專利名稱：：一類脫氫水飛薊賓三烷基醚及其制備方法和藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及有機(jī)合成和醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體而言，本發(fā)明涉及3位、7位和20位垸基取代的脫氫水飛薊賓三醚類衍生物的制備方法及其藥物用途，該類化合物具有顯著抑制自由基誘導(dǎo)的脂過氧化物生成的活性；強(qiáng)效的對抗雙氧水引起的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞損傷作用，即對模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用；說明其對保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病有積極作用。藥效學(xué)結(jié)果表明該類脫氫水飛薊賓雙醚化合物可以預(yù)期用于制備防治神經(jīng)退行性疾病類藥物的用途。
背景技術(shù)：
：近年來，老年性癡呆癥(Alzheimer'sDisease,簡稱AD，又稱早老性癡呆)在我國發(fā)病率開始逐年增高，給國民生活帶來極大的負(fù)面影響，給患者家庭和社會保障體系帶來了巨大的負(fù)擔(dān)，國內(nèi)外政府和藥業(yè)均將越來越多的研究投入到這種神經(jīng)退行性疾病的成因和治療研究中，取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。神經(jīng)退行性疾病是極為可怕的一系列毀滅性的疾病，其可以毀壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，導(dǎo)致多種認(rèn)知缺陷和/或行動缺陷。就目前的醫(yī)療技術(shù)而言，此類疾病是致殘率及致死率均高的不可治愈性疾病，已構(gòu)成現(xiàn)代社會尤其是老齡化社會的一大健康隱患。老年性癡呆癥、帕金森氏癥(Parkinson'sDisease)、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病(priondisease)、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化都遭遇到大量的神經(jīng)元丟失。脂質(zhì)過氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機(jī)體有抗氧化的酶系及非酶系的保護(hù)作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過氧化作用則增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。脂質(zhì)過氧化是AD—個重要的發(fā)病機(jī)理(文獻(xiàn)-Busciglio等，A^wre,1995,378，776-9)。研究指出在與AD近似乃至一致的退行性疾病唐氏綜合癥中，神經(jīng)元發(fā)生凋亡而死亡，這種凋亡便是由脂質(zhì)過氧化引起。使用過氧化氫酶和自由基清除劑可以阻止這種脂質(zhì)過氧化造成的神經(jīng)元凋亡。此外，活性氧能造成細(xì)胞膜雙磷脂層的變化和損傷，有些雙磷脂層的破壞直接造成AD的病因(文獻(xiàn)Nitsch，R.M.,Ato/爿c^SC71992,89,1671-1675)。Markesbeiy的研究顯示脂質(zhì)過氧化可以造成細(xì)胞膜雙磷脂層的降解從而導(dǎo)致AD患者發(fā)病(Markesbery，W.R.，F(xiàn)MeiaAc歷oMW,1997,23,134~147)。因此，使用抗氧化劑和鐵離子螯合劑都可以減緩脂質(zhì)過氧化和AD的進(jìn)程?，F(xiàn)在常見的抗氧化制劑有維生素C、維生素E、銀杏制劑EGb761、褪黑激素、黃酮和胡蘿卜素類。由于市場的需要，更多的抗氧化劑諸如雌激素類也開始活躍。衰老也是老年性癡呆的一大誘因，而衰老基本上都是由自由基攻擊細(xì)胞開始的。老年性癡呆患者的腦組織解剖檢査發(fā)現(xiàn)許多自由基攻擊的痕跡，如線粒體DNA和核DNA損傷、蛋白氧化損傷、脂質(zhì)過氧化、產(chǎn)生深度糖基化最終產(chǎn)物(AGEs)等。自由基攻擊(3-淀粉樣蛋白使之聚合形成糾結(jié)及結(jié)塊，或者生成多肽自由基。抗氧化劑如自由基清除劑可以減緩自由基對p-淀粉樣蛋白的毒性損傷。自由基是一種十分有害的物質(zhì)，能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或不可逆的傷害。除了引起衰老外，還導(dǎo)致神經(jīng)退行性發(fā)生和神經(jīng)元死亡。該類活性氧(reactiveoxygenspecies,簡稱ROS)可對細(xì)胞主要成分如細(xì)胞核、線粒體DNA、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)造成損傷。實驗發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元對自由基非常敏感，此類自由基和活性氧的產(chǎn)生一旦出現(xiàn)失衡，神經(jīng)元細(xì)胞很可能遭到持續(xù)損傷并造成神經(jīng)退行性疾病諸如老年性癡呆。眾多的抗自由基天然產(chǎn)物除了前述的維生素C、維生素E、銀杏制劑EGb761、褪黑激素、黃酮和胡蘿卜素外，水飛薊素也是少數(shù)幾個在臨床上廣泛應(yīng)用的藥物之一。三十多年的臨床實驗證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱FloraK.等，Gas化oe"fera/，1998,93,139—143;SailerR.等，Dn^s，2001，61(14),2035—2063)。水飛薊素中水飛薊賓(Silybin)含量最多，活性也相對最高。故關(guān)于水飛薊賓之藥效學(xué)研究最為廣泛。國家食品與藥品監(jiān)督管理局制訂的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)水飛薊素一欄中，要求含水飛薊素以水飛薊賓計算，不得少于68%。該天然藥物的主要作用有抗自由基活性、保護(hù)肝細(xì)胞膜、促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)和再生、抗腫瘤作用。水飛薊賓類化合物具有確切的療效，故而以此天然藥物為先導(dǎo)化合物(Leadcompound)進(jìn)一步開發(fā)，尋找水飛薊賓類新的衍生物，使其能夠具有更高或者更新的藥理活性，以期獲取自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥，實屬必要。如我們前期報道的在水飛薊賓的B環(huán)上引入甲氧基就顯著提高了其清除超氧陰離子自由基的活性[楊雷香，趙昱等，"SynthesisandAntioxidantPropertiesEvaluationofNovelSilybinAnalogue",<_￡>^yme/"秘衍o"""dMWc,"a/CAew&^y,2006，21(4)，399—404.]。根據(jù)碳鏈越長、碳數(shù)越多則親脂性越強(qiáng)的設(shè)計原則，同時其親脂性得到加強(qiáng)，有利于提高其通過血腦屏障、在腦部脂質(zhì)體層直接發(fā)揮藥效的功力，我們設(shè)計了新的3位、7位和20位取代的脫氫水飛薊賓三醚，并以比乙烯基長的含3-5個碳的烷基作為首選取代基團(tuán)。以期其作用耙點(diǎn)更傾向于親脂性的腦脂質(zhì)體，從而對老年性癡呆等腦神經(jīng)退行性疾病起到預(yù)防及治療的作用。鑒于至今尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道增強(qiáng)了引入上述親脂性基團(tuán)后的脫氫水飛薊賓三醚類是否能提高其抗氧化活性，為了證明此類新型結(jié)構(gòu)的化合物抗神經(jīng)退行相關(guān)之藥效學(xué)活性，本發(fā)明還用了多種抗氧化損傷藥效學(xué)模型對我們設(shè)計合成出的化合物進(jìn)行了檢驗和藥效學(xué)評價。首先，領(lǐng)ij試了H202誘發(fā)PC12細(xì)胞的抗氧化損傷能力。目前比較肯定的用于研究神經(jīng)退行性疾病(主要是膽堿能神經(jīng)系統(tǒng))的體外細(xì)胞模型主要有3種(1)原代培養(yǎng)的海馬、皮層、基底前腦神經(jīng)細(xì)胞；(2)大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞；(3)小鼠HT22海馬細(xì)胞株。其中，由于PC12細(xì)胞更容易培養(yǎng)且由于其細(xì)胞均一性而成為神經(jīng)科學(xué)離體研究中的重要工具細(xì)胞，并用于研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如AD、帕金森病等。雙氧水(H202)是一種強(qiáng)氧化劑，它能穿透細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧自由基產(chǎn)生增加。因此，我們通過測試經(jīng)H202處理后PC12細(xì)胞的死亡情況來評價新合成的抗氧化劑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷的能力。其次，本發(fā)明人還研究了設(shè)計合成出的化合物對大鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用。采用非酶促之維生素C-F^+系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，MDA能與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，產(chǎn)物在532nm處有最大吸收，通過MDA量的變化可以間接反映化合物對肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用。上述藥效學(xué)研究證實本發(fā)明的化合物有強(qiáng)效抑制非酶系統(tǒng)自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物生成的活性，并且對模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷和神經(jīng)元保護(hù)作用。說明設(shè)計合成的3位、7位和20位垸基取代脫氫水飛薊賓三醚類化合物對保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用，從而可以預(yù)期用于制備該類藥物的用途，還可以預(yù)期發(fā)展成為防治其他神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病(priondisease)、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化等的藥物或藥物組合物。由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的3位、7位和20位垸基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物或其可藥用鹽其中，R是含3-5個碳的烷基，該烷基是指飽和或不飽和的直鏈烷基或支鏈垸基；10，ll位同時為R構(gòu)型或同時為S構(gòu)型。優(yōu)選的式(I)化合物是化合物I-b:3,7,20-三-l-烯丁基-脫氫水飛薊賓醚。本發(fā)明還提供了一種制備式(I)化合物的方法，其特征是水飛薊賓在堿催化下與過量的烷基鹵素反應(yīng)制備而得;反應(yīng)溫度為20°C至200。C，反應(yīng)時間為10分鐘至48小時；其中過量烷基鹵素是指參與反應(yīng)的烷基鹵素的摩爾數(shù)是參與同一反應(yīng)的水飛薊賓之摩爾數(shù)的三倍或三倍以上;水飛薊賓是指非對應(yīng)體的水飛薊賓A或水飛薊賓B或它們的混合物。堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿，烷基鹵素優(yōu)選垸基溴。本發(fā)明的另一目的是提供了式(I)所示結(jié)構(gòu)的3位、7位和20位烷基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物或其可藥用鹽在制備防治神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用；所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病(priondisease)、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化等病種。本發(fā)明的又一目的是提供了一種用于防治神經(jīng)退行性疾病包括老年性癡呆癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病(priondisease)、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化病的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示結(jié)構(gòu)的3位、7位和20位垸基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。本發(fā)明的再一目的是提供了式(I)化合物或其可藥用鹽用于制備防治肝腦脂質(zhì)過氧化有關(guān)的其他生理改變或疾病藥物的用途；尤其是用于防治自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成引起的急/慢性肝損傷類疾病、炎癥，也包括由脂質(zhì)過氧化引起的自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動脈粥樣硬化癥藥物的用途。本發(fā)明的又一目的是提供了一種用于防治自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成引起的急/慢性肝損傷類疾病、炎癥，也包括由脂質(zhì)過氧化引起的自身免疫性疾病、放射治療后遺癥、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應(yīng)、動脈粥樣硬化癥的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示之3位、7位和20位烷基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。本發(fā)明的有益之處在于提供了3位、7位和20位取代的脫氫水飛薊賓三醚衍生物，并用藥理實驗揭示了該類化合物具有抗脂質(zhì)過氧化，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞減輕氧化損傷能力。這些衍生物均顯示出比水飛薊賓優(yōu)越的抗氧化活性，從而可預(yù)期發(fā)展成為新型抗氧化劑類藥物及防治包括老年性癡呆癥在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病藥物的制藥用途。具有潛在的巨大社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明中式(I)化合物由天然藥物為母體制備而得，方法簡單、步驟短，污染小，適于節(jié)能減排大環(huán)境下的產(chǎn)業(yè)化。具體實施方式為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面首先用實施例的形式說明化合物制備的過程，實施例給出了化合物的部分物理和化學(xué)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)。實施例1:化合物I-a即3,7，20"三烯丙基-脫氫水飛薊賓醚的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>在干燥的反應(yīng)瓶中，0.24克水飛薊賓溶于5毫升DMF中，加入0.28克碳酸鉀，攪拌10分鐘使溶解完全。緩慢滴加烯丙基溴0.22克，攪拌5分鐘，再于75°C反應(yīng)3小時。靜置冷卻，加入25毫升蒸餾水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有機(jī)層，IO毫升蒸餾水洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得淺黃色粗品，經(jīng)200300目硅膠(IO克)柱層析，石油醚醋酸乙酯=10:1洗脫，得到淺黃色固體39.9毫克。收率13.3%?；衔颕-a:2-[2，3-二氫-3-(4-烯丙基氧基-3-甲氧基苯基)-2-羥甲基-1,4-苯并二氧六環(huán)-6+3，7-二烯丙基氧基-5-羥基-4/^-1-苯并吡喃-4-酮，Rf(石油醚醋酸乙酯-3:1)0.72;核磁共振氫譜&NMR(400MHz,氘代丙酮)5:3.54(多重峰，2H，H—23)，3.87(單峰，3H，OCH3)，4.27(多重峰，1H,H-10),4.62(雙峰，J=5.2Hz,2H,H—1')，4.67(雙峰，J=6.0Hz，2H，H—1"),4.72(雙峰,J=5.2Hz，2H,H-l'")，5.10(雙峰，J=8.0Hz,1H，H-ll),5.17~5.48(多重峰，6H，H—3',H-3〃&H—3'〃)，6.10(多重峰，3H，H—2',H-2〃&H—2'〃)，6.35(雙峰，J=2.0Hz,1H，H-6),6.77(雙峰，J=2.0Hz,1H,H-8),7.03~7.10(多重峰，3H,芳香環(huán)Ar-H-16，H-21&H-22)，7.19(雙峰，J=8.0Hz,1H，H-18),7.75(雙峰,J=2.0Hz,1H，H-13),7,82(雙雙峰,J=8.8，2.0Hz，1H，H—15),12.70(單峰，1H，5~OH);電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:601(M+H)+。實施例2:化合物I-b即3，7,20~三-l-烯丁基-脫氫水飛薊賓醚的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>在干燥的反應(yīng)瓶中，0.24克水飛薊賓溶于5毫升DMF中，加入0.28克碳酸鉀，攪拌10分鐘使溶解完全。緩慢滴加4-溴-1-丁烯0.25克，攪拌5分鐘，再于75^反應(yīng)3小時。靜置冷卻，加入25毫升蒸餾水，醋酸乙酯萃取3次(每次10毫升)，合并有機(jī)層，10毫升蒸餾水洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮。得淺黃色粗品，經(jīng)200300目硅膠(10克)柱層析，石油醚醋酸乙酯=10:1洗脫，得到淺黃色固體33.4毫克。收率10.4%。化合物I-b:2-[2，3-二氫-3-(4-烯丁基氧基-3-甲氧基苯基)-2-羥甲基-1,4-苯并二氧六環(huán)-6-]-3，7-二烯丁基氧基-5-羥基-4//-1-苯并吡喃-4-酮，Rf(氯仿醋酸乙酯醋酸=2010.5)0.5;核磁共振氫譜&NMR(400MHz，氖代氯仿)S:2.432.67(多重峰，6H,H—2'，H-2〃&H—2'〃)，3.59(多重峰，1H,H—23a),3.75(多重峰，1H,H—23b)，3.91(單峰，3H,OCH3),4.054.16(多重峰，7H,H—1',H-l",H-l'〃&H-IO),5.03(雙峰，J=8.4Hz，1H，H—11)，5.08~5.22(多重峰，6H,H—4',H4〃&H"4'"),5.79~5.98(多重峰，3H，H—3'，H—3〃&H-3'〃)，6.34(雙峰，J=2.0Hz,1H,H-6)，6.42(雙峰,J=2.0Hz，1H,H-8)，6.94(雙峰，J=8.4Hz，1H，H—16)，6.97(寬雙峰，J=8.0Hz,1H,H-15),7.02(寬雙峰，J=8.0Hz，1H,H-22),7.09(雙峰，J=8.8Hz,1H,H-21),7.78(寬單峰，2H，H-13&H—18)，7.09(寬雙峰，J=8.8Hz,1H,H—15)，12.63(單峰，1H,5-OH);核磁共振碳譜13CNMR(100MHz，氘代氯仿)S:33.20(CH2，C-2'),33.48(CH2，C-2"),34.48(CH2，C-2"')，56.07(OCH3)，61.55(CH2，C-23)，67.66(CH2,C-1')，68.19(CH2,C-1'〃)，71.88(CH2,C-l")，76.20(CH，C-ll)，78.63(CH，C-IO)，92.44(CH，C-8)，98.24(CH，C~6)，105.93(C,CMa),110.40(CH,C-13),112.94(CH,C-18)，116.97(CH2，C"4'),117.07(CH2,C"4")，117.34(CH,C-16)，117.51(CH，C-21),117.62(CH2，CM'"),120.07(CH，C—15)，122.78(CH，C—22)，123.85(C，C-14)，128.23(C，C-17),133.7(CH，C-3')，133.95(CH，C—3'〃)，134.43(CH，C-3")，138.13(C，C-3),143.60(C,C-20)，145.59(C，C-16a)，149.02(C，C—12a),149.75(C,C—19)，155.44(C,C-2),156.63(C，C—8a),161.85(C,C-5)，164.66(C，C-7)，178.77(C，C~4);電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:643(M+H)+。本發(fā)明中的式(I)化合物和具有多種重要的生物活性，通過藥效學(xué)試驗，證明式(I)化合物具有確切的體外抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過氧化物生成的活性、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷的作用。表明式(I)化合物可以預(yù)期用于制備防治神經(jīng)退行性疾病類藥物的用途，所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病(priondisease)、肌蔞縮性(脊椎)側(cè)索硬化等病種；還可以防治肝、腦脂質(zhì)過氧化物生成引起的急、慢性肝損傷類疾病、肝炎、腦動脈粥樣硬化癥藥物。本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有抵御脂質(zhì)過氧化物引起之損害、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷作用的抗氧化藥物或藥物組合物，可用于防治老年性癡呆癥(AD)、帕金森氏癥(PD)、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病(priondisease)、肌萎縮性(脊椎)側(cè)索硬化等神經(jīng)退行性疾病，還可用于治療急、慢性肝損傷類疾病、肝炎、腦動脈粥樣硬化癥等疾病。上述各類藥物或藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑等劑型。本發(fā)明中所述劑型都可以根據(jù)現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識經(jīng)由常規(guī)制備而得，在這些公知知識和技術(shù)基礎(chǔ)上制備出的含有本發(fā)明權(quán)利要求化合物的藥物或藥物組合物之其他劑型都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用藥理相關(guān)實施例的形式列舉式(I)化合物對雙氧水H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用試驗、以及抑制自由基誘導(dǎo)之脂質(zhì)過氧化物生成的活性試驗之結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的用途以及用于制備相關(guān)抗氧化劑類藥物的根據(jù)。藥理相關(guān)實施例給出了化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說明，本發(fā)明列舉的這些實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實施例3:式(I)化合物對雙氧水H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性試驗3.1實驗材料與樣品3丄1細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所。3丄2實驗試劑3.1.2.1雙氧水(hydrogenperoxide,H202)、硝基四氮唑蘭(nitrobluetetrazolium,NBT)、菲咯嗪(ferrozine)購自Sigma公司；3丄2.2水飛薊賓(Silybin)購自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測純度98%。3.1.2.3Tris堿，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；3.1.2.43—(4,5-dimethylthiazol—2畫yl)國2,5-diphenyltGtfazoliumbromide(MTT)購自Amresco公司；3丄2.5小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；3丄2.6青霉素和鏈霉素由石家莊制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；3丄2.7其它試劑均為國產(chǎn)分析純，購自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。3.1.3實驗儀器3丄3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；3丄3.2立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；3丄3.3紫外分光光度計UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；3丄3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；3.1.3.5除菌過濾器Sterifil500型，Millipore公司;3丄3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；3丄3.7C02細(xì)胞培養(yǎng)箱MMM，德國公司；3丄3.8倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司。3.2實驗原理雙氧水H202是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡，PC12細(xì)胞可模擬腦神經(jīng)細(xì)胞，因此常用它來作為研究藥物與神經(jīng)細(xì)胞之間關(guān)系的模型，用MTT測細(xì)胞的存活率，如果待測化合物有清除由H202引起的自由基、保護(hù)細(xì)胞抗氧化損傷的作用，則其細(xì)胞存活率就高，相應(yīng)之OD值也高，反之細(xì)胞存活率和OD值均低。本發(fā)明之藥理學(xué)試驗采用對唐希燦所報道之方法(XiaoqiuXiao等，A^/msc/Z欲er,1999，275:73-76)加以改進(jìn)來測定化合物對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。3.3細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞用含10%小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37°C、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。3.4實驗方法3.4.1細(xì)胞毒性的測定首先用改良的MTT法測定了待測化合物對PC12細(xì)胞增殖的作用。PC12細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，收集細(xì)胞，計數(shù)，用含10。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至8000個/毫升的密度，然后接種于96孔細(xì)胞板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時后，分別將新配的待測的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物I-b的最終濃度分別為32、16、8微克/毫升。72小時后，加入10微升MTT(5毫克廣升)的生理鹽水溶液，繼續(xù)在37。C，5%二氧化碳潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時，棄去原液，每孔中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜，用酶標(biāo)儀在570nm波長下比色，細(xì)胞生長抑制率計算公式％細(xì)胞生長抑制率=(OD溶劑對照OD樣品)/OD溶艦照x100%。3.4.2化合物I-b對11202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的測定PC12細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素。細(xì)胞以每孔8000個的密度加到96孔板中，在37°C，50%二氧化碳潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及用MTT法測定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞經(jīng)36小時的孵育后，分別將新配的化合物I-b的二甲亞砜14溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時后加入新配的H202(終濃度為600微摩爾/升)作用3小時，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100微升，然后加入MTT10微升，3小時后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150微升DMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。采用水飛薊賓為陽性對照藥物。3.4.3試驗結(jié)果見表一。表一化合物I-b及對照品組對雙氧水損傷PC12細(xì)胞保護(hù)作用樣品測試濃度(微克/毫升)細(xì)胞存活率空白對照3216.24%(不加藥)1615.22%815.27%水飛薊賓3232.16%1625.21%818.83%化合物I-b3236.64%1626.71%812.39%3.5結(jié)論試驗結(jié)果表明，化合物I-b具有明確的對抗自由基引起的PC12細(xì)胞損傷作用，即對模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞有抗氧化損傷保護(hù)作用。在高濃度時其對保護(hù)PC12細(xì)胞免受自由基損傷之能力比未加藥時提高了100%以上。且其在中、高濃度時保護(hù)PC12細(xì)胞能力均強(qiáng)于陽性對照藥物水飛薊賓。說明該類3，7,20位丁烯取代脫氫水飛薊賓三醚或其可藥用鹽屬于具有顯效保護(hù)模擬腦神經(jīng)細(xì)胞的PC12細(xì)胞作用的抗氧化物質(zhì)。測定化合物對H202所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可作為初步探討其保護(hù)中樞腦神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)理之依據(jù)。故據(jù)該化合物表現(xiàn)出之對雙氧水損傷所致PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，可預(yù)期該類3位、7位和20位烷基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物對神經(jīng)退行性疾病類藥物中的治療有積極作用。實施例4:式(I)化合物抑制自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成活性的試驗4.1實驗原理脂質(zhì)過氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機(jī)體有抗氧化的酶系及非酶系的保護(hù)作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過氧化作用則增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。因此，測定樣品抗脂質(zhì)過氧化作用，是篩選抗氧化、抗衰老藥物的重要指標(biāo)之一。本研究用維生素C-F^+系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，MDA能與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，產(chǎn)物在532nm處有最大吸收，通過MDA量的變化間接反映化合物對肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用(文獻(xiàn)楊雷香等，Zowma/o/7w/7/6他'ow朋dAfW"'wa/C7z簡&吵,2009，24(2)，425-431)。4.2實驗材料與樣品4.2.1試驗動物SD(sprague-dawley)大鼠購自浙江大學(xué)實驗動物中心。合格證號SCXK(浙2007-0029)。4.2.2實驗試劑4.2.2.1硫酸亞鐵FeS04溶液國產(chǎn)FeS04分析醇試劑，購自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配；4.2.2.2維生素C(即Vc)溶液國產(chǎn)Vc分析醇試劑，購自杭州華東試劑公司，使用前按照要求自配；4.2.2.3三氯醋酸(20%)溶液國產(chǎn)CC13C02H分析醇試劑，購自杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司，使用前按照要求自配；4.2.2.4磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫代巴比妥酸及其它試劑均為國產(chǎn)分析純，杭州華東醫(yī)藥試劑有限公司。4.2.2.5水飛薊賓購自遼寧盤錦天緣藥業(yè)有限公司，HPLC檢測純度98%。4.3實驗儀器4.3.1酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；4.3.2立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；4.3.3紫外分光光度計UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；4.3.4超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；4.3.5恒溫水浴箱上海森信試驗科學(xué)儀器公司；4.3.6氣浴恒溫振蕩器THZ-C，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；4.3.7臺式高速冷凍離心機(jī)TGL-16G，上海安亭儀器廠。4.4實驗方法4.4.1肝勻槳的制備取SD實驗大鼠5只斷頭處死，迅速取出肝臟，用超速離心法制備肝勻漿。4.4.2樣品對鼠肝脂質(zhì)過氧化的抑制作用在含F(xiàn)eS04(4微摩爾/升)與Vc(50微摩爾/升)的1毫升緩沖液中加入200微克/毫升肝微粒體，以誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，同時加入不同濃度的化合物I-a樣品，37。C孵育30分鐘后加入1毫升三氯醋酸(20%)中止反應(yīng)加入1.5毫升硫代巴比妥酸(0.76%)，10(TC沸水浴處理20分鐘，離心去除蛋白沉淀，在532nm波長下測定上清吸光度。脂質(zhì)過氧化以反應(yīng)中生成的丙二醛表示，實驗以水飛薊賓作為陽性對照藥物。用緩沖液代替反應(yīng)液作為空白對照組，加入同樣體積DMSO的為溶劑對照組。樣品對大鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化抑制率的計算公式計算公式如下抑制率(％)=(OD樣品管—OD空白管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管—OD空白管)><100%04.5試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>4.6結(jié)論試驗結(jié)果表明，化合物I-a屬于具有強(qiáng)效的保護(hù)細(xì)胞抗氧化物質(zhì)，其具有顯著的抑制自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成能力，其半數(shù)抑制濃度IC5o為54.8微摩爾/升，強(qiáng)于陽性對照藥物水飛薊賓，說明該類3位、7位和20位取代的脫氫水飛薊賓三醚類衍生物或其可藥用鹽具有保護(hù)細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化的作用，可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療腦組織氧化損傷或者急/慢性肝損傷類疾病的作用，值得進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)，或與其他相關(guān)藥物聯(lián)合使用。實施例5:化合物I-b抑制自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成活性的試驗5.1實驗原理同實施例4。5.2實驗材料與樣品同實施例4。5.3實驗儀器同實施例4。5.4實驗方法5.4.1肝勻漿的制備同實施例4。5.4.2樣品對鼠肝脂質(zhì)過氧化的抑制作用在含F(xiàn)eS04(4微摩爾/升)與Vc(50微摩爾/升)的1毫升緩沖液中加入200微克/毫升肝微粒體，以誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，同時加入不同濃度的化合物I-b樣品，37。C孵育30分鐘后加入1毫升三氯醋酸(20%)中止反應(yīng)加入1.5毫升硫代巴比妥酸(0.76%)，IO(TC沸水浴處理20分鐘，離心去除蛋白沉淀，在532nm波長下測定上清吸光度。脂質(zhì)過氧化以反應(yīng)中生成的丙二醛表示，實驗以水飛薊賓作為陽性對照藥物。用緩沖液代替反應(yīng)液作為空白對照組，加入同樣體積DMSO的為溶劑對照組。樣品對大鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化抑制率的計算公式計算公式如下抑制率(％)=(OD樣品管一OD空白管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管一OD空白管)><100%。5.5試驗結(jié)果試驗結(jié)果見表三。表三.化合物I-b對大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>5.6結(jié)論試驗結(jié)果表明，化合物I-b同樣屬于具有強(qiáng)效的保護(hù)細(xì)胞抗氧化物質(zhì)，其具有顯著的抑制自由基誘導(dǎo)之脂過氧化物生成能力，其半數(shù)抑制濃度ICs。為57.6微摩爾/升，優(yōu)于陽性對照藥物水飛薊賓，說明該類3位、7位和20位取代的脫氫水飛薊賓三醚類衍生物或其可藥用鹽具有保護(hù)細(xì)胞膜免受脂質(zhì)過氧化的作用，可以預(yù)期用于制備預(yù)防或治療腦組織氧化損傷或者急、慢性肝損傷類疾病的作用，值得進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)，或與其他相關(guān)藥物聯(lián)合使用。在上述說明書闡述本發(fā)明時，同時提供了實施例和藥理相關(guān)實施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實際操作過程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時，本發(fā)明的實際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。權(quán)利要求1.具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的3位、7位和20位烷基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物或其可藥用鹽其中，R是含3-5個碳的飽和或不飽和的直鏈/支鏈烷基；10，11位同時為R構(gòu)型或同時為S構(gòu)型。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的式(I)化合物，它們是化合物I-a:3,7,20-三烯丙基-脫氫水飛薊賓醚；或化合物I-b:3,7,20-三-l-烯丁基-脫氫水飛薊賓醚。3.—種權(quán)利要求l所述的式(I)化合物的制備方法，其特征是水飛薊賓在堿催化下與過量的烷基鹵素反應(yīng)制備而得;反應(yīng)溫度為20°C至200°C，反應(yīng)時間為10分鐘至48小時。4.根據(jù)權(quán)利要求3的制備方法，其中堿是無機(jī)堿或有機(jī)堿；過量的垸基鹵素是指參與反應(yīng)的烷基鹵素的摩爾數(shù)是參與同一反應(yīng)的水飛薊賓之摩爾數(shù)的三倍或三倍以上；水飛薊賓是指非對應(yīng)體的水飛薊賓A或水飛薊賓B或它們的混合物。5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其中堿是指碳酸鉀；垸基鹵素是指烷基溴。6.式(I)所示結(jié)構(gòu)的3位、7位和20位烷基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物或其可藥用鹽在制備防治神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病或肌萎縮性脊椎側(cè)索硬化。8.—種用于防治神經(jīng)退行性疾病的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)所示結(jié)構(gòu)的3位、7位和20位烷基取代的脫氫水飛薊賓三醚化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物或藥物組合物，其特征在于所述的神經(jīng)退行性疾病是指老年性癡呆癥、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈病、蛋白感染素病或肌萎縮性脊椎側(cè)索硬化。全文摘要本發(fā)明涉及一類脫氫水飛薊賓三烷基醚及其制備方法和藥物用途。具體而言，本發(fā)明涉及3位、7位和20位取代的脫氫水飛薊賓烯丙三醚和1-丁烯三醚衍生物，以及該類化合物的制備方法和藥物用途。該類化合物具有顯著抑制自由基誘導(dǎo)的脂過氧化物生成的活性；強(qiáng)效的對抗自由基引起的大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細(xì)胞損傷作用，說明其對保護(hù)腦細(xì)胞組織抗氧化和腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病有積極作用。藥效學(xué)結(jié)果表明該類脫氫水飛薊賓三醚化合物可以預(yù)期用于制備防治神經(jīng)退行性疾病類藥物的用途。文檔編號C07D407/04GK101665489SQ20091009940公開日2010年3月10日申請日期2009年6月11日優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日發(fā)明者馮玉冰,劉光明,北姜,巫秀美,蘇曾,李校堃,王曉雨,羅建蓉,昱趙,郝小江申請人:大理學(xué)院