專利名稱：用于動脈硬化性疾病的靶向Salusin的治療劑和檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于動脈硬化性疾病(arteriosclerotic disease)的靶向(target) salusin-a或salusin-p的預(yù)防和治療劑。本發(fā)明進一步涉及通過耙向salusin-a來檢測動脈硬化性疾病的方法或試劑。
背景技術(shù)：
根據(jù)2005年由厚生勞動省(Ministry of Health, Labor and Welfare)發(fā)布的"人口動態(tài)統(tǒng)計(Dynamic Statistics of the Population )"，在日本
由于癌癥造成的死亡人數(shù)為326,000，使其成為死亡的主要原因，其次是心臟病(173,000)，其是第二大死亡原因，以及中風(fēng)(133,000)，其是第三大死亡原因。心臟病和中風(fēng)的總死亡人數(shù)幾乎與癌癥相當(dāng)。具體地，缺血性心臟病(其是心臟病的代表性實例)和腦梗塞(其是中風(fēng)的典型疾病模式)的發(fā)展以動脈硬化為基本病理狀態(tài)。因此，預(yù)防動脈硬化的發(fā)病和發(fā)展對于保持和增強國民的健康是非常重要的。
在動脈硬化的原發(fā)病灶中特征性的病理發(fā)現(xiàn)是巨噬細胞源性泡沫細胞的聚集，其中膽固醇酯積聚在細胞內(nèi)。巨噬細胞經(jīng)多種清道夫受體將修飾的LDL諸如氧化低密度脂蛋白(氧化LDL)結(jié)合至細胞內(nèi)。膽固醇酯是一種重要的氧化LDL膽固醇，其在溶酶體內(nèi)被降解為游離的膽固醇和脂肪酸。當(dāng)細胞內(nèi)游離膽固醇水平達到過度的程度時，其由兩種機制調(diào)節(jié)。第一種機制是通過ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP-bindingcassette transporter) Al (ABCA-1)膽固醇外流至細胞外，第二種機制是通過?；?CoA:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-1 (ACAT-l)轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减?。?dāng)膽固醇酯積聚在細胞質(zhì)中時，巨噬細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?，形成動脈硬化的原發(fā)病灶。
動脈硬化的原發(fā)病灶中的另 一特征型病理發(fā)現(xiàn)是其中積聚了膽固醇酯的巨噬細胞源性泡沫細胞的聚集。巨噬細胞源性泡沫細胞分泌多種細胞因子，誘導(dǎo)血管平滑肌細胞從動脈的中膜遷移至動脈內(nèi)膜，或誘導(dǎo)該血管平滑肌細胞在動脈內(nèi)膜內(nèi)增殖。已經(jīng)遷移至動脈內(nèi)膜的血 管平滑肌細胞合成并分泌細胞外基質(zhì)，使動脈內(nèi)膜變厚。這種內(nèi)膜增 厚導(dǎo)致血管腔變窄并減少血流。來自血管平滑肌細胞的泡沬細胞還見 于中期動脈硬化時和之后。
Salusin是最近通過生物信息學(xué)分析鑒別的循環(huán)調(diào)節(jié)物質(zhì)。有兩種 稱為salusin-a和salusin-(3的相關(guān)肽類(見非專利文件1)。東京醫(yī)科齒 科大學(xué)(Tokyo Medical and Dental University)的Nanasato等人搜索了 人cDNA數(shù)據(jù)庫，以篩選編碼具有明顯的信號序列的分泌性蛋白的基 因。將這些基因轉(zhuǎn)染進培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞中，然后將培養(yǎng)上清液加 入至培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中，從而鑒別出誘導(dǎo)細胞內(nèi)C,濃度增加 的基因salusin(見非專利文件2)。 Salusin-oc包括28個氨基酸，salusin-P 包括20個氨基酸。它們通過其前體preprosalusin的加工而產(chǎn)生。 Preprosalusin由242個氨基酸組成，并且在對TOR2A基因進行選擇性 剪接使得發(fā)生移碼時得以生物合成，上述TOR2A基因是TOR1A (DYT1)的相關(guān)基因，已有報道TORIA (DYT1)是早發(fā)性扭轉(zhuǎn)性肌 張力障礙的致病基因。由于在N-端上有26個氨基酸的信號序列，推斷 兩種salusin從216個氨基酸的Prosalusin的C-端側(cè)生物合成。salusin-ot 和salusin-!3二者的表達分布在人血管壁細胞、內(nèi)分泌-中樞神經(jīng)系統(tǒng)等 中得以證實。目前，可以通過放射免疫測定來測量人血清和尿中的 salusin-a濃度。對于健康受試者，結(jié)果分別為23.3 ± 8.1 pM和156.8 ± 95.8pM (見非專利文件3)。其主要效應(yīng)已經(jīng)在大鼠中得到證實，包括 強降血壓效應(yīng)、強降心率效應(yīng)(P>a)、促進腦垂體分泌加壓素的效應(yīng) (僅有P)以及促進血管平滑肌細胞和成纖維細胞增殖的效應(yīng)(P〉a)。
非專利文件1: ShichiriM等人，NatMed. 2003; 9: 1166-1172。
非專禾ll文件2 : Masayoshi Nanasato, Journal of Experimental Medicine Vol. 210， No. 4 2004. 7. 24， pp. 267-270
非專利文件3: SatoK等人，Peptides. 2006;27:2561-2566。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于動脈硬化性疾病的預(yù)防和治療劑。 本發(fā)明的另一 目的是提供用于檢測動脈硬化性疾病的方法和試劑。
5本發(fā)明的發(fā)明人己經(jīng)推知，新的控制血壓、心率等的血管活性物
質(zhì)salusin以類似于已知血管活性物質(zhì)尾加壓素(urotensin) II和5-羥 色胺的方式作用于巨噬細胞，從而對巨噬細胞的泡沫化產(chǎn)生影響；艮P， 它們在動脈硬化病變(arteriosclerotic lesion)的形成中發(fā)揮重要作用。 因此，發(fā)明人集中于控制巨噬細胞的泡沫化和這種控制所必需的酶 ACAT-1的表達調(diào)控。發(fā)明人還考察了 salusin-ot和salusin-(3的作用。由 此，發(fā)明人己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，sakisin在動脈硬化病變的形成中發(fā)揮重要的病 理生理作用。具體來說，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，salusin-ot抑制巨噬細胞的泡 沫化，從而抑制動脈硬化病變的形成，salusin-P則促進巨噬細胞的泡沫 化，從而促進動脈硬化病變的形成。發(fā)明人由此進一步發(fā)現(xiàn)，能夠抑 制salusin-(3或salusin-ct的作用的化合物可以用于預(yù)防或治療動脈硬化 性疾病。此外，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，動脈硬化病變與生物樣品中salusin-oc 的濃度呈負相關(guān)，salusin-ot可以用作檢測動脈硬化性疾病的標(biāo)志物。由 此，發(fā)明人完成了本發(fā)明。 本發(fā)明如下。 一種用于動脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-a或 salusin-a的激動劑(agonist)作為活性成分。 —種用于動脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-P的拮抗劑 (antagonist)作為活性成分。根據(jù)[2]所述的用于動脈硬化性疾病的治療劑，其中所述 salusin-p的拮抗劑是抗salusin-(3抗體。根據(jù)[l]-[3]中任意一項所述的用于動脈硬化性疾病的治療劑， 其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病， 即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血(encephalorrhagy)、主動脈瘤、 主動脈夾層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥(arteriosclerosis obliterans)。 —種用于動脈硬化性疾病的治療組合物，其包括salusin-a或 salusin-a的激動劑和salusin-P的拮抗劑。根據(jù)[5]所述的用于動脈硬化性疾病的治療組合物，其中所述 salusin-(3的拮抗劑是抗salusin-p抗體。根據(jù)[5]或[6]所述的用于動脈硬化性疾病的治療組合物，其中 所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。 —種用于檢測動脈硬化性疾病的方法，其包括化驗(assay)生物樣品中的salusin-a。根據(jù)[8]所述的用于檢測動脈硬化性疾病的方法，其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。根據(jù)[8]或[9]所述的用于檢測動脈硬化性疾病的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。 一種用于確定動脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其包括化驗生物樣品中的salusin-a。根據(jù)[ll]所述的用于確定動脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。根據(jù)[11]或[12]所述的用于確定動脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。 一種用于檢測動脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物，其包括salusin-a。根據(jù)[14]所述的用于檢測動脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物，其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。 —種用于檢測動脈硬化性疾病的試劑，其包括抗salusin-a抗體并使用salusin-a作為檢測動脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物。根據(jù)[16]所述的用于檢測動脈硬化性疾病的試劑，其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。
本說明書包括本申請的優(yōu)先權(quán)文件日本專利申請第2007-127131號的說明書和/或附圖所公開的部分或全部內(nèi)容。


圖1顯示了 salusin-ot和salusin-P及其氨基酸序列之前的關(guān)系。
圖2A顯示了 salusin-a和salusin-(3對人單核細胞源性巨噬細胞中酰基-CoA:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-l(ACAT-l)蛋白質(zhì)表達的劑量依賴性影響。具體地，圖2A顯示了 salusin的劑量依賴性影響(0 nM至0.6 nM)。
圖2B顯示了 salusin-a和salusin-卩對人單核細胞源性巨噬細胞中ACAT-1蛋白質(zhì)表達的劑量依賴性影響。具體地，圖2B顯示了 salusin的劑量依賴性影響(0nM至10nM)。
圖3顯示了在人單核細胞源性巨噬細胞的分化期期間salusin-a和salusin-p對ACAT-1蛋白質(zhì)表達的時間依賴性影響。
圖4顯示了 ACAT活性測定的原理。
圖5顯示了 salusin-ot和salusin-P對人單核細胞源性巨噬細胞的ACAT活性的影響。
圖6顯示了 salusin-oc和salusin-P對人單核細胞源性巨噬細胞的ACAT-1 mRNA表達的影響。
圖7圖示了膽固醇酯化測定的原理。在圖7中，CE表示膽固醇酯。
圖8顯示了 salusin-a和salusin-P對人單核細胞源性巨噬細胞的泡沫化(膽固醇酯[CE]的積聚)的影響。
圖9顯示了A型清道夫受體(SR-A)活性的測量原理。
圖10顯示了 salusin-a和salusin-P對人單核細胞源性巨噬細胞的A型清道夫受體(SR-A)活性的影響。圖IOA顯示結(jié)合測定(associationassay)的結(jié)果，圖10B顯示降解測定的結(jié)果。
圖11顯示了 salusin-ot和salusin-(3對人單核細胞源性巨噬細胞中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al (ABCA-1)蛋白質(zhì)表達的影響。圖11A顯示salusin-ot的結(jié)果，圖11B顯示salusin-P的結(jié)果。
圖12顯示了 salusin-a和salusin-P對分化的培養(yǎng)的人單核細胞源性巨噬細胞的ACAT-1蛋白質(zhì)表達的影響。圖12A顯示salusin-a的結(jié)果，圖12B顯示salusin-P的結(jié)果。
圖13所示的照片顯示了人冠狀動脈的動脈硬化病變中的salusin-P表達。照片B是A的高倍放大圖，照片D是C的高倍圖像。圖13A-D中的標(biāo)尺分別表示1.0 mm、 100|im、 200 |um和200 |iim。在死于急性冠狀動脈綜合征(ACS)的患者(72歲男性)的左前降支(left anteriordescending artery)中，除了粥樣斑(atheroma)(斑塊)部分的平滑肌細胞(圖13B中的1)和成纖維細胞(圖13B中的2)以外，還證實了在右冠狀動脈的脂紋內(nèi)的巨噬細胞源性泡沫細胞(圖13D中的3)和中膜內(nèi)的成纖維細胞(圖13D中的4)中有很強的salusin-l3表達。
圖14顯示了中年男性受試者的血清salusin-oc濃度和頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度的最大值(最大IMT，頸動脈硬化的指標(biāo))之間的關(guān)系。
圖15顯示了患有缺血性心臟病(穩(wěn)定性勞力型心絞痛、急性冠狀動脈綜合征[ACS]和陳舊性心肌梗塞)的患者、高血壓患者和健康受試者的血清salusin-oc濃度的比較。選擇的病例為沒有ACS病史的穩(wěn)定性勞力型心絞痛病例、在ACS發(fā)作后6小時內(nèi)進行檢査的ACS病例和在被選擇前6個月或更多月份發(fā)生ACS發(fā)作的陳舊性心肌梗塞病例。
圖16顯示了急性冠狀動脈綜合征(ACS)患者的單支血管病變(1-VD)組、兩支血管病變(2-VD)組和三支血管病變(3-VD)組中的血清salusin-oc濃度。
圖17-1所示的照片顯示了 salusin-P對apoE缺陷小鼠的主動脈中的動脈硬化病變的影響。A-E顯示了用油紅O染色的主動脈弓中的動脈粥樣硬化性病變。F-J顯示了近端主動脈橫截面的油紅O染色。
圖17-2顯示了 salusin-P對apoE缺陷小鼠的主動脈中的動脈硬化病變的效應(yīng)。在此顯示的均值士SEM是使用每組6只小鼠通過測定用油紅O染色的主動脈弓的動脈硬化病變的面積得到的。
圖17-3顯示了經(jīng)測定每組11只apoE缺陷小鼠獲得的血液數(shù)據(jù)的均值iSEM。
圖18-1顯示了 salusin-ot對apoE缺陷小鼠的主動脈中的動脈硬化病變的影響。A-C顯示用油紅O染色的胸主動脈的動脈硬化病變。D-F顯示近端主動脈橫截面的油紅O染色。
圖18-2顯示了 salusin-a對apoE缺陷小鼠的主動脈中的動脈硬化病變的效應(yīng)。在此顯示的均數(shù)士SEM是使用每組5只小鼠通過測定用油紅O染色的胸主動脈中的動脈硬化病變的面積得的。
圖18-3顯示了經(jīng)測定每組8只apoE缺陷小鼠獲得的血液數(shù)據(jù)的均數(shù)iSEM。圖19A顯示了 apoE缺陷小鼠中的巨噬細胞泡沫化。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)士 SEM。
圖19B顯示了 salusin-ot和salusin-(3對apoE缺陷小鼠的巨噬細胞中的膽固醇外流的影響。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
圖20A顯示了 salusin-a和salusin-卩對apoE缺陷小鼠的巨噬細胞表達CD36的影響。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)士 SEM。
圖20B顯示了 salusin-a和salusin-P對apoE缺陷小鼠的巨噬細胞表達SR-A的影響。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)士 SEM。
圖20C顯示了 salusin-a和salusin-(3對apoE缺陷小鼠的巨噬細胞表達ACAT1的影響。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
圖20D顯示了 salusin-oc和salusin-P對apoE缺陷小鼠的巨噬細胞表達ABCA1的影響。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
圖20E顯示了 salusin-ot和salusin-p對apoE缺陷小鼠的巨噬細胞表達ABCG1的影響。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)土SEM。
圖20F顯示了 salusin-a和salusin-P對apoE缺陷小鼠的巨噬細胞表達SR-BI的影響。每個數(shù)據(jù)都是經(jīng)測定每組6只小鼠得到的均數(shù)士SEM。
具體實施例方式
本發(fā)明將詳細解釋如下。
Salusin-a是包括28個氨基酸殘基的肽(SEQIDNO: 1)或包括29個氨基酸殘基的肽(SEQ ID NO: 2)，其在包括28個氨基酸殘基的肽的C-端上具有酰胺化甘氨酸。另夕卜，salusin-(3是包括20個氨基酸殘基的肽(SEQ ID NO: 3)。 Salusin-oc和salusin-P由包括242個氨基酸的preprosalusin (SEQIDNO:4)加工而產(chǎn)生。使preprosalusin N-端的包括26個氨基酸的信號序列缺失，產(chǎn)生包括216個氨基酸的prosalusin，然后從prosalusin的C-端側(cè)生成salusin-a和salusin-p。圖1顯示了
10salusin-a和salusin-P之間的關(guān)系(圖1A)及其氨基酸序列之間的關(guān)系 (圖1B)。
Salusin-oc抑制巨噬細胞的泡沫化，而salusin-P促進巨噬細胞的泡沬 化。巨噬細胞的泡沬化是由于巨噬細胞參入(incorporate)氧化LDL 而發(fā)生的現(xiàn)象，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞中的脂質(zhì)沉積。巨噬細胞的泡沫化 由膽固醇酯的細胞內(nèi)生成和積聚而造成。氧化LDL經(jīng)巨噬細胞的多個 清道夫受體被參入，然后，由源于氧化LDL的膽固醇產(chǎn)生的膽固醇酯 發(fā)生積聚，從而發(fā)生巨噬細胞泡沬化。在巨噬細胞的泡沫化形成泡沫 細胞后，形成了動脈硬化性疾病的原發(fā)病灶，例如粥樣斑形成。
Salusin-ot抑制巨噬細胞的泡沬化，從而抑制動脈硬化性疾病的病 變形成。因此，salusin-a可以用于預(yù)防或治療動脈硬化性疾病。此外， salusin-a的激動劑也可以類似于salusin-ot的方式用于預(yù)防或治療動脈 硬化性疾病。在此，salusin-a的激動劑的例子包括所有促進salusin-a 的作用的化合物。這類激動劑的例子包括與salusin-a的受體結(jié)合、從 而發(fā)揮類似于salusin-a的作用的化合物以及具有激動劑活性的抗 salusin-a受體抗體。
另一方面，salusin-p促進巨噬細胞的泡沫化，從而以促進的方式作 用于動脈硬化病變的形成。因此，與salusin-P結(jié)合從而抑制salusin-P 的作用的salusin-(3拮抗劑，抑制salusin-P導(dǎo)致巨噬細胞泡沫化的作用， 從而產(chǎn)生了抑制動脈硬化性疾病的病變形成的能力。因此，salusin-P 的拮抗劑可以用于預(yù)防或治療動脈硬化性疾病。本發(fā)明的這類salusin-p 的拮抗劑的例子包括所有與salusin-P或salusin-p的受體結(jié)合從而抑制 salusin-P的體內(nèi)作用的化合物，例如中和抗體和受體拮抗劑。
統(tǒng)稱為動脈硬化性疾病的疾病特征在于由于動脈硬化的危險因 素造成內(nèi)膜中膜厚度(IMT)增加，導(dǎo)致動脈的彈性喪失和硬化；膽固 醇酯沉積在動脈內(nèi)(形成粥樣斑)，使血管通道變窄(狹窄)或使阻塞 (阻斷)；動脈壁部分?jǐn)U張(動脈瘤)；動脈整體擴張(動脈擴張)；或 內(nèi)皮破裂，造成中膜分離(分離)或破裂(出血)，導(dǎo)致遍及組織和器 官的循環(huán)不足。在本發(fā)明中，動脈硬化性疾病的預(yù)防或治療不僅包括 預(yù)防或治療這些動脈硬化性疾病，而且還包括預(yù)防或治療急性冠狀動 脈綜合征(ACS; acute coronary syndrome)、缺血性心臟病心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬化、閉塞性 動脈硬化癥以及由這些動脈硬化性疾病引起的疾病。在此，術(shù)語"急 性冠狀動脈綜合征"是指由動脈硬化粥樣斑(斑塊)破裂后形成血栓、 接著冠狀動脈血流極度減少或阻塞所引起的病理狀況。該病理狀況的 臨床實例包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗塞和心臟猝死。此外，動 脈硬化在相對粗的動脈例如主動脈、腦動脈和冠狀動脈中發(fā)生。動脈 硬化的例子包括動脈粥樣硬化，其中動脈中膜中膽固醇酯(熔點40 °C )的動脈粥樣化積累導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的形成及其厚度的逐漸 增加，從而使動脈腔變窄；由于高血壓造成的改變而趨于在腦或腎中 的小動脈中發(fā)生的動脈毛細血管硬化，其與整個血管壁的破裂所引起 的堵塞(梗塞)和出血有關(guān)；以及動脈中膜中的鈣沉積引起的門克伯 格氏動脈硬化(Monckeberg，s arteriosclerosis),其使動脈硬化并導(dǎo)致中 膜變脆。此外，本發(fā)明還可以主要應(yīng)用于預(yù)防或治療動脈壁增厚或斑 塊形成。
salusin-財吉抗劑的實例包括所有抑制salusin-(3的作用的化合物，例 如具有拮抗活性的抗salusin-p抗體。
Salusin-ot可以根據(jù)氨基酸序列信息通過化學(xué)合成來制備，或者可 以通過基因工程技術(shù)制備。此外，由SEQIDNO: 1的氨基酸序列缺失、 取代或添加一個或數(shù)個氨基酸、并具有salusin-ot的活性的氨基酸序列 組成的肽，也可以用作本發(fā)明的用于動脈硬化性疾病的預(yù)防或治療劑。 在此，術(shù)語"1個或數(shù)個"是指"1-3"個，優(yōu)選1個或2個，進一步 優(yōu)選1個。
抗salusin-(3抗體可以通過已知方法作為多克隆抗體或單克隆抗體 而獲得，并優(yōu)選作為單克隆抗體而獲得。單克隆抗體的例子包括由雜 交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體以及由用含有抗體基因的表達載體通過基因工 程技術(shù)轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的單克隆抗體。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以 通過如下所述的已知技術(shù)而制備。具體地，產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤 可以通過如下方法制備使用salusin-P或其肽片段作為致敏性抗原通 過已知的免疫方法進行免疫，通過通常的細胞融合法將由此獲得的免 疫細胞與已知的母細胞融合，然后通過已知的篩選方法篩選產(chǎn)生單克 隆抗體的細胞。在用salusin-p免疫后，可以將載體蛋白質(zhì)例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍蛋白與其結(jié)合，然后使用。可以用作單克 隆抗體的重組單克隆抗體通過如下方法產(chǎn)生從雜交瘤克隆抗體基因， 將該基因結(jié)合到適當(dāng)?shù)妮d體中，將該載體導(dǎo)入至宿主中，然后由此經(jīng)
基因重組技術(shù)使抗體產(chǎn)生(例如，參見Vandamme， A. M.等人，Eur. J. Biochem. 1990; 192: 767-775)。這時，編碼抗體重鏈(H鏈)的DNA 和編碼輕鏈(L鏈)的DNA可以分別地合并到不同的表達載體中，然 后可以同時用這些表達載體對宿主細胞進行轉(zhuǎn)化。另外可選地，將編 碼H鏈和L鏈的DNA結(jié)合到單個表達載體中，然后可以用該表達載 體對宿主細胞進行轉(zhuǎn)化(參見WO 94/11523)。此外，還可以使用轉(zhuǎn)基 因動物來產(chǎn)生重組抗體。例如，將抗體基因插入至編碼獨特地在奶中 產(chǎn)生的蛋白(例如，山羊p酪蛋白)的基因中間，從而制備融合基因。 將含有其中插入有抗體基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎 中，然后將胚胎導(dǎo)入到雌山羊中。所需抗體可以從由已接受該胚胎的 山羊所生的轉(zhuǎn)基因山羊、或該轉(zhuǎn)基因山羊的后代所產(chǎn)的奶中獲得(Ebert， K. M.等人，Bio/Technology 1994; 12: 699-702)。
本發(fā)明的抗salusin-P抗體的例子包括被人為改變以降低對人的異 種抗原性(heterologous antigenicity)的基因重組抗體，例如嵌合抗體 和人源化抗體。這些抗體的例子包括嵌合抗體、人源化抗體和人抗體， 其均可以使用已知方法產(chǎn)生。嵌合抗體可以通過如下方法獲得制備
編碼抗體V區(qū)的DNA，將該DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接， 將生成物結(jié)合到表達載體中，將該載體導(dǎo)入宿主中，然后使其產(chǎn)生。 人源化抗體也稱作人重構(gòu)抗體。人源化抗體通過將非人哺乳動物例如 鼠的抗體的互補決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的互補決定區(qū)中而制備。 這種人源化抗體可以通過已知的方法制備(參見歐洲專利申請公開第 EP 125023號和WO 96/02576)。人抗體的部分用于嵌合抗體或人源化 抗體的C區(qū)。例如，Cyl、 Cy2、 CY3和Q4可以用于H鏈，Ck禾卩CX 可以用于L鏈。此外，為了改善抗體或其生產(chǎn)穩(wěn)定性，人抗體的C區(qū) 可以加以修飾。
人抗體可以通過如下方法獲得例如，導(dǎo)入人抗體基因座位(gene locus)，然后將抗原給予能夠產(chǎn)生人源性抗體的轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動 物的例子包括小鼠。例如，產(chǎn)生能夠產(chǎn)生人抗體的小鼠的方法參見國
13際專利公開WO02/43478的公開文本。
本發(fā)明的抗salusin-P抗體的例子不僅包括完全抗體，而且還包括 其功能片段。術(shù)語"抗體的功能片段"是指保留了抗體對抗原的一種 或多種作用的抗體部分(部分片段)。其具體例子包括F(ab')2、 Fab'、 Fab、Fv、 二硫鍵Fv、單鏈Fv(scFv)及其聚合物[D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998 T. J. International Ltd]。
由此獲得的抗體是否具有對salusin-p的拮抗活性可以通過如下方 法確定例如，將抗體與salusin-卩結(jié)合，然后驗證salusin-P的活性是否 受到了抑制。
對salusin-a或salusin-P具有拮抗活性的化合物可以用作用于動脈 硬化性疾病的預(yù)防或治療劑。
劑量取決于癥狀、年齡、性別等而變化。通常來說，在口服給藥 的情況下，對于成人，劑量范圍為每天約0.01 mg至1000 mg，可以一 次給藥或數(shù)次分別給藥。在胃腸外給藥的情況下，每次給藥約0.01mg 至1000 mg的劑量可以經(jīng)皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射來給藥。 而且，給藥時間可以是動脈硬化性疾病的臨床癥狀出現(xiàn)之前或之后。
本發(fā)明的預(yù)防或治療劑可以多種形式給藥。這些形式的給藥途徑 的例子包括片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖漿劑等的口服給藥，以及 注射制劑、滴劑、栓劑等的胃腸外給藥。
含有本發(fā)明的對salusin-a或salusin-l3具有拮抗活性的化合物的用 于動脈硬化性疾病的預(yù)防或治療劑可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法配制 (Remington's Pharmaceutical Science,最近版本,Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.),并且這些化合物可以一起含有藥物可接受的 載體和藥物可接受的添加劑。這些載體和藥物添加劑的例子包括水、 藥物可接受的有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、羧基乙 烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚 糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉 伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、 石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳 糖和可接受作為藥物添加劑的表面活性劑。實際的添加劑是取決于本 發(fā)明的預(yù)防或治療劑的劑型而從上述例子中單獨選擇的，或者從上述例子中選擇其合適的組合。但是，其實例并不限于此。
此外，本發(fā)明的用于動脈硬化性疾病的預(yù)防或治療劑可以含有具
有salusin-P拮抗活性的化合物與salusin-a的組合。
本發(fā)明進一步包括下列涉及生物樣品中的salusin-cx的化驗的方法: 用于檢測從其中采集了生物樣品的待測受試者是否患有動脈硬化性疾 病的方法、用于確定動脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法以及用于評價患 動脈硬化性疾病的風(fēng)險的方法。具體地，本發(fā)明可以優(yōu)選地用于檢測 急性冠狀動脈綜合征。
生物樣品的例子包括全血、血清、血漿和尿。這些生物樣品中的 Salusin-ot可以進行定量或定性化驗。
另外可選地，生物樣品可以直接用于其中salusin-oc的化驗。然而， 由于生物樣品中的salusin-(x含量低，優(yōu)選地，從生物樣品中濃縮或分 離salusin-oc用于化驗。這種分離或濃縮可以經(jīng)固相萃取從血清、血漿、 尿等中進行。在此，術(shù)語"固相萃取"是指如下技術(shù)使用分離/純化 用的固定相(固相或吸附劑)例如化學(xué)結(jié)合硅膠、多孔聚合物、氧化 鋁、活性炭等，以選擇性的方式從具有復(fù)雜組成的樣品中專門地萃取 特定的目標(biāo)成分，從而可以去除樣品中的污染物。對于固相萃取，可 以廣泛地使用反相分配色譜用的固定相、離子交換色譜用的固定相等。 對于反相色譜用的固定相，可以使用具有例如十八碳烷基甲硅烷基 (C18)、辛基(C8)、 丁基(C4)、三甲基(C3)、苯基(Ph)、 丁基、 三十碳烷基(C30)等的基團的填充劑。其中，優(yōu)選具有十八碳烷基甲 硅烷基(C18)或辛基(C8)的填充劑。使用市售的萃取柱(cartridge) 用于固相萃取?？梢允褂米⑸淦餍凸滔噍腿≈虮P型固相萃取柱。市 售萃取柱的例子包括Sep-Pak (注冊商標(biāo)，Waters)、 Autoprep (注冊商 標(biāo)，Showa Denko K.K.) 、 Discovery DSC-18 ( SUPELCO )禾B Discovery DSC-8 (SUPELCO)。用于洗脫salusin-a的溶劑的例子包括乙腈、甲醇 和四氫呋喃。在固相萃取之前，將生物樣品用三氟乙酸(TFA)進行酸 處理，然后離心?？梢允褂糜纱双@得的上清液。
另外，可以使用反相色譜柱通過HPLC對預(yù)處理過的生物樣品進 行分離和純化。
Salusin可以通過免疫測定例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)、 ELISA或熒光測定來進行測定。在測定時，可以使用用放射 性同位素例如1251;酶諸如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或P-半乳糖苷 酶；或熒光物質(zhì)例如異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗salusin-a抗體。 這些免疫學(xué)測定可以通過己知的方法進行。例如，將能夠與salusin-a 結(jié)合的第一配體例如抗salusin-a抗體固定化在塑料制微量滴定板孔等 的孔中的固相載體上。然后，使生物樣品與結(jié)合在固相上的能夠與 salusin-a結(jié)合的第一配體例如抗salusin-a抗體發(fā)生反應(yīng)。因此，作為配 體-受體結(jié)合反應(yīng)例如抗體-抗體反應(yīng)的結(jié)果，使樣品中的salusin-a經(jīng)結(jié) 合在固相上的第一配體而結(jié)合在固相上。隨后，進行洗滌，然后使能 夠與salusin-a結(jié)合的第二配體與結(jié)合在固相上的樣品中的salusin-a發(fā) 生反應(yīng)。具體地，形成能夠與salusin-a結(jié)合的第一配體的復(fù)合體，例 如己經(jīng)結(jié)合在固相上的抗salusin-a抗體/salusin-a/第二配體?？梢允褂?抗salusin-a抗體等作為能夠與salusin-a結(jié)合的第二配體。隨后，進行 洗滌，然后測定已經(jīng)結(jié)合在固相上的能夠與salusin-ot結(jié)合的第二配體 例如第二抗saliisin-a抗體。這種測定可以通過在免疫學(xué)分析領(lǐng)域中普 遍使用的多種方法進行。例如，將能夠與salusin-ot結(jié)合的第二配體用 酶、熒光素、生物素、放射性標(biāo)記等標(biāo)記以便產(chǎn)生諸如酶標(biāo)記產(chǎn)物。 可以通過測定這種標(biāo)記來測定已經(jīng)結(jié)合在固相上的能夠與salusin-a結(jié) 合的第二配體。
在測定salusin-a時，不僅可以測定完整的salusin-ot，還可以測定 salusin-oc片段。
從生物樣品中分離和純化salusin-oc用的技術(shù)的實例描述如下。
(1) 將三氟乙酸(0.1% (v/v))加入至血清或血漿(2mL)中， 然后以3000rpm離心10分鐘。
(2) 將得到的上清液導(dǎo)入至Sep-Pak (注冊商標(biāo))C18萃取柱中。 萃取柱預(yù)先用99.8%甲醇(5mL)、純水(5mL)和0.1。/。TFA (5mL) 處理。
(3) 用0.1%TFA (lmL)和50%甲醇進行萃取。得到的洗脫液用 離心濃縮機以2000 rpm濃縮至大約100 (iL。
(4) 將測定緩沖液(250 ^L)加入至樣品中，以測定其中含有的 salusin-a 。
16可以根據(jù)Sato K等人，Peptides, 2006; 27: 2561-2566進行用于測定salusin-oc的分離和純化方法和RIA測定法。
對于健康受試者，人血清和尿中的salusin-ot濃度分別為23.3 ± 8.1pM和156.8 ±95.8 pM (各值均為均數(shù)土SD)。因此，當(dāng)待測受試者的血清或尿中的salusin濃度顯著低于健康受試者時，可以判斷出待測受試者患有動脈硬化性疾病或處于患動脈硬化性疾病的明顯危險中。Sahisin濃度顯著低的情況的例子是如下情況當(dāng)與上述健康受試者的均數(shù)和SD相比較時，salusin濃度小于均數(shù)-lxSD，優(yōu)選均數(shù)-2xSD，進一步優(yōu)選小于均數(shù)-3 x SD。另夕卜，動脈硬化性疾病越嚴(yán)重，salusin-a的濃度越低。例如，對于急性冠狀動脈綜合征(ACS)的情況，隨著病變的進展程度以單支冠狀動脈病變組、兩支冠狀動脈病變組和3支冠狀動脈病變組的順序增加，待測受試者的生物樣品中的salusin-oc濃度減少。另外，生物樣品中的salusin-oc濃度和用作動脈硬化指標(biāo)的內(nèi)膜-中膜復(fù)合體厚度體(IMT:內(nèi)膜中膜厚度)之間呈負相關(guān)。IMT越厚，salusin-a的濃度越低。因此，salusin-a可以代替IMT來用作動脈硬化性疾病進展的指標(biāo)。此外，salusin-oc能有效地用于急性動脈硬化性疾病的檢測。
此外，通過常規(guī)檢測從待測受試者采集的生物樣品的salusin-a，并監(jiān)測salusin-a的濃度，可以對動脈硬化性疾病的進展進行管理。
Salusin-a可以用作檢測/診斷動脈硬化性疾病的標(biāo)志物。本發(fā)明包括salusin-a作為檢測動脈硬化性疾病的檢測標(biāo)志物的用途，并進一步包括用于檢測/診斷動脈硬化性疾病的包括salusin-a的疾病檢測/診斷標(biāo)志物。
下文參考下列實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于此。
在下面的實施例中，從人外周血制備單核細胞并培養(yǎng)7天，使其分化為巨噬細胞。這時，同時向其中加入salusin-ot(0-10nM)和salusin-p(0-10 nM)，并考察salusin的作用。
從人外周血獲得的單核細胞的培養(yǎng)通過已知方法進行。分離的單核細胞添加RPMI-1640(15 mL)進行培養(yǎng)，然后用血細胞計數(shù)室(bloodcell counting chmber)對漂浮的單核細胞進行細胞計數(shù)。細胞接種在6-cm皿中，以得到4 x 106細胞/2 mL。單核細胞在37。C下在5% C02 的存在下保溫1小時，使細胞粘附在皿上。培養(yǎng)基替換為含有10%人 血清的RPMI-1640，然后培養(yǎng)7天。培養(yǎng)基每3天更換一次。
實施例l:salusin-a和salusin-p對人單核細胞源性巨噬細胞中的ACAT-1 蛋白質(zhì)表達的影響
ACAT-1是一種將細胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)化成膽固醇酯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶。 ACAT-1基因?qū)τ诰奘杉毎呐菽浅Ｖ匾?。為了考察salusin-a和 salusin-l3對ACAT-1表達的影響，通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting) 考察ACAT-1蛋白質(zhì)的表達。
將己培養(yǎng)7天的單核細胞源性巨噬細胞用PBS洗滌3次，然后向 每個皿中加入10。/。SDS (十二烷基硫酸鈉)(100 pL)進行溶解。用細 胞刮棒鏟起每種細胞提取溶液，然后使用1-mL TERUMO注射器和破 碎(剪切)用23-G注射針進行粉碎。生成物以15,000 rpm離心3分鐘 (Himac CF15D2高速微型低溫離心機；Hitach, Ltd.)。上清液中的蛋 白質(zhì)濃度通過二喹啉甲酸(bicinchoninic acid， BCA)法(Pierce)測 定，并用作蛋白質(zhì)印跡法用的細胞提取溶液。
將本發(fā)明實施例中獲得的每種培養(yǎng)上清液中的ACAT-1或ABCA-1 根據(jù)下面所述的方法通過蛋白質(zhì)印跡法進行測定。 ACAT-1蛋白質(zhì)檢測
對于ACAT-1蛋白質(zhì)檢測，使用通過對兔進行免疫制備的抗人 ACAT-1多克隆抗體(DMIO， Dr. Chang, Dartmouth Medical School惠 贈)[Chang CCY等人，J Biol Chem. 1995; 270: 29532-29540]作為第一 抗體(終濃度0.5|ag/mL)，用于在室溫下在轉(zhuǎn)移膜上反應(yīng)1小時。轉(zhuǎn) 移膜用PBS-0.1% Tween 20洗滌，然后與第二抗體(抗兔IgG抗體 結(jié)合有辣根過氧化物酶(HRP)的抗兔IgG驢抗體(GE Healthcare Bio-Science))在室溫下反應(yīng)1小時。對于第二抗體，用PBS-0.1% Tween 20 (5 mL)將原液(0.5 pL)稀釋10,000倍，使用生成物。用PBS-0.1% Tween 20進行洗滌，然后使用Lumi-Light Plus (PerkinElmer Life Sciences)進行ACAT-1蛋白質(zhì)檢測。 ABCA-1蛋白質(zhì)檢測對于ABCA-1蛋白檢測，與抗人ABCA-1抗體的反應(yīng)在轉(zhuǎn)移膜上 在室溫下進行1小時。對于第一抗體(抗人ABCA-1兔多克隆抗體 (Funakoshi Corporation))，用PBS隱0.1 。/。 Tween 20 (5 mL )將原液(5 pL)稀釋1，000倍，使用稀釋液。轉(zhuǎn)移膜用PBS-0.1。/。Tween20洗滌。 然后，與第二抗體(抗兔IgG抗體結(jié)合有辣根過氧化物酶(HRP) 的抗兔IgG驢抗體(GE Healthcare Bioscience))的反應(yīng)在室溫下進行 1小時。對于第二抗體，用PBS-0.1%Tween20 (5mL)將原液(0.5 pL) 稀釋10,000倍，使用稀釋液。用PBS-0.in/。 Tween 20進行洗滌，然后 使用Lumi-Light Plus (PerkinElmer Life Sciences)進行ABCA-1蛋白質(zhì) 檢測。
將人外周血單核細胞(4 x 1(^細胞/6-cm皿)在含有10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成為巨噬細胞。為了 考察salusin對ACAT-1蛋白質(zhì)表達的劑量依賴性影響，在培養(yǎng)開始時 將salusin-a或salusin-p以0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8或1.0 nM的濃度添力口 到培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)第7天時，將從單核細胞分化的巨噬細胞用PBS 洗滌，然后溶解在10% SDS (100 pL)中，然后使用ACAT-1特異性 抗體進行蛋白質(zhì)印跡法。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)salusin-oc以依賴濃度的方式抑制 大約40。/。ACAT-l蛋白質(zhì)的表達(圖2A)。同時，salusin-(3在0-0.6 nM 的濃度下以依賴濃度的方式促進ACAT-1蛋白質(zhì)的表達。Salusin-P的作 用在0.6 nM時達到峰值水平，這時ACAT-1蛋白質(zhì)表達水平增加至對 照的2.1倍。Salusin-P促進ACAT-1蛋白質(zhì)表達的作用在0.6 nM以上的 濃度下逐漸衰減(圖2B)。
接下來，考察在單核細胞分化為巨噬細胞的分化期間salusin-a或 salusin-P對ACAT-1蛋白質(zhì)表達的時間依賴性影響。將人外周血單核細 胞(4x 1()S細胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細胞。這時，在培 養(yǎng)期間加入0.6 nM salusin-a或salusin-p。在接種后1、 3、 5或7天時 用PBS洗滌每個皿。將其中反應(yīng)已在第l、 3、 5天終止的皿暫時冷凍 在-8(TC下，并在第7天時解凍。將由此獲得的細胞以及接種后7天時 的細胞溶解在10n/。SDS (100 pL)中。作為通過蛋白質(zhì)印跡法的考察 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在接種后第1、 3或5天用salusin-a處理的細胞中的ACAT-1 蛋白質(zhì)表達沒有顯著地不同于對照細胞。但是，在第7天時表達受到
19了顯著的抑制。發(fā)現(xiàn)用salusin-(3處理的細胞中的ACAT-1蛋白質(zhì)表達水 平顯著地增加到高于對照細胞在第5天或更晚時的表達水平(圖3)。
實施例2: salusin-a和salusin-(3對人單核細胞源性巨噬細胞中的ACAT 活性的影響
對于ACAT活性測定，使用脂質(zhì)體重組法。該方法涉及使用如下 體系使用包括膽固醇/磷脂酰膽堿的混合膠束將存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 ACAT-1蛋白質(zhì)重組到脂質(zhì)體中，從而達到可用作ACAT-1底物的膽固 醇的飽和濃度水平[Cheng D等人，J Biol Chem. 1995; 270: 685-695.]。 在常規(guī)使用的微粒體法中，使用內(nèi)源性地存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的膽固醇作 為底物。但是，通常地，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜缺乏膽固醇。因此，認(rèn)為沒有達到 能夠用作ACAT底物的膽固醇的飽和水平，導(dǎo)致低估ACAT的活性。 在此，通過向反應(yīng)體系中添加另一種底物^C]油酰基-CoA并測定通過 ACAT反應(yīng)生成的膽固醇["C]油酸酯來測定ACAT的活性(圖4)。
該實施例中使用的細胞提取溶液說明如下。
將外周血人單核細胞(4 x 106細胞/2 mL)接種在4-6個6-cm皿中， 并培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細胞。這時，在培養(yǎng)期間加入salusin-a或 salusin-p。然后，考察salusin-a或salusin-P對ACAT活性的效應(yīng)。培養(yǎng) 7天后，將細胞用已經(jīng)冷卻至4"C的PBS洗滌兩次，向其中加入低滲緩 沖液(1 mM Tris-HCl， 1 mM EDTA， pH 7.4) (2mL/皿)，將生成物放置 5分鐘。這些操作的目的在于通過滲透壓來粉碎細胞膜，洗滌排出的細 胞質(zhì)蛋白質(zhì)，并濃縮含有ACAT-1的膜蛋白。將皿顛倒，以充分地去除 其中的緩沖液。在使用前立即向其中一皿中加入含有蛋白酶抑制劑雞 尾酒(cocktail) (SIGMA) (1/1000體積)的緩沖液A (50 mMTris-HCl， lmMEDTA，pH7.4) (100 pL)。用細胞刮棒從其中回收細胞。將緩沖 液(100 |LiL)轉(zhuǎn)移到在相同條件下培養(yǎng)的下一皿中，然后進行相同的 操作。最后，將4-6個皿合并在一起，以濃縮膜蛋白。將回收的細胞提 取溶液(1 mL)導(dǎo)入到Teflon勻漿器中，然后進行3組勻化作用(每 組20沖程)。在冰上進行均化，組間的暫停時間為大約1分鐘。勻化 過的細胞提取溶液的蛋白質(zhì)濃度通過BCA法(Pierce)進行定量測定。 將細胞提取溶液與4 M KC1 (1/3體積)和20% CHAPS (1/9體積)混合(使得KC1的終濃度為1M且CHAPS終濃度為2%)。蛋白質(zhì)濃度用 含有1 M KCl和2% CHAPS的緩沖液A調(diào)節(jié)。生成物在室溫下放置10 分鐘。
混合膠束如下制備。
將氯仿(172.4 [iL)中的100 mg/mL蛋黃L-a-磷脂酰膽堿(SIGMA) 和苯(62|uL)中的20 mg/mL膽固醇(SIGMA)導(dǎo)入至閃爍管中并進 行渦旋，然后用氮氣干燥。向其中加入10%牛磺膽酸(SIGMA) (100 ILiL)、 10 x緩沖液A (100|liL)和無菌純凈水(800|liL)，生成物進行 渦旋。在避光的同時，將瓶中的空氣用氮氣置換，然后超聲IO分鐘， 并在冰上冷卻5分鐘。上述操作重復(fù)約10次，從而獲得基本上透明的 生成物。超聲之后，向其中加入無菌純凈水(lmL)，然后充分混合。
通過制備含有1 mM ["C]油?；鵆oA (GE Healthcare Bio-Science, CFA634, 1.85 MBq) (16pL)、 34 mM冷的油?；?CoA (SIGMA) (10 ILiL)、 0.25 M Tris國HCl (pH 7.8)中30 mg/mL的BSA (834 pL)和無 菌純凈水(996 pL)的2，00(HiL溶液，得到0.25 mM ["C]油?；?CoA 混合物。
薄層色譜法(TLC)如下進行。
通過將膽固醇油酸酯(SIGMA) (20 mg)加入到異丙醇(4mL) 中，將混合物在6(TC的熱浴中加熱進行溶解，并進一步向其中加入0.91 g/mL甘油三油酸酯(SIGMA) (20 pL)，從而制備TLC標(biāo)準(zhǔn)物。通過 毛細管點樣將TLC標(biāo)準(zhǔn)物(60 fiL)點在TLC鋁板(20 x 20 cm)上的 硅膠60F254 (Merck)上。制備己烷/二乙醚/乙酸(90:10:1， v/v)作為 展開溶劑。
將混合膠束(140 jiL )加入到蛋白質(zhì)量恒定的細胞提取溶液(80-100 pg)中，將生成物緩慢混合并在冰上靜置10分鐘。然后，向其中加入 ["C]油酰基-CoA混合物(20pL)，然后在不導(dǎo)致發(fā)泡的情況下進行混 合。生成物在37'C下保溫30分鐘以進行反應(yīng)。之后，向其中加入氯仿 /甲醇(2:l,v/v) (3mL)和無菌純凈水(lmL)，生成物進行渦旋，使 反應(yīng)終止。以2，500rpm離心10分鐘(TOMYLC-120低速離心機，轉(zhuǎn) 子7015-06)。然后，從中去除上層(水層)，下層(油層)用氮氣干燥。 將提取出的脂質(zhì)用異丙醇(60 jiL)溶解。生成物在標(biāo)準(zhǔn)物點之間點樣。將脂質(zhì)展開，直至展開溶劑到達玻璃室中TLC板的上邊緣。將TLC板
轉(zhuǎn)移到另一玻璃室內(nèi)，該室內(nèi)已經(jīng)分散有少量的碘用來使TLC標(biāo)準(zhǔn)物
的脂質(zhì)顯色。將對應(yīng)于膽固醇油酸酯的部分用剪刀切下，置于瓶中，
然后添加閃爍雞尾酒(Perkin Elmer) (3 mL)進行測定。對于比活性 測定，測定["C]油?；?CoA混合物(10 ^L)的放射活性。將通過ACAT 反應(yīng)生成的膽固醇["C]油酸酯的放射活性(cpm)除以反應(yīng)系統(tǒng)中使用 的細胞蛋白質(zhì)的量(mg)、 ["C]油?；?CoA的比活性(cpm/pmo1)和 反應(yīng)時間(10分鐘)，計算ACAT活性水平(pmol/mg細胞蛋白質(zhì)/min)。
發(fā)現(xiàn)Salusin-a或salusin-卩引起了 ACAT-1蛋白質(zhì)表達的改變。因 此，考察了 salusin-a或salusin-P對ACAT酶活性的效應(yīng)。將人外周血 單核細胞(4xl06細胞/皿)在含有10%人血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細胞。這時，在培養(yǎng)期間向培養(yǎng)基中 力口入0.6 nM salusin-a或salusin-(3。
通過向細胞提取溶液中加入混合膠束(膽固醇/磷脂酰膽堿)將 ACAT-1蛋白質(zhì)重組到脂質(zhì)體中。將["C]油?；?CoA加入到所得的樣 品中，然后在37"C下反應(yīng)10分鐘。測定通過ACAT反應(yīng)生成的膽固醇 ["C]油酸酯的放射活性，然后計算ACAT活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在用salusin-a 處理的細胞中的ACAT活性已經(jīng)被抑制到對照的50n/。。同時，發(fā)現(xiàn)在 用salusin-P處理的細胞中的ACAT活性已經(jīng)增加到對照的1.8倍水平 (圖5)。
實施例3: salusin-cx和salusin-P對人單核細胞源性巨噬細胞中的ACAT-1 mRNA表達的影響
使用TRIzol試劑(LIFETECHNOLOGIES)進行RNA提取。 將細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，然后去除培養(yǎng)基。細胞用PBS洗滌 3次。從中充分去除PBS，并向其中加入TRIzol (1 mL)用于細胞溶 解。將細胞提取溶液吸入吸出5次，然后轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中。 然后，將該管在室溫下放置5分鐘。向其中加入氯仿(200jiL)，然后 劇烈振搖15秒。該管進一步放置2-3分鐘，并以12,000 rpm離心15 分鐘(Himac CF15D2高速微型低溫離心機；Hitach, Ltd.)。將上層轉(zhuǎn) 移至新的Eppendorf管中，并向其中加入異丙醇(500 pL)，然后上下
22顛倒地混合。將該管放置10分鐘，并以12,000 rpm離心10分鐘。從 生成物中去除上清液。將75%乙醇(180 (iL)加入至剩余的沉淀中， 然后以15,000 rpm離心5分鐘。從生成物中去除上清液，然后風(fēng)干。 生成物溶解在無菌純凈水(90 pL)中，并在65"C下保溫10分鐘。向 其中加入脫氧核糖核酸酶(DNase) I溶液(IOjliL)，并將生成物在37 。C下保溫15分鐘。向其中加入3M乙酸鈉(10nL)和苯酚/氯仿(1:1， v/v) (IOOjiL)，然后振搖。以15,000 rpm離心3分鐘。將上清液收集 在新的Eppendorf管中。向其中加入氯仿/異戊醇(24:1, v/v) (100 pL), 并將該管進一歩以15,000 rpm離心3分鐘。收集上清液，并向其中加 入乙醇(200|iiL)。將生成物在-8(TC下放置30分鐘或更長時間，然后 以15,000 rpm離心IO分鐘。去除上清液。將生成物用70%乙醇洗滌并 干燥。將得到的產(chǎn)物溶解在無菌蒸餾水(15pL)中。通過測定260nm 處的吸光度，得到由此獲得的RNA溶液的濃度。將無菌純凈水加入至 溶液中，以達到預(yù)定的濃度。
接下來，通過實時RT-PCR法來分析ACAT-1 mRNA的RNA表達。 使用以下各個人mRNA序列，通過Primer Express 1.0版(PE Biosystems)確定引物序列。 卩-肌動蛋白
正向引物5，-CCTGGCACCCAGCACAAT (SEQ ID NO: 5 ) 反向引物5'國GGGCCGGACTCGTCATAC (SEQ ID NO: 6) ACAT畫l
正向引物5，-TTCGGAATATCATCAAACAGGAGCC(SEQIDNO: 7) 反向引物5，畫CACACCTGGCAAGATGGAGTT (SEQ ID NO: 8 ) 將用salusin-a或salusin-(3處理的外周血人單核細胞(4 x 106細胞/6 cm皿)在含10%人血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天， 以分化成巨噬細胞。從用salusin-a或salusin-p處理的細胞和未經(jīng)處理 的細胞中提取總RNA。對每種總RNA (1 jig)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以進行 cDNA合成。
進行實時PCR，以便對使用qPCR MasterMix SYBR Greenl (Eurogentec)通過GeneAmp 5700序歹ll檢領(lǐng)lj系統(tǒng)(Applied Biosystems Japan)獲得的cDNA進行定量。接下來，通過下述方法進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
將隨機引物(TaKaRa, 80nM) (0.5 pL)和無菌純凈水(10.5 |iL) 加入到各總RNA溶液(1 pg/(iL) (1 (iL)中，然后在7(TC下加熱10 分鐘。向其中加入核糖核酸酶(RNase)抑制劑(0.75 pL)、5 x First Strand Buffer (Invitrogen) (4 |tiL)、 O.IM二硫蘇糖醇(2 (iL)、 2.5 mM dNTP
(TaKaRa) (4 ^L)禾口 Superscript II (200 U/|uL; Invitrogen) (lpL)， 然后在37"C下反應(yīng)1小時。在95'C下變性5分鐘后，將生成物在冰上 冷卻，并向其中加入無菌純凈水(40pL)。
通過下述方法進行實時RT-PCR。
將qPCR MasterMix SYBR Greenl (12.5 pL)、引物溶液(正向+反 向每種5pM) (2.5 pL)和無菌純凈水(8pL)加入到通過逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)獲得的cDNA溶液(2)aL)中，然后進行反應(yīng)。
PCR循環(huán)包括一個循環(huán)的95°C/10分鐘，以及40個循環(huán)的94°C/20 秒、55 °C/20秒和72 °C/30秒。
發(fā)現(xiàn)Salusin-a和salusin-卩引起ACAT-1蛋白質(zhì)表達和ACAT活性 的改變。因此，進一歩考察salusin-a和salusin-P對ACAT-1 mRNA表 達的影響。將人外周血單核細胞(4xl(^細胞/皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細胞。這時， 在培養(yǎng)期間加入0.6 nM salusin-ot或salusin-p， 以考察salusin-a或 salusin-p對ACAT-1 mRNA表達的影響。在培養(yǎng)第7天時，從細胞中提 取總RNA。通過實時RT-PCR考察salusin-a和salusin-p對ACAT-1 mRNA的影響。因此，發(fā)現(xiàn)salusin-a將ACAT-1 mRNA的表達水平抑 制至對照的80%的水平，發(fā)現(xiàn)salusin-(3將ACAT-1 mRNA的表達水平 增加至對照的1.6倍(圖6)。
實施例4: salusin-a和salusin-p對人單核細胞源性巨噬細胞泡沫化(膽 固醇酯的積聚)的影響
采用膽固醇酯化測定作為巨噬細胞泡沫化的測定方法[Goldstein JL等人，Methods Enzymol. 1983; 98: 241-260]。巨噬細胞使乙酰化LDL (AcLDL)經(jīng)清道夫受體而結(jié)合到細胞中，從而引起溶酶體降解。將 在溶酶體中產(chǎn)生的游離膽固醇轉(zhuǎn)移至ACAT，并因ACAT反應(yīng)而轉(zhuǎn)化
24成膽固醇酯。如果向培養(yǎng)基中加入fH]油酸酯，貝1」[3司油酸酯被結(jié)合到 細胞中，并被酰基CoA合成酶轉(zhuǎn)變?yōu)閇SH]油?；?CoA。 ACAT使用 AcLDL來源的游離膽固醇和如上所述獲得的[SH]油酰基-CoA作為底 物，產(chǎn)生膽固醇[3司油酸酯。細胞中積聚的膽固醇[3司油酸酯的放射活 性可以用作膽固醇酯積聚的敏感指標(biāo)(圖7)。 人血漿LDL通過下述方法純化。
通過順序浮選超速離心從人血槳純化LDL (d = 1.019-1.063) [SchumakerVN等人，Methds Enzymol. 1986; 128: 155-170]。將人血漿 (350mL)分配到6個離心管中，使用RP-42轉(zhuǎn)子在4。C下以100,000 xg (36,000 rpm)超速離心20小時。從生成物中去除含有乳糜顆粒和 極低密度脂蛋白(VLDL)的混濁上層，使用抽吸器回收下層(黃色層)。 獲得的已經(jīng)去除乳糜顆粒和VLDL的血漿成分的體積用量瓶測量。其 比重用浮動比重計(floatinghydrometer)測定。向其中加入固體KBr， 直至達到"d= 1.063"的條件。假設(shè)"V"代表獲得的已經(jīng)去除乳糜顆 粒和VLDL的血漿成分的體積，"D"代表其比重，則可以通過下式來 大致計算達到1.063 g/mL的比重所必須加入的KBr的量。 KBr (g) =V (1扁國D) / 0.68323
將已被調(diào)節(jié)達到"d= 1.063"的含LDL的血漿成分的一半體積分 配到6個離心管中。將密度溶液(d= 1.063)導(dǎo)入其中至每個離心管的 邊緣的水平。使用RP-42轉(zhuǎn)子在4。C下以100,000 xg (36,000rpm)超 速離心20小時。然后，用巴斯德吸管回收上層(黃色層)(粗LDL)。 上述成分的剩余一半體積用相同的方式分配，然后進行超速離心。然 后，回收上層(黃色層)(粗制LDL)。將上述兩項操作獲得的各個部 分粗LDL混合在一起。將生成物分配到6個離心管中。將密度溶液(d =1.063)導(dǎo)入其中至每個離心管邊緣的水平。使用RP-42轉(zhuǎn)子在4。C 下以100，000xg (36,000 rpm)超速離心20小時。然后，回收上層(黃 色層)(純化LDL)。將LDL加入至透析膜，然后使用EDTA-鹽水(4 L) 在室內(nèi)在低溫下透析。重復(fù)3次12小時的透析。將生成物用 ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200 (AMICON)濃縮，使得蛋白 質(zhì)濃度為約2mg/mL，然后使用濾器無菌過濾。通過BCA法(Pierce) 測定蛋白質(zhì)濃度。LDL用于制備下述的AcLDL。AcLDL以下述方式制備。
將等體積的LDL (蛋白質(zhì)30mg)(如果為2.0 mg蛋白質(zhì)/mL則 15mL)和飽和乙酸鈉混合在一起。將混合物在冰上冷卻，并用攪拌棒 攪拌，期間逐滴加入乙酸酐(150 pL) (5iuL/LDLmg蛋白質(zhì))(每滴5 pL) [Miyazaki A等人，J Biol Chem. 1994;269:5264-5269.]。這時，向 其中逐滴加入5 N NaOH，用pH計監(jiān)測pH，使得pH可以維持在6.5 以上。將生成物在冰上放置1小時，然后使用EDTA-鹽水(4L)在室 內(nèi)在低溫下透析。重復(fù)3次12小時的透析。將生成物用 ULTRAFILTRATION CELL MODEL 8200 (AMICON)濃縮。通過BCA 法(Pierce)測定蛋白質(zhì)濃度。由此獲得實驗用的AcLDL。
用于下述操作的試劑如下。油酸(185MBq，在1 mL甲苯中，GE Healthcare Bio-Science) (油酸摩爾濃度0.625 mM)
3 mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA):白蛋白濃度為100 mg/mL (1.5 mM)， lmol試劑結(jié)合2-mol油酸。 制備3 mM [3司油酸混合物
將[9,10(n)-3H]油酸(50 |LiL) (9.25 MBq)導(dǎo)入至玻璃燒杯中，并 用氮氣干燥。將3mM油酸-牛血清白蛋白(SIGMA) (5mL)倒入玻 璃燒杯，然后用攪拌棒攪拌5小時，然后用2卞m濾器無菌過濾。
將人外周血單核細胞(4 x 106細胞/6 cm皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細胞。這時， 在培養(yǎng)其月間力B入0.6 nM salusin-oc或salusin畫p?？疾靤alusin國ot禾Q salusin-p 對細胞內(nèi)膽固醇酯積聚(膽固醇酯化)的影響。在第7天，更換培養(yǎng) 基。向細胞中加入5 (ig/mLAcLDL、 3 mM [3司油酸混合物(67 |uL)(終 濃度0.1 mM)禾B 0.6 nM salusin-a或salusin-p。進一步向其中加入適 當(dāng)量的培養(yǎng)基，以得到2mL的總量，然后再培養(yǎng)18小時。細胞用PBS 洗滌3次。向每個皿中加入己垸/異丙醇(3:2，v/v) (lmL)。每個皿在 室溫下放置l小時。將己垸/異丙醇回收到脂質(zhì)提取管中。此外，向每 個皿中加入1 mL己烷/異丙醇，以洗滌細胞和皿壁，然后回收到同一 脂質(zhì)提取管中。脂質(zhì)提取后，向每個皿中加入lNNaOH (lmL),以 進行蛋白質(zhì)提取。將脂質(zhì)提取管渦旋，并在室溫下放置30分鐘，然后用氮氣干燥。將提取的細胞脂質(zhì)進行渦旋，并加入60)lL異丙醇溶解。
將其總量廣泛地在標(biāo)準(zhǔn)物點之間點樣。通過TLC進行展開，使得展開 溶劑(己垸/二乙醚/乙酸(90: 10: 1，v/v))到達TLC板的上邊緣。將 TLC板置于玻璃室中，用碘使脂質(zhì)顯色。將對應(yīng)于膽固醇油酸酯的部 分用剪刀切下，并將該部分置于閃爍瓶中，然后加入閃爍雞尾酒(Perkin Elmer) (3 mL)進行測定?；厥罩凹尤胫撩總€皿中的1NNaOH，并 通過BCA法(Pierce)對細胞蛋白質(zhì)進行定量測定。測定3 mM [3H] 油酸混合物的比活性(dpm/nmo1)。將細胞中產(chǎn)生的膽固醇[3司油酸酯 的放射活性(dpm)除以卩H]油酸的比活性(dpm/nmo1)和細胞蛋白質(zhì) 的量(mg)，從而計算膽固醇的酯化(nmol/mg細胞蛋白質(zhì))。
ACAT-1是促進巨噬細胞泡沫化的重要因子。上述實驗揭示了 salusin-oc和salusin-(3以相反的方式影響著ACAT-1的表達和ACAT的活 性。因此，考察salusin-a和salusin-p對巨噬細胞泡沫化的影響。
將人外周血單核細胞(4 x 106細胞/6 cm皿)培養(yǎng)7天，以分化成 巨噬細胞。這時，考察在培養(yǎng)期間同時加入的0.6 nM salusin-a和 salusin-P對巨噬細胞泡沫化的影響。在培養(yǎng)第7天，向細胞中加入5 嗎/mL AcLDL、 0.1 mM [3司油酸混合物和0.6 nM salusin-ot或salusin-(3。 細胞進一步培養(yǎng)24小時，然后測定細胞中積聚的膽固醇[3司油酸酯。 當(dāng)對照細胞載有AcLDL時，觀察到積聚的膽固醇[3司油酸酯為5.6 nmol/mg細胞蛋白質(zhì)。該結(jié)果是載有AcLDL的細胞(未負載對照細胞) 所獲得結(jié)果的6.3倍。在用salusin-a處理的細胞中由AcLDL引起的膽 固醇[3司油酸酯的積聚程度降低至與對照細胞(負載對照)的50%對應(yīng) 的水平。在用salusin-P處理的細胞中積聚程度增加至對照細胞的1.6倍 的水平(圖8)。
實施例5:考察乙?；疞DL (AcLDL)的細胞參入量-測定A型清道夫 受體(SR-A)的活性
清道夫受體是在巨噬細胞上表達的脂蛋白受體。其識別修飾的 LDL例如氧化LDL或AcLDL，引起胞吞作用。己經(jīng)參入至細胞內(nèi)的 該受體的配體在溶酶體中降解。這種清道夫受體在巨噬細胞形成泡沫 細胞中發(fā)揮著非常重要的作用。清道夫受體的已知例子包括A型清道夫受體(SR-A)、 CD36、凝集素樣氧化LDL受體-1 (LOX-l)和CD68 [Greaves DR等人，J Lipid Res. 2005; 46: 11-20.]。氧化LDL可以與四 種類型的上述清道夫受體結(jié)合。然而，與AcLDL結(jié)合的清道夫受體只 有SR-A。在該實驗中，使用修飾LDL的代表性實例AcLDL作為配體， 測定作為能夠識別AcLDL的專用清道夫受體的SR-A的活性(圖9)。
將外周血人單核細胞(4 x 106細胞/6 cm皿)在含10%人血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基(2 mL)中培養(yǎng)7天，以分化成巨噬細胞。這時， 在培養(yǎng)期間加入0.6 nM salusin-ot或salusin-p， 以考察salusin-a和 salusin-P對[^I]AcLDL的胞吞活性(SR-A活性)的影響。在第7天， 更換培養(yǎng)基。將適當(dāng)量培養(yǎng)基加入[^I]AcLDL (5-10 (ig/mL)和0.6 nM salusin-a或salusin-J3中，以得到2 mL的總量。細胞進一步培養(yǎng)18小時。
將細胞用含有3% BSA的PBS洗滌一次，然后用PBS洗滌兩次。 向其中加入0.1NNaOH (lmL)，生成物在室溫下放置30分鐘。將細 胞回收到聚苯乙烯管(12 x 75 mm, Fisher Scientific Company)中，進 一步用0.1NNaOH (lmL)洗滌，并再次回收。細胞提取溶液的總量 使用Y計數(shù)儀測定。其一部分的蛋白質(zhì)濃度通過BCA法(Pierce)測定。 通過將細胞提取溶液的放射活性(cpm)除以[^I]AcLDL的比活性 (cpm/嗎)和每皿的細胞蛋白質(zhì)量(mg)，計算[^I]AcLDL的細胞結(jié) 合(嗎/mg細胞蛋白質(zhì))[Miyazaki A等人，J Biol Chem. 1994; 269: 5264-5269]。
降解測定通過下述方法進行。
經(jīng)清道夫受體被巨噬細胞參入的["I]AcLDL在溶酶體中被降解。 [巧]AcLDL的蛋白質(zhì)部分——[125I] apo B-100被蛋白質(zhì)降解酶破碎以 形成肽，從而被分泌至細胞外，然后其可以在三氯乙酸可溶部分中發(fā) 現(xiàn)。同時，在培養(yǎng)基中沒有被巨噬細胞參入的[^I]AcLDL不溶于三氯 乙酸，因此可以通過離心以沉淀物的形式得以分離。
從每種培養(yǎng)上清液中收集一部分(750 |iL)到聚苯乙烯管(12x75 mm, Fisher Scientific Company)中。向其中加入40%三氯乙酸(250 )uL) 禾口0.7MAgNO3 (200 nL)，并將混合物渦旋，然后以2,500 rpm離心 10分鐘(TOMY, LC-120低速離心機，轉(zhuǎn)子7015-06)。通過凝膠過濾 去除大部分在以碘標(biāo)記AcLDL的步驟中未與蛋白質(zhì)反應(yīng)的游離125I。但是，發(fā)現(xiàn)其一部分仍然有剩余。在該步驟中，剩余部分的1251可以通 過加入AgN03而以Ag[^I]的形式沉淀出來。因此，培養(yǎng)上清液中不溶
于三氯乙酸的部分含有未被細胞參入的[^I]AcLDL和來源于游離1251 的Ag[1251]。另夕卜，已被細胞加工的來自[^I]AcLDL的肽專一地在可溶 于三氯乙酸的部分中檢測出。離心之后，將上清液(600 )LiL)收集到 不同的管中，并用Y計數(shù)儀測定。基于測定結(jié)果，對每個皿計算培養(yǎng)上 清液中可溶于三氯乙酸的部分的總放射活性(cpm)。通過將總放射活 性除以[，]AcLDL的比活性(cpm/jig AcLDL蛋白質(zhì))和每皿的細胞 蛋白質(zhì)量(mg)，得到[^I]AcLDL的降解率()ng/mg細胞蛋白質(zhì))。
作為上述實驗的結(jié)果，其揭示了 salusin-a和salusin-(3控制著巨噬 細胞的泡沫化。因此，考察受salusin控制的SR-A活性是否會影響上 述現(xiàn)象。細胞內(nèi)參入的AcLDL的蛋白質(zhì)部分(apoB-100)被溶酶體中 的蛋白質(zhì)降解酶降解成肽，從而被分泌至細胞外。在結(jié)合測定中，測 定存在于細胞表面或細胞內(nèi)部的1251的放射活性。在降解測定中，測定 已在溶酶體中被破碎成肽、并被分泌至細胞外的[^I]AcLDL(apoB-100 肽片段)的放射活性?；趦煞N測定，確定SR-A的活性。
將人外周血單核細胞(4x 1()S細胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以分化成 巨噬細胞。這時，在培養(yǎng)期間加入0.6nMsalusin-a或salusin-(3。然后， 考察salusin-oc和salusin-P對[^I]AcLD的參入和降解的影響。在此，在 培養(yǎng)第7天時，向細胞中加入5-10嗎/mL [125I]AcLDL禾口 0.6 nM salusin-a或salusin-(3，并將細胞進一步培養(yǎng)18小時。然后，進行結(jié)合 測定和降解測定。結(jié)果，在任一測定中，與對照細胞相比，都觀察不 到由salusin-ot和salusin-(3引起的顯著變化。(圖10A禾B IOB，圖10A 顯示結(jié)合測定結(jié)果，圖10B顯示降解測定結(jié)果。)因此，已經(jīng)揭示出， salusin-a和salusin-P影響AcLDL參入細胞后的膽固醇代謝，但不影響 SR-A的活性。
實施例6: salusin-a和salusin-P對人單核細胞源性巨噬細胞中的ATP結(jié) 合盒轉(zhuǎn)運體A1 (ABCA-1)蛋白質(zhì)表達的影響
控制巨噬細胞泡沫化現(xiàn)象的一種機制是經(jīng)ABCA-1向細胞外分泌 游離膽固醇的機制(膽固醇外流)?？疾靤alusin對ABCA-l蛋白質(zhì)表達的影響。將外周血人單核細胞(4x 1(^細胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以 分化成巨噬細胞。這時，在培養(yǎng)期間加入salusin-ot或salusin-P (0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8或1.0nM)。然后，考察salusin-a和salusin-卩對ABCA國1 蛋白質(zhì)表達的影響。在前述使用ABCA-1特異性抗體進行蛋白質(zhì)印跡 法的情況下，發(fā)現(xiàn)salusin-oc和salusin-P均沒有引起ABCA-1蛋白質(zhì)表 達的顯著變化。(圖11A和11B:圖11A顯示salusin-ot的結(jié)果，圖11B 顯示salusin-p的結(jié)果。)
實施例7: salusin-a和salusin-P對分化后的培養(yǎng)的人單核細胞源性巨噬 細胞中的ACAT-1蛋白質(zhì)表達的影響
在實施例1-6中每一個實驗中，在培養(yǎng)的人單核細胞分化為巨噬細 胞的分化期加入salusin-a和salusin-p，使用培養(yǎng)第7天獲得的細胞來 考察salusin-a和salusin-(3的影響。在該實施例中，考察salusin-a和 salusin-(3是否對分化后獲得的巨噬細胞中的AC AT-1蛋白質(zhì)表達具有類 似的影響。將外周血人單核細胞(4x 1()S細胞/6cm皿)培養(yǎng)7天，以 分化成巨噬細胞。在第7天時，向其中加入salusin-ot和salusin-P (0、 0.4、 0.6或1.0nM)，巨噬細胞進一步培養(yǎng)3天。作為通過蛋白質(zhì)印跡 法對ACAT-1進行考察的結(jié)果，1.0 nM salusin-ot將ACAT-1蛋白質(zhì)的表 達水平降低至與對照的60。/。對應(yīng)的水平。同時，0.6nMbsalusin-(3將上 述表達水平增加至對照的2.2倍水平(圖12A和12B，圖12A顯示 salusin-a的結(jié)果，圖12B顯示salusin-P的結(jié)果。)。基于這些結(jié)果己經(jīng)揭 示出，即使在單核細胞分化成巨噬細胞之后，salusin-ot或salusin-P對 ACAT-1表達的控制仍然得以保持。
以下是在上述實施例中通過考察新的血管活性物質(zhì)(即salusin-a 和salusin-p)對培養(yǎng)的人單核細胞源性巨噬細胞的泡沫化(細胞內(nèi)膽 固醇酯積聚)以及與該泡沫化有關(guān)的基因表達的影響獲得的主要結(jié)果。
(1) salusin-ot抑制由AcLDL引起的巨噬細胞泡沫化，salusin-(3則 促進由AcLDL引起的巨噬細胞泡沬化。
(2) salusin-ot抑制細胞內(nèi)膽固醇酯化酶ACAT-l的表達，salusin-卩 則促進該酶的表達。
(3) SR-A能夠識別并細胞內(nèi)參入AcLDL的活性不受salusin-a或salusin-p的影響。
(4)在細胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用的ABCA-1的表達不受 salusin-oc或salusin-p的影口向。
基于上述結(jié)果己經(jīng)揭示，培養(yǎng)的人單核細胞源性巨噬細胞的泡沫 化以相反的方式受salusin-a和salusin-P的控制，而且控制該泡沫化的 機制涉及到salusin-oc和salusin-P以相反的方式控制ACAT-1的表達。
另外，已有報道稱salusin-(3對促進血管平滑肌細胞或成纖維細胞 增殖的正面效果不受用salusin-oc預(yù)處理的抑制，因此，可以獲得 salusin-a和salusin-p的累加效應(yīng)[Shichiri M等人，Nat Med. 2003; 9: 1166-1172]。該報道提出，salusin-a和salusin-p可能經(jīng)由不同的受體作 用于這些細胞。另外，Wang等人已報道稱，在其中已經(jīng)表達有小鼠 mas樣G蛋白偶聯(lián)受體Al (mMrgAl)的HEK293T細胞中，salusin-P 被認(rèn)為是配體[Wang Z等人，Eur J Pharmacol. 2006; 539: 145-150]。同 時，salusin-a不作為mMrgAl的受體，表明salusin-a和salusin-(3由不同 的受體識別[Wang Z等人，Eur J Pharmacol. 2006; 539: 145-150]。在該 研究中，獲得的結(jié)果表明salusin-a和salusin-P以相反的方式作用于巨 噬細胞的泡沫化和ACAT-1表達。因此，可以假設(shè)salusin-ot和salusin-P 經(jīng)由巨噬細胞中表達的不同受體發(fā)揮作用。
實施例8: salusin-a和salusin-(3在人冠狀動脈的動脈硬化病變中的表達 從死于急性冠狀動脈綜合征(ACS)的患者(72歲男性)制備冠 狀動脈病理切片，并用己純化的免疫化學(xué)組織染色用抗salusin-a和-p 抗體極性染色。不僅在冠狀動脈的斑塊部分中的平滑肌細胞和成纖維 細胞中，而且在脂紋中的巨噬細胞源性泡沫細胞中，都觀察到強的 salusin-P表達(圖13A-13D)。 Salusin-a禾B salusin-卩被認(rèn)為由共用前體 (Preprosalusin)的共同部分產(chǎn)生。但是，在其中有強salusin-P表達的 冠狀動脈的動脈硬化病變中基本上觀察不到salusin-ot的表達。在其他3 名患者(一名40歲男性、 一名76歲女性和一名86歲女性)中也證實 了類似的發(fā)現(xiàn)。作為上述考察的結(jié)果，已經(jīng)闡明，強的salusin-p表達 和降低的salusin-ot表達均深入地參與了人冠狀動脈硬化的進展。
31實施例9:使用salusin-a作為標(biāo)志物檢測動脈硬化
考察64名中老年男性(40-86歲)的血清salusin-a濃度和動脈硬 化之間的關(guān)系。對于動脈硬化評價，使用可以簡單、非侵入的方式進 行的頸動脈超聲波心動描記法(模式B)。測定每一側(cè)頸動脈內(nèi)膜-中膜 厚度(IMT)的最大水平(最大IMT)。在健康人中最大IMT為1 mm 或更小。已經(jīng)證明，最大IMT大于1 mm是急性冠狀動脈綜合征(ACS)、 中風(fēng)等的危險因素。通過Sato K等人，Peptides. 2006; 27: 2561-2566中 所述的放射免疫測定法來測定血清salusin-ot的濃度。血清salusin-a濃 度與頸動脈最大IMT之間呈顯著的負相關(guān)(r = 0.29, P< 0.02;圖14)。 這表明，血清salusin-a的濃度越低，動脈硬化的進程越靠后期。
實施例10:使用salusin-a作為標(biāo)志物檢測急性冠狀動脈綜合征、缺血 性心臟病和動脈硬化
從以下病例中收集血清標(biāo)本由37名穩(wěn)定性勞力型心絞痛患者 (26名男性病例和11名女性病例)、60名急性冠狀動脈綜合征患者(發(fā) 作后6小時內(nèi))(41名男性病例和19名女性病例)以及76名陳舊性心 肌梗塞患者(自急性冠狀動脈綜合征發(fā)作后已經(jīng)過了 6個月或更長時 間)(61名男性病例和15名女性病例)組成的缺血性心臟病病例(共 計173名病例)；以及由40名原發(fā)性高血壓患者(28名男性病例和12 名女性病例)和55名健康志愿者G5名男性病例和20名女性病例) 組成的對照病例。根據(jù)Sato K等人，Peptides. 2006; 27: 2561-2566的描 述通過放射免疫測定法來測定Salusin-a濃度。所有急性冠狀動脈綜合 征病例均接受急診冠狀動脈成像。基于發(fā)現(xiàn)具有動脈硬化病變的冠狀 動脈分支(右冠狀動脈+左前降支+左回旋支=總計3個分支)的數(shù)目 來評價冠狀動脈病變的嚴(yán)重性。另外，所有高血壓病例和23名健康志 愿者均接受頸動脈超聲波心動描記法。具有清晰邊界的IMT為1.1 mm 或更大的病變被指定為斑塊病變。斑塊分?jǐn)?shù)(plaque score)確定為所 有斑塊病變(右側(cè)和左側(cè))的厚度的總和。斑塊分?jǐn)?shù)1.1-5指定成對應(yīng) 于輕度動脈硬化。斑塊分?jǐn)?shù)5-10指定成對應(yīng)于中度動脈硬化，斑塊分 數(shù)10以上指定成對應(yīng)于重度動脈硬化。
對于缺血性心臟病患者，血清salusin-a濃度為4.9 ± 0.6 pM。該數(shù)值顯著低于健康志愿者(21.7士1.5pM)(均值土SEM，下同)和高血壓 患者(15.4 ± 1.1 pM) (p< 0.0001)。在缺血性心臟病患者中，勞力型 心絞痛患者的血清salusin-oc濃度是穩(wěn)定的(6.4±0.9pM)，急性冠狀動 脈綜合征患者為3.6土0.6pM，陳舊性心肌梗塞患者為5.2± 1.2pM (圖 15)。作為60名急性冠狀動脈綜合征患者的急診冠狀動脈成像的結(jié)果， 其中23例發(fā)現(xiàn)有單支血管病變，17例發(fā)現(xiàn)有兩支血管病變，20例發(fā) 現(xiàn)有3支血管病變。單支血管病變患者的salusin-ot濃度為5.2 ± 1.0 pM， 兩支血管病變患者的salusin-ot濃度為3.1 ± 1.4 pM， 3支血管病變患者 的salusin-a濃度為2.3 ± 0.9 pM。 3支血管病變患者的結(jié)果要顯著低于 單支血管病變的患者(p<0.05，圖16)。
對于40名高血壓患者和23名健康志愿者，頸動脈最大IMT和 salusin-a濃度之間呈負相關(guān)。另外，斑塊分?jǐn)?shù)隨著嚴(yán)重性增加而逐漸減 小。因此，認(rèn)為salusin-a濃度下降參與了動脈硬化的進展。
就上述而言，假設(shè)salusin-oc濃度下降反映了動脈硬化、特別是缺 血性心臟病的存在。對于急性冠狀動脈綜合征，所得到salusin-a的濃 度比任何其他缺血性心臟病病例中得到的濃度更低。另外，發(fā)現(xiàn) salusin-oc的濃度隨著冠狀動脈病變的嚴(yán)重性增加而進一步下降。這表明 具有抗動脈硬化作用的sahisin-ot可以非常有效地用作指示急性冠狀動 脈綜合征的發(fā)作或嚴(yán)重性的標(biāo)志物。
實施例11: salusin-a和salusin-p的連續(xù)給藥對動脈硬化的影響
使用apoE缺陷小鼠作為動脈硬化動物模型，考察salusin-a和 salusin-p的連續(xù)給藥對動脈硬化的影響。在此，還考察了 salusin-ot或 salusin-P的抗血清作用。除了考察動脈硬化病變以外，研究還集中于對 于動脈硬化原發(fā)病灶的形成非常重要的巨噬細胞泡沫化，并且還測定 了氧化LDL引起的膽固醇酯積聚。對于能夠識別氧化LDL的清道夫 受體(CD36和SR-A)、細胞內(nèi)膽固醇酯化酶(?；?CoA)(膽固醇酰 基轉(zhuǎn)移酶l (ACATl))以及參與過量細胞內(nèi)游離膽固醇的細胞外轉(zhuǎn)運 (膽固醇外流)的機制的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al (ABCA1)、 ABCG1 和SR-BI，進行了表達分析。
上述動物實驗根據(jù)ShowaUniversity (日本)制定的實驗實踐指南
33進行。該研究用的所有apoE缺陷小鼠均購自Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, U.S.A.)。
將13周齡雄性apoE缺陷小鼠(72只小鼠)分成以下6組(i)生 理鹽水(對照);(ii) salusin-a (0.6畫l/kg/h); (iii) salusin-卩(0.6 nmol/kg/h); (iv) salusin-ot (0.6 nmol/kg/h) +抗salusin-a血清(1.4 嗎/kg/h ); ( v ) salusin-P (0.6 nmol/kg/h ) +抗salusin-p血清(1.4 jig/kg/h); 和(vi)抗salusin-(3血清(1.4嗎/kg/h)。使用微量滲透泵對小鼠連續(xù)皮 下給藥4-8周。微量滲透泵和其中所含的溶液每周更換。
對攝取正常飲食的小鼠進行實驗。測定以下參數(shù)。
1. 主動脈的動脈硬化病變的分析
將每條采集的主動脈沿縱向切開，然后進行油紅O染色，用于考 察每個具有脂質(zhì)色素沉著的動脈粥樣硬化病變的表面積。使用Adobe Photoshop (Adobe System Inc., San Jose, CA, U.S.A.)鑒別動脈硬化病 變，然后使用NIH Scion Image (Scion Corp., Frederick, MD, U.S.A.)進 行各處病變的表面積的定量分析。另外，制備主動脈附近(緊接著主 動脈瓣下方)的切片，然后進行油紅O染色，用于對動脈硬化病變進 行詳細分析。
2. 巨噬細胞的分析
(1) 考察細胞內(nèi)膽固醇酯積聚 在腹膜內(nèi)給予巰基乙酸鹽后的第4天，收集滲出的巨噬細胞，并
用含10%胎牛血清的RPMI1640溶液培養(yǎng)。向培養(yǎng)溶液中加入氧化LDL (10嗎/mL)禾口[3司油酸(0.1 mM)。 13小時后，測定細胞內(nèi)積聚的膽 固醇[3司油酸的放射活性，以對巨噬細胞的泡沬化進行評價。
(2) 考察膽固醇外流 將以上述方式收集的巨噬細胞在如上制備的含有用[3司膽固醇(74
kBq/mL)標(biāo)記的氧化LDL (10pg/ml)的培養(yǎng)溶液中保溫24小時，并 用PBS洗滌兩次。之后，將巨噬細胞在其中已添加有HDL (15 pg/mL) 的含0.1% BSA的RPMI1640溶液中保溫16小時。培養(yǎng)溶液以15,000 rpm離心10分鐘，以從中去除殘渣。細胞用PBS洗滌兩次，然后溶解 在lNNaOH (0.3 mL)中。測定培養(yǎng)溶液和細胞提取溶液中的[3司膽 固醇放射活性膽固醇外流率(％)=培養(yǎng)溶液中的[3司膽固醇放射活性/培養(yǎng)溶液中的[3司膽固醇放射活性+細胞提取溶液中的[3司膽固醇 放射活性X 100 (3)考察與泡沫化有關(guān)的基因的表達
如(1)中的實驗?zāi)菢邮占奘杉毎ㄟ^蛋白質(zhì)印跡法分析參與
巨噬細胞泡沬化的基因(即清道夫受體CD36和能夠識別氧化LDL的 SR-A、細胞內(nèi)膽固醇酯化酶ACAT1以及參與膽固醇外流的ABCA1、 ABCG1禾n SR-BI)的蛋白質(zhì)表達。對于巨噬細胞功能的內(nèi)標(biāo)，還考察 了P-肌動蛋白的表達。為了對條帶濃度進行定量，使用Analyzer(ATTO Corporation, Tokyo )。
作為上述考察的結(jié)果，獲得了以下結(jié)果。
1. 主動脈的動脈硬化病變
給藥后4周，與用生理鹽水處理的對照小鼠(圖17-1A)相比，在 用salusin-P處理的apoE缺陷小鼠中在從主動脈根至頭臂動脈分岔的廣 泛區(qū)域中觀察到用油紅O染成紅色的主動脈弓的動脈硬化病變(圖 17-lC，箭頭)。關(guān)于對各組(由6只小鼠組成)測定的動脈硬化病變 表面積的平均值，發(fā)現(xiàn)salusin-p處理組的平均值已經(jīng)增加至對照組的 約2.5倍(P < 0.005,圖17-2)。在近端主動脈切片中，與對照組(圖 17-1F)相比，在salusin-(3處理組中觀察到用油紅0染成紅色的粥樣斑 的形成和血管壁的增厚(圖17-lH，箭頭)。在除salusin-P之外還用抗 salusin-P血清處理的小鼠中，與單用salusin-P處理的小鼠相比，主動脈 的動脈硬化病變(圖17-1D)、粥樣斑和血管壁的增厚(圖17-11)得到 改善。在單用抗salusin-(3血清處理的小鼠中，觀察到與對照小鼠類似 的動脈硬化病變(圖17-lE和J)。
給藥后8周，在用生理鹽水處理的對照小鼠中，主動脈弓中的動 脈硬化病變的大小顯著增加(圖18-lA，箭頭)。但是，作為給予salusin-ot 的結(jié)果，動脈硬化表面積減小至給予salusin-oc前的一半以下(圖18-1B 和18-2)。另夕卜，作為給予salusin-a的結(jié)果，觀察不到明顯的斑塊形成 (圖18-1B和E)。在抗salusin-a血清的存在下，salusin-a對動脈硬化 病變的抑制效應(yīng)消失(圖18-lC和F和18-2)。
2. 巨噬細胞的分析
給藥后4周，在給予salusin-a的情況下，由氧化LDL (細胞內(nèi)膽固醇酯積聚)引起的腹膜內(nèi)收集的滲出巨噬細胞的泡沫化減少到對照
的大約l/4的水平(P<0.05，圖19A)。在給予salusin-P的情況下，巨 噬細胞的泡沫化增加至對照的約2倍的水平(P〈0.01，圖19A)。但是， 在抗salusin-卩血清的存在下，其被抑制到對照的水平(P < 0.01，圖 19A)。在salusin-oc的存在下HDL引起的膽固醇外流增加到對照的約2 倍的水平(P<0.01，圖19B)。
圖20顯示了在同一時期參與巨噬細胞泡沬化的基因的蛋白質(zhì)表達 水平。Salusin-ot不影響能夠識別氧化LDL的清道夫受體(CD36， SR-A) 的表達(圖20A和B)。但是，salusin-ot將ACAT1的表達減少到初始 水平的大約一半的水平(P < 0.05，圖20C)，并將參與膽固醇外流的 ABCA1、 ABCG1和SR-BI的表達增加到初始水平的1.5-2倍的水平(P < 0.05，圖20D、 E和F)。同時，salusin-p將CD36、 SR國A和ACAT1 的表達增加到對照水平的大約1.5-2.8倍的水平(P<0.05，圖20A、 B 禾口C)。上述salusin-P的作用完全被抗salusin P血清所取消(圖20A、 B 和C)。
工業(yè)應(yīng)用性
如實施例中所述，salusin-oc抑制巨噬細胞的泡沫化，從而抑制動脈 硬化病變的形成。因此，salusin-ot可以用作動脈硬化性疾病的預(yù)防性治 療劑。同時，salusin-P促進巨噬細胞的泡沬化，從而促進動脈硬化病變 的形成。因此，動脈硬化性疾病可以通過抑制salusin-P的作用來預(yù)防 和治療。抗salusin-(3抗體抑制salusin-P的作用，因此其可以用作動脈硬 化性疾病的預(yù)防性治療劑。此外，生物樣品例如血清、尿等中的 salusin-a濃度與動脈硬化病變的形成有關(guān)。因此，生物樣品中的 salusin-oc可以用作用于動脈硬化性疾病的檢測或風(fēng)險評價的標(biāo)志物。
抑制salusin-a或salusin-p的作用的拮抗性化合物可以用于預(yù)防/治 療動脈硬化性疾病。另外，salusin-a可以用作檢測動脈硬化性疾病用的 標(biāo)志物。如上所述，本發(fā)明可以應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。
本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此全部全文并入作為 引證。
權(quán)利要求
1.一種用于動脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-α作為活性成分。
2. —種用于動脈硬化性疾病的治療劑，其包括salusin-p的拮抗劑 作為活性成分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于動脈硬化性疾病的治療劑，其中所 述salusin-p的拮抗劑是抗salusin-p抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的用于動脈硬化性疾病的治 療劑，其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心 臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾 層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。
5. —種用于動脈硬化性疾病的治療組合物，其包括salusin-a，并 包括salusin-p的拮抗劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于動脈硬化性疾病的治療組合物，其 中所述salusin-(3的拮抗劑是抗salusin-p抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用于動脈硬化性疾病的治療組合物， 其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病， 即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎 硬化和閉塞性動脈硬化癥。
8. —種用于檢測動脈硬化性疾病的方法，其包括化驗生物樣品中 的salusin-ou
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測動脈硬化性疾病的方法，其中 所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬化 和閉塞性動脈硬化癥。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用于檢測動脈硬化性疾病的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。
11. 一種用于確定動脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的方法，其包括化驗生物樣品中的salusin-a。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于確定動脈硬化性疾病的嚴(yán)重性的 方法，其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心 臟病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾 層、腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的用于確定動脈硬化性疾病的嚴(yán)重 性的方法，其中所述生物樣品選自血清、血漿和尿。
14. 一種用于檢測動脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物，其包括 salusin-ou
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于檢測動脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志 物，其中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟 病，即心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、 腎硬化和閉塞性動脈硬化癥。
16. —種用于檢測動脈硬化性疾病的試劑，其包括抗salusin-a抗 體，并使用salusin-a作為檢測動脈硬化性疾病的診斷標(biāo)志物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的用于檢測動脈硬化性疾病的試劑，其 中所述動脈硬化性疾病選自急性冠狀動脈綜合征、缺血性心臟病，即 心肌梗塞或心絞痛、腦梗塞、腦出血、主動脈瘤、主動脈夾層、腎硬 化和閉塞性動脈硬化癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于動脈硬化性疾病的預(yù)防和治療劑以及用于檢測動脈硬化性疾病的方法或試劑。此外，本發(fā)明提供包括salusin-α作為活性成分的用于動脈硬化性疾病的治療劑、包括salusin-β的拮抗劑作為活性成分的用于動脈硬化性疾病的治療劑、以及用于檢測動脈硬化性疾病的方法，上述方法包括化驗生物樣品中的salusin-α。
文檔編號C07K14/47GK101687008SQ20088002302
公開日2010年3月31日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者七里真義, 渡部琢也 申請人:株式會社蛋白質(zhì)表達;學(xué)校法人昭和大學(xué);國立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué)