試劑盒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是基因突變檢測(cè)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及試劑盒 及其用途，更具體地，涉及試劑盒、對(duì)待測(cè)結(jié)核分支桿菌預(yù)定基因預(yù)定位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測(cè)的 方法以及對(duì)待測(cè)結(jié)核分支桿菌進(jìn)行預(yù)定藥物耐藥性檢測(cè)的系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核?。═B)是當(dāng)今全球范圍對(duì)人類最具威脅性的感染性疾病之一，是單病因所 致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，全球每年死于結(jié)核病的人數(shù)接近200萬。中國是全 球結(jié)核病的重災(zāi)區(qū)，結(jié)核病發(fā)病總?cè)藬?shù)居全球第二，每年死于結(jié)核病者約25萬，結(jié)核病奪 去的生命多于其它所有傳染病所造成死亡例數(shù)的總和。耐藥結(jié)核分枝桿菌的產(chǎn)生和傳播及 結(jié)核合并HW感染是造成近年來結(jié)核病死灰復(fù)燃、卷土重來的主要原因。目前對(duì)結(jié)核病治療 主要使用化學(xué)藥物，然而由于抗結(jié)核藥物的不規(guī)范治療，病人體內(nèi)的結(jié)核菌對(duì)多種抗結(jié)核 藥物發(fā)生耐藥，從而形成耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，MDR_TB)，這 是結(jié)核病疫情重新上升的最主要的原因之一。中國結(jié)核病疫情的主要特點(diǎn)之一就是耐藥率 高，耐多藥結(jié)核病人數(shù)居全球第一。結(jié)核病耐藥問題非常突出，已成為結(jié)核病防治的一個(gè)難 題。因此深入開展結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制研宄及在此基礎(chǔ)上建立適合臨床應(yīng)用的快速耐藥 檢測(cè)方法，對(duì)于指導(dǎo)結(jié)核病臨床治療，控制耐多藥結(jié)核病的傳播，以及開發(fā)新型抗結(jié)核藥物 均具有重大的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
[0003] 目前，臨床結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)以培養(yǎng)加藥敏試驗(yàn)為主，方法可靠但費(fèi)時(shí)， 一般需要4-6周，難以滿足臨床需要。BACTEC MGIT 960系統(tǒng)是一種快速培養(yǎng)儀系統(tǒng)，在5-7 d即可獲得藥敏結(jié)果，但此法費(fèi)用較高，不利于在耐藥結(jié)核發(fā)病率高的不發(fā)達(dá)地區(qū)推廣，嚴(yán) 重影響結(jié)核病治療。為此，結(jié)核分枝桿菌耐藥性快速低費(fèi)用檢測(cè)技術(shù)研制顯得十分重要。
[0004] 然而，目前的結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0006] 近年來，相應(yīng)產(chǎn)生了許多與藥物敏感性相關(guān)的耐藥基因的研宄，結(jié)核分枝桿菌耐 藥的分子機(jī)制研宄取得了一些進(jìn)展，測(cè)定的耐藥基因有katG、inhA、rpoB、embB、mabA、ahpC、 oxyR、pncA、rrs、rpsl、gyrA和gyrB等。其中，針對(duì)臨床上最常用的異煙肼、利福平、鏈霉 素、已胺丁醇藥物，異煙肼耐藥基因?yàn)镵atG基因，利福平耐藥基因?yàn)镽poB基因，鏈霉素耐藥 基因?yàn)镽psL基因，已胺丁醇耐藥基因?yàn)閑mbB基因，其耐藥機(jī)理分別如下：異煙肼（INH)作 為一種高效特異的抗結(jié)核藥物，一種前體藥，通過KatG編碼的觸酶過氧化物酶活化產(chǎn)生游 離的自由基，然后其攻擊細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)藥物靶點(diǎn)。結(jié)核桿菌內(nèi)過氧化氫-過氧化物酶（由 KatG基因編碼）的作用下才能轉(zhuǎn)化為活性形式作用于enoyl-ACP還原酶，抑制桿菌酸和細(xì) 胞壁合成。由于KatG蛋白是唯一可以激活異煙肼的酶，所以其功能的下降或缺失必然會(huì)造 成結(jié)核菌異煙肼耐藥性，進(jìn)一步的研宄發(fā)現(xiàn)造成臨床異煙肼耐藥性的主要原因不僅是KatG 基因的完全缺失、點(diǎn)位突變、堿基的插入和缺失同樣重要。利福平（RFP)是抗結(jié)核聯(lián)合化療 中主要的一線藥物，利福平耐藥性是MDR-TB的標(biāo)志物。利福平通過與RNA聚合酶的β亞單 位（RpoB基因編碼）結(jié)合，抑制RNA聚合酶的活力，干擾分支桿菌RNA的轉(zhuǎn)錄及合成，阻礙蛋 白質(zhì)的合成而發(fā)揮抗菌作用。90%以上結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥菌株RpoB基因的利福平 耐藥確定區(qū)域（Rifampin Resistance Retermining Region，RRDR)內(nèi)存在遺傳變異。突變 類型包括單個(gè)核苷酸、缺失和插入變異。通過大量研宄表明，利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床 分離株基因突變一般發(fā)生在的RRDR區(qū)域內(nèi)一段高度保守8Ibp (507-533位27個(gè)氨基酸密 碼子處）的區(qū)域。鏈霉素（SM)是1945年發(fā)明的一種氨基糖苷類抗生素，是第一種有效的抗 結(jié)核藥物，目前仍是結(jié)核病治療的一線藥物。在抗結(jié)核藥物中，其耐藥發(fā)生率高居榜首。鏈 霉素主要通過與細(xì)菌核糖體蛋白小亞基不可逆的結(jié)合，干擾tRNA的正確定位，使mRNA錯(cuò)誤 轉(zhuǎn)譯，從而破壞翻譯過程的正常進(jìn)行，合成結(jié)構(gòu)功能異常的蛋白來發(fā)揮其殺菌作用。許多研 宄認(rèn)為大多數(shù)鏈霉素耐藥性的產(chǎn)生與RpsL基因（結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組的第 781560?781934位，全長375bp，編碼核糖體蛋白S12)，作用可能是維持讀碼過程中一些輕 微的不準(zhǔn)確性，而突變的S12蛋白卻要求與tRNA的嚴(yán)格配對(duì)，更準(zhǔn)確的表達(dá)mRNA上的每一 個(gè)密碼，從而抑制了鏈霉素誘導(dǎo)的密碼子錯(cuò)讀而表現(xiàn)為對(duì)鏈霉素的耐藥性。RpsL基因中突 變率最高的是43位密碼子和88位密碼子，總之，RpsL基因結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的主要分 子機(jī)制之一，可通過分析高頻突變而檢測(cè)大部分結(jié)核分枝桿菌對(duì)鏈霉素的耐藥性。乙胺丁 醇（EMB)是一種人工合成的阿拉伯糖類似物，是具有廣譜抗分枝桿菌活性的一線抗結(jié)核藥 物，主要作用于靶分子阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶，抑制阿拉伯糖基與阿拉伯半乳聚糖的聚合，從而 抑制細(xì)菌細(xì)胞壁分枝菌酸邛可拉伯半乳聚糖一肽聚糖復(fù)合物的形成，引起細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)改 變，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。embB基因全長約3246bp，編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶。embB基因突變使 阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其與乙胺丁醇的結(jié)合和相互作用，使乙胺丁醇失 去作用祀分子或結(jié)合力降低而無從發(fā)揮其殺菌作用，導(dǎo)致耐乙胺丁醇的產(chǎn)生。Sreevatsan 等報(bào)道在耐乙胺丁醇結(jié)核分枝桿菌中embB基因的突變率為69%，其中89%是306位密碼 子突變。這些基因的高頻突變位點(diǎn)檢測(cè)已有相關(guān)專利和商品化試劑盒，但是檢測(cè)費(fèi)用仍然 車父尚，檢測(cè)速度還有待提尚。
[0007] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于針對(duì)上述臨床上最常用的異煙肼、利福平、鏈霉素、已胺丁醇藥物，提出一種針對(duì)這4 種藥物高頻耐藥基因的位點(diǎn)開發(fā)的，費(fèi)用低、速度快的結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)技術(shù)。
[0008] 進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明首先提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施 例，該試劑盒包含：第一引物組，所述第一引物組特異性識(shí)別結(jié)核分支桿菌的KatG基因，由 第一引物對(duì)和第二引物對(duì)組成，所述第一引物對(duì)具有SEQ ID NO. 1-2所示的核酸序列，所述 第二引物對(duì)具有SEQ ID NO. 3-4所示的核酸序列；第二引物組，所述第二引物組特異性識(shí) 別結(jié)核分支桿菌的RpoB基因，由第三引物對(duì)和第四引物對(duì)組成，所述第三引物對(duì)具有SEQ ID NO. 5-6所示的核酸序列，所述第四引物對(duì)具有SEQ ID NO. 7-8所示的核酸序列；第三引 物組，所述第三引物組特異性識(shí)別結(jié)核分支桿菌的RpsL基因，由第五引物對(duì)和第六引物對(duì) 組成，所述第五引物對(duì)具有SEQ ID NO. 9-10所示的核酸序列，所述第六引物對(duì)具有SEQ ID NO. 11-12所示的核酸序列；以及第四引物組，所述第四引物組特異性識(shí)別結(jié)核分支桿菌的 embB基因，由第七引物對(duì)和第八引物對(duì)組成，所述第七引物對(duì)具有SEQ ID NO. 13-14所示的 核酸序列，所述第八引物對(duì)具有SEQ ID NO. 15-16所示的核酸序列。
[0009] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的試劑盒，能夠?qū)Υ郎y(cè)結(jié)核分枝桿菌的預(yù)定基因， 即KatG基因、RpoB基因、RpsL基因和embB基因的至少之一的核酸序列進(jìn)行有效富集，進(jìn)而 通過對(duì)富集序列進(jìn)行文庫構(gòu)建、測(cè)序、比對(duì)分析，能夠準(zhǔn)確有效確定預(yù)定基因的高頻突變位 點(diǎn)是否存在突變，從而能夠容易地判定待測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)預(yù)定基因?qū)?yīng)的藥物是否具備 耐藥性，并且判定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可重復(fù)性好，檢測(cè)過程簡單、需時(shí)少，便于推廣應(yīng)用。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種對(duì)待測(cè)結(jié)核分支桿菌預(yù)定基因預(yù)定 位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測(cè)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述預(yù)定基因預(yù)定位點(diǎn)為選自結(jié)核分支 桿菌的KatG基因315位點(diǎn)、RpoB基因526和531位點(diǎn)、RpsL基因43和88位點(diǎn)、以及embB 基因306位點(diǎn)的至少之一，該方法包括：利用前面所述的試劑盒富集待測(cè)結(jié)核分支桿菌預(yù) 定基因的核酸序列；針對(duì)富集得到的核酸序列，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫；對(duì)所述核酸測(cè)序文庫 進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果；基于所述測(cè)序結(jié)果，確定待測(cè)結(jié)核分 支桿菌預(yù)定基因的序列信息；以及基于所述待測(cè)結(jié)核分支桿菌預(yù)定基因的序列信息，確定 所述待測(cè)結(jié)核分支桿菌的預(yù)定基因預(yù)定位點(diǎn)是否存在突變。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用本發(fā)明的對(duì)待測(cè)結(jié)核分支桿菌預(yù)定基因預(yù)定位點(diǎn)進(jìn)行 突變檢測(cè)的方法，通過對(duì)待測(cè)結(jié)核分枝桿菌的預(yù)定基因即KatG基因、RpoB基因、RpsL基因 和embB基因的至少之一的核酸序列進(jìn)行有效富集，并對(duì)富集序列進(jìn)行文庫構(gòu)建、測(cè)序、比 對(duì)分析，能夠準(zhǔn)確有效確定預(yù)定基因的高頻突變位點(diǎn)是否存在突變，進(jìn)而能夠容易地判定 待測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)預(yù)定基因?qū)?yīng)的藥物是否具備耐藥性，并且判定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可重 復(fù)性好，檢測(cè)過程簡單、需時(shí)少，便于推廣應(yīng)用。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種對(duì)待測(cè)結(jié)核分支桿菌進(jìn)行預(yù)定藥物 耐藥性檢測(cè)的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述預(yù)定藥物為異煙肼、利福平、鏈霉素和已胺 丁醇，該系統(tǒng)包括：突變檢測(cè)裝置，所述突變檢測(cè)裝置適于根