檢測癌癥療法耐藥性的方法【專利摘要】本發(fā)明描述了BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體，其以5′至3′順序包含SEQ?ID?NO:5中所示的核苷酸序列和緊接的SEQ?ID?NO:7中所示的核苷酸序列。這種BIM多態(tài)性變體可以用缺少SEQ?ID?NO:6中所示的核苷酸序列表征。它可以用來在包含這種多態(tài)性的個體中檢測慢性髓性白血病的BCR-ABL非依賴性TKI耐藥(酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性)、胃腸道間質腫瘤(GIST)的c-KIT/PDGFR非依賴性TKI耐藥、非小細胞肺癌(NSCLC)的EGFR非依賴性TKI耐藥或骨髓增生病的JAK2非依賴性TKI耐藥?！緦＠f明】檢測癌癥療法耐藥性的方法【
技術領域：
】[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥、細胞生物學、分子生物學和遺傳學領域?！?br>背景技術：
】[0002]慢性髓性白血病(CML)是造血干細胞癌癥，并且因稱作BCR-ABL的致癌融合基因的存在而引起，所述致癌融合基因存在于全部CML患者中。[0003]BCR-ABL編碼組成型活性酪氨酸激酶，所述酪氨酸激酶介導與其正常對應物相比時增加的CML細胞存活和增殖。CML的有效治療以一類抑制BCR-ABL激酶活性的藥物形式存在，它們常被稱作酪氨酸激酶抑制劑(TKI)。[0004]然而，小比例的患者將顯示針對TKI的原發(fā)耐藥性并且無反應，而其他患者將具有初始反應，但是隨時間推移，形成對這些藥物的繼發(fā)耐藥性(一個經(jīng)常與轉變成原始細胞危象(BC)CML相關的事件)和存活較短。在約60%存在TKI耐藥的患者中(參考文獻Al)，發(fā)現(xiàn)BCR-ABL激酶活性通過BCR-ABL基因中致使TKI與BCR-ABL結合能力降低的突變或通過‘野生型’BCR-ABL基因或蛋白的擴增和過量表達而再激活。[0005]在剩余40%的患者中，TKI耐藥的原因未知。發(fā)現(xiàn)在BCR-AB再激活不存在情況下介導TKI耐藥的機制(也稱作BCR-ABL非依賴性TKI耐藥)對于確定克服TKI耐藥的策略和更好的管理CML患者至關重要。[0006]因此，采用BCR-ABL抑制劑的療法已經(jīng)在大多數(shù)慢性期慢性髓性白血病(CML)患中取得很高的病情控制率。然而，仍有很大比例的患者不能獲得最佳反應1并且?guī)缀跞炕加型砥诩膊〉幕颊咚烙谄浼膊?。[0007]利用臨床推動的風險評分評估患者的臨床結果的嘗試取得的成功有限3Λ這部分歸因于這類評分不考慮促成臨床結果的疾病的分子特征或患者特異性遺傳因素。實際上，對預測慢性期CML的反應的宿主遺傳因素幾乎一無所知5_7。[0008]因此，當前在臨床上推薦用相同初始劑量的伊馬替尼治療全部患者，以常規(guī)時間間距監(jiān)測基準臨床反應。這些包括外周血計數(shù)的標準化和三個月至六個月的間隔下細胞遺傳學和分子反應的程度5。僅未能達到基準時才改變療法。作為決策方向，選項包括增加伊馬替尼劑量、轉向更強力的酪氨酸激酶抑制劑，以及準備好大劑量化療和移植。[0009]理想地，將可能根據(jù)白血病和患者兩者來調整療法，從而實現(xiàn)最快的反應并避免出現(xiàn)耐藥性或病情發(fā)展。出于這些原因，需要用于預測反應和指導治療的可靠標記。最近的工作依賴基于陣列的表達概況分析，以深入了解與ML中耐藥性和病情發(fā)展相關的遺傳因素8。然而，這類方法受限于它們的內在偏差以及不能確定促成這些表達譜的基礎性遺傳事件。[0010]發(fā)明概沭[0011]根據(jù)本發(fā)明的第一方`面，提供一種預測可能患有或患有癌癥或骨髓增生病的個體是否可能形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性的方法。[0012]該方法可以包括確定該個體是否具有BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體。所述多態(tài)性變體或多態(tài)性可以按5'至3'順序包含SEQIDNO:5中所述的核苷酸序列和緊接的SEQIDN0:7中所述的核苷酸序列。BM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體可以缺少SEQIDNO:6中所述的核苷酸序列。[0013]該方法可以包括檢測包含SEQIDNO:1中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物的存在，所述擴增產(chǎn)物作為該個體具有這種BM(BCL2L11)基因多態(tài)性變體的指示物?？蛇x地或額外地，該方法可以包括檢測包含SEQIDNO:2中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物的存在，所述擴增產(chǎn)物作為該個體缺少這種BIM(BCL2L11)基因多態(tài)性變體的指示物。[0014]該方法可以包括核酸擴增。該方法可以利用如SEQIDN0:3中所述的核苷酸序列。它可以利用SEQIDN0:4中所述的核苷酸序列。它可以利用這類序列的組合?？梢宰鳛橐锛隙谠摻M合中。[0015]該方法可以是這樣的，當確定該個體具有BM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體時，所述個體可能形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性?？蛇x地或額外地，該方法可以是這樣的，當確定該個體不具有BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體時，所述個體較不可能形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性。[0016]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種為患有癌癥或骨髓增生病的個體選擇療法的方法。該方法可以包括通過上述方法確定患者是否可能形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性。該方法可以是這樣的，從而在確定該個體可能形成這類耐藥性的情況下，選擇療法。[0017]該療法可以包括更頻繁地監(jiān)測患者。該療法可以包括更頻繁的血液檢查。該療法可以包括更頻繁的骨髓檢查。該療法可以包括骨髓移植。該療法可以包括施用更有力的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)。所述酪氨酸激酶抑制劑可以包括尼洛替尼或達沙替尼，或這兩者。該療法可以包括施用BH3-模擬物`。所述BH3-模擬物可以包括ABT-263。所述BH3-模擬物可以與TKI組合施用。該療法可以包括增加酪氨酸激酶抑制劑的劑量。所述酪氨酸激酶抑制劑可以包括伊馬替尼。所述劑量可以增加超過400mg/日的標準劑量至600mg/日或SOOmg/日。所述療法可以包括用抑制BCL2組蛋白質的促存活作用的藥物治療。[0018]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種確定特定療法在患有癌癥或骨髓增生病的個體上取得成功的可能性的方法。這種方法可以包括將所述療法與由上述方法確定的療法比較。[0019]癌癥或骨髓增生病可以包括慢性髓性白血病(CML)。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括BCR-ABL非依賴性TKI耐藥性。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括酪氨酸激酶抑制劑耐藥性。這種酪氨酸激酶抑制劑可以包括伊馬替尼。[0020]癌癥或骨髓增生病可以包括胃腸道間質腫瘤(GIST)。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括c-KIT/PDGFR非依賴性TKI耐藥。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括伊馬替尼耐藥性。[0021]癌癥或骨髓增生病可以包括非小細胞肺癌(NSCLC)。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括EGFR非依賴性TKI耐藥。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括針對厄洛替尼、吉非替尼、舒尼替尼、尼洛替尼和索拉非尼中任一種或多種或其組合的耐藥性。[0022]癌癥或骨髓增生病可以包括如選自真性紅細胞增多癥(polycythaemiavera)、原發(fā)性血小板增多癥(essentialthrombocythaemia)和原發(fā)性骨髓纖維化(primarymyelofibrosis)的骨髓增生病。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括JAK2非依賴性TKI耐藥。酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性可以包括JAK抑制劑耐藥性。[0023]癌癥或骨髓增生病可以選自:血液學惡性病、慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性髓樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生病(包括真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化)、實體瘤、小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌、黑色素瘤和神經(jīng)母細胞瘤。[0024]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供一種BM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體，其以5'至3'順序包含SEQIDNO:5中所述的核苷酸序列和緊接的SEQIDN0:7中所述的核苷酸序列。[0025]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供BM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體，其特征在于缺少SEQIDNO:6中所述的核苷酸序列。[0026]在第六方面，本發(fā)明提供SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所述的核苷酸序列。這種核苷酸序列可以從上述的BM多態(tài)性變體獲得。它可以是通過核酸擴增可獲得。[0027]BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體或上述核苷酸序列可以與BCR-ABL再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑治療慢性髓性白血病的耐藥性(BCR-ABL非依賴性TKI耐藥)相關。它們可能與c-KIT/PDGFR再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑治療胃腸道間質腫瘤(GIST)的耐藥性(c-KIT/PDGFR非依賴性TKI耐藥)相關。它們可能與EGFR再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑治療非小細胞肺癌(NSCLC)的耐藥性(EGFR非依賴性TKI耐藥)相關。它們可能與JAK2再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑治療骨髓增生病的耐藥性(JAK2非依賴性TKI耐藥)相關。[0028]在本發(fā)明的第七方面，提供SEQIDNO:3中所述的核苷酸序列。我們還提供SEQIDN0:4中所述的核苷酸序列。`我們也提供所述核苷酸序列的組合。這種組合可以作為引物集合提供。[0029]根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供一種檢測上述BM(BCL2L11)多態(tài)性在個體中存在或不存在的方法。該方法可以包括檢測包含SEQIDNO:1中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物。該方法可以包括檢測SEQIDN0:2中所述的序列。這種檢測可以利用上述的引物集合。[0030]根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供一種治療患有癌癥或骨髓增生病的患者的方法。該方法可以包括確定所述癌癥或骨髓增生病是否為BCR-ABL非依賴性TKI耐藥性CML癌癥。該方法可以包括確定所述癌癥或骨髓增生病是否為c-KIT/PDGFR非依賴性TKI耐藥性GIST癌癥。該方法可以包括確定所述癌癥或骨髓增生病是否為EGFR非依賴性TKI耐藥性NSCLC癌癥。該方法可以包括確定所述癌癥或骨髓增生病是否為JAK2非依賴性TKI耐藥性骨髓增生病。該方法可以如上述。該方法還可以包括通過執(zhí)行選自本發(fā)明第二方面所述的(a)至(g)的步驟治療患者。[0031]這種方法可以包括檢測包含SEQIDNO:1中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物。這可以通過使用如上文所述的引物集合進行。[0032]除非另外說明，本發(fā)明的實施將采用化學、分子生物學、微生物學和重組DNA和免疫學的常規(guī)技術，這些技術屬于本領域普通技術人員的能力范圍。此類技術在文獻中有解釋。見例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第1-3卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress；AusubeI,F.M.等人，(1995和定期增補；CurrentProtocolsinMolecularBiology,第9,13和16章，Johnffiley&Sons,NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNAIsolation和Sequencing:EssentialTechniques,Johnffiley&Sons；J.M.Polak和JamesO'D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992，MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolN0.1byEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow(編者)，DavidLane(編者)編著(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2)，1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編著(2001，NewYork,NY,MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9)JPLabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers編著,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些通用教材的每一部通過引用的方式并入本文?！緦＠綀D】【附圖說明】[0033]圖1顯示UCSC基因(上部)和RefSeq基因(GeneBank，下部)的人類基因組(hgl8)chr2:111,593，210-111，644，581的UCSC基因組瀏覽器視圖。將BM基因和表征多態(tài)性的缺失標出。[0034]圖2顯示六個CML基因組的DNA-PET分析。[0035]圖2A匯總用于DNA-PET分析的患者樣品和CML細胞系的門診-病理特征。[0036]圖2B顯示六個CML基因組的核基因組圖，所述圖是使用Circos由DNA-PET數(shù)據(jù)生成的29并且繪制為環(huán)形圖。濾除與32個正常基因組至少之一中所鑒定的那些SV匹配的SV(這些SV對應于表E4中的那些)。將不同類別的結構性變異(SV)以同心層方式如圖注中所示那樣排布。星號(*)表示存在BCR-ABL1/ABL1-BCR易位。[0037]圖3顯示與急變(blast)轉化相關的體細胞結構性變異。[0038]圖3A顯示在P098中EVIl基因座內的新型重排的基因組瀏覽器視圖。已知位于這個基因座內的基因[加利福尼亞州立大學圣克魯茲分(UCSC)](Rhead等人，2010)以紅色和藍色顯示(頂部)。紅色跡線反映一致PET的片段覆蓋范圍(coverage)。暗紅色和粉紅色水平箭頭代表表示存在插入的不一致PET的定位區(qū)域(錨定區(qū))。[0039]圖3B顯示如通過定量實時PCR測量的EVIl的表達水平。顯示2份急變期樣品(P022和P098)和4份慢性期樣品(P308、P355、P490和P500)的EVIl水平，其針對β-肌動蛋白的表達歸一化。[0040]圖3C顯示使用如圖3Α中所示的針對染色體3(RP11_137H17，綠色)和染色體8(RP11-828L6，紅色；RP11_159N7，黃色)的定制探針時EVIl重排的熒光原位雜交分析結果。EVIl重排不存在于正常對照中，但是可以在P098樣品中作為紅-綠-黃色融合信號見到。[0041]圖4顯示在BM的內含子2中的多態(tài)性2903bp缺失均存在于全部三份耐藥樣品中。[0042]圖4A顯示通過DNA-PET在來自存在酪氨酸激酶抑制劑耐藥的患者的全部三份樣品(P308、P022和P098)均檢測到BM缺失，但是在來自酪氨酸激酶抑制劑敏感的患者或細胞系的樣品(P145、P440和K562)中沒有檢測到。在基因組瀏覽器中顯示5份臨床CML樣品和K562的Chr2:111580000..111650000DNA-PET數(shù)據(jù)。由綠線連接的暗紅色和粉紅色水平箭頭代表表示存在缺失的不一致PET的定位區(qū)域(錨定區(qū))。垂直短劃線表示缺失的區(qū)域。[0043]圖4B顯示通過針對缺失(chr2:111,599,666..111,602,568)的UCSC基因組瀏覽器'28-WayCons'Track證明，該區(qū)域在哺乳動物中保守，y-軸上為保守程度。[0044]圖4C顯示使用來自5位患者和K562細胞的基因組DNA樣品，通過PCR證實該缺失。大小為4.2Kb的PCR產(chǎn)物對應于未缺失的等位基因，而大小為1.3Kb的PCR產(chǎn)物對應于缺失等位基因。M,IKb標記(Fermentas)。[0045]圖4D描述全部三份含缺失的樣品中通過PCR產(chǎn)物的Sanger測序找到的相同斷點。缺失的序列以藍色顯示。[0046]圖5顯示BM多態(tài)性的功能效應。[0047]圖5A描述BM的基因組構造，其顯示主要BM同工型(包括BMEL、BML和BMS)的外顯子以及BMY(已知含有外顯子3的唯一同工型)的外顯子3°_32。外顯子2和外顯子3之間的多態(tài)性缺失以紅線突出顯示。也突出顯示了含有起始密碼子(起始)、動力蛋白結合結構域(DBD)、BH3結構域(B`H3)和終止密碼子/多聚腺苷化信號序列(Stop/PolyA)的外顯子。該圖未按比例繪制。[0048]圖5B顯示通過定量實時PCR在23份CML患者樣品[無缺失的樣品數(shù)n=ll(WT)和帶缺失的樣品數(shù)n=12(攜帶者)]中測量的BIM的外顯子特異性轉錄物的表達水平。含有外顯子E2A、E3或E4的各種轉錄物的水平表示為相對于外顯子2A或β-肌動蛋白的歸一化比率。均數(shù)和均數(shù)標準誤由紅線和標度表示。統(tǒng)計顯著性(P)由Wilcoxon秩和檢驗計算。[0049]圖5C顯示使用實施例2中描述的方法，來自東亞人和非東亞人CML細胞系的收集物中的PCR反應產(chǎn)物，其中進行所示PCR檢測缺失。[0050]圖顯示在具有或不具有缺失的CML細胞系中含有外顯子3的轉錄物與含有外顯子4的轉錄物的比率。[0051]圖5E是顯示細胞裂解物中BMEL水平的蛋白質印跡，其中所述細胞裂解物是在用IμM伊馬替尼處理具有或不具有缺失的細胞系24小時后獲得的。[0052]圖5F顯示用IμM伊馬替尼一起培養(yǎng)的具有或不具有缺失的CML細胞系的生長曲線。[0053]圖5G顯示伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)和ABT-737針對KCL22和KY0-1細胞的凋亡活性。細胞用2μM伊馬替尼、50ηΜ達沙替尼或2.5μMABT-737處理48小時，并且通過流式細胞術測定死細胞百分數(shù)。[0054]圖6顯示BM多態(tài)性與酪氨酸激酶抑制劑臨床耐藥性的相關性。根據(jù)通過歐洲白血病網(wǎng)絡標準確定的對酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的敏感性或耐藥性以及BCR-ABL中已知引起耐藥性的突變存在與否，將兩個東南亞轉診中心處所見到的慢期或加速期CML患者分組。然后確定BM多態(tài)性在這些組中每一個組內的發(fā)生率。使用雙尾Fisher精確檢驗計算P值。[0055]圖6A顯示具有TKI耐藥和BCR-ABL突變的患者和具有TKI耐藥而不存在BCR-ABL突變的患者中BM缺失的頻率。[0056]圖6B顯示患有TKI敏感性疾病的患者和具有TKI耐藥而不存在BCR-ABL突變的患者中BM缺失的頻率。[0057]圖6C顯示患有TKI敏感性疾病的患者和存在TKI耐藥的全部患者中BM缺失的頻率。[0058]圖7顯示從cPET標簽計數(shù)推斷的拷貝數(shù)信息。染色體在水平軸上以交替綠色和藍色排列，如底部上所示?？截悢?shù)值在Y-軸上用紅色顯示的平滑化窗口值顯示。樣品ID在圖的左上角中顯示。注意K562的y-軸尺度不同。[0059]圖8顯示東亞人中BM缺失的基因組背景。[0060]圖8A.74位HapMapI期東亞個體針對BM中的內含子缺失進行基因分型，并且使用HaploView軟件，使缺失基因型與SNP基因型相關(Barrett等人，2005)?；贚D的單倍型域用SNP以基因組順序從左至右顯示。單倍型頻率在右側以灰色顯示。標記#49代表BIM缺失，其中A=無缺失，C=缺失。這種缺失以藍色單倍型為背景，其與和最頻繁的紅色單倍型相同的缺失分開。單倍型標記的SNP以箭頭標記。[0061]圖8Β.Α(#)中的加標簽SNP的ID(名稱)用它們的雜合性頻率(ObsHET)、微小等位基因頻率(MAF)和等位基因顯示。[0062]圖9.DNA配對末端標簽(PET)測序法。將基因組DNA經(jīng)液壓剪切，將EcoP15I識別位點甲基化并且EcoP15ICAP銜接子(adaptor)連接至DNA片段的末端。甲基化的DNA構建體在瓊脂糖凝膠上分離并且選擇9Kb大小的片段用于連接，產(chǎn)生環(huán)化產(chǎn)物，其中這些9Kb片段的5'末端(R3，暗紅色)和3'末端(F3，粉紅色)由具有兩個側翼非甲基化EcoP15ICAP銜接子的內部生物素酰化銜接子連接。通過甲基化敏感性EcoP15I消化構建體以釋放5'和3'PET構建體。將測序銜接子連接至PET構建體，所述PET構建體隨后由PCR擴增并且通過AppliedBiosystemsSOLiD系統(tǒng)測序。所產(chǎn)生的PET相對于人類參考序列hgl8定位。[0063]圖10.通過dPET聚類(cluster)鑒定結構性變異(SV)。‘解讀'顯示經(jīng)測序的基因組的基因組結構，其從相對于人類參考序列的PET聚類的定位圖(‘相對于參考定位')推斷得出。暗紅色箭頭代表5'錨定區(qū)，粉紅色箭頭代表3'錨定區(qū)。灰色、藍色和紅色水平線代表染色體區(qū)段。紅箭頭指示染色體區(qū)段的取向。[0064]圖11.細胞遺傳預測的異染色體17q的重構。大小為2的DNA-PET聚類連接染色體17位置17，595，066負鏈與染色體17位置28，282，853正鏈。頂部，顯示染色體17帶圖，斷點位置由紅色垂線顯示。暗紅色和粉紅色箭頭表示PET的定位位置和取向。中部，顯示對應于頂部上紅線的斷點區(qū)域的基因組瀏覽器視圖。紅色跡線代表一致定位PET的覆蓋范圍；基因以綠色顯示；暗紅色和粉紅色箭頭表示PET的定位位置(mappingposition)和取向(orientation)。底部,基于DNA-PET數(shù)據(jù)的異染色體17q的重構。箭頭指示漸增的基因組坐標的方向。[0065]圖12.與急變轉化相關的體細胞結構變異。[0066]圖12A顯示BCR和ABLl基因的基因組結構和易位斷點的位置。外顯子由框指示，內含子由指示轉錄方向的羽化線表示(+鏈，從左到右)。斷點的位置由具有相應樣品ID的紅色垂線指示。[0067]圖12B關聯(lián)BCR與ABLl的配對末端讀數(shù)(對覆蓋范圍歸一化的聚類尺度)次數(shù)相對于關聯(lián)事件(reciprocalevent)的比率與病情進展相關。在水平軸上顯示染色體22上的BCR和染色體9上的ABLl的基因組區(qū)域，基因以綠色和藍色顯示?？截悢?shù)估計值由紫色跡線表示。粉紅色和暗紅色箭頭顯示BCR和ABLl之間的關聯(lián)性。BCR-ABLl易位和ABLl-BCR易位的PET的數(shù)目分別以藍色和灰色顯示。垂直短劃線指示斷點的位置。[0068]圖12C顯示由DNA-PET鑒定的BCR-ABLl易位的FISH驗證結果。[0069]圖13.BIM的外顯子特異性轉錄物的表達水平。通過定量實時PCR在7個細胞系中測量表達水平，所述細胞系生成自未患CML的正常個體[不帶缺失的個體數(shù)n=3(WT)，帶有缺失的個體數(shù)n=4(攜帶者)]。含有外顯子E2A、E3或E4的各種轉錄物的水平表述為相對于外顯子2A或β_肌動蛋白的歸一化比率。鑒定的一位純合攜帶者的表達以綠色突出顯示。統(tǒng)計顯著性(P)由雙尾Wilcoxon秩和檢驗以及雙尾t-檢驗(黑色)計算。[0070]圖14A至圖14D是顯示在TKI耐藥CML患者樣品中存在的BM的內含子2內2903bp缺失多態(tài)性的簡圖。[0071]圖14A.顯示了來自5份臨床CML樣品和K562細胞的包含Chr2:111,580.000..111,650.000的DNA-PET數(shù)據(jù)的基因組瀏覽器視圖。通過DNA-PET在來自存在伊馬替尼耐藥的患者的全部三份樣品(P308、P022和P098)中均檢測到BM缺失，但是在來自伊馬替尼敏感的患者或`細胞系的樣品(P145、P440和K562)中沒有檢測到。紅色跡線代表定位至該區(qū)域的經(jīng)測序的一致PET的數(shù)目(覆蓋范圍)。由綠線連接的紫紅色和粉紅色水平箭頭代表不一致PET的定位區(qū)域并且表示存在缺失。垂直短劃線表示缺失的區(qū)域。[0072]圖14B.描述內含子性BM缺失多態(tài)性和側翼序列的示意圖。通過PCR產(chǎn)物的Sanger測序鑒定的斷點。缺失的序列以藍色突出顯示。人類參考序列坐標基于NCBIBuild36。[0073]圖14C.顯示使用在缺失旁側分布的引物時來自5份患者樣品和K562細胞的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠。大小4，226bp和1，323bp的PCR產(chǎn)物分別對應于無缺失和缺失的等位基因。4，226bp和1，323bp產(chǎn)物的存在表示該個體對這種缺失多態(tài)性為雜合。[0074]圖14D.顯示缺失多態(tài)性在不同人種群體中頻率的表。將樣品通過PCR進行基因分型并且在瓊脂糖凝膠上分析，如a中所示。[0075]圖15A至圖15J是顯示缺失多態(tài)性對BM基因功能的影響的簡圖。[0076]圖15A.BM的基因組構造，顯示了主要BM同工型(包括BMEL、BML和BMS)以及BMY(缺少BH3結構域)16的外顯子。外顯子2和外顯子3之間的刪除多態(tài)性以紅線突出顯示。也突出顯示了含有起始密碼子(起始)、動力蛋白結合結構域(DBD)、BH3結構域(BH3)和終止密碼子/多聚腺苷化信號序列(終止/PolyA)的外顯子。該圖未按比例繪制。[0077]圖15B.兩個微型構建體的示意圖，所述微基因構建體被轉染至K562或KCL22CML細胞中并且用作計量針對外顯子3/4的剪接作用的解讀。使用針對U-E3和U-E4轉錄物的特異性引物，通過Q-PCR獲得外顯子3/4比率，針對腺病毒特異性外顯子序列⑶歸一化。[0078]圖15C.與K562細胞(左側圖)中和KCL22細胞(右側圖)中的缺失微基因構建體相比，無缺失的微基因構建體中增加的E3轉錄物對E4轉錄物比率的柱狀圖(均數(shù)+/_均數(shù)標準誤，**ρ=0.0002，**ρ=0.012)。[0079]圖15D.通過定量實時PCR(Q-PCR)在23份CML患者樣品[無缺失的樣品數(shù)H=Il(WT)和帶缺失的樣品數(shù)η=12(攜帶者)]中測量的BIM的外顯子特異性轉錄物的表達水平。含有外顯子Ε2Α、Ε3或Ε4的各種轉錄物的水平表述為相對于Ε2Α(對于Ε3和Ε4)或β-肌動蛋白(對于Ε2Α[總BM轉錄物])的歸一化比率。均數(shù)和均數(shù)標準誤由紅線和標度表示。一位純合攜帶者的表述水平以綠色突出顯示。使用Wilcoxon秩和檢驗確定統(tǒng)計顯著性。[0080]圖15Ε.使用圖14中所述的方法的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠，鑒定東亞人和非東亞人CML細胞系的收集物中的多態(tài)性。[0081]圖15F.具有缺失多態(tài)性的CML細胞系(KCL22)和不具有缺失多態(tài)性的CML細胞系(Κ562和ΚΥ0-1)中含有Ε3的轉錄物對含有Ε4的轉錄物的比率(均數(shù)+/-均數(shù)標準誤，*ρ=0.016,林ρ=0.011)。[0082]圖15G.在IμΜ伊馬替尼處理24小時后，具有和不具有缺失多態(tài)性的細胞系中通過Q-PCR測量BM外顯子4特異性轉錄物的表達水平(針對β-肌動蛋白歸一化)(均數(shù)+/-均數(shù)標準誤，對于伊馬替尼處理的KCL22細胞，*ρ〈0.01，**ρ=0.004)。[0083]圖15Η.顯示BMEL(含有外顯子4和ΒΗ3結構域)和CrkL在細胞裂解物中水平的蛋白質印跡，所述細胞裂解物來自如圖15G中處理的細胞系。在全部三細胞系中，伊馬替尼暴露導致CrkL的去磷酸化，表`示對BCR-ABL激酶活性的抑制。[0084]圖151.顯示如圖15G中所述處理的細胞中胱天蛋白酶(caspase)3裂解作用的蛋白質印跡。[0085]圖15J.分析在具有或沒有ABT-737的情況下用伊馬替尼處理的細胞系的胱天蛋白酶3裂解作用的蛋白質印跡。[0086]圖16A至16H是顯示攜帶BM缺失多態(tài)性的CML細胞系的從頭生成和分析的簡圖。[0087]圖16A使用鋅指核酸酶(ZFN)向K562CML細胞系的基因組引入BM缺失多態(tài)性的策略的示意圖。[0088]圖16B.使用圖16A中所述的引物來檢測基因組編輯的K562細胞系中多態(tài)性的PCR產(chǎn)物，以KCL22細胞作為對照。分離對缺失多態(tài)性呈陰性(Κ562-ΒΜ?#?+/+)以及雜合(K562-BM內含子+勺和純合(K562-BM內含子+)的克隆。[0089]圖16C.Κ562-Β頂內含子+/+、Κ562-Β頂內含子+和Κ562-Β頂內含子+細胞中通過Q-PCR測量的外顯子3/外顯子4轉錄物比率(均數(shù)+/_均數(shù)標準誤，*ρ=0.002，**ρ=0.0001)。[0090]圖16?.Κ562-ΒΜ?#?+/+、Κ562-ΒΜ和Κ562-ΒΜ+細胞中伊馬替尼暴露后含有Ε4的轉錄物的表達(均數(shù)+/_均數(shù)標準誤，*ρ=0.015，**ρ=0.001)。[0091]圖16Ε.用漸增濃度的伊馬替尼處理后，來自Κ562-ΒΜ?#?+/+、Κ562_ΒΜ?#?Α和細胞的細胞裂解物的蛋白質印跡。蛋白質印跡用針對BMEL、切割的胱天蛋白酶3、PARP、CrkL和β-肌動蛋白的抗體探測。[0092]圖16F.e中BMEL(**ρ=0.0086，***ρ=0.00016)和切割的PARP(*Ρ=0.018，**P=0.0084)的研究結果的光密度測定柱狀圖，所述研究結果分別針對β-肌動蛋白和未切割的PARP歸一化(均數(shù)+/_均數(shù)標準誤)。[0093]圖16G.使用基于ELISA的測定法來檢測凋亡細胞的胞質部分中的單核小體和寡核小體的相對凋亡性細胞死亡(均數(shù)+/-均數(shù)標準誤，**ρ=0.006,*林ρ=0.00021)。[0094]圖16Η.蛋白質印跡，其顯示添加ΒΗ3模擬物藥物ΑΒΤ-737至伊馬替尼對Κ562-ΒΜ內含子+/+、Κ562-ΒΜ內含子+/+和Κ562-ΒΜ內含子+細胞中凋亡信號傳導的影響。[0095]圖17.DNA配對末端標簽(PET)測序方法.將基因組DNA經(jīng)液壓剪切，將EcoP15I識別位點甲基化并且EcoP15ICAP銜接子連接至DNA片段的末端。甲基化的DNA構建體在瓊脂糖凝膠上分離并且分別選擇5、7和9Kb大小的片段用于連接，產(chǎn)生環(huán)化產(chǎn)物，其中這些5、7或9Kb片段的5'末端(R3，暗紅色)和3'末端(F3，粉紅色)通過具有兩個側翼非甲基化EcoP15ICAP銜接子的內部生物素?；暯幼舆B接。通過甲基化敏感性EcoP15I消化構建體以釋放5'和3'PET構建體。將測序銜接子連接至PET構建體，所述PET構建體隨后由PCR擴增并且通過AppliedBiosystemsSOLiD系統(tǒng)測序。所產(chǎn)生的PET相對于人類參考序列NCBIbuild36定位(圖改編自Y。[0096]圖18.六個CML基因組的DNA-PET分析。六個CML基因組的核基因組圖，所述圖使用Circos從DNA-PET數(shù)據(jù)生成并且繪制為環(huán)形圖18。濾除與31個正?；蚪M至少之一中所鑒定的那些SV匹配的SV(表H3至H5)。將不同類別的結構變異(SV)以同心層方式如圖注中所示那樣排列布。星號(*)表示存在BCR-ABL/ABL-BCR易位。染色體9/22易位在P098中因der9上相互ABL/BCR融合的3Mb缺失而喪失其均衡特征，在K562中因復雜重排而喪失其均衡特征。在P440中找到的易位可能是插入，并且也在來自相同患者(P145)的配對樣品中借助PCR而不是DNA-PET而找到(見表H5的腳注)。[0097]圖19A至19C.六個C`ML基因組中的BCR-ABL重排。[0098]圖19A顯示BCR和ABLl基因的基因組結構以及易位斷點的位置。外顯子由黑色框指示，而內含子由指示轉錄方向的羽化線表示(+鏈，從左到右)。斷點的位置由紅色垂線連同相應樣品的ID指示。[0099]圖19B顯示使BCR與ABLl關聯(lián)的配對末端讀數(shù)(聚類尺度)次數(shù)(藍色)以及使ABLl與BCR關聯(lián)的關聯(lián)事件(灰色)的比率與疾病階段相關。在水平軸上顯示染色體22上的BCR和染色體9上的ABLl的基因組區(qū)域，BCR和ABLl以綠色顯示?？截悢?shù)估計值由紫色跡線表示。粉紅色和紫紅色箭頭顯示BCR和ABLl之間的關聯(lián)性。BCR-ABL易位和ABL-BCR易位的針對樣品特異性測序深度修正的DNA-PET信號(覆蓋范圍；見表Hl)分別以藍色和灰色顯示。垂直短劃線指示斷點的位置。‘MMR'=主要分子緩解。[0100]圖19C顯示由DNA-PET鑒定的BCR-ABLl易位的FISH驗證結果。用于BCR和ABLl的FISH探針分別標記為綠色和紅色。根據(jù)DNA-PET結果，P145顯示均衡的易位事件(二個融合物)和每一者的一個正常副本(IGlR)，P440不顯示BCR基因座和ABLl基因座之間的易位事件(2R2G)，P022顯示均衡易位和與BCR-ABL的額外副本相對應的一個額外融合物(三個融合物)以及每一者的一個正常副本(IGlR)，P098顯示BCR-ABL之間的融合物(一個融合物)和與染色體9上ABLl缺失相對應的BCR探針剩余信號(IG)以及每一者的一個正常副本(IGlR)。[0101]圖20.BIM的外顯子3含有終止密碼子和多聚腺苷化信號。BIMY的核苷酸序列和衍生氨基酸序列用右側上所示的殘基編號和堿基編號顯示。外顯子3的核苷酸序列以藍色突出顯示，并且外顯子3內部的終止密碼子(TGA)以紅色突出顯示。外顯子3中的多聚腺苷化信號(AATAAA)加下劃線顯示。[0102]圖21.與BMy相比，BML和BMS是更有力的凋亡誘導物。將BML、BMS和BIMYcDNA克隆至pcDNA3_FLAG3質粒中(KojiItahana的慷慨饋贈質粒被核轉染至KCL22細胞中并且核轉染24小時后，使用膜聯(lián)蛋白V-FITC/7-AAD染色法測量凋亡細胞的量。顯示的全部數(shù)據(jù)均是三次獨立實驗的均值(+/_均數(shù)標準誤)。[0103]圖22A至22C。siRNA介導的BMY敲減不使KCL22細胞對伊馬替尼敏感。[0104]圖22A顯示伊馬替尼在BMY敲減后對KCL22細胞的凋亡性活性。細胞用siRNA轉染24小時(U=未轉染的對照)，并且用2μM伊馬替尼處理另外48小時，并且凋亡細胞百分數(shù)由流式細胞術測定。[0105]圖22Β顯示BM的含有Ε3的轉錄物在用對照或Ε3特異性siRNA轉染的KCL22細胞中的表達水平，其通過定量實時PCR測量。統(tǒng)計顯著性由Studentt_檢驗確定。[0106]圖22C顯示與K562和KYOl相比，用對照或E3特異性siRNA轉染的KCL22細胞中含有E3的轉錄物和含有E4的轉錄物的比率。顯示的全部數(shù)據(jù)均是三次獨立實驗的均值(+/-均數(shù)標準誤)。[0107]圖23.BM缺失多態(tài)性對淋巴母細胞樣細胞系中BM基因剪接的功能性影響。通過定量實時PCR(Q-PCR)在來自7位正常HapMap個體的淋巴母細胞樣細胞系[3位不帶缺失(WT)和4位帶缺失(攜帶者)]中測量的BIM的外顯子特異性轉錄物的表達水平。含有外顯子E2A、E3或E4的各種轉錄物的水平表述為相對于E2A(對于E3和E4)或β-肌動蛋白(對于Ε2Α)的歸一化比率。這`些攜帶者之一是純合的(綠色菱形)。[0108]圖24.比較通過DNA-PET在慢性期期間和緩解后從相同患者獲得的樣品中鑒定到的dPET聚類。在患者樣品P145和P440之間比較‘低置信度聚類排除’合格的dPET聚類。聚類劃分成兩個組:在兩份樣品中均鑒定到的聚類(共享聚類)和僅在兩份樣品之一中鑒定到的聚類(獨特聚類)。在這些分組內部，顯示尺度2至50的聚類部分(fraction)。[0109]圖25A至25F是顯示HCC2279(一種攜帶BM缺失多態(tài)性的NSCLC細胞系)對吉非替尼的內在耐受性的簡圖。[0110]圖25A.使用前述方法鑒定HCC2279細胞中多態(tài)性的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠13。[0111]圖25B.具有缺失多態(tài)性(HCC2279)和不具有缺失多態(tài)性(PC9)的NSCLC細胞系中含有E3的轉錄物對含有E4的轉錄物的比率(均數(shù)+/_均數(shù)標準誤)。[0112]圖25C.在對照(DMSO)或0.5μM吉非替尼處理24小時后，PC9和HCC2279中通過Q-PCR測量的含有外顯子4的BM轉錄物的表達水平(針對β-肌動蛋白歸一化)(均數(shù)+/_均數(shù)標準誤，對于吉非替尼處理的PC9細胞，*ρ=0.0025)。[0113]圖25D.顯示BMEL(含有外顯子4和ΒΗ3結構域)和PARP在細胞裂解物中水平的蛋白質印跡，所述細胞裂解物來自對照(DMSO)或0.5μM吉非替尼處理24小時的細胞系。[0114]圖25Ε.顯示用0.5μM吉非替尼、2.5μMABT-737或這兩者處理24小時的細胞中磷酸-EGFR(p-EGFR)、PARP和胱天蛋白酶3裂解的水平的蛋白質印跡。[0115]圖25F.用0.5μΜ吉非替尼、2.5μΜΑΒΤ-737或這兩者處理48小時的PC9和HCC2279細胞的生存力。細胞生存力由臺盼藍拒染法測定并且以無藥物對照的百分數(shù)作圖。(均數(shù)+/-均數(shù)標準誤，對于吉非替尼處理和ABT-737處理的PC9細胞，*p=0.00004)。[0116]圖26是顯示BM缺失多態(tài)性預測采用EGFRTKI療法治療的EGFR-突變性非小細胞肺癌患者具有較差的無進展生存期的簡圖。確來自新加坡和日本的141位NSCLC患者中BIM缺失多態(tài)性的存在與否，其中所述患者已知在EGFR中具有激活的突變并且接受了TKI療法。使用Kaplan-Meier方法估計每個組的無進展生存期。[0117]序列表[0118]SEQIDN0:1是使用8頂_(^1_?和8頂_(^1_1?引物從具有所述缺失的BM基因擴增的PCR片段的序列(長度1，323bp)。[0119]SEQIDNO:2是使用8頂_(^1_?和BM_del_R引物從具有所述缺失的BM野生型基因擴增的PCR片段的序列(長度4，226bp)。[0120]SEQIDN0:3是Bim_del_FE向引物(+chr2:111,599,051..1ll,599,070,hgl8)的序列。[0121]SEQIDN0:4是祀111_(^1_1?反向引物(_chr2:111，603，257..111，603，276，hgl8)的序列。[0122]SEQIDNO:5是B頂:chr2:111，599，666-111，602，568(hgl8)中所述的缺失:chr2:111，598，666-111，599，665上游的1000bp側翼序列的序列。[0123]SEQIDNO:6是在B頂:chr2:111，599，666-111，602，568(hgl8)中缺失的序列。[0124]SEQIDNO:7是B頂:chr2:111，599，666-111，602，568(hgl8)中所述的缺失:chr2:111，602，569-111`，603，568下游的1000bp側翼序列的序列。[0125]發(fā)明詳沭[0126]本發(fā)明描述了我們在東亞人群體中發(fā)現(xiàn)的BIM基因內的一種新的多態(tài)性。這種多態(tài)性是與慢性髓性白血病(CML)患者中耐藥性的形成相關。[0127]患有CML并攜帶這種多態(tài)性的患者比不是這種情況的患者更可能對CML的標準療法形成耐藥性。對這種多態(tài)性的檢測可用作生物標記用于預測耐藥性和早期鑒定可能從替代性療法和/或更激進療法中獲益的患者。另外，因為BIM基因在其他癌類型中是一種療法誘導細胞死亡的重要介體，所以我們的發(fā)明也可能對東亞人群中廣泛類型的人類癌癥有意義。[0128]為了發(fā)現(xiàn)TKI耐藥機制，我們應用了一項稱作基因組配對末端雙標簽或DNA-PET的新技術(參考文獻A2、參考文獻A3)，其與高通量測序串聯(lián)以探查來自具有或沒有耐藥性的患者的CML細胞的基因組。在此過程中，我們發(fā)現(xiàn)了與BCR-ABL非依賴性TKI耐藥形成相關的BM基因中一個先前未知的缺失。具有這種缺失的患者具有BCR-ABL非依賴性TKI耐藥可能性是沒有這種缺失的患者的4至5倍(17.4%對3.9%)(p=0.04，雙尾Fisher精確檢驗)。此外，我們也已經(jīng)能夠使BM缺失的存在與否與來自患者的CML細胞系中的BCR-ABL非依賴性TKI耐藥關聯(lián)，這提示了BM缺失在TKI耐藥中的直接機制性地位。由于已知TK1-介導的CML細胞死亡需要BM蛋白的促凋亡同工型的上調(參考文獻A4-A7)，所以我們假設BM缺失破壞了促凋亡BM的表達。[0129]BM多態(tài)性[0130]我們描述了包含一個或多個BIM多態(tài)性核酸分子的分離的多核苷酸。這些多核苷酸以及相應多肽在本文中各異地描述為“BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體”或簡單地為“BM多態(tài)性”。[0131]這種分離的多核苷酸可以在多種診斷方法中使用。如本文中所述的分離的多態(tài)性BIM核酸分子可以在一種或多種以下方法中使用:a)篩查分析法；b)預測醫(yī)學(例如，診斷性測定、預后性測定、監(jiān)測性臨床試驗和藥物遺傳學)；和(3)治療方法(例如，治療性和預防性方法)。[0132]BM基因是是本領域已知的，如本文獻中其他地方所述。BM基因的來源可以是任何哺乳動物BIM基因。通常，對于診斷測定，BIM基因的動物來源將是與正在測試其核酸的動物的相同種類。[0133]分離的多態(tài)性BM核酸分子包含一個或多個BM多態(tài)性。例如，BM多態(tài)性可以按5'至3'順序包含SEQIDNO:5中所述的核苷酸序列，和緊接SEQIDN0:7中所述的核苷酸序列。這種BM多態(tài)性變體可以以缺少SEQIDN0:6中所述的核苷酸序列為特征。[0134]對于一些用途，例如，在篩查性分析中，BM多態(tài)性核酸分子將具有至少約15個核苷酸(nt),至少約18個nt,至少約20個nt,或至少約25個nt長度，并且經(jīng)常至少約50個nt。這類小DNA片段可用作聚合酶鏈反應(PCR)、雜交篩查等的引物。較大多核苷酸片段，例如、至少約50nt、至少約lOOnt、至少約200nt、至少約300nt、至少約500nt、至少約lOOOnt、至少約1500nt、多達完整編碼區(qū)，或多達完整編碼區(qū)外加距BM基因多達約1000nt的5'側翼序列和/或多達約1000nt3'側翼序列可用于產(chǎn)生編碼的多肽、啟動子基序等。為了用于擴增反應如PCR中，將使用一對引物。引物序列的確切組成不重要，但是對于大部分應用，所述引物將與主題序列在本領域已知的嚴格條件下雜交。[0135]當用作探針時，分離的多態(tài)性BM核酸分子可以包含非BM核苷酸序列，只要額外的非BIM核苷酸序列不干擾檢測試驗。探針可以包含分離的多態(tài)性BM序列，和任何數(shù)目的非BM核苷酸序列，例如，約I`bp至約Ikb或更多。[0136]出于篩查目的時，多態(tài)性序列的雜交探針可以在兩種形式均存在的情況下使用，或者在獨立的反應中，在固相基質上空間分離，或經(jīng)標記從而它們可以彼此區(qū)分。測定可以利用與一個或多個所述多態(tài)性雜交的核酸。[0137]本文所述的分離的多態(tài)性BIM核酸分子可以直接或間接地(例如，經(jīng)接頭分子)與固態(tài)基體偶聯(lián)(例如，化學綴合)。固體基體可以是本領域已知的任一種，包括但不限于珠，例如，聚苯乙烯珠；芯片，例如玻璃、二氧化硅等；塑料表面，例如，聚苯乙烯、聚碳酸酯塑料多孔板等。[0138]分離的多態(tài)性BM核酸分子可以通過化學合成或生物化學合成、通過重組DNA技術、或通過從生物來源分離核酸或前述方式之任意組合獲得。例如，可以使用本領域已知的固相合成技術合成核酸。Edge等人，(1981)Nature292:756;Duckworth等人，(1981)NucleicAcidsRes.9:1691和Beaucage和Caruthers(1981)Tet.Letters22:1859也描述了寡核苷酸合成。在制備核酸后，則將核酸連接于表達系統(tǒng)的其他元件，以產(chǎn)生包含與轉錄起始區(qū)和終止區(qū)可操作組合的編碼主題產(chǎn)物的核酸的表達盒或系統(tǒng)，所述表達盒或系統(tǒng)使所述核酸在合適條件下表達成主題多肽產(chǎn)物。[0139]可以使用本領域已知的多種方法，包括但不限于SSCP、變性HPLC和測序的任一種鑒定額外的BM基因多態(tài)性。SSCP可以用來鑒定額外的BM基因多態(tài)性。通常，選擇PCR引物和限制性酶，從而產(chǎn)生尺度范圍為約25bp至約500bp、或約IOObp至約250bp、或其中任何中間或重疊范圍的產(chǎn)物。[0140]多態(tài)性BM多肽[0141]我們進一步描述了分離的多態(tài)性BM多肽。分離的多態(tài)性BM多肽可用于篩查調節(jié)BIM多肽的生物活性的藥物的試驗中。[0142]術語“多態(tài)性BM多肽”包括由已知BM多核苷酸的開放閱讀框(ORF)編碼的氨基酸序列，包括全長天然多肽及其片段，尤其是生物活性片段和/或與功能性結構域相對應的片段，例如具有生物活性的區(qū)域或結構域等；其抗原性片段，并且包括主題多肽與其他蛋白質或其部分的融合物。BIM多肽的氨基酸序列已經(jīng)公開。見，例如上文的Moore等人。BIM多肽中的多態(tài)性通常相對于一種參考序列定義。[0143]如本文所用，“多態(tài)性BIM多肽”指具有以下對象的氨基酸序列的重組或非重組多肽的氨基酸序列:i)天然多態(tài)性BIM多肽，ii)多態(tài)性BIM多肽的片段，iii)多態(tài)性BIM多肽的多肽類似物，iv)多態(tài)性BIM多肽的變體；v)多態(tài)性BIM多肽的免疫活性片段；和vi)包含多態(tài)性BIM多肽的融合蛋白。多態(tài)性BIM多肽可以從生物樣品獲得，或來自任何來源，無論其是否為天然、合成的、半合成或重組的。[0144]術語“多態(tài)性BIM多肽”包括了包含多態(tài)性BIM多肽的至少約5個氨基酸、至少約10個氨基酸、至少約15個氨基酸、至少約25個氨基酸、至少約50個氨基酸、至少約75個氨基酸、至少約100個氨基酸、至少約200個氨基酸、至少約300個氨基酸、至少約400個氨基酸或多達整個多肽的多肽。在一些實施方案中，多態(tài)性BM多肽顯示生物活性，例如，這種多肽在體外測定中引起B(yǎng)細胞增殖和免疫球蛋白的產(chǎn)生。BIM生物活性的其他測定是本領域已知的并且可以用來測定一種多態(tài)性BM多肽是否顯示生物活性并且如果需要，則用來定量BM生物活性。BM生物學測定在各種出版物中描述，例如上文的Moore等人。[0145]多態(tài)性BM多肽可以是融合蛋白的部分。合適的融合配對體(partner)(例如，非BIM多肽，或“異源多肽”)包括但不限于提供免疫識別的異源多肽，例如，表位標簽；提供可檢測信號的異源多肽，例如，綠色熒光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶等；提供催化功能的異源多肽；和促進進入細胞的異源多肽。使用合成多肽的標準方法或使用重組方法，可以將這種融合配對體與多態(tài)性BIM多肽的N末端、C-末端或兩端符合可讀框地偶聯(lián)。[0146]多態(tài)性BIM多肽可以通過任何已知的方法，或這類方法的組合獲得，包括從天然來源分離中；通過化學合成產(chǎn)生；和通過標準重組技術產(chǎn)生。[0147]可以使用親和層析，例如，使用對B頂多肽特異的固定在固相支持物上的抗體，從生物學來源分離多態(tài)性BIM多肽。取決于表達目的，這些多肽可以根據(jù)常規(guī)方式在原核生物或真核生物中表達。為了大規(guī)模生產(chǎn)這種蛋白質，可以使用單細胞生物，如大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、與桿狀病毒載體組合的昆蟲細胞或高等生物如脊椎動物、尤其哺乳動物的細胞，例如C0S7細胞s、CHO細胞、HEK293細胞等作為表達宿主細胞。在一些情況下，想要在真核細胞中表達該基因，其中這種蛋白質將得益于天然折疊過程和翻譯后修飾。多肽隨后可以使用親和層析方法或陰離子交換體積排阻色譜方法從細胞培養(yǎng)上清液或從細胞裂解物分離，如上文所述。[0148]隨著通過使用表達宿主可大量獲得蛋白質或其片段，可以根據(jù)常規(guī)方式分離和純化蛋白質?？梢灾苽浔磉_宿主的裂解物并且使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其他純化技術純化裂解物。[0149]BM多態(tài)性的檢測[0150]通過采用多種不同方法分析DNA的多態(tài)性或突變，例如，本文所述的BM多態(tài)性。[0151]因此，可以通過本領域已知的任何手段實現(xiàn)在源自個體的多核苷酸樣品中檢測BIM多態(tài)性，所述手段包括但不限于，用特異性引物擴增序列；測定多核苷酸樣品的核苷酸序列；雜交分析；單鏈構象多態(tài)性分析；變性梯度凝膠電泳；錯配切割檢測等。也可以通過以下方式實現(xiàn)對BM多態(tài)性的檢測:檢測BIM基因的mRNA轉錄物水平的改變；BIM基因的異常修飾，例如，異常甲基化譜圖；BIMmRNA非野生型剪接樣式的存在；BIM多肽水平的改變；和/或BIM多肽生物活性的改變。[0152]樣品[0153]源自(例如，獲自)個體的多核苷酸樣品從取自該個體的生物樣品獲得。包含來自所述個體的多核苷酸的任何生物樣品都適合使用。可以加工生物樣品，從而分離多核苷酸?？蛇x地，可以在不分離其中所含多核苷酸的情況下使用完整細胞或其他生物樣品。[0154]核酸擴增[0155]可以按眾多方式通過分析多核苷酸樣品檢測BM多態(tài)性。測試核酸樣品可以用擴增已知包含BM多態(tài)性的序列區(qū)域的引物擴增?？梢灾苯邮褂没蚪MDNA或mRNA?？蛇x地，可以將目的區(qū)域克隆至合適的載體中并且培育至足以分析的量。[0156]核酸可以由常規(guī)技術如聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)等擴增，以提供足以用于分析的量。聚合酶鏈式反應的用途在多種出版物中均有描述，所述出版物包括例如，"PCRProtocols(MethodsinMolecularBiology)"(2000)J.M.S.Bartlett和D.Stirling編著，HumanaPress;和"PCRAppIications!ProtocolsforFunctionalGenomics"(1999)Innis,`Gelfand和Sninsky編著，AcademicPress。[0157]可以在擴增反應中包含可檢測的標記物。合適的標記物包括熒光物質，例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2',7'-二甲氧基-4'，5'-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2'，4',7'，4，7-六氯熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或N，N，N',N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、放射性標記物，例如32P、35S、3H等。標記物可以是一種兩階段體系，其中擴增的DNA與具有高親和力結合配偶物的生物素、半抗原等(例如抗生物素蛋白avidin)、特異性抗體等綴合，其中所述結合配偶物與可檢測標記物綴合。標記物可以與引物之一或兩種引物綴合?？蛇x地，標記在擴增中所用的核苷酸匯集物，從將標記物摻入擴增產(chǎn)物中。[0158]一旦包含BM多態(tài)性的區(qū)域已經(jīng)擴增，則可以通過核苷酸測序、通過SSCP分析，或本領域已知的任何其他方法檢測PCR產(chǎn)物中的BM多態(tài)性。[0159]核酸測序[0160]最確定的方法是將DNA或轉錄的mRNA測序(如果適用)以確定實際堿基序列(Maxam和Gilbert,1977；Sanger等人,1977)。[0161]樣品核酸可以由雙脫氧鏈終止方法或其他熟知方法測序?？梢灾苯邮褂没蚪MDNA或mRNA。如果使用mRNA，可以首先產(chǎn)生cDNA副本。如果需要，可以使用PCR擴增樣品核酸。本領域已知的多種測序反應均可以用來直接將其中已知出現(xiàn)具體多態(tài)性的BIM基因或其部分進行測序，并且通過將樣品核酸的序列與含有BM多態(tài)性的參考多核苷酸進行比較來檢測多態(tài)性?？梢允褂枚喾N自動化測序方法的任一種。見，例如W094/16101;Cohen等人,(1996)Adv.Chromatography36:127-162。[0162]雖然這種方法是最確定的，但是它也是最昂貴和最費時的方法。[0163]限制性作圖分析(RFLP分析)[0164]個體中的特定DNA序列，例如，編碼BM基因的多態(tài)性變體(BCL2L11)的基因，可以發(fā)生許多不同變化，如DNA序列的缺失、插入重復的序列、序列倒位、或單個核苷酸轉變成另一種。可以通過使用識別4-6個核苷酸的特定DNA序列的限制性酶，追蹤特定DNA序列的變化。[0165]限制性作圖分析可以因此也用于分析DNA的多態(tài)性。如果正在搜尋某位點處將改變限制性酶的識別位點的已知多態(tài)性，則可以簡單地用這種限制性酶消化DNA并在凝膠上分析片段或采用DNA印跡法測定在所述多態(tài)性的存在與否。這種類型的分析也可用于確定巨大插入或缺失的存在與否。用等位基因特異性寡核苷酸雜交是用于測定已知多態(tài)性的存在的又一種方法。[0166]限制性酶在它們的特異性識別序列處切割(消化)DNA，產(chǎn)生百萬個左右的小片。當存在使限制性酶識別的序列變成不識別序列的差異時，因切割這個區(qū)域所產(chǎn)生的DNA小片具有不同的大小。來自給定區(qū)域的各種可能片段大小因此取決于該區(qū)域內精確的DNA序列。[0167]所產(chǎn)生的片段的變異稱作“限制性片段長度多態(tài)性”(RFLP)。反映不同變異DNA序列的不同大小的片段可以通過將消化的DNA根據(jù)其大小分離進行可視化?？梢酝ㄟ^各種手段進行分級，如凝膠或毛細管電泳，尤其是丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠。[0168]例如，DNA片段可以在瓊脂糖凝膠上電泳并通過與放射性標記的DNA“探針”復性而使各個片段可視化。每位個體均可以攜帶兩種不同形式的具體序列。當兩種同源物攜帶相同形式的多態(tài)性時，見到一條帶。對于特定的DNA標記，多于兩種形式的多態(tài)性可能在群體中存，但是在一個家族中，僅可能是4種形式；來自每位親本的各兩種形式。每個子體從每位親本繼承一種形式的多態(tài)性。因此，可以追蹤每個染色體區(qū)域的來源(母系來源或父系來源)。[0169]前述技術是本領域熟知的。這些技術的詳細描述可以在多種出版物中找到，例如包括〃LaboratoryMethodsfortheDetectionofMutationsandPolymorphismsinDNA"(1997)G.R.Taylor編著，CRCPress和其中引用的參考文獻。[0170]逆轉翻譯聚合酶鏈式反應(RT-PCR)[0171]可選地或額外地，可以實施RT-PCR。通過使用對某種多態(tài)性特異的引物，PCR因此也可以用來確定這種多態(tài)性是否存在。[0172]這類方法可以包括以下步驟:從個體采集包含個體遺傳物質的生物樣品作為模板，任選地從所述生物樣品分離模板核酸(基因組DNA、mRNA或這兩者)，使模板核酸樣品與一個或多個引物接觸，所述引物與BIM多態(tài)性核酸分子特異性雜交,雜交條件使得產(chǎn)生樣品中模板核酸分子的雜交和擴增，并且相對于對照樣品，檢測擴增產(chǎn)物的存在、不存在和/或相對量并且比較長度。觀察到預期大小的擴增產(chǎn)物表示BM多態(tài)性引物內部所包含的BIM多態(tài)性存在于測試核酸樣品中。[0173]可以選擇多項參數(shù)，如雜交條件、BM多態(tài)性引物長度和多態(tài)性在BIM多態(tài)性引物內部的位置，從而使得除非引物中存在的多態(tài)性存也存在于樣品核酸中，否則雜交將不發(fā)生。本領域普通技術人員完全知曉怎樣選擇和改變這類參數(shù)。見，例如Saiki等人，(1986)Nature324:163;和Saiki等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:6230.[0174]雜交分析[0175]與變異序列的雜交也可以用來確定多態(tài)性的存在。[0176]雜交分析可以按眾多不同方式實施，包括但不限于DNA印跡、RNA印跡、斑點印跡、微陣列等。如美國專利號5，445，934中或W095/35505中所述，對照變異序列與固定于固相支持物上的寡核苷酸探針陣列的雜交譜圖也可以用作檢測變異序列存在的手段。[0177]可以通過使樣品和對照核酸與含有數(shù)百或數(shù)千個寡核苷酸探針的高密度陣列雜交，鑒定核酸樣品中的多態(tài)性。Cronin等人，(1996)HumanMutation7:244-255;和Kozal等人，(1996)NatureMed.2:753-759。[0178]質譜法[0179]美國專利號5，869，242中公開了質譜法測定已知基因內部存在多態(tài)性的用途。[0180]寡核苷酸連接[0181]可選地，利用寡核苷酸連接作為檢測多態(tài)性的手段的各種方法是本領域已知的。見，例如Riley等人，(1990)NucleicAcidsRes.18:2887-2890;和Delahunty等人，(1996)Am.JHum.Genet.58:1239-1246。[0182]單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析[0183]單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析是一種用于檢測多態(tài)性的快速且有效的方法(Dean等人,Cell61:863,1990；`Glavac和Dean,Hum.Mutation2:404,1993；Poduslo等人,Am.J.Hum.Genet.49:106，1992)。在SSCP中，凝膠上的異常鏈遷移率與基因中的突變事件相關。[0184]凝膠基質中的變性梯度凝膠電泳(DGGE)、錯配切割檢測和雜雙鏈體分析也可以用來檢測多態(tài)性。[0185]限制性核酸內切酶指紋分析(REF)[0186]也可以實施限制性核酸內切酶指紋分析(REF)，任選地在實施RT-PCR后進行。REF是單鏈構象多態(tài)性(SSCP)方法的改良形式，并且使高效檢測多達2kb長度的DNA片段中的序列改變成為可能(Liu和Sommer,1995)。[0187]多態(tài)性的遺傳分析在美國專利號5，552，28、5，654，13、5，670，33、5，807，67、5，858，66,5,691，15,5,922，57,5,972，60,6,136，53和5，955，26連同其他專利中均有詳細公開。[0188]等位基因特異性寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析[0189]另一種用于檢測具體基因上多態(tài)性的方法是以下的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)-斑點印跡分析(Conner,B.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.，U.S.A.，80,278-282(1983))。這種方法可以通過以下方式進行:使DNA片段進行斑點印跡分析，所述DNA片段能夠與寡核苷酸探針雜交，所述寡核苷酸探針特異于使用經(jīng)設計從而夾住靶多態(tài)性的正向引物和反向引物的PCR擴增的基因片段的等位基因特異。以這種方式，可以檢測到這類DNA片段上的多態(tài)性。[0190]多肽分析[0191]當多態(tài)性涉及氨基酸變化時，使用待分析基因的表達產(chǎn)物分析多態(tài)性是可能的。在這種情況下，可以使用部分蛋白質或部分肽作為用于分析的樣品，只要它含有與多態(tài)性位點相對應的氨基酸。在這種情況下，可以使用直接分析多態(tài)性位點處氨基酸的方法或免疫學方法。已知的氨基酸序列分析方法如Edman方法可以在前者中使用，而使用對基因表達產(chǎn)物具有特異結合活性的單克隆或多克隆抗體的方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA方法)、放射免疫測定法、免疫沉淀方法或免疫擴散方法，可以在后者中使用。[0192]如上文所述獲得的關于多態(tài)性的信息可以統(tǒng)計地匯總并且用于診斷疾病、檢測和區(qū)分病情的相對風險并選擇治療法。[0193]表達分析[0194]眾多方法均可用于確定特定樣品中多態(tài)性BIM核酸分子(例如，多態(tài)性BIMmRNA)或多態(tài)性BIM多肽的表達水平?？梢酝ㄟ^確定患者樣品中不存在或存在正常或異常BIMmRNA或其改變的量的眾多方法實施診斷。例如，檢測可以利用標記抗體對細胞或組織學切片的染色，所述染色按常規(guī)方法進行。使細胞透化以著染胞質分子。將目的抗體添加至細胞樣品，并孵育足以允許與表位結合的一段時間，通常至少約10分鐘。所述抗體可以用放射性同位素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑或用于直接檢測的其他標記物標記?？蛇x地，第二階段抗體或試劑用來擴大信號。這類試劑是本領域熟知的。例如，第一抗體可以與生物素綴合，添加辣根過氧化物酶綴合的抗生物素蛋白作為第二階段試劑?？蛇x地，第二抗體與熒光化合物，例如熒光素、羅丹明、德克薩斯紅等綴合。最終的檢測使用在過氧化物酶存在時發(fā)生顏色變化的底物?？梢酝ㄟ^各種方法，包括解離細胞的流式細胞術、顯微術、放射線照相術、閃爍計數(shù)等，確定是否存在抗體結合作用。也可以按普通技術人員已知的任何方式檢測和/或定量多態(tài)性BIM多肽的存在和/或其水平。[0195]此外，測試可以包括計算BMmRNA的表達。可以進行生物化學研究以確定BM編碼區(qū)或控制區(qū)中的序列多態(tài)性是否與疾病相關。疾病相關的多態(tài)性可以包括基因的缺失或截短，改變表達水平，影響蛋白質活性的突變等。[0196]啟動子或增強子序列中可能影響B(tài)M表達水平的變化可以通過各種本領域已知的方法與正常等位基因的表達水平比較。用于確定啟動子或增強子強度的方法包括量化表達的天然蛋白質；插入變異控制元件至具有提供便利定量的報道基因如β_半乳糖苷酶、螢光素酶、氯霉素乙酰轉移酶等的載體中等。[0197]篩查多態(tài)性BIM多肽中的突變可以基于蛋白質的功能特征或抗原性特征。蛋白質截短測定法可用于檢測可能影響蛋白質生物活性的缺失?？梢栽诤Y查中使用設計成檢測多態(tài)性BIM多肽中多態(tài)性的各種免疫測定法。在許多不同遺傳突變導致特定疾病表型的情況下，已經(jīng)證明功能性蛋白質測定法是有效篩查工具?？梢酝ㄟ^與缺少特定多態(tài)性的參考BM多肽比較，確定編碼的多態(tài)性BM多肽的活性。[0198]其中的BIM基因表達水平特別值得關注的診斷方法一般包括將目的樣品的BM核酸豐度與對照值比較以確定任何相對差異，其中所述差異可以定性地和/或定量地度量，所述差異隨后與異常BIM基因表達譜圖的存在與否相關。用于確定樣品中核酸豐度的多種不同方法是本領域技術人員已知的，其中感興趣的具體方法包括以下參考文獻中描述的那些:Pietu等人，GenomeRes.(1996年6月)6:492-503；Zhao等人，Gene(1995年4月24日)156:207-213；Soares,Curr.0pin.Biotechnol.(1997年10月)8:542-546；Raval,J.PharmacolToxicolMethods(1994年11月)32:125-127;Chalifour等人，Anal.Biochem(1994年2月I日)216:299-304;Stolz和Tuan,Mol.Biotechnol.(1996年12月)6:225-230;Hong等人,BioscienceReports(1982)2:907；和McGraw,Anal.Biochem.(1984)143:298。還值得關注的是W097/27317中公開的方法，所述專利的公開內容通過引用的方式并入本文。[0199]B頂(BCL2L11)[0200]BIM是也稱作BAM；BIM；B0D；BimL；BimEL；ΒΙΜ-β6；BIM-β7；BIM-α6；BCL2L11。[0201]BM基因和多肽的GenBank登錄號和UCSC基因ID如下:[0202]GeneBank登錄號:【權利要求】1.一種預測易患或患有癌癥或骨髓增生病的個體是否可能形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性的方法，所述方法包括確定所述個體是否具有BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體，所述多態(tài)性變體以5'至3'順序包含SEQIDNO:5中所述的核苷酸序列和緊接的SEQIDNO:7中所述的核苷酸序列，優(yōu)選地，其中所述BM(BCL2L11)基因多態(tài)性變體缺少SEQIDNO:6中所述的核苷酸序列。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其包括:(a)檢測包含SEQIDNO:1中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物的存在，所述擴增產(chǎn)物作為所述個體具有所述BIM(BCL2L11)基因多態(tài)性變體的指示物，或(b)檢測包含SEQIDNO:2中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物的存在，所述擴增產(chǎn)物作為所述個體缺少所述BIM(BCL2L11)基因多態(tài)性變體的指示物。3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括使用例如(a)如SEQIDNO:3中所述或(b)如SEQIDN0:4中所述或(a)和(b)組合的核苷酸序列作為引物集合時的核酸擴增產(chǎn)物。4.根據(jù)權利要求1、2或3中任一項所述的方法，其中(a)如果測定所述個體具有所述BIM(BCL2L11)基因多態(tài)性變體，則所述個體可能形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性，或其中(b)如果測定所述個體不具有所述BIM(BCL2L11)基因多態(tài)性變體，則所述個體形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性的可能性較小。5.一種為患有癌癥或骨髓增生病的個體選擇療法的方法，所述方法包括通過前述任一項權利要求所述的方法確定患者是否可能形成酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性，并且在確定所述個體可能形成這種耐藥性的情況下，選擇包括以下一種或多種的療法:(a)更頻繁地監(jiān)測所述患者；(b)更頻繁的血液檢查和骨髓檢查；(C)骨髓移植；(d)施用更強力的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，如尼洛替尼或達沙替尼；(e)施用BH3-模擬物，例如，ABT-263，例如與TKI組合；(f)增加酪氨酸激酶抑制劑例如伊馬替尼的劑量，例如超過400mg/日的標準劑量至600mg/日或800mg/日；或(g)用抑制BCL2組蛋白質的促存活作用的藥物治療。6.確定具體療法在患有癌癥或骨髓增生病的個體上取得成功的可能性的方法，所述方法包括將所述療法與通過權利要求5所述的方法確定的療法相比較。7.根據(jù)前述任一項權利要求所述的方法，其中:(a)所述癌癥或骨髓增生病包括慢性髓性白血病(CML)，并且其中酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性包括例如BCR-ABL非依賴性TKI耐藥性，如針對酪氨酸激酶抑制劑如伊馬替尼的耐藥性；(b)所述癌癥或骨髓增生病包括胃腸道間質腫瘤(GIST)，并且其中酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性包括例如c-KIT/PDGFR非依賴性TKI耐藥性，如針對酪氨酸激酶抑制劑如伊馬替尼的耐藥性；(c)所述癌癥或骨髓增生病包括非小細胞肺癌(NSCLC)，并且其中酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性包括例如EGFR非依賴性TKI耐藥性，如針對酪氨酸激酶抑制劑如厄洛替尼或吉非替尼或其他激酶抑制劑例如舒尼替尼、尼洛替尼和索拉非尼的耐藥性；(d)所述癌癥或骨髓增生病包括如選自真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化的骨髓增生病，并且其中酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥性包括例如JAK2非依賴性TKI耐藥性，如針對JAK抑制劑的耐藥性；或(e)其中所述癌癥或骨髓增生病選自:血液學惡性病、慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性髓樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生病(包括真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化)、實體瘤、小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌、黑色素瘤和神經(jīng)母細胞瘤。8.BM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體，其以5'至3'順序包含SEQIDN0:5中所述的核苷酸序列和緊接的SEQIDNO:7中所述的核苷酸序列。9.BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體，其特征在于缺少SEQIDN0:6中所述的核苷酸序列。10.如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所述的核苷酸序列，其通過例如核酸擴增可獲自權利要求8或9所述的BIM多態(tài)性變體。11.根據(jù)權利要求8或9所述的BIM(BCL2L11)基因的多態(tài)性變體或根據(jù)權利要求10所述的核苷酸序列，其在包含這種多態(tài)性的個體中與以下相關:(i)在BCR-ABL再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑對慢性髓性白血病的治療耐藥性(BCR-ABL非依賴性TKI耐藥)；(?)在c-KIT/PDGFR再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑對胃腸道間質腫瘤(GIST)的治療耐藥性(c-KIT/PDGFR非依賴性TKI耐藥)；(iii)在EGFR再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑對非小細胞肺癌(NSCLC)的治療耐藥性(EGFR非依賴性TKI耐藥)；或(iv)在JAK2再激活不存在的情況下酪氨酸激酶抑制劑對骨髓增生病的治療耐藥性(JAK2非依賴性TKI耐藥)。12.(a)如SEQIDNO:3中所述或(b)如SEQIDNO:4中所述或(a)和(b)組合的核苷酸序列，例如引物集合。13.檢測個體中存在或不存在權利要求8或9所述的BIM(BCL2L11)多態(tài)性的方法，所述方法包括檢測包含SEQIDNO:1中所述序列或SEQIDNO:2中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物，例如通過使用權利要求12所述的引物集合檢測。14.治療患有癌癥或骨髓增生病的患者的方法，所述方法包括通過權利要求1至7任一項所述的方法確定所述癌癥或骨髓增生病是否為BCR-ABL非依賴性TKI耐藥性CML癌癥、c-KIT/PDGFR非依賴性TKI耐藥性GIST癌癥、EGFR非依賴性TKI耐藥性NSCLC癌癥或JAK2非依賴性TKI耐藥性骨髓增生病，和通過實施選自權利要求5中所述的(a)至(g)的步驟治療所述患者。15.根據(jù)權利要求13或14所述的方法，其包括檢測包含SEQIDΝΟ:1中所述序列的核酸擴增產(chǎn)物，例如通過使用權利要求5所述的引物集合檢測。16.多態(tài)性變體、核苷酸序列或方法，其基本上如本文參考附圖1至26所描述和如附圖1至26中所顯示。【文檔編號】C12N15/11GK103649330SQ201180067524【公開日】2014年3月19日申請日期:2011年12月14日優(yōu)先權日:2010年12月14日【發(fā)明者】亦軍·阮,翁欣桐,吳金潘,查爾斯·順·亨·蔡,阿克塞爾·馬克西米利安·希爾默,阮文春申請人:新加坡國立大學,新加坡保健服務集團有限公司,新加坡科技研究局