小并觀察是否抑制了基因的表達(dá)來(lái)測(cè)定。
根生長(zhǎng)增強(qiáng)的植物 一個(gè)實(shí)施方案提供了含有或表達(dá)一種或多種核酸的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述核酸編碼寄生線蟲(chóng)的一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段。較之非轉(zhuǎn)基因植物或?qū)φ罩参?，一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段在植物或植物細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)、刺激或增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物的根生長(zhǎng)。根包括種子根、不定根、一級(jí)側(cè)根、二級(jí)側(cè)根等，飼養(yǎng)根，初生根，次生根，和粗根。
用于公開(kāi)的實(shí)施方案的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段能增加根的大小、根的數(shù)量、根的表面積和根系的整體質(zhì)量。能用本公開(kāi)的組合物和方法產(chǎn)生的塊根作物，比不用本公開(kāi)的組合物和方法的塊根作物要大。本公開(kāi)的組合物和方法產(chǎn)生的其它作物能夠抗旱、抗腐蝕(erosion)或增大的環(huán)境應(yīng)力。環(huán)境應(yīng)力包括諸如降雨量、溫度和濕度的氣候改變。
線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段包括但不限于，由SEQ ID NOs 1、2或5-51，其片段或其組合編碼的多肽。線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段可直接或間接增進(jìn)、刺激或加強(qiáng)根生長(zhǎng)。例如，在線蟲(chóng)分泌性多肽與包括基因組DNA、RNA和mRNA的宿主植物核酸結(jié)合時(shí)，可發(fā)生直接調(diào)節(jié)。間接調(diào)節(jié)可發(fā)生在例如，多肽與一種或多種其它蛋白或因子結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)。然后該復(fù)合物能與宿主植物核酸結(jié)合，或促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段的量，是有效刺激、增強(qiáng)或促進(jìn)根生長(zhǎng)或發(fā)育的量?；蛘?，線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段可以直接遞送到植物。線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽或其片段在轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中的表達(dá)水平可以用本領(lǐng)域已知的方法控制，例如用帶有強(qiáng)啟動(dòng)子或組成型活性啟動(dòng)子的載體、高拷貝載體等。植物或細(xì)胞能被穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
線蟲(chóng)的實(shí)例包括但不限于，根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne spp.)類(lèi)的成員，也稱作根結(jié)線蟲(chóng)(root-knot nematode)。代表性的種類(lèi)包括但不限于花生根結(jié)線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)和禾谷類(lèi)根結(jié)線蟲(chóng)。
代表性的宿主植物的系統(tǒng)科包括爵床科，槭樹(shù)科，獼猴桃科，龍舌蘭科，番杏科，莧科，番荔枝科，傘形科，夾竹桃科，天南星科，五加科，棕櫚科，馬兜鈴科，鳳仙花科，金刀木科，落葵科，小檗科，樺木科，紫葳科，紅木科，木棉科，紫草科，黃楊科，刺果藤科，仙人掌科，云實(shí)科，美人蕉科，山柑科，忍冬科，番木瓜科，石竹科，木麻黃科，木麻黃科，衛(wèi)予科，藜科，藜科，金粟蘭科，鴨跖草科，旋花科，山茱萸科，榛木科，景天科，葫蘆科，柏科，桫欏科，莎草科，四數(shù)木科，五椏果科，薯蕷科，川續(xù)斷科，柿科，杜鵑花科，大戟科，蝶形花科，大風(fēng)子科，荷包牡丹科，龍膽科，牻牛兒苗科，苦苣苔科，銀杏科，草海桐科，藤黃科，血皮草科，金縷梅科，蝎尾蕉科，田基麻科，金絲桃科，鳶尾科，胡桃科，燈心草科，唇形科(Labiatae)，唇形科(Lamiaceae)，樟科，百合科，亞麻科，半邊蓮科，馬錢(qián)科，千屈菜科，木蘭科，金虎尾科，錦葵科，竹芋科，野牡丹科，楝科，防己科，含羞草科，?？疲沤犊?，苦檻藍(lán)科，楊梅科，肉豆蔻科，桃金娘科，紫茉莉科，木犀科，柳葉菜科，蘭科，Othnaceae，酢漿草科，芍藥科，露兜樹(shù)科，罌粟科，胡麻科，商陸科，松科，胡椒科，海桐花科，車(chē)前科，懸鈴木科，白花丹科，禾本科，川薹草科，花荵科，遠(yuǎn)志科，馬齒莧科，報(bào)春花科，山龍眼科，石榴科，毛茛科，木犀草科，鼠李科，薔薇科，茜草科，蕓香科，楊柳科，檀香科，無(wú)患子科，瓶子草科，虎耳草科，玄參科，菝葜科，茄科，梧桐科，安息香科，檉柳科，杉科，堅(jiān)果番杏科，山茶科，假輪葉科，瑞香科，椴樹(shù)科，旱金蓮科，時(shí)鐘花科，香蒲科，榆科，蕁麻科，敗醬科，馬鞭草科，堇菜科，葡萄科，澤米蘇鐵科，姜科或蒺藜科。
能根結(jié)本公開(kāi)被編碼RKN食道腺細(xì)胞分泌性多肽的核酸轉(zhuǎn)染的宿主植物的通用名，包括但不限于番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆(甜瓜、西瓜等)、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類(lèi)、紫花苜蓿、煙草、柑桔、苜蓿、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本公開(kāi)包括分泌改變宿主基因表達(dá)的蛋白的任何線蟲(chóng)。例如，一種實(shí)施方案提供了含有編碼根結(jié)線蟲(chóng)成員分泌的蛋白的核酸的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中分泌的蛋白刺激、增強(qiáng)或促進(jìn)根生長(zhǎng)或發(fā)育。
另一種實(shí)施方案提供了包含具有序列SEQ ID NOs.1、2或5-5 1或其片段或其同源物的核酸的組合物。當(dāng)該組合物被遞送到植物或植物細(xì)胞時(shí)，刺激、促進(jìn)或增強(qiáng)根生長(zhǎng)或發(fā)育。
還有一種實(shí)施方案提供了包含一種或多種由SEQ ID NOs.1、2或5-51或者其同源物被遞送到植物或植物細(xì)胞時(shí)所編碼的多肽或其片段的組合物。
這里公開(kāi)的根刺激組合物可任選含有生長(zhǎng)增強(qiáng)劑、肥料、一種或多種殺線蟲(chóng)劑、殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑或其組合。代表性的殺線蟲(chóng)劑包括但不限于三氯硝基甲、溴甲烷、1，3-二氯丙烯、甲基二硫代氨基甲酸鈉、四硫代碳酸鈉；以及氨基甲酸鹽如2-甲基-2-(甲基硫代)丙醛O-甲基氨基甲?；?aldicarb)、2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃酚甲基氨基甲酸鹽(carbofuran)、甲基2-(二甲基氨基)-N-[[(甲基氨基)羰基]氧基]-2-氧代硫代乙烷亞胺(oxamyl)、2-甲基-2-(甲基磺?；?丙醛O-[(甲基氨基)羰基]肟(aldoxycarb)、0，0-二乙基O-[4-(甲基亞硫?；?苯基]硫代磷酸酯(fensulfothion)、O-乙基S，S-二丙基二硫代磷酸酯(ethoprop)、和乙基-3-甲基-4-(甲基硫代)苯基(1-甲基乙基)氨基磷酸酯(phenamiphos)。
另一種實(shí)施方案提供了含有一種或多種編碼線蟲(chóng)分泌性多肽或其片段的細(xì)胞，例如植物細(xì)胞，其中線蟲(chóng)分泌性多肽直接或間接刺激、增強(qiáng)或促進(jìn)根生長(zhǎng)或發(fā)育。細(xì)胞可以是原核或真核，并通常是植物細(xì)胞，特別是根細(xì)胞。
還有一種實(shí)施方案提供了為植物提供抗干旱的方法，是將植物接觸有效刺激、促進(jìn)或增強(qiáng)根發(fā)育的量的一種或多種線蟲(chóng)食道蛋白或編碼線蟲(chóng)食道蛋白的核酸。組合物可以噴灑在植物上、施用在植物周?chē)耐寥乐谢蛞云渌绞竭f送給植物，使該組合物與植物接觸。
植物轉(zhuǎn)化技術(shù) 本公開(kāi)的DNA分子和RNA分子用常規(guī)重組DNA技術(shù)整合到植物或細(xì)菌細(xì)胞。通常，本公開(kāi)的DNA或RNA分子包含在轉(zhuǎn)化載體中?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的眾多這類(lèi)載體系統(tǒng)，如質(zhì)粒。表達(dá)系統(tǒng)的成分可以修飾用以，比如，增加導(dǎo)入的RNA片段的表達(dá)。例如，可以采用截?cái)嘈蛄?、核苷酸取代或其它修飾?？捎帽绢I(lǐng)域已知的表達(dá)系統(tǒng)在適當(dāng)?shù)臈l件下，實(shí)際轉(zhuǎn)化任何植物細(xì)胞。包含本發(fā)明DNA分子的轉(zhuǎn)基因優(yōu)選是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化并整合到宿主細(xì)胞的基因組中。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞優(yōu)選再生進(jìn)入整株植物。轉(zhuǎn)化技術(shù)的詳細(xì)說(shuō)明在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
報(bào)道基因或篩選標(biāo)記基因可包括在表達(dá)盒中。本領(lǐng)域已知的適用報(bào)道基因的實(shí)例可以在例如下列這些文獻(xiàn)中找到Jefferson等(1991)in Plant Molecular Biology Manual，ed.Gelvin等(Kluwer AcademicPublishers)，pp.1-33；DeWet等(1987)MoI.Cell.Biol.7725-737；Goff等等(1990)EMBO J.92517-2522；Kain等(1995)Bio Techniques19650-655；和Chiu等(1996)Current Biology 6325-330. 用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織的篩選標(biāo)記基因可包括賦予抗生素抗性或除草劑抗性的基因。適用的篩選標(biāo)記基因包括但不限于，編碼下列物質(zhì)抗性的基因氯霉素(Herrera Estrella等(1983)EMBO J.2987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella等(1983)Nature 303209-213；Meijer等(1991)Plant MoI.Biol.16807-820)；潮霉素(Waldron等(1985)Plant MoI.Biol.5103-108；Zhijian等(1995)Plant Science108219-227)；鏈霉素(Jones等(1987)MoI.Gen.Genet 21086-91)；壯觀霉素(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.5131-137)；博來(lái)霉素(HiIIe等(1990)Plant MoI.Biol 7171-176)；磺酰胺(Guerineau等1990)Plant MoI.Biol.15127-136)；溴苯腈(bromoxynil)(Stalker等(1988)Science 24241 9423)；草甘膦(Shaw等(1986)Science233478481)；草胺膦(phosphinothricin)((DeBlock等(1987)EMBO J.62513-2518). 在轉(zhuǎn)基因事件的回收中可提供用處但在終產(chǎn)物中可能不需要的其它基因包括但不限于，例如GUS(b-葡萄糖苷酸酶(glycoronidase)；Jefferson(1987)Plant MoI.Biol.Rep.5387)，GFP(綠色熒光蛋白；Chalfie等(1994)Science 263802)，熒光素酶(Riggs等(1987)Nucleic Acids Res.15(19)8115和Luehrsen等(1992)MethodsEnzymol.216397-414)和編碼花青素產(chǎn)物的玉米基因(Ludwig等(1990)Science 247449). 包含與所關(guān)注的異源核酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子序列的表達(dá)盒，可用于轉(zhuǎn)化任何植物。以這種方式，可獲得遺傳修飾的植物、植物細(xì)胞、植物組織、種子等。
轉(zhuǎn)化規(guī)程以及將核苷酸序列導(dǎo)入植物的規(guī)程可以根據(jù)轉(zhuǎn)化靶向的植物類(lèi)型或植物細(xì)胞而改變，即單子葉或雙子葉。將核酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞和將序列插入植物基因組的方法包括，顯微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4320-334)，電穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835602-5606，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Townsend等，U.S.Pat.No.5,563,055；Zhao等WO US98/01268)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等(1984)EMBO J.32717-2722)，和彈道顆粒加速(例見(jiàn)，Sanford等，U.S.Pat.No.4,945,050；Tomes等(1995)″Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment，″inPlant Cell，Tissue，and Organ CultureFundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe等(1988)Biotechnology 6923-926).還參見(jiàn)Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477；Sanford等(1987)Particulate Science andTechnology 527-37(洋蔥)；Christou等(1988)Plant Physiol.87671-674(大豆)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96319-324(大豆)；Dafia等(1990)Biotechnology 8736-740(水稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6559-563(玉米)；Tomes的美國(guó)專(zhuān)利5,240,855；Buising等的美國(guó)專(zhuān)利5,322,783和5,324,646；Tomes等(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cellsvia Microprojectile Bombardment，″in Plant Cell，Tissue，and OrganCultureFundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等(1988)Plant Physiol.91440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London)311763-764；Bowen等的美國(guó)專(zhuān)利5,736,369(谷類(lèi))；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845345-5349(百合科)；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of OvuleTissues，ed.Chapman等(Longman，N.Y.)，pp.197-209(pollen)；Kaeppler等(1990)Plant Cell Reports 9415-418 and Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(whisker介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D′Halluin等(1992)Plant Cell 41495-1505(電穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports12250-255 and Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75407-413(稻子)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14745-750(借助于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的玉米)；這里的所有文獻(xiàn)均全文合并作為參考。
已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可依照常規(guī)技術(shù)長(zhǎng)成為植物。例見(jiàn)，McCormick等(1986)Plant Cell Reports 581-84。然后這些植物生長(zhǎng)，并與相同的轉(zhuǎn)化株或不同的植株授粉，形成具有可識(shí)別的組成型表達(dá)所需表現(xiàn)型特征的的雜交株?？梢陨L(zhǎng)兩代或多代以確保所需表現(xiàn)型特征的組成型表達(dá)被穩(wěn)定保持和繼承，然后收獲種子確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表現(xiàn)型特征的組成型表達(dá)。
可以用化學(xué)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子通過(guò)施用外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)基因在植物中的表達(dá)。取決于目標(biāo)，啟動(dòng)子可以是化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子(其中施用化學(xué)品誘導(dǎo)基因表達(dá))，或者化學(xué)抑制啟動(dòng)子(其中施化學(xué)品抑制基因表達(dá))?；瘜W(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子本領(lǐng)域已知，包括但不限于，被苯磺酰胺除草劑安全劑活化的玉米1n2-2啟動(dòng)子，被用作出土前除草劑的疏水親電化合物活化的玉米GST啟動(dòng)子，和被水楊酸活化的煙草PR-1啟動(dòng)子。其它感興趣的化學(xué)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括類(lèi)固醇響應(yīng)啟動(dòng)子(例見(jiàn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子，描述于Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8810421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2)247-257)以及四環(huán)素誘導(dǎo)和四環(huán)素抑制啟動(dòng)子(例見(jiàn)Gatz等(1991)MoI.Gen.Genet.227229-237，以及美國(guó)專(zhuān)利，814,618和5,789,156)，這里全文引入作為參考。
組成型啟動(dòng)子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子和其它組成型啟動(dòng)子，公開(kāi)于WO 99/43838和美國(guó)專(zhuān)利6,072,050；核心CAMV 35S啟動(dòng)子(Odell等(1985)Nature 313810-812)；水稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant MoI.Biol.12619-632和Christensen等(1992)Plant MoI.Biol.18675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.32723-2730)；ALS啟動(dòng)子(U.S.Pat.No.5,659,026)等。其它組成型啟動(dòng)子包括，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142。
在需要低水平表達(dá)時(shí)，可用弱啟動(dòng)子。通常，“弱啟動(dòng)子”指在低水平驅(qū)動(dòng)編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子。低水平指大約1/1000轉(zhuǎn)錄至約1/100,000轉(zhuǎn)錄至大約1/500,000轉(zhuǎn)錄的水平?；蛘?，可以認(rèn)識(shí)到弱啟動(dòng)子也包括僅在一些細(xì)胞而不在其它細(xì)胞表達(dá)，而產(chǎn)生總體低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。在啟動(dòng)子以無(wú)法接受的高水平表達(dá)的情況下，可以刪除或修飾啟動(dòng)子的部分序列，降低表達(dá)水平。
這樣的弱組成型啟動(dòng)子包括，例如，Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子(WO 99/43838和美國(guó)專(zhuān)利6,072,050)、核心35S CaMV啟動(dòng)子等。其它組成型啟動(dòng)子包括，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142。
可以用“組織偏愛(ài)的”啟動(dòng)子在特定組織內(nèi)靶向基因表達(dá)。組織偏愛(ài)的啟動(dòng)子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7)792-803；Hansen等(1997)MoI.Gen.Genet.254(3)337-343；Russell等(1997)TransgenicRes.6(2)157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2)525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2)513-524；Yamamoto等(1994)Plant CellPhysiol.35(5)773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20181-196；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3)495-505。需要的話，這樣的啟動(dòng)子可以修飾為弱表達(dá)。
“種子偏愛(ài)的”啟動(dòng)子包括“種子特異性”啟動(dòng)子(在種子發(fā)育期間有活性的啟動(dòng)子如種子儲(chǔ)存蛋白啟動(dòng)子)以及“種子萌發(fā)”啟動(dòng)子(種子萌發(fā)期間有活性的啟動(dòng)子)二者。見(jiàn)Thompson等(1989)BioEssays 10108，這里合并作為參考。所述種子偏愛(ài)的啟動(dòng)子包括但不限于，Cim1(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶)；和ce1A(纖維素合成酶)。γ-玉米蛋白是優(yōu)選的胚乳特異性啟動(dòng)子。Glob-1是優(yōu)選的胚特異性啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于，豆類(lèi)β菜豆蛋白、napin、β伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。對(duì)于單子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于，玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、糯性蛋白(waxy)、shrunken1、shrunken 2、球蛋白1等。
葉子特異性啟動(dòng)子本領(lǐng)域已知。例見(jiàn)，Yamamoto等(1997)PlantJ.12(2)255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105357-67；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)773-778；Gotor等(1993)Plant J.3509-18；Orozco等(1993)Plant MoI.Biol.23(6)1129-1138；和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590。
根偏愛(ài)的啟動(dòng)子是已知的，并可從文獻(xiàn)的很多現(xiàn)有啟動(dòng)子中選擇，或者從各種相容的品種中重新分離。參見(jiàn)，例如，Hire等(1992)PlantMoI.Biol.20(2)207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)1051-1061(在法國(guó)菜豆的GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14(3)433-443(根癌農(nóng)桿菌的甘露堿合成酶(MAS)基因的根特異性啟動(dòng)子)；和Miao等(1991)Plant Cell 3(1)1 1′-22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長(zhǎng)cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達(dá))。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。
葉綠體靶向的序列在本領(lǐng)域已知，并包括葉綠體的小亞單位核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)(de Castro Silva Filho等(1996)PlantMoI.Biol.30769-780；Schnell等(1991)J.Biol.Chem.266(5)3335-3342)；5-(烯醇式丙酮)莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)789-810)；色氨酸合酶(Zhao等(1995)J.Biol.Chem.270(11)6081-6087)；質(zhì)體藍(lán)素 (Lawrence等(1997)J.Biol.Chem.272(33)20357-20363)；分支酸合酶(chorismatesynthase)(Schmidt等(1993)J.Biol.Chem.268(36)27447-27457)；和捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHBP)(Lamppa等(1988)J.Biol.Chem.26314996-14999).還參見(jiàn)Von Heijne等(1991)Plant MoI.Biol.Rep.9104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.26417544-17550；Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.1961414-1421；和Shah等(1986)Science 233478-481. 轉(zhuǎn)化葉綠體的方法本領(lǐng)域已知。例見(jiàn)，Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12601-606.該方法依靠粒子槍遞送含有選擇標(biāo)記的DNA，并通過(guò)同源重組將DNA靶向到質(zhì)體基因組上。另外，通過(guò)細(xì)胞核編碼并由質(zhì)粒定向的RNA聚合酶的組織偏愛(ài)表達(dá)，反式激活沉默的質(zhì)體-bome轉(zhuǎn)基因，而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。這樣的體系已在McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA917301-7305中得以報(bào)告。
所關(guān)注的要靶向到葉綠體上的核酸可通過(guò)植物細(xì)胞核和該細(xì)胞器官之間密碼子使用的差異而優(yōu)化在葉綠體中的表達(dá)。在這種方式中，所關(guān)注的核酸可以用葉綠體偏愛(ài)的密碼子合成。例見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利5,380,831，本文合并作為參考。
依照本公開(kāi)的轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，并包括但不限于任何線蟲(chóng)宿主植物。
構(gòu)建植物表達(dá)盒的要求 在轉(zhuǎn)基因植物中用于表達(dá)的核酸序列首先裝配在位于可在植物中表達(dá)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子之后的表達(dá)盒中。表達(dá)盒還能包含轉(zhuǎn)基因表達(dá)需要的或選擇的任何其它序列。這樣的序列包括但不限于，轉(zhuǎn)錄終止子、提高表達(dá)的外來(lái)序列如內(nèi)含子、關(guān)鍵序列、和用于將基因靶定到特定細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室中的序列。然后這些表達(dá)盒能容易地轉(zhuǎn)移到下文所述的植物轉(zhuǎn)化載體中。下文說(shuō)明典型的表達(dá)盒的各種成分。
啟動(dòng)子 表達(dá)盒中所用的啟動(dòng)子的選擇決定了轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的空間和時(shí)間表達(dá)模式。所選的啟動(dòng)子在特定細(xì)胞類(lèi)型(如葉表皮細(xì)胞，葉肉細(xì)胞，根皮層細(xì)胞)或者特定的組織或器官(如根、葉或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，該選擇反映了基因產(chǎn)物想要蓄積的部位?；蛘撸x的啟動(dòng)子在各種誘導(dǎo)條件下驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。
啟動(dòng)子的強(qiáng)度，即啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力不同。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞體系，可以用本領(lǐng)域已知的眾多適用啟動(dòng)子的任何一種。例如，對(duì)于組成型表達(dá)，可以用CaMV 35S啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白(actin)啟動(dòng)子、或泛素(ubiquitin)啟動(dòng)子。例如，對(duì)于可調(diào)節(jié)的表達(dá)，可以用來(lái)自煙草或擬南芥的化學(xué)可誘導(dǎo)的PR-1啟動(dòng)子(例見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利5,689,044)。
適用的啟動(dòng)子類(lèi)別是損傷誘導(dǎo)的。據(jù)記述許多啟動(dòng)子都在損傷部位表達(dá)。優(yōu)選的這類(lèi)啟動(dòng)子包括下列文獻(xiàn)所述者Stanford等MoI.Gen.Genet.215200-208(1989)，Xu等Plant Molec.Biol.22573-588(1993)，Logemann等Plant Cell 1151-158(1989)，Rohrmeier & Lehle，Plant Molec.Biol.22783-792(1993)，F(xiàn)irek等Plant Molec.Biol.22129-142(1993)，和Warner等Plant J.3191-201(1993). 合適的組織特異性表達(dá)模式包括綠色組織特異性、根特異性、莖特異性和花特異性。適合在綠色組織中表達(dá)的啟動(dòng)子包括調(diào)節(jié)參與光合作用的基因的許多啟動(dòng)子，其中很多已從單子葉植物和雙子葉植物中被克隆。適用的啟動(dòng)子為來(lái)自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC啟動(dòng)子(Hudspeth & Grula，Plant Molec.Biol.12579-589(1989))。適合根特異性表達(dá)的啟動(dòng)子是de Framond所述者(FEBS 290103-106(1991)；EP0 452 269和來(lái)自T-1基因的根特異性表達(dá)啟動(dòng)子。莖特異性的適用啟動(dòng)子在美國(guó)專(zhuān)利5,625,136中有記述，并且其驅(qū)動(dòng)玉米trpA基因的表達(dá)。
轉(zhuǎn)錄終止子 有多種轉(zhuǎn)錄終止子可用于表達(dá)盒。其負(fù)責(zé)終止超出轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和其正確的多聚腺苷酸化。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是那些已知在植物中發(fā)揮功能者，包括CaMV 35S終止子、tm1終止子、胭脂堿(nopaline)合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。這些既用于單子葉植物也用于雙子葉植物。
提高或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列 已發(fā)現(xiàn)來(lái)自轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的許多序列能提高基因表達(dá)，這些序列可以與基因結(jié)合使用，增加它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。例如，各種內(nèi)含子序列如玉米Adh1基因的內(nèi)含子已經(jīng)表現(xiàn)出能提高表達(dá)，特別是在單子葉植物的細(xì)胞中。另外，還已知病毒衍生的眾多非翻譯的前導(dǎo)序列能提高表達(dá)，這些在雙子葉植物的細(xì)胞中尤其有效。
編碼序列的最優(yōu)化 所選基因的編碼序列可進(jìn)行基因工程改變編碼序列，用以在所關(guān)注的作物品種中最佳表達(dá)。修飾編碼序列以實(shí)現(xiàn)在特定作物品種中的最佳表達(dá)的方法已是眾所周知(例見(jiàn)Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324(1991)；和Koziel等，Bio/technol.11194(1993))。
另一種實(shí)施方案提供了直接轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中的RNA分子。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)詳盡地記述在美國(guó)專(zhuān)利5,451,513、5,545,817和5,545,818；PCT申請(qǐng)WO 95/16783；和McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305之中。葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)涉及將側(cè)翼帶有選擇標(biāo)記連同所關(guān)注的基因的克隆質(zhì)體DNA區(qū)域?qū)脒m當(dāng)?shù)陌薪M織，如用生物導(dǎo)彈(biolistics)或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(如氯化鈣或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)。1-1.5kb的側(cè)翼區(qū)，稱為靶序列，促進(jìn)了與質(zhì)體基因組的同源重組，并進(jìn)而使質(zhì)體基因組的特定區(qū)域被替換或修飾。起初，葉綠體16S rRNA和rps12基因中賦予壯觀霉素和/或鏈霉素抗性的點(diǎn)突變，被用作轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.，and Maliga，P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub，J.M.，和Maliga，P.(1992)PlantCell 4，39-45)。這些標(biāo)記之間存在的克隆位點(diǎn)使得產(chǎn)生了導(dǎo)入外來(lái)DNA分子的質(zhì)體靶定載體(Staub，J.M.，and Maliga，P.(1993)EMBO J.12，601-606)。用顯性選擇標(biāo)記，編碼壯觀霉素解毒酶氨基葡萄糖苷-3’-腺苷轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌aadA基因，替換隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因，可得到轉(zhuǎn)化頻率顯著增加(Svab，Z.，and Maliga，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，913-917)。以前，該標(biāo)記已經(jīng)被成功地用于高頻率轉(zhuǎn)化綠藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的質(zhì)體基因組(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)Nucl.Acids Res.194083-4089)。本領(lǐng)域已知有其它用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，并包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體 植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知，多種轉(zhuǎn)化載體可用于植物轉(zhuǎn)化，并且本公開(kāi)有關(guān)的基因能與任何這類(lèi)載體結(jié)合應(yīng)用。載體的選擇取決于選擇的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的目標(biāo)品種。對(duì)于某些目標(biāo)品種，優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化中常規(guī)用的選擇標(biāo)記包括npt11基因，其賦予了對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素的抗性(Messing & Vierra.Gene 19259-268(1982)；Bevan等，Nature 304184-187(1983))，bar基因，賦予了對(duì)除草劑草銨膦(phosphinothricin)的抗性(White等，Nucl.Acids Res 181062(1990)，Spencer等Theor.Appl.Genet 79625-631(1990))，hph基因，賦予了對(duì)抗生素潮霉素的抗性(Blochinger &Diggelmann，MoI Cell Biol 42929-2931)，manA基因，在存在甘露糖時(shí)允許陽(yáng)性選擇(Miles and Guest(1984)Gene，3241-48；U.S.Patent No.5,767,378)，和dhfr基因，賦予了對(duì)氨甲蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBOJ.2(7)1099-1104(1983))，和EPSPS基因，賦予了對(duì)草甘膦的抗性(U.S.Pat.Nos.4,940,935 and 5,188,642)。
許多載體可用于應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉(zhuǎn)化。它們通常帶有至少一個(gè)T-DNA邊緣序列，并包括如pBIN19的載體(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))。適合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括二元載體(binary vector)pCIB200和pCIB2001，以及二元載體pCIB 10及其潮霉素選擇衍生物。(例見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利5,639,949)。
不使用根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化避免了所選的轉(zhuǎn)化載體對(duì)T-DNA序列的需求，因此除了如上述含有T-DNA序列的載體之外，利用了缺乏這些序列的載體。不依靠農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括借助于粒子轟擊、原生質(zhì)體攝取(如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇主要取決于對(duì)要轉(zhuǎn)化的品種的優(yōu)先選擇。適合非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括pCIB3064、pSOG 19和pSOG35。(例見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利5,639,949)。
轉(zhuǎn)化技術(shù) 一旦所關(guān)注的DNA序列被克隆到表達(dá)系統(tǒng)中后，它即被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化的方法和植物再生的方法在本領(lǐng)域中是公知的。例如，Ti質(zhì)粒載體被用于遞送外源DNA，以及直接攝取DNA、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射和微彈(microprojectile)。另外，農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌可以用來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化雙子葉植物的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，并包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng)桿菌技術(shù)涉及通過(guò)原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源基因材料。這通過(guò)PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、粒子轟擊介導(dǎo)的遞送或顯微注射實(shí)現(xiàn)。在各種情況下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以再生為整株植物。
大多數(shù)單子葉植物品種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在變得有些常規(guī)。優(yōu)選的技術(shù)包括用PEG或電穿孔技術(shù)將基因直接轉(zhuǎn)移進(jìn)原生質(zhì)體中、粒子轟擊進(jìn)入愈傷組織或有組織的(organized)結(jié)構(gòu)中、以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
用本領(lǐng)域已知的方法，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化事件的植物生長(zhǎng)、繁殖和育種，產(chǎn)生出具有所需特性的后代，并獲取帶有所需特征的種子。該方法產(chǎn)生包含本發(fā)明RNA片段的植物細(xì)胞，其中所述靶基因在所述植物細(xì)胞中的表達(dá)被所述RNA片段改變，并產(chǎn)生從該植物細(xì)胞衍生的植物及其后代、以及源于該植物的種子。
本公開(kāi)的抑制性核酸或RKN食道腺細(xì)胞分泌多肽可單獨(dú)使用或作為試劑盒的組分，所述試劑盒具有至少一種進(jìn)行體外或體內(nèi)將RNA導(dǎo)入到對(duì)象中所必需的試劑。適用的組分是dsRNA和促進(jìn)dsRNA導(dǎo)入的媒介。這樣的試劑盒也可包括使用說(shuō)明書(shū)，使試劑盒的用戶實(shí)施本發(fā)明。
另一種實(shí)施方案通過(guò)將包含雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA(所述雙鏈結(jié)構(gòu)具有與靶mRNA的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列)導(dǎo)入線蟲(chóng)的宿主植物，提供了對(duì)抗線蟲(chóng)病害的方法；并任選驗(yàn)證靶mRNA的表達(dá)抑制。
一種實(shí)施方案通過(guò)將植物內(nèi)或植物上的寄生線蟲(chóng)與dsRNA接觸，所述dsRNA具有與編碼線蟲(chóng)分泌蛋白(例如食道腺細(xì)胞蛋白)的mRNA至少部分互補(bǔ)的序列，提供了一種治療或預(yù)防線蟲(chóng)病害的方法；其中分泌蛋白調(diào)節(jié)植物的基因表達(dá)。
還有一種實(shí)施方案提供了例如含有表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞，該構(gòu)建體編碼形成了雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA，所述雙鏈結(jié)構(gòu)具有與編碼線蟲(chóng)分泌蛋白(例如食道腺細(xì)胞蛋白)的靶mRNA的至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列，以及提供了含有所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
另一種實(shí)施方案中，RNA片段包含在兩種不同的RNA分子中。這種情況下，RNA片段在導(dǎo)入所述細(xì)胞之前混合，例如在允許其形成雙鏈RNA分子的條件下。在另一種實(shí)施方案中，RNA片段依次導(dǎo)入所述細(xì)胞。優(yōu)選，導(dǎo)入每種RNA分子之間的時(shí)間間隔短，優(yōu)選少于一小時(shí)。
還有一種實(shí)施方案，RNA片段包含在一種RNA分子中。用一種RNA分子，兩個(gè)互補(bǔ)RNA片段緊密接近，使得有利于配對(duì)和雙鏈形成。這樣的情況下，RNA分子優(yōu)選能夠折疊，使包含于其中的所述RNA片段構(gòu)成雙鏈區(qū)。這樣，RNA片段的互補(bǔ)部分能互相識(shí)別，彼此配對(duì)，并形成雙鏈RNA分子。在另一種實(shí)施方案中，RNA片段在導(dǎo)入細(xì)胞之前，在使它們能形成雙鏈RNA分子的條件下孵育。另外還有一種實(shí)施方案，RNA分子包含有義RNA片段和無(wú)義RNA片段之間的接頭。該接頭優(yōu)選包含由含有功能基因如選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒編碼的RNA序列。在另一種實(shí)施方案中，接頭包含由調(diào)節(jié)序列編碼的RNA序列，如包含內(nèi)含子加工信號(hào)。
另一種實(shí)施方案提供了一種dsRNA構(gòu)建體，其具有與所述dsRNA可操作連接的啟動(dòng)子，并還可包括所述的dsRNA分子。啟動(dòng)子可以是異源性啟動(dòng)子，例如組織特異性啟動(dòng)子、發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、趨異或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。終止信號(hào)也可任選包括在DNA分子中。
單一RNA分子或兩種不同的RNA分子優(yōu)選能夠形成雙鏈區(qū)，其中RNA片段的互補(bǔ)部分彼此識(shí)別，互相配對(duì)，并形成雙鏈RNA分子。
另一種實(shí)施方案以原料、丸粒、顆粒、片狀等形式提供了所公開(kāi)的轉(zhuǎn)基因植物材料。這里公開(kāi)的抑制性核酸可以是源自上述轉(zhuǎn)基因植物的種子和種子產(chǎn)物。另一種實(shí)施方案提供了一種含有所公開(kāi)的抑制性核酸的組合物，能涂在種子上。該涂料可以配制成使抑制性核酸在種子成熟和根發(fā)育時(shí)，能保持抑制線蟲(chóng)分泌蛋白。
其它的實(shí)施方案提供了含有所公開(kāi)的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段的嵌合或融合蛋白。本文所用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括與外源多肽連接的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段?！巴庠炊嚯摹笔桥c線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段不顯著同源的多肽。外源多肽可以融合到線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段的N-端或C-端。
融合蛋白可包括對(duì)配體有高親和力的部分(moiety)。例如，融合蛋白可以是GST融合蛋白，其中線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段融合到GST的C-端。這樣的融合蛋白可以易于多肽的提純?；蛘撸撊诤系鞍卓梢栽谄銷(xiāo)-端含有異源信號(hào)序列。在某些宿主細(xì)胞中，蛋白的表達(dá)、分泌或運(yùn)送可通過(guò)使用異源信號(hào)序列而增加。例如，在植物細(xì)胞中，本發(fā)明的多肽可以與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽使多肽從植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺~綠體中，從而增加根發(fā)育。，已經(jīng)編碼了融合的部分(如GST多肽)的表達(dá)載體可以從市場(chǎng)上得到。編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白或其片段的核酸可以克隆到這樣的表達(dá)載體之中，使融合部分符合讀框地連接到多肽上。
下面僅是示范性實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不受限于這些實(shí)施例。本公開(kāi)的其它重要應(yīng)用可以被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地認(rèn)識(shí)到?？杀槐绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員潛在認(rèn)識(shí)到的其它用途也是本公開(kāi)的部分。
本文提到的參考文獻(xiàn)，根據(jù)適用的法律所允許的最大限度全文引入。
實(shí)施例 實(shí)施例1線蟲(chóng)和植物 根結(jié)線蟲(chóng)品種在溫室生長(zhǎng)的番茄(Lycopersicon esculentum cv.Marion或Better-Boy)的根上繁殖。根結(jié)線蟲(chóng)的卵按所述方式收集(Hussey and Barker，1973)。經(jīng)過(guò)孵卵，在25-μm孔篩上將寄生前的二期幼蟲(chóng)(pre-J2)收集在塑料碗中的去離子水中。通過(guò)根混合和篩選，收集南方根結(jié)線蟲(chóng)的不同寄生期(Ding等1998)。用于原位雜交的南方根結(jié)線蟲(chóng)的混合寄生期(MS)，在如De Boer等(1998)所述的卵接種后13-15天收集。相似地，從感染的大豆(Glycine max)的根上收集大豆胞囊線蟲(chóng)(heterogera glycines)的pre-J2和MS。秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)在大腸桿菌(E.coli)的OP50上培養(yǎng)(Brenner，1974)。從生長(zhǎng)室生長(zhǎng)的煙草(Nicotiana tabacum cv.Petite Havana SR1)和擬南芥生態(tài)變種Col-O上，收集一月齡的宿主植物葉子。
實(shí)施例2核酸操作 密集(packed)的線蟲(chóng)Pre-J2用液氮冷凍在1.5ml微量離心管中，并用底部光滑的金屬桿研磨。冷凍的線蟲(chóng)片段與0.5ml提取液(100mMNaCl，100mM Tris-HCl[pH8.0]，50mM EDTA，1％十二烷基硫酸鈉，4mg/ml蛋白酶K和10μg/ml RNase)混合，并在37℃孵育1小時(shí)。DNA用苯酚/氯仿提取，然后用異丙醇沉淀(Sambrook等，1989)。DNA在H2O中再懸浮。煙草和擬南芥的基因組DNA用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取(Dellaporta 1993)。
用Dynabeads mRNA DIRECT試劑盒(Dynal，Lake Success，NY)，從研磨的植物組織提取和純化mRNA，用10μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的水洗脫，并用逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR SMART PCR cDNA合成試劑盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，依照制造商的說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)換成第一鏈cDNA。RT-PCR反應(yīng)含有下列成分5×第一鏈緩沖液4.0μl，20mMDTT 2.0μl，10mM 50×dNTP 2.0μl，10μM 3′-CDS引物1μl，分離的mRNA 10μl，和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/μl，Gibco BRL，Rockville，MD)1μl。反應(yīng)在42℃孵育1小時(shí)。
實(shí)施例3分離16D10 cDNA克隆 編碼分泌性信號(hào)肽的16D10克隆在南方根結(jié)線蟲(chóng)的腺細(xì)胞特異性cDNA文庫(kù)的隨機(jī)測(cè)序期間被鑒別(Huang等，2003)，并命名為16D10。pGEM-T Easy載體中的16D10全長(zhǎng)雙鏈cDNA序列，通過(guò)在測(cè)序反應(yīng)中用T7和SP6引物得到。如SignalP所預(yù)測(cè)的，16D10 cDNA(364bp)的最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框編碼包括了30aa N-端疏水信號(hào)肽的43aa的推導(dǎo)的蛋白(Nielsen等，1997)。雖然13aa(GKKPSGPNPGGNN，Mx 1,223Da)(SEQ ID NO52)的成熟16D10肽沒(méi)有提供明顯的BLASTX相似性，但它確實(shí)含有擬南芥CLV3-樣蛋白功能結(jié)構(gòu)域的保守C-端13aa基序(KRLVPSGPNPLHN)(SEQ ID NO54)的8aa(K-PSGPNP--N)(SEQ IDNO53)(Cock和McCormick，2001)，以及按PROSITE預(yù)測(cè)的cAMP/cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)[KKpS](Hofmann等，1999)。
實(shí)施例4在根結(jié)線蟲(chóng)品種中的基因組克隆 從南方根結(jié)線蟲(chóng)16D10的cDNA序列最末端5’-和3’-端設(shè)計(jì)的一對(duì)基因特異性引物16D10GF(5′-GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTC-S′)(SEQ ID NO55)和16D10GR(δ′-CAGATATAATTTTATTCAG-S‘)(SEQ ID NO56)，用于從南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)的200ng基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的基因組序列(或最高同源性的序列)。PCR產(chǎn)物從1.2％瓊脂糖凝膠上切下，用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化。提純的產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega，Madison，W1)中測(cè)序。根結(jié)線蟲(chóng)品種的16D10同源物在核苷酸水平享有超過(guò)95％的一致性，并且推定的cDNA編碼的推導(dǎo)出的蛋白與南方根結(jié)線蟲(chóng)16D10的蛋白一致。
實(shí)施例5Southern印跡分析 每個(gè)樣品，10μg基因組DNA以50單位的EcoRI或BamHI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)完全消化，在0.7％(w/v)瓊脂糖凝膠中分離，轉(zhuǎn)移到Hybond-N尼龍膜上(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，并用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程(Sambrook等，1989)進(jìn)行印跡。用T7和SP6引物從pGEM-T Easy載體的插入物擴(kuò)增相應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA，產(chǎn)生16D10探針。凝膠純化的PCR產(chǎn)物以PCR-DIG探針合成體系(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)用PCR標(biāo)記。大約15ngDIG-標(biāo)記的探針/ml用于每個(gè)雜交。在室溫(RT)下，雜交在DIG Easy Hyb液(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)中，于40℃進(jìn)行16h，隨后用2×SSC/0.1％SDS液清洗2次，每次5分鐘。然后在68℃用0.5×SSC/0.1％SDS液清洗膜兩次，每次30分鐘。在1％阻斷試劑中孵育膜1小時(shí)后，膜用綿羊抗-DIG堿性磷酸酶(AP)結(jié)合物的1∶10,000稀釋溶液孵育30分鐘。未結(jié)合的抗體通過(guò)用馬來(lái)酸清洗緩沖液(100mM馬來(lái)酸，150mM NaCl，pH7.5，和0.3％Tween 20)清洗兩次，每次15分鐘而清除。膜在AP檢測(cè)緩沖液(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，和50mMMgCl2)中孵育10分鐘，然后加入化學(xué)發(fā)光底物3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2’-(5’-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸}-4基)苯基磷酸二鈉(CSPD)(Roche Applied Science)1∶50稀釋液，隨后將膜密封在兩片透明薄膜中并將其暴露在X-線薄膜下1.5小時(shí)。含有南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)基因組DNA與16D10 cDNA雜交的印跡，顯示16D10以3-4個(gè)拷貝或同源物存在于四種重要的農(nóng)業(yè)根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)中(圖6)。沒(méi)有檢測(cè)到與大豆胞囊線蟲(chóng)H.glycines、非寄生自由生存的線蟲(chóng)秀麗隱桿線蟲(chóng)、和植物(煙草和擬南芥)的基因組DNA的雜交。
實(shí)施例6序列分析 在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)，用BLAST程序PSI-BLASTP和BLASTX，進(jìn)行序列相似性檢索(Altschul等，1998)。用ClustalW1.8產(chǎn)生了根結(jié)線蟲(chóng)16D10基因組DNA序列的多重序列比對(duì)(Jeanmougin等，1994)。對(duì)于分泌和切割位點(diǎn)的信號(hào)肽的預(yù)測(cè)借助于SignalP程序進(jìn)行(Nielsen等，1997)。
實(shí)施例7原位雜交 通過(guò)不對(duì)稱PCR(Huang等，2003)，16D10 cDNA克隆的特定正向和反向引物，用于合成洋地黃毒甙(DIG)標(biāo)記的有義和反義cDNA探針(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)等。原位雜交用南方根結(jié)線蟲(chóng)以福爾馬林固定的、通透化的寄生前幼蟲(chóng)和混合的寄生期進(jìn)行(De Boer等，1998；Huang等，2003)。在線蟲(chóng)內(nèi)雜交的cDNA探針以堿性磷酸酶結(jié)合的抗DIG抗體和底物檢測(cè)，并且標(biāo)本用復(fù)合型光學(xué)顯微鏡觀察(DeBoer等，1998)。原位mRNA雜交揭示，16D10在南方根結(jié)線蟲(chóng)的寄生早期，在兩種側(cè)腹食道腺細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。
實(shí)施例8免疫熒光分析 按照Goverse等(1994)之前敘述的方法，提純的16D10多克隆抗血清用來(lái)以間接免疫熒光法定位16D10在南方根結(jié)線蟲(chóng)的寄生前J2、混合寄生期的切片中的表達(dá)。在新鮮配制的含2％多聚甲醛的PBS緩沖液(80mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4，100mM NaCI，pH7.4)中在40℃固定5天后，線蟲(chóng)在PBS緩沖液中洗三次，在去離子水中洗一次。固定的線蟲(chóng)被切成切片，孵育在37℃每ml含有0.6mg蛋白酶K(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)的磷酸緩沖鹽水(PBS)緩沖液中1小時(shí)。以PBS洗過(guò)一次后，部分消化的線蟲(chóng)放在-80℃冰箱中20分鐘，在干冰狀冷甲醇中孵育3分鐘，然后在干冰狀冷丙酮中孵育15分鐘。線蟲(chóng)用如前所述(Goverse等，1994)的用蛋白酶抑制劑改良的封閉液(10％山羊血清，0.02％NaN3，1mM苯甲基磺酰氟，1×PBS)清洗一次，在4℃下孵育3天，然后立即用于熒光免疫。封閉過(guò)的線蟲(chóng)等分放入96孔Multiscreen板(Millipore，Bedford，MA)的孔中，攪拌在ELISA稀釋劑(0.05％Tween，0.02％NaN3，1％BSA，1×PBS)中1∶250稀釋的16D10純化的多克隆抗體，室溫下在潮濕的艙中過(guò)夜。線蟲(chóng)切片用PBST(1χ×PBS，0.5％Triton X-100)洗三次，每次5分鐘，并在室溫下黑暗中，1∶1000稀釋的熒光素異硫氰酸鹽(FITC)-結(jié)合的山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在Tris-鹽水-BSA(0.15M NaCl，0.01MTris，pH7.2，0.2％Triton X-100，3％BSA)中攪拌3小時(shí)。切片在PBST中洗兩次，用蒸餾水洗一次。處理的切片在15-μl水滴中被轉(zhuǎn)移到事先用5μl 0.1％聚-L-賴氨酸(Sigma Chemical)包被的Multitest玻片(ICN-Flow，Horsham，PA)上的單個(gè)孔中。切片在玻片上空氣干燥，用抗淬滅劑(500mM碳酸鹽緩沖液中0.02mg/ml苯二胺，pH8.6，與無(wú)熒光的甘油混合)的3μl小滴覆蓋，并用蓋玻片。標(biāo)本在Olympus熒光顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照由免疫前的兔血清組成。提純的16D10抗血清結(jié)合到寄生前和寄生J2的側(cè)腹腺細(xì)胞及其細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)展和膨脹壺腹(expanded ampullae)內(nèi)的分泌顆粒上，其位于掌部的泵室(pumpchamber)后方。在任何的線蟲(chóng)標(biāo)本上均沒(méi)有觀察到與免疫前的兔血清的特異標(biāo)記。
實(shí)施例9蛋白提取 通過(guò)研磨置于液氮的微量離心管中200μl提取緩沖液[100mMTris-HCI，pH7.0，150mM NaCl和1×全蛋白酶抑制劑(completeprotease inhibitors)(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)]內(nèi)的南方根結(jié)線蟲(chóng)和大豆胞囊線蟲(chóng)的寄生前J2和混合寄生期，提取線蟲(chóng)蛋白。通過(guò)研磨置于液氮的微量離心管中200μl提取緩沖液[50mM Tris-HCI，pH7.0，150mM NaCl，1×全蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science)]內(nèi)的轉(zhuǎn)基因幼苗和根組織，提取植物蛋白(0.5g)。13,000rpm離心10分鐘后，從組織勻漿中回收上清液。用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)所有的蛋白濃度(用Bio-Rad Protein Assay Kit II)。作為陽(yáng)性對(duì)照，從Sigma-Genosys，TX合成的16D10肽(GKKPSGPNPGGNN，純度＞95％)(SEQ ID NO52)用于免疫檢測(cè)分析(見(jiàn)實(shí)施例12-13)。
實(shí)施例10采集口針?lè)置谖? 按照Davis等(1994)的敘述，在體外產(chǎn)生和采集南方根結(jié)線蟲(chóng)J2的口針?lè)置谖铩＜纳癑2在室溫的潮濕艙中，在0.4％間苯二酚(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培育6小時(shí)。口針?lè)置谖锿ㄟ^(guò)添加等體積的0.1M Tris-NaOH，pH11.0而溶解。溶解的口針?lè)置谖镉肧trataClean(Stratagene，La JoIIa，CA)濃縮。短時(shí)間里，通過(guò)在誘引混合物(460ml)上清液中懸浮1.5ml珠子并將其在恒定的混合下孵育1小時(shí)，溶解的分泌蛋白被俘獲。珠子被離心，重新懸浮在2×SDS-PAGE樣品緩沖液中，煮沸3分鐘釋放吸附的蛋白。濃縮的口針?lè)置谖镉锰峒兊?6D10抗血清，用于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和免疫印跡分析(見(jiàn)實(shí)施例11-13)。兩種分析均在口針?lè)置谖镏校约澳戏礁Y(jié)線蟲(chóng)J2和混合寄生期的總提取物中，鑒別到了16D10。
實(shí)施例11生產(chǎn)抗血清 用Eurogentec，Inc.(Herstal，Belgium)的合成的成熟(即不帶N-端信號(hào)肽)16D10肽(GKKPSGPNPGGNN)(SEQ ID NO52)免疫兩只兔子制備16D10抗血清。用肽抗原從15ml最終粗制血清中親和純化抗血清。肽親和純化的16D10多克隆抗血清，用在免疫熒光顯微鏡法(Goverse等，1994)中定位南方根結(jié)線蟲(chóng)標(biāo)本中16D10的表達(dá)，并用在口針?lè)置谖锖娃D(zhuǎn)基因植物表達(dá)的或體外翻譯的16D10中16D10的免疫檢測(cè)。
實(shí)施例12Western斑點(diǎn)印跡分析 蛋白質(zhì)樣品(2μl)點(diǎn)到Hybond ECL硝酸纖維素上。使硝酸纖維素膜空氣干燥20分鐘。膜在封閉液(2％脫脂奶粉，1×Tris-緩沖鹽水-Tween[TBS-T20mM Tris-HCl，pH7.4，0.8％NaCl，0.1％Tween 20])中37℃孵育過(guò)夜，然后用純化的16D10多克隆抗血清(1∶2,000)處理，繼之以抗兔IgG(全分子)堿性磷酸酶結(jié)合物(1∶30,000)(Sigma)處理。膜在1×TBS-T緩沖液中室溫下洗三次，室溫下在底物溶液中(10ml AP緩沖液[100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl]中，45μl硝基藍(lán)四唑[NBT]溶液和35μlδ-溴-氯-S-吲哚基-磷酸鹽toluidinium[BCIP]溶液)孵育直至出現(xiàn)顏色。
實(shí)施例13ELISA分析 對(duì)Pratt等(1986)的方法修改后進(jìn)行ELISA。Dynatech Immulon板包被有下列來(lái)源的硼酸鹽水(0.2M硼酸鈉，75mM NaCl，pH8.5)稀釋的蛋白，4°下過(guò)夜1000×濃縮的南方根結(jié)線蟲(chóng)J2的口針?lè)置谖?μl，南方根結(jié)線蟲(chóng)pre-J2、南方根結(jié)線蟲(chóng)MS、大豆胞囊線蟲(chóng)pre-J2和MS的總提取蛋白10μg，或BSA(Sigma Chemical)10μg作為陰性對(duì)照。用100ng合成的16D10肽(純度＞95％，Sigma-Genosys，TX)包被孔，作為陽(yáng)性對(duì)照。用清洗緩沖液(10mM Tris.HCI，pHδ.0，0.5M NaCl)洗孔三次，以PBS(32.9mM Na2HPO4，1.77mM NaH2PO4，0.14M NaCl，pH7.4)的1％BSA室溫下封閉30分鐘。用清洗緩沖液洗一次后，每個(gè)包被的孔用被PBS的0.5％BSA液1∶1,000稀釋的純化16D10多克隆抗血清在室溫下孵育1小時(shí)。陰性對(duì)照包括省略用初級(jí)多克隆抗體孵育，和用兔免疫前血清孵育。洗孔三次，用堿性磷酸酶-結(jié)合的山羊抗兔抗體(Sigma Chemical)1∶5,000稀釋?zhuān)谑覝叵路跤?小時(shí)，在加入磷酸鹽比色底物之前清洗三次。底物對(duì)-硝基苯磷酸鹽根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，在堿性磷酸酶緩沖液(1M二乙醇胺，0.5mM MgCl2，pH 9.8)中制備，并在用3N NaOH停止反應(yīng)前，于室溫下在處理過(guò)的孔中孵育30分鐘。在ELISA讀數(shù)器上測(cè)定405nm和490nm下的吸光度。
實(shí)施例14構(gòu)建質(zhì)粒 用導(dǎo)入Kpn\或Xba\限制性位點(diǎn)(下劃線處)和終止/啟動(dòng)密碼子(斜體字)的引物16D10SF(5’-CGGGGIACCLAGATGTTTACTAATTCAATTAA-S′)(SEQ IDNO57)或16D10F(5′-CGGGGTACCTAGATGGGCAAAAAGCCTAGTG-3′)(SEQ IDNO58)和16D10R(5′-GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-3′)(SEQID NO59)，從全長(zhǎng)cDNA克隆擴(kuò)增帶有或不帶有信號(hào)肽序列的16D10編碼區(qū)，克隆到二元載體pBIX的位于CaMV 35S啟動(dòng)子的控制下的Kpn\和Xba\位點(diǎn)，分別產(chǎn)生pBIX(16D10S)和pBIX(16D10)，并通過(guò)測(cè)序證實(shí)。pBIX從pBI101(BD Biosciences，Palo Alto，CA)衍生而來(lái)，含有nos啟動(dòng)子-nptll-nos終止子盒、35S啟動(dòng)子-gusA-nos終止子、和帶有具備Kpn\和Xba\位點(diǎn)的多接頭的第二35S啟動(dòng)子。從擬南芥基因組，用導(dǎo)入Kpn\限制性位點(diǎn)(下劃線者)的引物C3K(5′-GGGGTACCATGGATTCTAAAAGCTTTG-S′)(SEQ ID NO60)和C3R(5′-CCACTAGGCTTTTTGCCAAGGAACAAGAAGCAG-S’)(SEQID NO61)作為信號(hào)序列，以及從16D10 cDNA，采用以Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，使用為成熟肽編碼序列導(dǎo)入Xba\限制性位點(diǎn)(下劃線者)的引物C3F(5’-CTTCTGCTTCTTGTTCCTTGGCAAAAAGCCTAGTGG-S′)(SEQ IDNO62)和16D10X(5′-GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQID NO63)，通過(guò)PCR擴(kuò)增生成clv3和16D10雜交表達(dá)序列。然后將以上兩種產(chǎn)物用于在融合PCR(fusion PCT)反應(yīng)中彼此引發(fā)。得到的片段克隆到pBIX以產(chǎn)生pBIX(C3S-16D10)，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例15轉(zhuǎn)化煙草毛狀根 質(zhì)粒pBIX(16D10)、pBIX(16D10S)和作為對(duì)照的空載體pBIX，通過(guò)電穿孔(Shen and Forde，1989)轉(zhuǎn)移到發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC 15834中，并用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉轉(zhuǎn)化(Christey，1997)，轉(zhuǎn)化到煙草中(Nicotiana tabacum cv Petite Havana SR1)。從帶有100mg/L卡那霉素和timentins(230.8mg/L替卡西林二鈉加上7.69mg/L克拉維酸鉀)的含有0.8％Noble瓊脂的Gamborg′s B-5板上，生成了轉(zhuǎn)化的毛狀根。24℃下，黑暗中培養(yǎng)單個(gè)毛狀根稍(約0.5cm)3周，單個(gè)毛狀根體系的2-3個(gè)根接受GUS-染色(Jefferson等，1987)。經(jīng)PCR分析證實(shí)有卡那霉素抗性并且GUS陽(yáng)性而沒(méi)有細(xì)菌污染的根系，用于建立毛狀根體系。每?jī)芍軐⒏栽贕amborg′s B-5平板上進(jìn)行次培養(yǎng)(subculture)，用于在沒(méi)有激素的Gamborg’s B-5板上進(jìn)行根生長(zhǎng)分析，切過(guò)的根在原來(lái)的平板上于24℃黑暗中保持培養(yǎng)用于分析。為了分析根生長(zhǎng)，平板在黑暗中水平培養(yǎng)，研究5個(gè)來(lái)自各轉(zhuǎn)基因體系的毛狀根，每個(gè)重復(fù)三次。采用與在轉(zhuǎn)基因擬南芥的方法中相同的程序，等對(duì)按照所述方法(Does等，1991)鑒別的帶有單個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的轉(zhuǎn)基因毛狀根或愈傷組織進(jìn)行有關(guān)的RT-PCR和免疫印跡分析。16D10在毛狀根細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增進(jìn)了根生長(zhǎng)率約65％[在16D10轉(zhuǎn)基因體系中，2周后平均根長(zhǎng)度為5.20±0.61cm(n＝90)，比較之下，對(duì)照體系為3.15±0.34cm(n＝90)]，在第5周產(chǎn)生了茂盛的側(cè)根，并在根被切下進(jìn)行次培養(yǎng)之處形成愈傷組織。16D10表達(dá)的RT-PCR分析顯示，愈傷組織中穩(wěn)態(tài)mRNA水平高于毛狀根。用純化16D10抗血清進(jìn)行的免疫印跡分析揭示，16D10在毛狀根和愈傷組織二者中產(chǎn)生。在對(duì)照載體轉(zhuǎn)化的毛狀根中沒(méi)有檢測(cè)到16D10的表達(dá)。
實(shí)施例16擬南芥Floral-dip轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒pBIX(16D10)、pBIX(C3S-16D10)和作為對(duì)照的空載體pBIX，以電穿孔(Shen和Forde，1989)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58C1中，并通過(guò)floral dip法(Clough和Bent，1998)，轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型Col-O植株中?？敲顾乜剐?、GUS染色(Jefferson等，1987)和16D10的分離(segregate)，與PCR分析結(jié)合，證實(shí)轉(zhuǎn)基因純合T2系的產(chǎn)生。反向PCR(Does等，1991)以基因組中的單個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝鑒別純合系，用于分子和根生長(zhǎng)分析。每個(gè)轉(zhuǎn)基因系的30株植物，每個(gè)重復(fù)三次，以16h有光(24℃)/8h黑暗(20℃)的周期，體外培養(yǎng)在帶有3％蔗糖的MS平板上，平板保持垂直以便根生長(zhǎng)分析。
產(chǎn)生了四種轉(zhuǎn)基因擬南芥T2純合子系，其含有在35S啟動(dòng)子控制下的16D10單個(gè)拷貝，沒(méi)有信號(hào)肽。還產(chǎn)生了來(lái)源于空白轉(zhuǎn)化載體的兩種轉(zhuǎn)基因系作為對(duì)照。RT-PCR和免疫印跡分析證實(shí)，16D10在所有的16D10轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)，但是不在對(duì)照系中表達(dá)。與對(duì)照比較，16D10在擬南芥細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增加了初生根的長(zhǎng)度達(dá)85％[四種16D10轉(zhuǎn)基因系(n＝90/系)，平均54.01±8.75mm，兩個(gè)對(duì)照系(n＝90/系)為29.20±4.50mm]，并且側(cè)枝和不定根的數(shù)量分別增加了1.4倍和2.08倍(圖2和圖3)。初生根生長(zhǎng)的增加與側(cè)根數(shù)量的增加和不定根數(shù)量的增加密切相關(guān)。3天內(nèi)根稍生長(zhǎng)率的測(cè)定顯示，僅在16D10根的分生區(qū)有長(zhǎng)度增加(20％)，表明細(xì)胞數(shù)量而不是細(xì)胞大小的增加促進(jìn)了根生長(zhǎng)。
實(shí)施例17互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 由于成熟16D10肽13aa(GKKPSGPNPGGNN)(SEQ ID NO52)含有擬南芥CLV3-樣蛋白功能區(qū)保守C-端13aa基序(KRLVPSGPNPLHN)(SEQ ID NO54)的8aa(K-PSGPNP-N)(SEQ ID NO53)(Cock和McCormick，2001)，以擬南芥CLAVATA3信號(hào)肽編碼南方根結(jié)線蟲(chóng)16D10的質(zhì)粒pBIX(Clv3S-16D10)，借助于根癌農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)的floral-dip轉(zhuǎn)化(Clough和Bent，1998)，被轉(zhuǎn)移到擬南芥clv3突變株clv3-1(中間體)、clv3-2和clv3-6中，用于功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。作為對(duì)照，質(zhì)粒pBIX(16D10)和pBIX也被導(dǎo)入到clv 3突變體中。還產(chǎn)生了三種轉(zhuǎn)基因T2純合系用于各自的構(gòu)建體。按照Fletcher等(1999)的記述，研究16D10轉(zhuǎn)化的clv3系的表現(xiàn)型(花和莖尖分生組織)并與載體轉(zhuǎn)化系、擬南芥野生型生態(tài)型Col-O以及clv3突變株后代相比較。雖然16D10含有擬南芥CLV3-樣蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，但16D10在擬南芥clv3突變株的質(zhì)外體或細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)并沒(méi)有恢復(fù)野生型表型，表明16D10沒(méi)有作為CLV3-樣蛋白的功能。
實(shí)施例18組織學(xué)分析 擬南芥的初生根被固定和脫水(Dolan等，1993)，用低黏度包埋(Low Viscosity Embedding)試劑盒(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)依照制造商的說(shuō)明書(shū)包埋在Spurrs樹(shù)脂中。用Reichert-Jung Ultracut E切片機(jī)制作薄切片(0.4μM)，并用1％甲苯胺藍(lán)染色。根分生組織之內(nèi)和之上的根橫切片和根稍的縱切片表明，與野生型比較，在轉(zhuǎn)基因系中，平均細(xì)胞大小以及細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞層的數(shù)量沒(méi)有不同。在我們的轉(zhuǎn)基因植物中，根形態(tài)學(xué)也沒(méi)有改變，增進(jìn)生長(zhǎng)伴隨著加速根系發(fā)育。因此，16D10的異位表達(dá)提高了根生長(zhǎng)率并誘導(dǎo)側(cè)根萌發(fā)，可能是通過(guò)刺激分生組織中的細(xì)胞分裂，增加細(xì)胞產(chǎn)生率而不改變分生組織的構(gòu)成。
實(shí)施例19相關(guān)RT-PCR 對(duì)從等量植物組織中提取的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR。上述的16D10基因特異性引物16D10F和16D10R用在后續(xù)的PCR擴(kuò)增中。在對(duì)照中，從擬南芥野生型生態(tài)型Col-O中均一表達(dá)的UBQ10基因(基因庫(kù)登記號(hào)NM_202787)設(shè)計(jì)引物UBQ1(5′-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-S′)(SEQ ID NO64)和UBQ2(5′-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAGG-S′)(SEQ ID NO65)，用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因擬南芥系的483bp獨(dú)有序列。引物ActF(5′-CCGGTCGTGGTCTTACTGAT-S’)(SEQ ID NO66)和ActR(5′-GCACCGATTGTGATGACTTG-S’)(SEQ ID NO67)從煙草(N.tabacum cv)Petite Havana SR1均一表達(dá)的肌動(dòng)蛋白基因(基因庫(kù)登記號(hào)U60494)中設(shè)計(jì)，用于從轉(zhuǎn)基因煙草毛狀根中擴(kuò)增煙草肌動(dòng)蛋白(Tob104)基因的獨(dú)有序列。PCR含有下列成分10×BD Advantage 2PCR緩沖液5μl，10mM dNTP混合物1.0μl，5′引物1.5μl，3′引物1.5μl，cDNA 2μl，水38μl和50×BD Advantage 2聚合酶混合物1.0μl(BDBiosciences，Palo Alto，CA)。PCR循環(huán)的組成為94℃下初始變性步驟2分鐘，隨后是35個(gè)循環(huán)的94℃下1分鐘、55℃下30秒、72℃下40秒和最后10分鐘72℃下的延伸步驟。每個(gè)RT-PCR反應(yīng)的10微升等分試樣在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用相應(yīng)的DIG-標(biāo)記的DNA探針雜交。RT-PCR分析表明，16D10轉(zhuǎn)錄本在16D10轉(zhuǎn)基因煙草的毛狀根和擬南芥系中穩(wěn)定存在，但在載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照系中缺乏。
實(shí)施例20酵母雙雜交篩選 酵母雙雜交篩選中采用了MATCHMAKER酵母雙雜交系統(tǒng)II(BDBiosciences，Palo Alto，CA)。編碼16D10成熟肽的cDNA被按閱讀框克隆進(jìn)入pGBKT7的GAL4-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)，產(chǎn)生pGBKT7(16D10)并表達(dá)作為誘餌以在pGADT7的GAL4活化結(jié)構(gòu)域(AD)中篩選從番茄根組織的mRNA構(gòu)建的番茄根cDNA文庫(kù)。12個(gè)全長(zhǎng)編碼SCL的cDNAs(AtSCLI，AtSCL3，AtSCL5，AtSCL6，AtSCLQ，AtSCL13，AtSCL14，AtSCL21，AtSCR，AtSHR，AtRGA，AtGAI)，用各基因的基于基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)(Bolle，2004)中相應(yīng)序列的特定引物，從擬南芥根組織mRNA制成的根cDNA庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，并按閱讀框克隆在pGADT7中。各構(gòu)建體用pGBKT7(16D10)導(dǎo)入酵母菌株AH109。編碼AtSCL6和AtSCL21特定區(qū)域的cDNA克隆在pGADT7之中，然后與pGBKT7(16D10)共同轉(zhuǎn)化到菌株AH109中。包括cDNA文庫(kù)篩選、陽(yáng)性克隆的選擇和β-半乳糖苷酶活性分析的所有程序，依照MATCHMAKER酵母雙雜交系統(tǒng)II(BD Biosciences，Palo Alto，CA)的規(guī)程進(jìn)行。兩種擬南芥SCL蛋白AtSCL.6和AtSCL.21，與16D10在酵母中相互反應(yīng)。結(jié)構(gòu)域分析表明，16D10與AtSCL.6和AtSCL21的SAW結(jié)構(gòu)域特異性相互反應(yīng)，但16D10與SCL蛋白的其余結(jié)構(gòu)域沒(méi)有相互反應(yīng)，顯示了SCL轉(zhuǎn)錄因子是RKN寄生植物期間分泌的16D10的推定靶標(biāo)。
實(shí)施例21浸透(Soaking)得到RNAi 16D10的42bp和271bp序列用下列引物從全長(zhǎng)cDNA克隆分別擴(kuò)增16D10T7F1(5′-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCAAAAATACCATAAAG-3′)(SEQ ID NO68)和16D10T7R1(5′-TAATACGACTCACTATAGGGGAAATTAACAAAGGAAACC-S′)(SEQ ID NO69)，和16D10T7F2(5′-TAATACGACTCACTATAGGGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-S)(SEQ ID NO70)和16D10T7R2(5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQ ID NO71)，各自引入RNA引物位點(diǎn)T7(下劃線者)。用MEGAscript RNAi試劑盒(Ambion，Austin，TX)，按照制造商的說(shuō)明書(shū)，以凝膠純化的PCR產(chǎn)物用作模板，在體外的單一反應(yīng)中合成16D10RNA的有義鏈和反義鏈，不同的是反應(yīng)孵育16小時(shí)以增加RNA產(chǎn)率。生成的雙鏈(ds)RNA的數(shù)量和質(zhì)量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序(Sambrook等，1989)估計(jì)和定量。dsRNA產(chǎn)物用乙醇沉淀，并重新懸浮在沒(méi)有核酸酶的水中，濃度為10-15μg/μl。
大約10,000條新孵化的南方根結(jié)線蟲(chóng)J2浸在含有1mg/ml 16D10dsRNA、1％間苯二酚、0.13mg/ml FITC異構(gòu)體I、0.05％明膠和3mM亞精胺的1/4M9緩沖液(10.9mM Na2HPO4，5mM KH2PO4，4JmM NH4Cl，和2.2mM NaCl)中，并在旋轉(zhuǎn)器上室溫下黑暗中孵育4小時(shí)。間苯二酚(Res)用來(lái)幫助刺激攝取dsRNA。對(duì)照樣品在同樣的但沒(méi)有間苯二酚或dsRNA的溶液中孵育。浸透后，線蟲(chóng)通過(guò)離心法用不含核酸酶的水徹底清洗5次，用Olympus熒光顯微鏡觀察，處理過(guò)的線蟲(chóng)大約100％攝取FITC，這是攝取dsRNA的標(biāo)記。用從等量處理過(guò)的J2的mRNA合成的cDNA第一條鏈作為模板，用南方根結(jié)線蟲(chóng)組成型表達(dá)的肌動(dòng)蛋白基因(基因庫(kù)登記號(hào)BE225475)片段擴(kuò)增的284bp作為對(duì)照，以相關(guān)RT-PCR分析(relative RT-PCR)對(duì)轉(zhuǎn)基因J2進(jìn)行分析，確定16D10轉(zhuǎn)錄體的沉默。根結(jié)線蟲(chóng)二期幼蟲(chóng)攝取短的或全長(zhǎng)16D10 dsRNA，導(dǎo)致了處理過(guò)的線蟲(chóng)中16D10轉(zhuǎn)錄本顯著減少(圖4)，為用RNAi在根結(jié)線蟲(chóng)體內(nèi)靶定16D10提供了直接證據(jù)。
南方根結(jié)線蟲(chóng)的J2還按上述方法用對(duì)8H11(SEQ ID NO17)或31H06(SEQ ID NO33)特異的1mg/ml dsRNA浸透。相關(guān)RT-PCR分析揭示，根結(jié)線蟲(chóng)二期幼蟲(chóng)攝取8H11和31H06 dsRNA，導(dǎo)致了處理過(guò)的線蟲(chóng)中這兩種附加的寄生基因的轉(zhuǎn)錄本顯著減少(圖5)。
實(shí)施例22植物內(nèi)(In planta)遞送RNAi 用下列分別導(dǎo)入Xho\、Kpn\、Cla\或Xbal限制性位點(diǎn)(下劃線處)的基因特異性引物，從全長(zhǎng)cDNA克隆擴(kuò)增16D10的有義或反義cDNAs(42bp或271bp)16D10Xho1(δ′-CCGCTCGAGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-S’)(SEQ ID NO72)和16D10Kpn1(5′-CGGGGTACCTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQID NO73)，16D10Cla1(5′-CCATCGATTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQ ID NO74)和16D10Xba1(5’-GCTCTAGAGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-3′)(SEQ ID NO75)，16D10Xho3(5′-CCGCTCGAGCCTCAAAAATACCATAAAG-3′(SEQ IDNO76)和16D10Kpn2(5′-CGGGGTACCGAAATTAACAAAGGAAACC-S’)(SEQ ID NO77)，16D10Cla2(5′-CCAICGAIGAAATTAACAAAGGAAACC-S′)(SEQ IDNO78)和16D10Xba3(5’-GCICIAGACCTCAAAAATACCATAAAG-S′)(SEQ ID NO79)。PCR產(chǎn)物凝膠提純，分別用限制性酶Xho\和Kpn1，或者Cla\和Xba\消化。消化的PCR產(chǎn)物克隆到Xho-Kpn\位點(diǎn)中，或pHANNIBAL的Cla\-Xba\位點(diǎn)中，分別生成pHANNIBAL(16D10#1)和pHANNIBAL(16D10#2)。pHANNIBAL-衍生的質(zhì)粒的有義和反義16D10cDNA被亞克隆為Not\片段進(jìn)入二元載體pART27(Gleave，1992)中，產(chǎn)生高度有效的含內(nèi)含子的“發(fā)夾”RNA(ihpRNA)沉默構(gòu)建體(Wesley等，2001)。pART27衍生的構(gòu)建體用電穿孔轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌C58C1中。轉(zhuǎn)化體在含有利福平(50mg/L)、慶大霉素(25mg/L)和壯觀霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，然后通過(guò)上述floral-dip轉(zhuǎn)化導(dǎo)入擬南芥生態(tài)型Col-O中。產(chǎn)生了在CaMV35S啟動(dòng)子下，組成型轉(zhuǎn)錄16D10特異性ihpRNA的轉(zhuǎn)基因同源T2系，用于根結(jié)線蟲(chóng)，根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne)種類(lèi)的抗性分析。
實(shí)施例23抗性分析 從pART27衍生的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化生成的擬南芥轉(zhuǎn)基因系的種子，在70％(v/v)中表面消毒1分鐘，在3％(v/v)的次氯酸鈉中表面消毒5分鐘，然后在無(wú)菌蒸餾水中洗5次。消毒的種子在Gamborg′s B-5培養(yǎng)基上發(fā)芽和生長(zhǎng)3周。消毒南方根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)卵，然后按記載的方法(Sijmons等，1991)，以每株植物約500個(gè)卵接種到根部附近。接種后3周，分析感染的根部上的蟲(chóng)癭數(shù)量和大小，接種后8周，感染的根部用酸性品紅按記載(Hwang等，2000)染成紅色，并分析每克根的蟲(chóng)卵數(shù)量。表達(dá)16D10 dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥系對(duì)四種主要的根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)有抗性-南方根結(jié)線蟲(chóng)，爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)。根蟲(chóng)癭分析顯示，16D10 dsRNA轉(zhuǎn)基因擬南芥系上蟲(chóng)癭的數(shù)量(和大小)，與載體轉(zhuǎn)化系比較，減少了63-90％(圖1A、1B和表1)。線蟲(chóng)繁殖分析揭示，與對(duì)照植物比較，16D10 dsRNA轉(zhuǎn)基因系每克根的RKN蟲(chóng)卵數(shù)量減少了70-97％(圖7)。
表1 與對(duì)照植物比較，接種了四種根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)(南方根結(jié)線蟲(chóng)，爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng))的表達(dá)16D10 dsRNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥上蟲(chóng)癭的產(chǎn)生。
實(shí)施例2416d10序列數(shù)據(jù) 16D10基因組DNA序列(840bp) GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGGT TAGCCA




AATGTTTACTAATTCAATTAA AAATTTAATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTT TTGTCTGTCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCA AATCCTGGAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACG TTTAAATTAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAG CTAATTTTGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTG AATTTACTGAATAAAATTATATCTGAAAAAAA(SEQ ID NO1) (粗體是一個(gè)476-bp內(nèi)含子序列) 16D10 cDNA序列(364bp) GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTA ATTATTCTTCAATCAAAAAAATGTTTACTAATTCAATTAAAAATTT AATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTG TCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATCCTG GAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAAT TAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTT GATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTGAATTTACT GAATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA(SEQ ID NO2) 用于制作16D10 RNAi構(gòu)建體的16D10 cDNA序列區(qū) GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTA ATTATTCTTCAATCAAAAAAArGTTTACTAATTCMTTAAAAATTTA ATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTGT CTCATTTGTGGATG


AAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAA TTAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTT TGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTGAATTTAC TGAATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO2)[粗體42-bp序列用于構(gòu)建pHANNIBAL(16D10#1)，下劃線的271-bp序列用于構(gòu)建pHANNIBAL(16D10#2)] pHANNIBAL(16D10#1) (a)構(gòu)建體(Xho\+42bp 16D10有義鏈序列+Kpn\＝54bp)+Pdk內(nèi)含子+(C/a1+42bp 16D10反義鏈序列+Xba\＝54bp) Xho1 CICGAGGGCAAAAAGCCT AGTGGGCCAAATCCTGGAGGAAAT AATTGAGGIACC.............. .Kpn\........... ..........................Pdk內(nèi)含 子........................................... ........................................... C/a1 ATCGATTCAATTATTTCCTCCAGGATTTGGCCCACTAGGCTTT TTGCCICIAGA Xba1 SEQ ID NO3) (b)PCR檢測(cè)引物H1 F1 & H1 R1(234bp PCR產(chǎn)物) 引物H1 F2 & H1 R2(273bp PCR產(chǎn)物) pHANNIBAL(16D10#2) (1).構(gòu)建體#2(Xho\+271 bp 16D10有義鏈序列+Kpn\＝283bp)+Pdk內(nèi)含子+(C/a1+271bp 16D10反義鏈序列+Xba\＝283bp) Xho\ CTCGAGCCTCAAAAATACCATAAAGTTAATTATTCTTCAATCA AAAAAATGTTT ACTAATTCAATT AAAAATTT AATT ATTT ATTTAATGCCTTTATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTGTCTCAT TTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATCCTGGAG GAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAATTA AACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTT GATGGTTTCCTTTGTTAATTTC GGTACC Kpn\-------Pdk內(nèi)含子 ---------- C/a1 ATCGATGAAATTAACAAAGGAAACCATCAAAATTAGCTTAATT TAAATTCCATTATTTCCCATTTATCGTTTAATTTAAACGTTTTT CTTCAATCATTTTTCTTCAATTATTTCCTCCAGGATTTGGCCCA CTAGGCTTTTTGCCTGCATCCACAAATGAGACAGACAAAAGCA TTAAAGTAACCATTAAAGGCATTAAATAAATAATTAAATTTTT AATTGAATTAGTAAACATTTTTTTGATTGAAGAATAATTAACTT TATGGTATTTTTGAGG TCTAGA(SEQ ID NO4) XaI 表權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其包含對(duì)至少一部分編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌多肽的核酸有特異性的抑制性核酸。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞對(duì)由至少兩種不同的線蟲(chóng)直接或間接引起的線蟲(chóng)病害有抗性。
3.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞對(duì)由南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)直接或間接引起的線蟲(chóng)病害有抗性。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞還對(duì)由爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)直接或間接引起的線蟲(chóng)病害有抗性。
5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞還對(duì)由花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.arenaria)直接或間接引起的線蟲(chóng)病害有抗性。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞還對(duì)由馬鈴薯根結(jié)線蟲(chóng)(M.chitwoodi)直接或間接引起的線蟲(chóng)病害有抗性。
7.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中通過(guò)寄生的線蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，與對(duì)照植物或細(xì)胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預(yù)防線蟲(chóng)食道多肽表達(dá)的量。
8.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中與對(duì)照植物或細(xì)胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預(yù)防線蟲(chóng)病害的量。
9.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中通過(guò)至少兩種根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)的寄生線蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，與對(duì)照植物或細(xì)胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預(yù)防線蟲(chóng)食道多肽表達(dá)的量。
10.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中與對(duì)照植物或細(xì)胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預(yù)防由至少兩種不同的根結(jié)線蟲(chóng)引起的線蟲(chóng)病害的量。
11.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中線蟲(chóng)食道多肽或其片段調(diào)節(jié)植物或細(xì)胞的基因表達(dá)，巨細(xì)胞的形成，線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移，植物的細(xì)胞代謝，在植物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或形成能使線蟲(chóng)從植物中形成的巨細(xì)胞取食的取食管。
12.權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中植物或細(xì)胞的基因表達(dá)通過(guò)線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽直接或間接地調(diào)節(jié)。
13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)生在根細(xì)胞中。
14.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬(Meloidogyne spp.)的成員。
15.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞是單子葉或雙子葉的。
16.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞是選自薔薇科(Rosaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、西番蓮科(Passifloraceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、錦葵科(Malvaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、葡萄科(Vitaceae)、茄科(Solanaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、茜草科(Rubiaceae)、豆科(Leguminosae)和十字花科(Brassicaceae)的系統(tǒng)發(fā)生家族的成員。
17.權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因植物是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類(lèi)、紫花苜蓿、煙草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
18.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸包括至少一部分與編碼由SEQ ID NOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼的蛋白的部分或全部mRNA互補(bǔ)的序列。
19.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸包括小干擾RNA。
20.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸包括微小RNA。
21.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸包括反義DNA。
22.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸抑制或干擾編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽的mRNA的翻譯。
23.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸誘導(dǎo)或促進(jìn)編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽的mRNA的降解。
24.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞包括對(duì)不同的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽特異的兩種或多種抑制性核酸。
25.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸包含非天然或天然核苷酸。
26.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中抑制性核酸包含至少一種修飾的核苷酸間的連接。
27.一種組合物，其包含對(duì)編碼由SEQ ID NOs 1、2、或5-51中的一種或多種編碼的多肽或其片段或同源體的mRNA或其片段具有特異性的抑制性核酸，當(dāng)遞送到線蟲(chóng)中時(shí)，其量足以抑制由SEQ ID NOs1、2或5-51中的一種或多種編碼的多肽或其同源體的表達(dá)。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中由SEQ ID NOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼的多肽或其片段調(diào)節(jié)植物或細(xì)胞的基因表達(dá)，巨細(xì)胞的形成，線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移，植物的細(xì)胞代謝，在植物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或形成使線蟲(chóng)從植物中形成的巨細(xì)胞取食的取食管。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中植物或細(xì)胞的基因表達(dá)被多肽直接或間接地調(diào)節(jié)。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)生在根細(xì)胞中。
31.權(quán)利要求27的組合物，其中線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬的成員。
32.權(quán)利要求27的組合物，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞是單子葉或雙子葉的。
33.權(quán)利要求27的組合物，其中植物或細(xì)胞是選自薔薇科、蝶形花科、西番蓮科、葫蘆科、錦葵科、大戟科、葡萄科、茄科、旋花科、茜草科、豆科和十字花科家族的成員。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中植物或細(xì)胞是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類(lèi)、紫花苜蓿、煙草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
35.一種細(xì)胞，包含編碼抑制性核酸的核酸，所述抑制性核酸對(duì)編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽的mRNA或其片段具有特異性，所述多肽調(diào)節(jié)植物或細(xì)胞的基因表達(dá)，巨細(xì)胞的形成，線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移，植物的細(xì)胞代謝，在植物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或形成使線蟲(chóng)從植物中形成的巨細(xì)胞取食的取食管。
36.一種載體，包含與編碼抑制性核酸的核酸可操作連接的啟動(dòng)子，所述抑制性核酸對(duì)編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞多肽的mRNA具有特異性，所述多肽調(diào)節(jié)植物或細(xì)胞的基因表達(dá)，巨細(xì)胞的形成，線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移，植物的細(xì)胞代謝，在植物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或形成使線蟲(chóng)從植物中形成的巨細(xì)胞取食的取食管。
37.權(quán)利要求36的載體，其中線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白由SEQ ID NOs1、2或5-51中的一種或多種編碼。
38.一種為植物提供線蟲(chóng)抗性的方法，包括在植物內(nèi)表達(dá)對(duì)線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白特異的抑制性核酸。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬的成員。
40.一種為植物提供線蟲(chóng)抗性的方法，包括將植物與對(duì)一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白特異的一種或多種抑制性核酸接觸，所述抑制性核酸的量足以減少線蟲(chóng)病害。
41.權(quán)利要求40的方法，其中一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞蛋白直接或間接調(diào)節(jié)植物或細(xì)胞的基因表達(dá)，巨細(xì)胞的形成，線蟲(chóng)通過(guò)植物根組織的遷移，植物的細(xì)胞代謝，在植物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或形成使線蟲(chóng)從植物中形成的巨細(xì)胞取食的取食管。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬的成員。
43.權(quán)利要求40的方法，其中植物對(duì)至少兩種不同的根結(jié)線蟲(chóng)病害具有抗性。
44.權(quán)利要求40的方法，其中植物對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)引起的線蟲(chóng)病害具有抗性。
45.一種轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，包含至少一部分編碼寄生線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌多肽的核酸。
46.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中與對(duì)照植物或細(xì)胞比較，食道腺細(xì)胞分泌多肽促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物根的生長(zhǎng)。
47.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中與對(duì)照植物或細(xì)胞比較，食道腺細(xì)胞分泌多肽表達(dá)的量有效提高轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞的根生長(zhǎng)。
48.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中食道腺細(xì)胞分泌多肽在根細(xì)胞中表達(dá)。
49.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬的成員。
50.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中線蟲(chóng)不是胞囊線蟲(chóng)屬(Heterodera spp)的成員。
51.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞是單子葉或雙子葉的。
52.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞是選自薔薇科、蝶形花科、西番蓮科、葫蘆科、錦葵科、大戟科、葡萄科、茄科、旋花科、茜草科、豆科和十字花科家族的成員。
53.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中植物是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類(lèi)、紫花苜蓿、煙草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
54.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中核酸包括SEQ ID NOs1、2或5-51的至少一部分。
55.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞包含兩種或多種編碼不同線蟲(chóng)分泌多肽的核酸。
56.一種組合物，包含
包含SEQ ID NOs 1、2或5-51、其互補(bǔ)序列、其片段、或其同源體的核酸，當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)，其量足以增強(qiáng)或促進(jìn)根生長(zhǎng)。
57.一種組合物，包含
由SEQ ID NOs 1、2或5-51、其互補(bǔ)序列、其片段、或其同源體編碼的多肽，其量足以增強(qiáng)或促進(jìn)根生長(zhǎng)。
58.權(quán)利要求57的組合物，其中線蟲(chóng)是根結(jié)線蟲(chóng)屬的成員。
59.權(quán)利要求57的組合物，其中線蟲(chóng)是胞囊線蟲(chóng)屬的成員。
60.權(quán)利要求57的組合物，其中轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞是單子葉或雙子葉的。
61.權(quán)利要求57的組合物，其中植物或細(xì)胞是選自薔薇科、蝶形花科、西番蓮科、葫蘆科、錦葵科、大戟科、葡萄科、茄科、旋花科、茜草科、豆科和十字花科家族的成員。
62.權(quán)利要求61的組合物，其中植物或細(xì)胞是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿卜、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類(lèi)、紫花苜蓿、煙草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
63.一種細(xì)胞，包含編碼刺激根生長(zhǎng)的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌多肽的核酸。
64.一種載體，包含與編碼刺激植物根生長(zhǎng)的線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌蛋白的核酸可操作地連接的啟動(dòng)子。
65.權(quán)利要求64的載體，其中線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌蛋白由SEQ IDNOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼。
66.一種刺激根生長(zhǎng)或提高側(cè)根或不定根生成的方法，包括將線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌多肽遞送到根細(xì)胞內(nèi)部。
67.一種產(chǎn)生改變的植物、植物細(xì)胞或植物組織的方法，包括將一種或多種線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌多肽導(dǎo)入所述植物的細(xì)胞、組織或器官中。
68.一種由權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞產(chǎn)生的種子。
69.一種與相應(yīng)的野生型植物相比較表現(xiàn)出增強(qiáng)的根生長(zhǎng)的重組植物，其中所述重組植物包含與調(diào)節(jié)序列可操作連接的編碼線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌蛋白或其片段的重組核酸。
70.權(quán)利要求69的重組植物，其中線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞分泌蛋白由SEQ ID NOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼。
71.一種融合蛋白，包含由SEQ ID NOs 1、2或5-51或其片段編碼的多肽。
72.權(quán)利要求71的融合蛋白，包含植物生長(zhǎng)激素或其片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了提供線蟲(chóng)抗性的組合物和方法。一方面提供了包含對(duì)一種或多種線蟲(chóng)食道多肽特異的抑制性核酸的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞。另一方面提供了對(duì)至少兩種不同的根結(jié)線蟲(chóng)具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101056534SQ20058003870
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月13日
發(fā)明者理查德·S·赫西, 黃國(guó)中 申請(qǐng)人:喬治亞大學(xué)研究基金會(huì)公司