專(zhuān)利名稱(chēng)：治療吉非替尼耐藥性癌癥的方法
治療吉非替尼耐藥性癌癥的方法 發(fā)明背景
上皮細(xì)胞癌，例如，前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、脾癌、睪丸癌、胸腺癌等，是以上皮細(xì)胞的異常加速生長(zhǎng)為特;(正的疾病。此加速生長(zhǎng)最初引起肺瘤形成。最后，也 可發(fā)生轉(zhuǎn)移至不同的器官部位置。雖然在多種癌癥的診斷和治療方 面已取得進(jìn)展，但是這些疾病仍然導(dǎo)致顯著的死亡率。
肺癌是工業(yè)國(guó)家中導(dǎo)致癌癥死亡的首要原因。開(kāi)始在肺中 的癌癥，依據(jù)細(xì)胞在顯微鏡下的表現(xiàn)，被分為兩種主要類(lèi)型，非小 細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌(鱗片細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞 癌癥)擴(kuò)散至其它器官一般比小細(xì)胞肺癌慢。約75。/。的肺癌病例被歸 類(lèi)為非小細(xì)胞肺癌(如，腺癌)，而其它25%的肺癌病例為小細(xì)胞肺癌。 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)為美國(guó)、日本和西歐癌癥致死的主要原因。對(duì) 于晚期疾病的患者而言，化學(xué)療法在生存率方面提供適度的幫助， 但是付出顯著毒性的代價(jià)，強(qiáng)烈需要特異性地靶向涉及腫瘤生長(zhǎng)的 關(guān)鍵基因損傷的治療劑(Schiller JH等，N Engl J Med, 346: 92-98, 2002)。
表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為在上皮細(xì)胞表面表達(dá)的170千 道爾頓(kDa)膜結(jié)合蛋白質(zhì)。EGFR為許多蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(一組細(xì) 胞周期調(diào)節(jié)分子)的生長(zhǎng)因子受體家族。(W.丄Gullick等，1986, Cancer Res., 46:285-292)。當(dāng)EGFR的配體(或者EGF或者TGF-ot)結(jié)合至胞 外域時(shí)，使EGFR活化，導(dǎo)致受體的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域自動(dòng) 磷酸化(S. Cohen等，1980, J. Biol. Chem., 255:4834-4842; A. B. Schreiber等，1983, J. Biol. Chem., 258:846-853)。
EGFR為生長(zhǎng)促進(jìn)致癌基因，erbB或ErbBl的蛋白質(zhì)產(chǎn)物， 其為家族即原癌基因(protooncogenes)的ERBB家族的一個(gè)成員，相 信在人類(lèi)許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。尤其是，在乳腺癌、 膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中觀察到EGFR 增強(qiáng)的表達(dá)。致癌基因的ERBB家族編碼四種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的跨膜受 體，即EGFR、 HER-2/neu(erbB2)、 HER-3 (erbB3)和HER-4 (erbB4)。 臨床上，已有報(bào)告腫瘤中的ERBB致癌基因擴(kuò)增和/或受體過(guò)度表達(dá) 與疾病復(fù)發(fā)和患者預(yù)后差相關(guān)，以及與療法的響應(yīng)相關(guān)。(L. Harris 等，1999, Int. J. Biol. Markers, 14:8-15;和J, Mendelsohn和J. Baselga, 2000, Oncogene, 19:6550-6565)。
EGFR由以下三個(gè)基本結(jié)構(gòu)域組成，即胞外域(ECD,其為 糖基化的(glycosylated)并且含具有兩個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域的配體-結(jié) 合袋(binding pocket);短跨膜結(jié)構(gòu)域和具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的細(xì) 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。跨膜區(qū)域?qū)⑴潴w-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接。氨 基酸和DNA序列分析以及EGFR的非糖基化形式的研究表明，EGFR 蛋白質(zhì)主鏈質(zhì)量為132kDa,具有1186個(gè)氨基酸殘基(A. L. Ullrich等， 1984, Nature, 307:418-425; I Downward等，1984, Nature, 307:521-527; C. R. Carlm等，1986, Mol. Cell. Biol.， 6:257-264;和F丄V. Mayes 和M. D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3:531-537)。
EGF或TGF-a與EGFR的結(jié)合激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并且導(dǎo)致 細(xì)胞增殖。EGFR分子的二聚、構(gòu)象變化和內(nèi)化(mternalization)起傳 導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的作用，引起細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)(G. Carpenter和S. Cohen, 1979， Ann. Rev. Biochem., 48:193-216)。影響生長(zhǎng)因子受體功能調(diào)節(jié) 或?qū)е率荏w和/或配體過(guò)度表達(dá)的遺傳學(xué)改變，引起細(xì)胞增殖。另夕卜， 已確定EGFR在細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的增強(qiáng)、蛋白質(zhì)分泌、新血 管形成、癌癥細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑和放射線的入侵、轉(zhuǎn)移和耐藥性方 面起作用。(M,J. Oh等，2000, Clin. Cancer Res., 6:4760-4763)。
已經(jīng)鑒定多種EGFR抑制劑，包括一些已經(jīng)正在進(jìn)行臨床 試驗(yàn)的用于治療各種癌癥的EGFR抑制劑。至于近期的概要，參見(jiàn)de Bono,丄S.和Rowinsky, E. K. (2002)， "The ErbB Receptor Family: A Therapeutic Target For Cancer"， 7>￡"必i"Mo/ecw/flrMe<iic/we， 8, S 19-26。
—批在癌癥治療中用于治療千涉的有前景的標(biāo)靶，包括 HER-激酶軸的成員。它們?cè)趯?shí)體上皮腫瘤例如前列腺、肺和乳腺腫 瘤中經(jīng)常向上調(diào)節(jié)，在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中也向上調(diào)節(jié)。表皮生長(zhǎng)因子 受體(EGFR)是HER-激酶軸的一個(gè)成員，并且已經(jīng)是開(kāi)發(fā)多種不同的 癌癥療法的選擇目標(biāo)。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)在這些 療法當(dāng)中，因?yàn)槔野彼釟埢目赡嫘粤姿峄癁镋GFR通路激活所必 需。換言之，EGFR-TKIs阻滯細(xì)胞表面受體是造成引起腫瘤細(xì)胞生 長(zhǎng)和分化的觸發(fā)和/或維持細(xì)胞信號(hào)通路的原因。特別是，相信這些 抑制劑干擾EGFR激酶結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為HER-I。在更有前景的EGFR-TKIs 中，有三個(gè)系列的化合物喹唑啉、吡啶并嘧啶和他咯并嘧咬。(由AstraZenecaUKLtd.開(kāi)發(fā)的化合物ZD 1839;可以IRESSA的商 標(biāo)名獲得；以下稱(chēng)"IRESSA")和埃羅替尼(Erlotmib)(由Genentech, Inc. 和OSI Pharmaceuticals, Inc.開(kāi)發(fā)的化合物OSI-774,可以TARCEVA 的商標(biāo)名獲得；以下稱(chēng)"TARCEVA");兩者均產(chǎn)生令人鼓舞的臨床結(jié) 果。以IRESSA和TARCEVA兩者進(jìn)行的常規(guī)癌癥治療包括每天分 別口服給予不超過(guò)500 mg化合物。在2003年5月，IRESSA是這些 產(chǎn)物中第 一個(gè)進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)的藥物，此時(shí)它被批準(zhǔn)用于晚期非小細(xì) 胞肺癌患者的治療。
IRESSA為通過(guò)直接抑制在EGFR分子上酪氨酸激酶磷酸 化發(fā)揮功效的口服活性喹唑啉。其竟?fàn)幦姿嵯佘?ATP)結(jié)合位點(diǎn)， 導(dǎo)致HER-激酶軸的抑制。IRESSA反應(yīng)的確切機(jī)制尚不完全明白， 然而，研究提示，EGFR的存在是是其作用的必要的先決條件。
在使用這些化合物中顯著的局限是，其接受者可在最初 對(duì)療法的反應(yīng)之后產(chǎn)生對(duì)它們治療效應(yīng)的耐藥，或它們可不對(duì)EGFR-TKIs起任何可檢測(cè)到級(jí)別的反應(yīng)。對(duì)于EGFR-TKIs的反應(yīng)率 在不同人種組別中各異。在低端EGFR-TKI反應(yīng)者，在某些人群中， 僅百分之10-15%的晚期非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)EGFR激酶抑制劑有反 應(yīng)。因此，對(duì)IRESSA和TARCEVA潛在敏感的分子學(xué)機(jī)制的更好 的理解，將非常有益于對(duì)那些最有可能從這樣療法中獲益的患者的 輩巴向療法。
本領(lǐng)域明顯需要對(duì)癌癥，且特別是上皮細(xì)胞癌的滿意治 療，所述癌癥有例如肺癌、卯巢癌、乳腺癌、腦癌、結(jié)腸癌和前列 腺癌，其整合TKI療法的利益并克服由患者表現(xiàn)出的無(wú)應(yīng)答。這樣 的治療可對(duì)患者，且尤其是老年患者(他們中癌癥特別常見(jiàn))的健康產(chǎn) 生極大的影響。發(fā)明簡(jiǎn)述
本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，不可逆性EGFR抑制劑在 對(duì)吉非— 齊尼和/或埃羅替尼療法不再響應(yīng)的患者中有效治療癌癥。因 此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療吉非替尼和/或埃羅替尼耐 藥性癌癥的方法。在該實(shí)施方案中，在初始給予吉非替尼和/或埃羅 替尼治療之后的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)患者癌癥的發(fā)展。癌癥的發(fā)展是對(duì)吉非 替尼和/或埃羅替尼治療耐藥的癌癥的指示，并且給予患者包含不可 逆性表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的藥用組合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不可逆性EGFR抑制劑為EKB-569、 HKI-272或HKI-357?；蛘?，不可逆性EGFR抑制劑可為結(jié)合 至EGFR (SEQ ID NO: l)的半胱氨酸773的任何化合物。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展。例 如，可通過(guò)對(duì)癌癥的目測(cè)(visual inspection)諸如，X-線、CT掃描或MRI監(jiān)測(cè)其發(fā)展?；蛘撸赏ㄟ^(guò)檢測(cè)腫瘤生物標(biāo)記物監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在整個(gè)癌癥治療的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè) 患者。例如，通過(guò)分析第二時(shí)間點(diǎn)癌癥的發(fā)展并將此分析與第一時(shí) 間點(diǎn)的分析比較，可監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展。第一時(shí)間點(diǎn)可在吉非—奈尼和/ 或埃羅替尼初始治療之前或之后，而第二時(shí)間點(diǎn)在第一點(diǎn)之后。癌 癥的增大的生長(zhǎng)表示癌癥的發(fā)展。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)分析癌癥的大小監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā) 展。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由采用X-線、CT掃描或MRI對(duì)癌癥進(jìn) 行目測(cè)，分析癌癥的大小。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)腫瘤生物 標(biāo)記物監(jiān)測(cè)癌癥的大小。
在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是上皮細(xì)胞癌。在一個(gè)實(shí)施方 案中，癌癥是胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道 癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、腎癌、碎見(jiàn)網(wǎng)膜癌、皮膚 癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌癥和膀胱癌。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在其它的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)癌癥的大小， 并且其它的時(shí)間點(diǎn)是在第二時(shí)間點(diǎn)之后。
在一個(gè)實(shí)施方案中，較晚的時(shí)間點(diǎn)在之前的時(shí)間點(diǎn)至少2 個(gè)月之后。在一個(gè)實(shí)施方案中，較晚的時(shí)間點(diǎn)在前面的時(shí)間點(diǎn)至少6 個(gè)月之后。在一個(gè)實(shí)施方案中，較晚的時(shí)間點(diǎn)在前面的時(shí)間點(diǎn)之后 至少10個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，l交晚的時(shí)間點(diǎn)在前面的時(shí)間點(diǎn)之 后至少一年。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，所 述方法包括給予患者包含不可逆性EGFR抑制劑的藥用組合物，所 述患者在EGFR上有突變，即在SEQ ID. NO. 1的790位置(T790M) 上的蘇氨酸被曱硫氨酸置換。T790M突變賦予對(duì)吉非替尼和/或埃羅 替尼治療的耐藥性。
圖的簡(jiǎn)述


圖1A-1B顯示來(lái)自?xún)擅@得性吉非替尼耐藥的NSCLC 患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移損傷中的EGFR序列分析。圖1A顯示病例1的序列 分析。EGFR中的T790M突變存在于發(fā)展臨床吉非替尼耐藥之后的 復(fù)發(fā)肝損傷。(左)在診斷時(shí)在原發(fā)性肺損傷中沒(méi)有檢測(cè)到突變。(右) 原發(fā)性肺腫瘤和復(fù)發(fā)肝損傷均包含(harbor) L858R吉非替尼-敏感性突 變。值得注意的是，L858R突變以期望的雜合的突變比例存在于原 發(fā)性和復(fù)發(fā)損傷兩者中，然而與野生型等位基因比較，T790M在低 水平上是可檢測(cè)的。在同樣的描記圖象(tracing)中顯示多型性(G/A)證 明非克隆PCR產(chǎn)物中的兩個(gè)等位基因的等價(jià)物再現(xiàn)。圖1B顯示病 例2的序列分析。T790M突變存在于少數(shù)吉非替尼-耐藥細(xì)胞中。(左) T790M突變或者在肺原發(fā)性胂瘤中或者在來(lái)自該病例的八個(gè)復(fù)發(fā)肝 損傷中，用測(cè)序非克隆PCR產(chǎn)物未能檢測(cè)。在鄰近多型性(G/A)的雜 合性證實(shí)來(lái)自這些樣本的兩個(gè)EGFR等位基因的擴(kuò)增。雜合的吉非 替尼-敏感性突變，L861Q,在原發(fā)性肺胂瘤以及八個(gè)復(fù)發(fā)肝損傷中 的每 一個(gè)以期望的比例被檢測(cè)到。
圖2A-2C顯示支氣管肺泡癌細(xì)胞系中獲得對(duì)吉非替尼性 耐藥和對(duì)不可逆性ERBB家族抑制劑的持續(xù)敏感性。圖2A顯示由酪 氨酸激酶抑制劑對(duì)支氣管肺泡癌癥細(xì)胞系增殖的抑制，該細(xì)胞系具 有野生型EGFR (NCI-H1 666)(其在EGFR (NCI-H1 650)中激活 delE746-A750突變)或NCI-H1 650 (G7和Cl l)的兩個(gè)代表性的吉非替 尼-耐藥亞克隆。可逆性抑制劑吉非替尼與不可逆性抑制劑HKI-357 的作用比較。用其它不可逆性抑制劑觀測(cè)到可比性結(jié)果。通過(guò)在暴 露于指定的藥物濃度72h后，于5%FCS中和100 ng/ml EGFR—起 培養(yǎng)后，經(jīng)結(jié)晶紫染色，測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表四個(gè)樣本 的平均值。圖2B顯示EGFR可逆性抑制劑吉非替尼、EGFR不可逆 性抑制劑EKB-569和兩個(gè)EGFR和ERBB2不可逆性雙重抑制劑 HKI-272和HKI-3"的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2C顯示在以不同濃度的吉非替 尼或不可逆性ERBB抑制劑EKB-569處理之后產(chǎn)生的藥物-耐藥性 NCI-HI 650細(xì)胞。在抑制劑存在下培養(yǎng)12天之后集落染色。
圖3A-3D顯示對(duì)吉非替尼-耐藥細(xì)胞中的EGFR和ERBB2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和改變的受體轉(zhuǎn)運(yùn)的持續(xù)依賴(lài)。圖3A顯示在帶有野生型 EGFR (NCI-H1 666)的支氣管肺泡細(xì)胞系中、EGFR和ERBB2的 siRNA-介導(dǎo)的敲除后的細(xì)胞生存能力，與在EGFR (NCI-H1 650)中具 有激活的delE746-A750突變和兩個(gè)吉非替尼-耐藥的衍生物(G7和Cl l)的細(xì)胞的生存能力進(jìn)行比較。用雙鏈RNA處理72h之后計(jì)數(shù)存活 的細(xì)胞，顯示為用非特性siRNA處理的細(xì)胞相關(guān)的分?jǐn)?shù)，按一式三 份樣本計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。圖3B顯示在用遞增濃度的吉非替尼或不可逆性 抑制劑HKI-357處理、P逸后用EGF進(jìn)行2-h脈沖的細(xì)胞中，抑制下 游效應(yīng)器AKT和MAPK (ERK)的'EGFR自動(dòng)磷酸化(Y1 068)和磷酸 化。將親代細(xì)胞系NCI-H1 650與代表性的吉非替尼-耐藥系G7比較。 總的AKT和MAPK作為對(duì)照顯示；對(duì)于在這些細(xì)胞中檢測(cè)的較低限 的總EGFR水平，使用微管蛋白作為荷載對(duì)照。圖3C顯示與敏感性 NCI-H1 650親代細(xì)胞系比較，在吉非替尼-耐藥NCI-H 1650 (G7)細(xì)胞 中的改變的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。在加入配體后5和20min時(shí)，使用若 丹明標(biāo)記的EGF標(biāo)記EGFR。在NCI畫(huà)H1 650 (G7)細(xì)胞中EGFR的增 強(qiáng)的內(nèi)化現(xiàn)象在20min時(shí)最明顯(Zeiss顯微鏡，x63放大倍率)。圖 3D顯示自NCI-H1 650親代細(xì)胞內(nèi)化的EGFR以及經(jīng)生物素化和追蹤 (chase)超過(guò)20 min脈沖標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白之后的耐藥衍生物G7的免 疫印跡。將NCI-H1 650 (G7)細(xì)胞中的增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)EGFR與不改變 的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體(TR)內(nèi)化現(xiàn)象進(jìn)行比較。
圖4A-4B顯示不可逆性ERBB抑制劑在抑制T790M EGFR 突變體中的效力。圖4A顯示吉非替尼和兩個(gè)不可逆性抑制劑(HKI-357 和HKI-272)抑制EGFR自動(dòng)磷酸化(Y1 068)和NCI-H1 975支氣管肺 泡細(xì)胞系(包含致敏性突變(L858R)和與耐藥相關(guān)聯(lián)的突變(T790M)兩 EGFR、 AKT和MAPK顯示為荷載對(duì)照。圖4B顯示與吉非替尼比較， 用三個(gè)不可逆性ERBB家族抑制劑對(duì)包含L858R和T790M突變的 NCI-H1 975細(xì)胞增殖的抑制。
圖5顯示EGFR的核苷酸序列(SEQIDN0: 2)和氨基酸 序列(SEQIDNO: 1)。
圖6顯示如同吉非替尼，HKI 357和EKB 569 (標(biāo)識(shí)為 "Wyeth")被證明對(duì)包含EGFR突變的NSCLC細(xì)胞的增強(qiáng)的細(xì)胞殺傷 能力，但又不同于吉非替尼，在體外不易于產(chǎn)生對(duì)這些藥物耐藥的 克隆并且它們保留其對(duì)抗吉非替尼-耐藥克隆的效力。發(fā)明詳述 耐吉非替尼和埃羅替尼的癌癥
吉非替尼(由AstraZeneca UK Ltd.開(kāi)發(fā)的化合物ZD 1839; 可以IRESSA的商標(biāo)名獲得)和埃羅替尼(由Genentech, Inc.和OSI Pharmaceuticals, Inc.開(kāi)發(fā)的化合物OSI-774,可以TARCEVA的商標(biāo) 名獲得)，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLCs)的病例中，產(chǎn)生令人驚奇的臨床 反應(yīng)，所述癌在EGF受體(EGFR) (l-3)中包含激活性突變，為這些ATP 結(jié)合的竟?fàn)幮砸种苿┑臉?biāo)靶(4, 5)。這些酪氨酸激酶抑制劑的效力既 可由與這些突變相關(guān)的ATP裂解(cleft)的改變(該突變導(dǎo)致這些藥物 增強(qiáng)對(duì)突變體激酶的抑制作用)引起，又可由這些癌癥細(xì)胞對(duì)于由突 變體受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)的生存信號(hào)的生物學(xué)依賴(lài)性(一種被描述為"致癌基因依賴(lài)(addiction)"的現(xiàn)象引起(6, 7)。
雖然對(duì)于吉非替尼和埃羅替尼兩者的治療反應(yīng)可持續(xù)長(zhǎng) 達(dá)2-3年，在大多數(shù)NSCLC病例中的反應(yīng)平均持續(xù)時(shí)期僅6-8個(gè)月 (8-10)。獲得性藥物耐藥的潛在的機(jī)制尚不很清楚。以此類(lèi)推，用伊 馬替尼(imatinib) (GLEEVEC)抑制涉及慢性髓細(xì)胞白血病(CMLs)的 BCR-ABL激酶、牽涉胃腸道基質(zhì)瘤(GISTs)的C-KIT激酶和特發(fā)性 嗜酸粒細(xì)胞增多綜合征(HES)的FIP1L1 -PDGFR-a激酶，繼發(fā)性激酶 結(jié)構(gòu)域突變可有效地抑制藥物結(jié)合(11-16)。然而，復(fù)發(fā)性NSCLC不 易于進(jìn)行活組織檢查；因此，僅有限的臨床標(biāo)本可用于分析。最近， 報(bào)告吉非替尼或埃羅替尼療法之后六例復(fù)發(fā)疾病的三個(gè)病例中，在 EGFR激酶結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)單一繼發(fā)性突變，T790M(17, 18)。類(lèi)似于密碼子7卯的5Ci -」B丄的密碼子315，在伊馬替尼-耐藥CML 中經(jīng)常突變(ll, 12),和C-XJr (密碼子WO)和F/P/L/-PDGi^-a (密碼 子674)中相應(yīng)的殘基突變分別與伊馬替尼-耐藥的GIST和HES相關(guān) (l5, 16)。早期體外對(duì)EGFR抑制劑耐藥的模型表明，野生型受體中 的密碼子790突變將類(lèi)似地抑制由EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抑制 作用(19)。最近，含激活性突變的轉(zhuǎn)染的EGFR蛋白與T790M取代 作用一起顯示降低由吉非替尼和埃羅替尼的抑制作用(17, 18)。雖然 T790M突變似乎對(duì)在一些NSCLC病例中的獲得性耐藥產(chǎn)生作用， 但是其在缺乏繼發(fā)性EGFR突變的病例中的治療失敗的潛在機(jī)制仍 然不清楚。
與細(xì)胞質(zhì)激酶BCR-ABL對(duì)比，由膜結(jié)合EGFR的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及復(fù)雜的配體結(jié)合通路、受體與ERBB2和其它家族成員的同 源二聚現(xiàn)象(homodimerization)和雜源二聚現(xiàn)象(heterodimerization), 隨后是內(nèi)化現(xiàn)象和配體-結(jié)合受體的再循環(huán)或泛素(ubiquitin)介導(dǎo)的受 體降解(20)。認(rèn)為在內(nèi)化過(guò)程發(fā)生重要的EGF-依賴(lài)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其也 與在細(xì)胞內(nèi)嚢泡中低pH下的EGFR復(fù)合體的離解相關(guān)。這樣，多重 因素調(diào)節(jié)由受體進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)度和質(zhì)量，并且EGFR運(yùn)輸?shù)?改變與EGF-依賴(lài)細(xì)胞性反應(yīng)的調(diào)節(jié)密切關(guān)聯(lián)(20)。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即吉非替尼耐藥性癌癥可包括那 些其中T790MEGFR突變僅存在于耐藥腫瘤細(xì)胞亞組和那些其中沒(méi) 有觀察到T790M突變，但觀察到增強(qiáng)的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象的癌癥。本 發(fā)明還基于以下發(fā)現(xiàn)，即與受體共價(jià)交聯(lián)的不可逆性EGFR抑制劑 在抑制伴T(mén)790M突變的癌癥中有效，以及在具有可使這樣的癌癥對(duì) 用吉非替尼和/或埃羅替尼治療耐藥的改變的EGFR傳輸?shù)陌┌Y中有
效。因此，本發(fā)明提供包括給予不可逆性EGFR抑制劑的治療吉非 替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥的方法。治療患者的方法
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療吉非替尼/埃羅替尼 耐藥性癌癥的方法。該方法包括給予需要此種治療的患者有效量的 某些不可逆性EGFR抑制劑，包括EKB-569 (4-苯胺基喹啉-3-腈； Greenberger等，11th NCI- EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy,阿姆斯特丹，2000年11月7-10日，摘要388; Wyeth)、 HKI-357 (4-苯胺基唾啉-3-腈的衍生物；Tsou等，J. Med. Chem. 2005, 48: 1107-1131; Wyeth)和/或HKI-272 (4-苯胺基壹啉-3-腈的衍生物； Rabindran等，Cancer Res. 2004, 64, 3958-3965; Wyeth)。在一個(gè)優(yōu)選 的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括給予需要此種治療的患者有效量的 EKB-569的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括給予 需要此種治療的患者有效量的HKI-357的方法。
該治療還可包括治療的組合，包括，但不限于酪氨酸激 酶抑制劑與其它的酪氨酸激酶抑制劑、化學(xué)療法、放射療法等的組 合。
采用在Lynch等，2004; 350:2129-2139描述中的方法， 可將癌癥最初診斷為吉非替尼/埃羅替尼敏感性或預(yù)測(cè)為吉非替尼/埃 羅替尼敏感性。通過(guò)存在于肺瘤的EGFR突變，包括，例如，與750 (丙 氨酸)中突變結(jié)合的殘基747 (賴(lài)氨酸)至749 (谷氨酸)的缺失、殘基747 (賴(lài)氨酸)至750 (丙氨酸)的缺失、于殘基858處的精氨酸代替亮氨酸、 于殘基861處的谷酰胺代替亮氨酸，可預(yù)測(cè)吉非替尼/埃羅替尼敏感 性。
在用吉非替尼和/或埃羅替尼開(kāi)始治療后，可將癌癥診斷 為吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥?；蛘?，在用這些化合物初始治療之 前，可將癌癥診斷為吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。肺瘤中的吉非替 尼和/或埃羅替尼耐藥性可發(fā)生在吉非替尼和/或埃羅替尼治療之后，
如，6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間?；蛘?，在用吉非替尼和/或埃羅替尼開(kāi)始治療不到6個(gè)月之后，可診斷腫瘤的吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。通過(guò)在吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展，可完成吉非 替尼和/或埃羅替尼耐藥的診斷。通過(guò)比較開(kāi)始治療后各時(shí)間點(diǎn)之間 的腫瘤狀況，或通過(guò)比較開(kāi)始治療后時(shí)間點(diǎn)與吉非替尼和/或埃羅替 尼初始治療之前時(shí)間點(diǎn)之間的胂瘤狀況，可確定腫瘤的發(fā)展。在用 吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間，可通過(guò)目測(cè)，例如，采用放射線照相術(shù)，例如，X-線、CT掃描或技術(shù)人員已知的其它監(jiān)測(cè)方法，包 括癌癥的心悸或監(jiān)測(cè)腫瘤生物標(biāo)記物水平的方法，監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展。 在用吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間的癌癥的發(fā)展，表明對(duì)吉非替 尼和/或埃羅替尼耐藥。腫瘤生物標(biāo)記物水平的提高，表明腫瘤發(fā)展。 因而，在用吉非替尼和/或埃羅替尼治療期間腫瘤生物標(biāo)記物水平提 高，表明對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。檢測(cè)到新的腫瘤或檢測(cè)到 轉(zhuǎn)移，表明腫瘤發(fā)展。腫瘤收縮停止，表明腫瘤發(fā)展。癌癥的生長(zhǎng) 由例如，胂瘤尺寸增大、轉(zhuǎn)移或檢測(cè)到新的癌癥和/或腫瘤生物標(biāo)記 物水平提高表示。
通過(guò)測(cè)試來(lái)自患者循環(huán)或其它體液的、在循環(huán)中的腫瘤 細(xì)胞的與吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥相關(guān)的突變存在，可監(jiān)測(cè)吉非 替尼和/或埃羅替尼耐藥的發(fā)生。來(lái)自患者紳瘤細(xì)胞中的與吉非替尼 和/或埃羅替尼耐藥相關(guān)的突變的存在，是吉非替尼和/或埃羅替尼耐 藥肺瘤的指示。
在一個(gè)實(shí)施方案中，患者的腫瘤包含指示吉非替尼和/或 埃羅替尼敏感性的突變，然而它對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼治療是耐 藥的。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者的胂瘤包含指示吉非替尼和/或埃羅 替尼敏感性的突變，和包含指示吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥的突變, 如，T790M突變，即在EGFR中，甲硫氨酸(methione)殘基取代天然 的蘇氨酸殘基，如增強(qiáng)的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，患 者的腫瘤不包含指示吉非替尼和/或埃羅替尼敏感性的突變和不包含 指示吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥的突變，如，EGFR中的T790M突 變，如，增強(qiáng)的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。
當(dāng)與藥物的給予相連時(shí)，"有效量"指對(duì)至少統(tǒng)計(jì)學(xué)上 有顯著意義的部分患者導(dǎo)致有益效應(yīng)的量，所述效應(yīng)為諸如癥狀的 改善、治愈、減輕疾病負(fù)擔(dān)、縮減肺塊或細(xì)胞數(shù)量、延長(zhǎng)生命、改 善生活質(zhì)量或通常由熟悉治療特殊類(lèi)型的疾病或病癥的醫(yī)生確認(rèn)為 積極的其它效應(yīng)。
所使用活性成分的有效劑量可依具體使用的化合物、給 藥模式、和被治療的病癥的嚴(yán)重程度不同而異。技術(shù)人員注意到用 于每一個(gè)患者的有效劑量可依疾病嚴(yán)重程度、個(gè)體遺傳變異或代謝 速率不同而變化。然而，通常，當(dāng)以約0.5-約1000mg/kg體重的每 天劑量，任選一天2-4次分劑量或以緩釋形式給予本發(fā)明化合物時(shí)， 得到滿意的結(jié)果。計(jì)劃每天總劑量約1-1000 mg,可優(yōu)選約2-500 mg。適宜于內(nèi)服的的劑型包括與藥學(xué)上可接受的固體或液體載體緊密混 合的約0.5-1000 mg的活性化合物?？烧{(diào)整該給藥方案以提供最佳的 治療效應(yīng)。例如，可每天給予多次分劑量或可依治療情形的緊急情 況的指示按比例減少劑量。
給藥途徑可為靜脈內(nèi)(I.V.)、肌肉內(nèi)(I.M.)、皮下(S.C)、皮 內(nèi)(I.D.)、腹腔(I.P.)、鞘內(nèi)(I.T.)、胸膜內(nèi)、子宮內(nèi)、直腸、陰道、局 部、腫瘤內(nèi)等。通過(guò)注射或整個(gè)時(shí)間漸進(jìn)輸液和可通過(guò)蠕動(dòng)方式傳 輸可胃腸外給予本發(fā)明化合物。
可通過(guò)透過(guò)粘膜或透皮方式給藥。對(duì)于透過(guò)粘膜或透皮 給藥，在配方中應(yīng)用適當(dāng)?shù)臐B透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常 為本領(lǐng)域所知，并且包括，例如，用于透過(guò)粘膜給藥的膽汁鹽類(lèi)和 梭鏈孢酸(fusidicacid)衍生物。再有，可應(yīng)用清潔劑以促進(jìn)滲透。透 過(guò)粘膜給藥可通過(guò)鼻噴霧劑，例如，或使用栓劑。對(duì)于口服給藥， 將本發(fā)明化合物配制成常規(guī)的口服給藥形式諸如膠嚢劑、片劑和滋 補(bǔ)劑。對(duì)于局部給藥，將藥用組合物(激酶活性抑制劑)配制成本 領(lǐng)域通常已知的軟膏劑、藥膏、凝膠劑或乳膏劑。
本發(fā)明的治療用組合物，如不可逆性EGFR抑制劑，例 如，如通過(guò)單位劑量注射經(jīng)常規(guī)靜脈給藥。當(dāng)用于指本發(fā)明的治療 用組合物時(shí)，術(shù)語(yǔ)"單位劑量"指適宜作為單一劑量給患者的物理 上不連續(xù)的單位，每一單位含經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生預(yù)想治療效應(yīng)的預(yù)定量的 活性物質(zhì)以及與之組合的所需的稀釋劑，即載體或媒介物。
以與劑型相協(xié)調(diào)的方式以及以有效治療量給予組合物。 將要給予的量和次數(shù)取決于被治療患者、利用活性成分的患者系統(tǒng) 的容量和想要的治療效應(yīng)的程度。需要給予的活性成分的精確量取 決于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷并且根據(jù)每一個(gè)體而不同。
本文描述了用于實(shí)施本發(fā)明方法的治療用組合物，如， 不可逆性EGFR抑制劑?？蓱?yīng)用通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何 制劑或藥物傳遞系統(tǒng)，其含有適合預(yù)定用途的活性成分。對(duì)于口服、 直腸、局部或胃腸外(包括吸入、皮下、腹腔、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi))給藥 的適宜的藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。所述載體必 須為藥學(xué)上可接受的，其意思是與制劑中的其它成分適配并且對(duì)其 接受者沒(méi)有害處。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"、"生理學(xué) 上可耐受的"及其文法上的變化，在它們指組合物、載體、稀釋劑 和反應(yīng)劑時(shí)，交替使用并且代表該物質(zhì)能夠是給予的，或者對(duì)于哺 乳動(dòng)物不產(chǎn)生不想要的生理效應(yīng)。
適宜胃腸外給藥的制劑便利地包括活性化合物滅菌水溶 液制劑，其優(yōu)選為與接受者的血液等滲。因而，這樣的制劑可^f更利 地含蒸餾水、在蒸餾水或鹽水中的5%右旋糖。有用的制劑還包括含 化合物的濃縮溶液或固體，其用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩玫缴鲜鲞m宜胃腸 外給藥的溶液劑。
對(duì)于腸道給藥，可以不連續(xù)的單位將化合物與惰性載體混合，例如膠嚢劑、扁嚢劑、片劑或糖錠劑，每一個(gè)含預(yù)定量的活性化合物；如粉劑或顆粒劑；或含水的或不含水的液體混懸劑或溶 液劑，如，糖漿劑、酏劑、乳劑或頓服劑(draught)。適宜載體可為淀 粉或糖粉和包括滑潤(rùn)劑、矯味劑、粘合劑及其它相同性質(zhì)的原料。
可任選與一種或多種助劑一起，通過(guò)壓制或模制，制備 片劑。通過(guò)使以自由流動(dòng)形式如粉狀或顆粒狀存在的活性化合物， 任選與助劑如粘合劑、滑潤(rùn)劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑 混合，在適宜的機(jī)器中壓制，可制備壓制片劑。通過(guò)將粉狀的活性 化合物與任何適宜載體的混合物，在適宜的機(jī)器中模制，可制備模 制片劑。
通過(guò)加入活性化合物至濃縮的糖，如蔗糖的水溶液中， 可制備糖漿劑或混懸劑，其中還可加入任何助劑。這樣的助劑可包 括矯味劑、阻止糖結(jié)晶的試劑或增加任何其它成分溶解的試劑，如 多元醇，例如，丙三醇或山梨醇。
用于直腸給藥的制劑可作為伴有作為栓劑基質(zhì)的常規(guī)的 栽體，如可可月旨或Witepsol S55 (Dynamite Nobel Chemical, Germany的商標(biāo))的栓劑形式存在。
用于口服給藥的制劑可含有增強(qiáng)劑?？诜山邮艿奈赵鰪?qiáng)劑包括表面活性劑諸如十二烷基硫酸鈉、棕櫚酰肉毒堿、聚乙 二醇單十二醚-9、磷脂酰膽^5成、環(huán)糊精及其衍生物；膽汁鹽類(lèi)諸如脫 氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鹽和夫西地酸鈉；螯合劑包括 EDTA、檸檬酸和水楊酸鹽；和脂肪酸(如，油酸、十二酸、?；?毒堿、單和雙甘油酯)。其它口服吸收的增強(qiáng)劑包括苯扎氯銨、千索 氯銨、CHAPS (3-(3-膽酰氨基丙基)-二曱銨基-l-丙磺酸鹽)、Big-CHAPS (N,N-雙(3-D-葡糖酰氨基丙基)-膽胺)、三氯叔丁醇、辛苯昔 醇-9、節(jié)醇、苯酚類(lèi)、曱酚和烷基醇。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的口服 吸收的增強(qiáng)劑是十二烷基硫酸鈉。
或者，可以脂質(zhì)體或微球(或微粒)的形式給予本化合物。 制備用于向患者給藥的脂質(zhì)體或孩"求的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,789,734描述了脂質(zhì)體中包嚢生物原料的方法，其 內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于本文。重要的是，將所述原料溶解于水溶液中， 加入適當(dāng)?shù)牧字椭|(zhì)，如果需要再加上表面活性劑，并且需要時(shí) 對(duì)原料進(jìn)行透析或超聲處理。已知的方法的綜述由G. Gregoriadis,第 14章，"Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine,第287-341 頁(yè)(Academic出版社，1979)提供。
由聚合體或蛋白質(zhì)形成的微球?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟悉， 并且其可被定制適合于通過(guò)胃腸道直接進(jìn)入血流。或者，可將該化 合物整合(incorporated),并且將^[效球或微球合成物植入，以用于在數(shù) 天至數(shù)月的時(shí)期內(nèi)緩慢釋放。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,906,474、 4,925,673和3,625,214和Jein, TIPS 19:155-157 (1998),其內(nèi)容通過(guò)引 用結(jié)合于本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的酪氨酸激酶抑制劑配 制成適合尺寸的脂質(zhì)體或孩t粒，以在靜脈給藥后聚集在毛細(xì)血管床。 當(dāng)將脂質(zhì)體或微粒放入缺血組織周?chē)拿?xì)血管床時(shí)，可局部給予 藥物至可為最有效的位點(diǎn)。靶向缺血組織的適宜的脂質(zhì)體一般小于 約200納米并且也典型地為單層嚢泡脂質(zhì)體(vesicle),如在例如 Baldescliweiler的題目為"Liposomal targeting of ischemic tissue"的美國(guó) 專(zhuān)利號(hào)5,593,688中所公開(kāi)的，其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于本文。
優(yōu)選的孩i粒為從生物可降解的聚合體，諸如聚乙醇酸 (poiyglycolide)、聚乳酸及其共聚物制備的微粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員依 據(jù)包括想要的藥物釋放速率和想要的劑量的各種因素可易于確定適 當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)由導(dǎo)管(catheter)將制劑直接給藥 到血管內(nèi)部。可例如，通過(guò)導(dǎo)管的孔給藥。在那些其中活性化合物 具有相對(duì)長(zhǎng)的半衰期(大約1天至1周或更長(zhǎng))的實(shí)施方案中，制劑可
納入生物可降解的聚合性水凝膠，諸如那些在Hubbell等的美國(guó)專(zhuān)利 號(hào)5,410,016中公開(kāi)的那樣?？蓪⑦@些聚合性水凝膠傳遞至組織內(nèi)腔 里并且在聚合體降解時(shí)活性化合物隨時(shí)間推移而釋放。如果需要， 聚合性水凝膠可具有包含分散在其中的活性化合物的孩i?；蛑|(zhì) 體，除非有另 一個(gè)機(jī)制提供活性化合物的控制釋放。
該制劑可便利地以單位劑型存在并且可用制藥領(lǐng)域熟悉 的任何方法制備。所有方法均包括將活性化合物與組成一種或多種 助劑的載體混合的步驟。通常，通過(guò)將活性化合物與液體載體或細(xì) 樣么粉碎的固體載體均勻地和密切地混合，然后，如果需要，將所述 產(chǎn)物定型為想要的單位劑型，制備該制劑。
該制劑還可包含一個(gè)或多個(gè)應(yīng)用于藥物制劑領(lǐng)域的任選 的助劑，如，稀釋劑、緩沖劑、矯味劑、粘合劑、表面活性劑、增 稠劑、滑潤(rùn)劑、助懸劑、防腐劑(包括抗氧化劑)等。道給藥的形式如鼻吸劑或氣霧劑或用于噴霧器的溶液劑或如用于吹 入的細(xì)微粉末存在，其單獨(dú)或與惰性載體諸如乳糖混合。在這樣的 情況下，活性化合物的粒子適宜具有小于50微米，優(yōu)選小于10微 米，更優(yōu)選為2-5微米的直徑。
—般用于鼻腔給藥時(shí)，弱酸pH將是優(yōu)選的。優(yōu)選本發(fā)明 組合物的pH為約3-5，更優(yōu)選為約3.5-約3.9和最優(yōu)選為3.7。通過(guò) 加入適當(dāng)?shù)乃嶂T如鹽酸實(shí)現(xiàn)pH的調(diào)節(jié)。
含溶解或分散于其中的活性成分的藥用組合物的制劑， 為本領(lǐng)域熟知的且不需限于制劑。典型地這樣的組合物被制備成可 注射的或者液體溶液劑或者混懸劑，然而，也可制備適宜用于溶液 劑或者混懸劑的固體形式，其在使用之前溶于液體。也可^f吏制劑乳 化。
可將活性成分以適宜用于本文描述的治療方法的量，與 藥學(xué)上可接受的并且與活性成分適配的賦形劑混合。適宜賦形劑為，例如，水、鹽水、右旋糖、丙三醇、乙醇等及其組合。再有，如果 需要，組合物可含少量的增強(qiáng)活性成分效力的輔助物質(zhì)諸如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等。
本發(fā)明不可逆性激酶抑制劑可包括其成分的藥學(xué)上可接 受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括與無(wú)機(jī)酸諸如，例如，鹽酸或-痺酸， 或諸如乙酸、酒石酸、扁桃酸這樣的有機(jī)酸等形成的酸加成鹽(與多 肽的游離氨基形成)。與游離羧基形成的鹽還可衍生自無(wú)機(jī)堿，例如， 氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氬氧化鈣或氫氧化鐵和諸如異丙 胺、三曱胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等此類(lèi)有機(jī)堿。
生理學(xué)上可耐受的載體為本領(lǐng)域所熟悉。作為實(shí)例的液 體載體為不含除活性成分和水之外物質(zhì)的滅菌水溶液，或含緩沖液 諸如生理pH值的磷酸鈉、生理鹽水或兩者，諸如磷酸鹽-緩沖鹽水 的滅菌水溶液。再有，水性載體可含一種以上的緩沖鹽，以及鹽例 如氯化鈉和氯化鉀、右旋糖、聚乙二醇和其它溶質(zhì)。
液體組合物還可含除水之外的以及排斥水的液相。作為 實(shí)例的這樣的其它液相為丙三醇、植物油諸如棉子油和水-油乳狀液。定義
術(shù)語(yǔ)"ErbBl"、"表皮生長(zhǎng)因子受體"和"EGFR"可 在本文中交互使用，并且指的是如在，例如在Carpenter等.Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)中公開(kāi)的天然序列EGFR,包括其變體(如 在Humphrey等.PNAS ( USA) 87:4207-4211 (1990)中的刪除突變體 EGFR)。 erbBl指編碼EGFR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。如本文所使用的， EGFR蛋白已作為由erbBl基因(GenBank檢索號(hào)NM—005228 (SEQ ID NO: 2))編碼的GenBank檢索號(hào)NP—005219 (SEQ ID NO.: l)公開(kāi)。erbBl /EGFR的核苷酸和氨基酸序列可在圖5中找到。
如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"激酶活性增加的核酸變異"指基 因的核苷酸序列中的變異(即突變)導(dǎo)致激酶活性增強(qiáng)。增強(qiáng)的激酶活 性是在核酸中變異的直接結(jié)果并且與基因所編碼的蛋白質(zhì)相關(guān)。
如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"藥物"或"化合物，，，指給予患者以治療或預(yù)防或控制疾病或病癥的化學(xué)實(shí)體或生物制品，或化學(xué) 實(shí)體或生物制品的組合?；瘜W(xué)實(shí)體或生物制品優(yōu)選，但不必是低分 子量化合物，而是也可為較大的化合物，例如，核酸、氨基酸的低聚體或碳水化合物包括但不限于蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酶、DNA酶、 糖蛋白、siRNAs、脂蛋白、適體、其修飾體及其組合。
如本文所^吏用的，術(shù)語(yǔ)"有效的"和"效力"包括藥理 學(xué)效應(yīng)和生理學(xué)上安全兩者。藥理學(xué)效應(yīng)指在患者中產(chǎn)生所需生物 學(xué)效應(yīng)的治療能力。生理學(xué)上安全指由給予治療導(dǎo)致的在細(xì)胞、器 官和/或生物水平的毒性水平或其它不利的生理學(xué)上效應(yīng)(通常指副作 用)。"較差效應(yīng)"意指治療導(dǎo)致在治療學(xué)上顯著較低水平的藥理學(xué) 效應(yīng)和/或在治療學(xué)上較高水平的不利的生理學(xué)上效應(yīng)。
可采用本領(lǐng)域熟悉的任何多種方法，從特殊的生物樣本 分離核酸分子，所選擇的具體分離過(guò)程與特定的生物樣本相適應(yīng)。 例如，應(yīng)用凍融(freeze-thaw)和堿裂解法，可從固體材料得到核酸分 子；應(yīng)用加熱和堿裂解法，可從尿中得到核酸分子；以及可應(yīng)用蛋 白酶K提取法從血液中得到核酸(Rolff, A等.PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)。
如本文所使用的，在受治療者或患者中的"癌癥"指存 在具有特征性的典型致癌細(xì)胞的細(xì)胞，諸如不受控制的增殖、不死性(immortality)、具轉(zhuǎn)移潛力、快速生長(zhǎng)和增殖率和某些特征性形態(tài) 學(xué)特征。在某些情況下，癌癥細(xì)胞將以腫瘤形式存在，或這樣的細(xì) 胞可局部存在于動(dòng)物體內(nèi)或作為獨(dú)立細(xì)胞在血流中循環(huán)。 實(shí)施例
化合物。本文使用的化合物，包括如在以下文獻(xiàn)中描述 的EKB-569、 HKI-357和HKI-272:美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，002,008; Greenberger 等，Proc. 11th NCI- EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy ， Clinical. Cancer Res. Vol. 6 Supplement, Nov. 2000, ISSN
1078-0432; Rabindran等，Cancer Res. 64: 3958- 3965 (2004); Holbro和 Hynes, Ann. Rev. Pharm. Tox. 44:195-217 (2004);和Tejpar等，J.Clin. Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. Vol. 22, No. 14S: 3579 (2004)。
復(fù)發(fā)NSCLC分析和吉非替尼-耐藥NCI-HI 650細(xì)胞產(chǎn)生。征得適當(dāng)同意后，將尸體解剖得到復(fù)發(fā)NSCLC臨床樣本。分析 非克隆PCR產(chǎn)物之后，對(duì)EGFR的完整激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行測(cè)序。對(duì)外 顯子20的多重克隆測(cè)序以檢測(cè)密碼子790。通過(guò)采用染料終止劑化 學(xué)(BIGDYE版本1.1， Applied Biosystems)的單個(gè)外顯子自動(dòng)測(cè)序和用 雙向測(cè)序的側(cè)翼內(nèi)含子(flanking intromc)序列(PCR條件按要求可得 到)，對(duì)吉非替尼-耐藥克隆中的EGFR(夕卜顯子1-28)、 ERBB2(外顯 子1-24)、 PTEN(夕卜顯子(Qxo似)1-9)、 Kias (密碼子12、 13和61)和p53 (外顯子5-S)以及親代NCI-Hl650細(xì)胞系進(jìn)行突變分析。在ABB100 測(cè)序儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)和通過(guò)采用SEQUENCE NAVIGATOR和FACTURA軟件(Applied Biosystems)分析電泳圖。
為產(chǎn)生NCI-H1 650細(xì)胞的耐藥亞克隆，用甲磺酸乙酯 (EMS;600jig/ml)處理這些細(xì)胞，使恢復(fù)72 h,然后接種于20 吉 非替尼中，密度為每10-cm2盤(pán)6xl04個(gè)細(xì)胞。與不可逆性抑制劑比 較，這些細(xì)胞對(duì)吉非替尼相對(duì)耐藥，這可通過(guò)在不同藥物濃度存在 下，將5 x 104個(gè)細(xì)胞接種于5% FCS和100 ng/ml EGF (Sigma)的六 孔盤(pán)中實(shí)現(xiàn)，隨后在用4%曱醛固定細(xì)胞7211后，用0.1%結(jié)晶紫染 色,用Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)對(duì)細(xì)胞群定量。對(duì)于微小干預(yù)RNA(siRNA)敲除實(shí)驗(yàn)，用靶向 EGFR、 ERBB2 (兩個(gè)SMART庫(kù)(pool)來(lái)自Dharmacon, Lafayette, CO) 的雙鏈RNA寡核苦酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或使用X-treme基因轉(zhuǎn)染反應(yīng)劑 (Roche Applied Science)進(jìn)行非特異性控制(LRT舊)。72h后,細(xì)胞經(jīng) 結(jié)晶紫染色，并用Odyssey紅外線掃描儀分析。
免疫印跡和信號(hào)傳導(dǎo)研究。由增加吉非替尼或不可逆性 抑制劑濃度對(duì)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的抑制通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)確定將9 x 104 個(gè)細(xì)胞接種于24-孔盤(pán)，將藥物加入含5。/oFCS的培養(yǎng)基中15min, 隨后用100ng/mlEGF脈沖2-h,收獲溶解產(chǎn)物。于2x凝膠i肯栽緩 沖液中制備溶解產(chǎn)物，經(jīng)超聲波處理，煮沸，然后用10%SDS/PAGE 分離，隨后通過(guò)電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜并進(jìn)行免疫印跡。 所用的抗體為磷酸化-EGFR Yl 068和磷酸化促有絲分裂原活4b蛋白 激酶(MAPK) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)、石舞fl臾]匕-AKT (BioSource International, Camarillo, CA)和總EGFR、 MAPK、 AKT和 微管蛋白(Santa Cruz Biotechnology)。
EGFR內(nèi)化現(xiàn)象分析。為了用熒光顯微鏡方法i正明EGFR 的內(nèi)化現(xiàn)象，將細(xì)胞生長(zhǎng)在蓋玻片上并與lng/ml重組人(rh)EGF(分 子探針，Eugene, OR)—起培養(yǎng)多個(gè)時(shí)間間隔，之后固定于4%多聚曱 醛中10min。用PBS洗滌蓋玻片并用ProLong Gold抗衰咸(antifade) 反應(yīng)劑(分子探針)封片(mounted)。為通過(guò)細(xì)胞表面生物素化4吏EGFR 內(nèi)化現(xiàn)象量化，將細(xì)胞生長(zhǎng)至融合，用環(huán)己酰胺(cyclohexamide)預(yù)處 理，于冰上用磺基琥珀酰亞氨基-2-(生物素基酰氨基(biotmamido))乙 基-l,3-二硫代丙酸酯(磺基(sulfo)-NHS-SS-生物素；Pierce) 1.5 mg/ml 培養(yǎng)1 h,并用封閉緩沖液(50 nMNH4CL/l mMMgCl2A) ImM CaCl2 在PBS中)洗滌以猝滅游離的磺基-NHS-SS-生物素，然后再用PBS 洗滌數(shù)次。然后將細(xì)胞于37^C培養(yǎng)基中培養(yǎng)多個(gè)時(shí)間間隔以使生物 素化的分子內(nèi)化，于冰上用谷胱甘肽溶液(50 mM谷胱甘月大/75 mM NaCl/75 mM NaOH/1% BSA)洗滌兩次20 min,從細(xì)胞表面剝離所有 生物素基團(tuán)，然后刮下細(xì)胞并將其溶解于用NaF、正釩酸凌內(nèi)和蛋白 酶抑制劑補(bǔ)充的500卩iM放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液(25 mM Tris-HCl,pH7.4,用150 mM NaCL/0.1% SDS/1% Triton X-l 00)。將 細(xì)胞提取液離心，將上清液與鏈霉抗生物素珠(Sigma)孵育以收集生 物素化的蛋白，然后通過(guò)SDS/PAGE和免疫印跡，用抗-EGFR抗體 (SC-03, Santa Cruz Biotechnology)或抗轉(zhuǎn)4失蛋白受體抗體(Santa Cruz Biotechnology),對(duì)生物素化的蛋白進(jìn)行分析。
結(jié)果和討論
對(duì)吉非替尼獲得性耐藥的復(fù)發(fā)性肺癌的分析。在兩個(gè)患 者中發(fā)生復(fù)發(fā)的對(duì)吉非替尼-耐藥的NSCLC,其腫瘤在診斷時(shí)已經(jīng)包 含EGFR激酶的激活的突變并且已經(jīng)顯示引人注目的對(duì)藥物的最初 臨床反應(yīng)(l)。在兩個(gè)病例中，初始治療后l-2年，在肝中發(fā)展的轉(zhuǎn) 移疾病導(dǎo)致患者死亡。在病例l中，尸檢時(shí)得到大部肝轉(zhuǎn)移的分析 表明，致敏EGFR突變(L858R)的持續(xù)以及存在新的獲得性T790M 突變(圖IA)。有趣的是，非克隆的PCR產(chǎn)物的分析顯示，最初L8S8R突變以與存在于所有腫瘤細(xì)胞中的雜合突變相一致的豐度存在，而 在約五分之一豐度的相應(yīng)的野生型等位基因見(jiàn)到繼發(fā)性T7卯M突變。因而，這種與耐藥相關(guān)的突變似乎僅存在于在復(fù)發(fā)腫瘤的部分 細(xì)胞中。
病例2涉及吉非替尼療法失敗后的八個(gè)在肝中明顯的復(fù) 發(fā)轉(zhuǎn)移。在所有這些獨(dú)立的損傷中，致敏的L861QEGFR突變以期 望的雜合突變的比率存在。通過(guò)對(duì)來(lái)自任何這些轉(zhuǎn)移的非克隆PCR 產(chǎn)物的分析，未檢測(cè)到繼發(fā)性EGFR突變。然而，在PCR產(chǎn)物亞克 隆之后，發(fā)現(xiàn)在四個(gè)轉(zhuǎn)移肺瘤分析中的兩個(gè)(T7卯M，自損傷l測(cè)序 的50個(gè)克隆中的2個(gè)和自損傷2測(cè)序的56個(gè)克隆中的1個(gè))中，T790M突變以非常低的頻率存在，但從兩個(gè)其它復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(自損傷3測(cè)序的 55個(gè)克隆中的0個(gè)和自損傷4測(cè)序的59個(gè)克隆中的0個(gè))或原發(fā)性 腫瘤(75個(gè)克隆中的0個(gè))中未能發(fā)現(xiàn)(圖W和表l)?？傊@些結(jié)果 與之前T790M突變存在于某些但不是所有的獲得性吉非替尼耐藥(7 個(gè)腫瘤中的3個(gè)；參見(jiàn)參考文獻(xiàn)H、 18和21)病例的報(bào)告一致。此 外，如前所指出的(18),即使在某些具有這種耐藥相關(guān)突變的病例中， 似乎僅存在于小部分復(fù)發(fā)損傷中的腫瘤細(xì)胞中。這些觀察提示，耐 藥的其它的機(jī)制涉及到?jīng)]有繼發(fā)性EGFR突變的病例中，并且這樣 的機(jī)制與在其它病例中的T790M突變共同存在。
吉非替尼-耐藥細(xì)胞依賴(lài)于EGFR和ERBB2表達(dá)。為了洞察吉非替尼耐藥性的獲得和對(duì)不可逆性抑制劑的持續(xù)敏感性的機(jī) 制，本申請(qǐng)人首先確定是否對(duì)于它們的生存能力而言，耐藥細(xì)胞系 依然依賴(lài)于EGFR。本申請(qǐng)人之前已經(jīng)表明，siRNA-介導(dǎo)的EGFR 的敲除在包含突變體EGFRs的細(xì)胞中觸發(fā)細(xì)胞凋亡，但是不在具野 生型等位基因的細(xì)胞中觸發(fā)細(xì)胞凋亡(6)。有顯著意義的是，在用 siRNA耙向的EGFR轉(zhuǎn)染之后，親代NCI-H1 650細(xì)胞及其吉非替尼-耐藥衍生物顯示可比性地降低細(xì)胞生存力(圖3A)。因而，吉非替尼-耐藥的獲得不包括下游效應(yīng)器的不依賴(lài)EGFR的激活。因?yàn)镠KI-272 和HKI-357耙向EGFR和ERBB2兩者，本申請(qǐng)人還試驗(yàn)此相關(guān)受體 的抑制。NCI-H1 650及其吉非替尼-耐藥衍生物中的ERBB2的敲除 還引起生存能力的喪失(圖3A),提示EGFR-ERBB2雜二聚體在包含 EGFR突變的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基本生存信號(hào)中的作用。僅由不可逆性如被主要靶向EGFR的EKB-569的效力所證明(26)。然而，鑒于通 過(guò)使用siRNA耙向EGFR和ERBB2的潛在補(bǔ)充效應(yīng)和靶向這些家族 成員的不可逆性抑制劑的可用性，雙重抑制的潛在利益得到考慮。
經(jīng)由介導(dǎo)其增殖和生存通路的EGFR的下游效應(yīng)器，本 申請(qǐng)人:比較吉非替尼和不可逆性ERBB家族抑制劑對(duì)抑制信號(hào)傳導(dǎo) 的能力。在抑制EGFR自動(dòng)磷酸化(在殘基Y1068檢測(cè))中，和包含 delE746-A750 EGFR突變的親4、 NCI-H1 650細(xì)胞中的AKT和MAPK 磷酸化中，HKI-357的效力未吉非替尼的IO倍(圖3B)。在吉非替尼-耐藥衍生物，NCI-H1650(G7)中，吉非替尼表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)亟档鸵种艫KT 磷酸化的效應(yīng)， 一種關(guān)聯(lián)吉非^,尼響應(yīng)的關(guān)鍵EGFR信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng) 器(6),相反，HKI-357被證明具有持續(xù)活性(圖3B)。
吉非替尼-耐藥克隆中的改變的EGFR內(nèi)化現(xiàn)象。鑒于 EGFR中的繼發(fā)性突變的缺乏和吉非替尼-耐藥細(xì)胞對(duì)siRNA-介導(dǎo)的 EGFR的抑制的持續(xù)易感性，本申請(qǐng)人試驗(yàn)在吉非替尼-耐藥細(xì)胞中 由可逆性和不可逆性抑制劑對(duì)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的分化抑制的潛在機(jī)制是否可能與受體傳輸?shù)母淖兿嚓P(guān)，這種傳輸已被充分證明為EGFR-依賴(lài)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)器(20)。確實(shí)，與藥物-敏感性親代細(xì)胞比較，如 采用熒光素-標(biāo)記的EGF內(nèi)化現(xiàn)象(圖3C)和細(xì)胞質(zhì)生物素化EGFR的 定量)兩者所檢測(cè)的，NCI-H1 650-衍化的耐藥細(xì)胞的EGFR傳輸?shù)姆?析證明與EGFR內(nèi)化現(xiàn)象的增強(qiáng)一致(圖3D。這樣的效應(yīng)沒(méi)有在轉(zhuǎn)鐵 蛋白受體中觀察到，提示此不是來(lái)自在所有受體過(guò)程(receptor processing)中普遍改變的結(jié)果。盡管需要進(jìn)行進(jìn)一 步的工作闡釋EGFR 傳輸中此種改變的準(zhǔn)確機(jī)制，但該復(fù)雜過(guò)程中已經(jīng)牽涉到許多調(diào)節(jié) 蛋白，這些結(jié)果提示吉非替尼抑制EGFR激活的能力危及這些細(xì)胞， 而不可逆性抑制劑的作用為可不可檢測(cè)地受到影響。
由不可逆性抑制劑引起的T790M EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的抑制 和增強(qiáng)的細(xì)胞殺傷力。由不可逆性ERBB抑制劑的對(duì)EGFR信號(hào)傳 導(dǎo)增強(qiáng)的抑制產(chǎn)生這樣的可能性，即這些藥物也可在包含EGFR中 的T790M繼發(fā)性突變的細(xì)胞的情況中表現(xiàn)持續(xù)活性。因此本申請(qǐng)人 測(cè)試這些抑制劑對(duì)包含EGFR中的L858R和T790M突變的NCI-HI 975支氣管肺泡癌細(xì)胞系的效應(yīng)(18)。有意義的是，該細(xì)胞系源自沒(méi) 有用EGFR抑制劑治療的患者，表明該突變不是獨(dú)特地與獲得性藥 物抵抗相關(guān)。在抑制配體-引起的￡Gf7 自動(dòng)磷酸化及其下游信號(hào)傳 導(dǎo)中，當(dāng)通過(guò)AKT和MAPK磷酸化測(cè)定時(shí)，HKI-357和HKI-272均 比吉非替尼明顯地更為有效(圖AA)。類(lèi)似地，所有三個(gè)不可逆性抑 制劑在該細(xì)胞系中，在其對(duì)吉非替尼耐藥的條件下抑制增殖(圖4B)。 因而，不可逆性ERBB抑制劑似乎在包含T790M EGFR的細(xì)胞中以 及在伴有野生型受體的改變的傳輸?shù)募?xì)胞中有效。
本申請(qǐng)人的結(jié)果確認(rèn)EGFR中的TWOM突變作為繼發(fā)性 突變的報(bào)告，該突變之前發(fā)生于包含激活性突變的敏感性NSCLCs 中，與獲得性耐藥的出現(xiàn)相關(guān)(17, 18)。然而，該突變僅存在于一個(gè) 亞組病例中，即使包含T790M突變的腫瘤可僅包含一小部分具有該
突變的細(xì)胞。這些觀察意味著多重耐藥機(jī)制可共同存在于最初對(duì)吉非替尼或類(lèi)似的可逆性EGFR抑制劑有反應(yīng)之后的復(fù)發(fā)腫瘤中。此 外，這些發(fā)現(xiàn)提示不依賴(lài)T790M的耐藥機(jī)制，如果不比在賦予藥物 抵抗中的T790M取代本身更有效，也可能是相同的，并可解釋為什 么復(fù)發(fā)腫瘤幾乎不表現(xiàn)對(duì)于T790M的克隆狀態(tài)(clonality) (17, 18)。 獲得性吉非替尼耐藥的體外機(jī)制不顯著頻繁涉及繼發(fā)性EGFR突變， 而是與改變的受體傳輸相關(guān)。然而，應(yīng)該指出的是，本申請(qǐng)人沒(méi)有 測(cè)試在所有本申請(qǐng)人體外建立的耐藥克隆中的EGFR傳輸，并且可 能在某些克隆中存在可對(duì)吉非替尼耐藥起作用的另外的機(jī)制。雖然 如此，事實(shí)上所有吉非替尼-耐藥克隆表現(xiàn)出對(duì)不可逆性ERBB抑制 劑的可比較的敏感性。
本申請(qǐng)人的結(jié)果表明竟?fàn)幮訣GFR抑制劑諸如吉非替尼 (其效力受到體外耐藥性快速發(fā)展的限制)與不可逆性抑制劑(對(duì)其的 獲得性耐藥似乎很少見(jiàn))之間顯著不同(圖2C)。本申請(qǐng)人推測(cè)耐藥細(xì) 胞中的配體-結(jié)合的EGFR的增強(qiáng)內(nèi)化現(xiàn)象，可與在細(xì)胞內(nèi)嚢泡的低 pH下吉非替尼-EGFR復(fù)合體的離解(dissociation)關(guān)聯(lián)。與此對(duì)照' 受體的不可逆性交聯(lián)將不受這樣的受體傳輸?shù)母淖兊挠绊?。在缺?藥物情況下細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代最多至20代后，對(duì)吉非替尼的獲得性耐藥 穩(wěn)定持續(xù)，提示調(diào)節(jié)EGFR轉(zhuǎn)換(turaover)的基因的遺傳或外遺傳的 改變可解釋此現(xiàn)象。因?yàn)槭荏w傳輸不容易通過(guò)采用可用的臨床樣本 進(jìn)行研究，所以在可能的臨床相關(guān)性之前進(jìn)行這樣的基因改變的鑒 定可能是必須的。雖然如此，這樣的機(jī)制可對(duì)EGFR中不具有繼發(fā)性突變的復(fù)發(fā)疾病患者體內(nèi)獲得性吉非替尼-耐藥起作用。
不可逆性ERBB抑制劑還似乎在克服由T790M突變介導(dǎo)的吉非替尼耐藥性中有效，所迷突變推測(cè)為不論這種重要?dú)埢母?變與否，因維護(hù)抑制劑結(jié)合所傳輸?shù)男?yīng)。當(dāng)在進(jìn)行此工作時(shí)，另 一種EGFR不可逆性抑制劑[CL-387,785, Calbiochem (27)]顯示抑制 T790MEGFR突變體的激酶活性(17)。在T790M的條件下的CL-387,785的效力被認(rèn)為是在苯胺基團(tuán)3號(hào)位置上缺乏氯(chloride)的結(jié) 果，所述基團(tuán)存在于吉非替尼中并且推定在空間上阻礙對(duì)在密碼子 790上突變體曱硫氨酸的結(jié)合。然而，EKB-569、 HKI-272和HKI-357 均在苯胺環(huán)的該位置上具有氯部分，提示它們的共享的對(duì)EGFR不 可逆結(jié)合能力或許解釋它們的效力，而不是缺乏與T790M的特異性 空間上相互作用(24-26)。因而，除了T790M突變外，可證明這些不 可逆性抑制劑在包括多種耐藥機(jī)制中也是廣泛有效的。表1. EGFRT790M突變?cè)诓±?的復(fù)發(fā)腫瘤中以非常低的頻率存在克隆數(shù)T790M突變體 野生型腫瘤原發(fā)性 0 復(fù)發(fā)1 2 復(fù)發(fā)2 1 復(fù)發(fā)3 0 復(fù)發(fā)4 0
大量克隆的PCR產(chǎn)物測(cè)序揭示: 少數(shù)等位基因含T790M突變。[OO卯]本說(shuō)曰j 合于本文。75 48 55 55 59四例肝損傷中的兩例的
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權(quán)利要求
1.一種治療吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥的方法，所述方法包括以下步驟a.在起先用吉非替尼和/或埃羅替尼治療患者后的時(shí)間點(diǎn)上，監(jiān)測(cè)患者癌癥的發(fā)展，其中所述癌癥的發(fā)展為對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼治療耐藥的癌癥的指征；和b.給予對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼治療耐藥的癌癥患者含不可逆性表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的藥用組合物。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑選自 EKB-569、 HKI-272和HKI-357。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑結(jié)合于 EGFR的半胱氨酸773 (SEQIDNO: 1)。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述癌癥的發(fā)展通過(guò)對(duì)癌癥的目測(cè) 來(lái)監(jiān)測(cè)。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述癌癥的目測(cè)通過(guò)X-線、CT掃 描或MRI進(jìn)行。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中所述癌癥的發(fā)展通過(guò)腫瘤生物標(biāo)記 物檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展包括將第二時(shí)間點(diǎn) 的癌癥與第一時(shí)間點(diǎn)的癌癥對(duì)比，其中第二時(shí)間點(diǎn)在第 一時(shí)間點(diǎn)之 后，其中第一時(shí)間點(diǎn)在起先用吉非替尼和/或埃羅替尼治療之前或之 后，其中癌癥的生長(zhǎng)增加指示癌癥的發(fā)展。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中其它的時(shí)間點(diǎn)的癌癥與之前的時(shí)間 點(diǎn)的癌癥作比辟交。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述癌癥是上皮細(xì)胞癌。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、 卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系 統(tǒng)癌癥、腎癌、4見(jiàn)網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌 癥和力旁"光癌。
11. 一種治療癌癥的方法，所述方法包括以下步芬聚a. 給予癌癥患者吉非替尼和/或埃羅替尼；b. 監(jiān)測(cè)患者的癌癥發(fā)展；和c. 一旦表明癌癥發(fā)展，擇給予患者不可逆性EGFR抑制劑。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑選自 EKB-569、 HKI-272和HKI畫(huà)357。
13. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑結(jié)合 EGFR的半胱氨酸773 (SEQIDNO: 1)。
14. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述癌癥的發(fā)展通過(guò)對(duì)癌癥的目 測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中對(duì)癌癥的目測(cè)采用X-線、CT掃 描或MRI進(jìn)行。
16. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述癌癥的發(fā)展通過(guò)腫瘤生物標(biāo) 記物檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)。
17. 權(quán)利要求ll的方法，其中監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展包括將笫二時(shí)間 點(diǎn)的癌癥與第一時(shí)間點(diǎn)的癌癥對(duì)比，其中第二時(shí)間點(diǎn)在第一時(shí)間點(diǎn) 之后，其中第 一 時(shí)間點(diǎn)在起先用吉非替尼和/或埃羅替尼治療之前或 之后，其中癌癥的生長(zhǎng)增加指示癌癥的發(fā)展。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中其它的時(shí)間點(diǎn)的癌癥與之前的時(shí) 間點(diǎn)的癌癥作比專(zhuān)交。
19. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述癌癥是上皮細(xì)胞癌。
20. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、 卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系 統(tǒng)癌癥、腎癌、碎見(jiàn)網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌 癥和膀胱癌。
21. 權(quán)利要求11的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑與可 逆性EGFR抑制劑同時(shí)給予。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述可逆性EGFR抑制劑是吉非 替尼或埃羅替尼。
23. —種治療癌癥的方法，所述方法包括給予癌癥患者含不可 逆性EGFR抑制劑的藥用組合物，所述患者在EGFR(SEQIDNO: 1) 上有突變，其中所述突變?yōu)樵?90位置上的蘇氨酸被曱硫氨酸置換。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述EGFR抑制劑選自EKB-569、 HKI-272和HKI-357。
25. 權(quán)利要求23的方法，其中所述不可逆性EGFR抑制劑結(jié)合 至EGFR(SEQIDNO: 1)的半胱氨酸773上。
26. 權(quán)利要求23的方法，其中所述癌癥是上皮細(xì)胞癌。
27. 權(quán)利要求23的方法，其中所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、 卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食道癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)系 統(tǒng)癌癥、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、泌尿生殖系癌 癥和力旁力光癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥性癌癥的方法。在用吉非替尼和/或埃羅替尼治療后監(jiān)測(cè)癌癥患者的癌癥發(fā)展。癌癥的發(fā)展指示癌癥對(duì)吉非替尼和/或埃羅替尼耐藥。一旦表明癌癥在發(fā)展，則給予患者含不可逆性表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的藥用組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不可逆性EGFR抑制劑是EKB-569、HKI-272和HKI-357。
文檔編號(hào)A61K31/00GK101155579SQ200680011003
公開(kāi)日2008年4月2日 申請(qǐng)日期2006年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者D·W·貝爾, D·哈伯, E·L·夸克, J·E·塞特爾曼, N·G·戈丁-海曼, R·索爾德拉, S·K·拉賓蘭 申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院公司;惠氏公司