專利名稱：ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體涉及一種ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
UDP-半乳糖酰胺多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAc-T)是0-型糖蛋白 糖鏈合成反應(yīng)的第一步起始糖基轉(zhuǎn)移酶，它能將N-乙酰氨基半乳糖結(jié)合到蛋白質(zhì)肽鏈 的絲氨酸或蘇氨酸上。人體中的ppGalNAc-T為一家族酶，迄今為止，己有16個成員 被研究報道，它們在人體組織中的分布和在體外多肽糖基化修飾的底物專一性上都存 在著差異。ppGalNAc-T可以作為腫瘤標(biāo)志物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞株中 有著特異性高表達(dá)的ppGalNAc-T13，它可以作為脊髓發(fā)生神經(jīng)母細(xì)胞瘤早期診斷標(biāo) 志。另外，ppGalNAc-T6可以作為乳腺癌的免疫組織化學(xué)檢測標(biāo)志。最新研究發(fā)現(xiàn) ppGalNAc-T14調(diào)控死亡受體Apo2L/TRAIL的糖基化修飾，ppGalNAc-T14的過表達(dá)能 顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。ppGalNAc-T在具有糖基轉(zhuǎn)移酶功能之外還潛在有重要的臨床意 義。現(xiàn)在，針對卯GalNAc-T參與的O-糖基化研究已成為國內(nèi)外研究的熱點。獲得各 種ppGalNAc-T的抗體，對精確定位ppGalNAc-T在組織和細(xì)胞中的分布有著重要作用， 從而更真實的反映它的生物學(xué)功能。然而ppGalNAc-T家族蛋白的同源性極高，不同 編號的卯GaNTaseT之間的同源性可達(dá)到40 % 60 %，因此保證卯GalNAc-T抗體的 特異性至關(guān)重要。
ppGalNAc-T家族蛋白為II型膜蛋白，有一個4 22個氨基酸的N端處于胞質(zhì)中， 繼以一個15 25個氨基酸的穿膜錨定結(jié)構(gòu)域，通過一個長短不一的莖部與C端伸入 高爾基體管腔內(nèi)大約450個氨基酸的催化區(qū)相連接。ppGalNAc-T18從蛋白質(zhì)一級結(jié) 構(gòu)分析上屬于UDP-半乳糖酰胺多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族基因，它與 ppGalNac-T17在氨基酸序列水平上具有54%的高結(jié)構(gòu)相似性，雖然在組織和細(xì)胞中檢 測到ppGalNAc-T18 mRNA的存在，但是目前為止還沒有檢測到它作為ppGalNAc-T的 糖基轉(zhuǎn)移酶活性，ppGalNAc-T18作為一個UDP-半乳糖酰胺多肽N-乙酰氨基半乳糖
轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)類似基因在細(xì)胞或者組織中到底發(fā)揮什么功能是本領(lǐng)域需要解決的一項 技術(shù)難題。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，有科研人員對PpGalNAc-T13抗體的制備采用了合 成多肽的方法(N Berois et al. ， ppGa皿c-T13: A New Molecular Marker of Bone Marrow Involvement in Neuroblastoma, Clinical Chemistry, 2006， 52: 1701-1712)。 該方法一般需要合成15個左右的氨基酸，它比較容易保證抗體的特異性。但是，多肽 的分子量相對較小，免疫原性較差，得到抗體比較困難。為此，通常用MAP或者KLH與 多肽偶聯(lián)，但這樣成本很高， 一般用來制備抗原的多肽要求10mg-20mg，純度要求85% 以上，這種級別的多肽合成價格為120元每個氨基酸，修飾基團(tuán)MAP的價格也在1000元 以上。較低的免疫原性和高昂的成本，限制了合成多肽方法的應(yīng)用。目前尚未見與 ppGalNAc-T18抗體制備有關(guān)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出一種ppGalNAc-T18的特異性多克 隆抗體的制備方法。在ppGalNAc-T18中選擇一段氨基酸，將其原核表達(dá)，用獲得的 抗原免疫家兔，制備得到抗體。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明涉及的一種ppGalNAc-T18特異性多 克隆抗體的制備方法，其步驟具體為
步驟一、對卯GalNAc-T18和ppGalNAc-T17的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，確定抗原序 列shortT18;
步驟二、根據(jù)抗原序列和質(zhì)粒多克隆位點設(shè)計引物，從ppGalNAc-T18全長基因 PCR產(chǎn)物中得到目的片段；目的片段經(jīng)SalI、 Notl雙酶切，割膠回收，用連接酶連 接入經(jīng)Sal I 、 Not I雙酶切的pGEX-5X-l空載體，構(gòu)成pGEX-5X-l-shortT18原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)；挑單菌落，抽 提質(zhì)粒，測序；
步驟三、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中;. 步驟四、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3); 步驟五、誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌BL21 (DE3);
步驟六、收集誘導(dǎo)后的菌體，用緩沖液振蕩混勻，超聲波破碎，離心并收集上清； 步驟七、純化得到的蛋白上清；
步驟八、用純化的蛋白對家兔進(jìn)行進(jìn)行免疫，取血，離心得到抗血清； 步驟九、純化抗血清，得到ppGalNAc-T18抗體。 步驟一中，所述抗原shortT18的氨基酸序列為
KQFQY。
步驟二中，所述引物序列為
上游引物為，5， - CAGCGGTCGACTCCGGGGGCAGGAGCCG-3，； 下游引物為，5' - GGCATGCGGCCGCTCGTACTGGAATTGCTT-3，。
步驟二中，所述PCR反應(yīng)條件為94°C 3min， 94°C 30s, 56°C 30s， 68°C 30s， 25個循環(huán)，68°C 10min;所述連接酶為Ligation High,購自于Toyobo公司，反應(yīng) 條件為16°C， 0. 5h。
步驟四中，所述氨芐青霉素篩選培養(yǎng)中氨芐青霉素使用濃度為100ug/ml，培養(yǎng) 溫度為37°C，培養(yǎng)時間為12h。
步驟四中，所述大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)基溶液組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蛋白胨 1.6%，酵母提取物1%， NaC10.5%;培養(yǎng)溫度為37。C。
步驟四中，所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3) 0D值為0.8-1.2。
步驟五中，所述誘導(dǎo)具體為加入IPTG 0. lmM -0. 5mM，誘導(dǎo)溫度為26'C，誘導(dǎo) 時間為3h -5h。
步驟六中，所述緩沖液的組分為pH值為7.3的PBS，體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-IOO， PMSF lmM。
步驟六中，所述超聲破碎具體為20次，每次5s。 步驟六中，所述離心具體為在4'C下，10000rpm離心15min。 步驟七中，所述純化的具體步驟為使用GE Healthcare公司的GSTrap HP蛋白 純化柱，先用5倍柱體積的PBS平衡該柱，接著讓蛋白上清通過該柱，再用5倍柱體 積的PBS沖洗該柱，然后用5倍柱體積的還原性谷胱甘肽溶液洗脫，還原性谷胱甘肽 溶液的組分為50mM Tris-HCl, 10mM還原性谷胱甘肽，pH值為8. 0，然后UV檢測， 收集洗脫峰。
步驟八中，所述免疫具體為每次用抗原蛋白200ng ， 2星期一次。 步驟八中，所述取血具體為在免疫后第3個月時取血。
步驟八中，所述離心具體為3000rpm，離心15分鐘。
步驟九中，所述純化步驟為使用GE Healthcare公司的Hitrap Protein A HP 抗體純化柱；先用IO倍柱體積的結(jié)合液平衡該柱，結(jié)合液成分為20mMNa3P04,其pH 值為7. 0，接著讓ppGalNAc-T18抗血清通過該柱，再用5倍柱體積的結(jié)合液沖洗該 柱，然后用5倍柱體積的洗脫液洗脫，洗脫液成分為O. 1MNa3C晶a，pH值為4.0， UV 檢測，收集洗脫峰。
本發(fā)明通過將ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T17的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，選擇 卯GalNAc-T18的莖部一段蛋白shortT18，將其克隆至pGEX-5X-1載體，使shortT18 與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)，融合蛋白作為抗原免疫家兔，獲得的抗血清經(jīng)純化 后得到抗體。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明得到的抗體是用 ppGalNAc-T18的莖部 一 段蛋白作為抗原得到的，本發(fā)明制備的抗體不與和 ppGalNAc-T18同源性極高的ppGalNAc-T17等發(fā)生交叉反應(yīng)，更不與其他ppGalNAc-T 發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明通過簡單的分子克隆實驗制備出所需的抗原，并且抗原與谷胱甘肽 -s-轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)，易于純化。本發(fā)明克服了合成多肽方法免疫原性差、價格昂貴 的缺點。本發(fā)明得到的抗體不僅可以免疫變性后的ppGalNAc-T18蛋白，而且可以免 疫具有活性的具天然構(gòu)像的ppGalNAc-T18蛋白。
本發(fā)明中所涉及的菌株大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21 (DE3)已在(汪玲玲， 楊輯，黃誠之，王海洪；大腸桿菌holo-ACP的過表達(dá)、分離純化及長鏈脂酰ACP的 合成，微生物學(xué)報，2008,48(7) :963-969)文獻(xiàn)中公開。本發(fā)明涉及的菌株可通過公 開市售的商業(yè)渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27 號航星商務(wù)樓1號樓606室。


圖1為用ppGalNAc-T18抗體和抗Flag抗體所作的Western Blotting圖，
其中a為用抗Flag抗體檢測帶Flag標(biāo)簽的ppGalNAc-T蛋白的Western Blotting 結(jié)果圖，b為用ppGalNAc-T18抗體檢測帶Flag標(biāo)簽的ppGalNAc-T蛋白的Western Blotting結(jié)果圖2為在QG56細(xì)胞中用ppGalNAc-T18抗體所做的免疫熒光染色圖3為shortT18蛋白誘導(dǎo)電泳圖4為shortT18蛋白純化電泳圖5為ppGalNAc-T18抗體純化電泳圖。
具體實施例方式
以下實例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實 施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠 商所建議的條件。
實施例1
步驟一、抗原序列的確立
在clustalW軟件中輸入卯GalNAc-T18和ppGalNAc-T17的蛋白序列進(jìn)行比對， 在ppGalNAc-T18蛋白的莖部選取一段序列shortT18作為抗原，序列為
KQFQY。
步驟二、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 確定抗原的氨基酸序列對應(yīng)的DNA序列為
AAGCAATTCCAGTAC。
根據(jù)pGEX-5X-1的多克隆位點和ppGalNAc-T18的DNA序列設(shè)計引物 上游引物為，5' - CAGCGGTCGACTCCGGGGGCAGGAGCCG-3，；下游引物為， 5， - GGCATGCGGCCGCTCGTACTGGAATTGCTT-3，。從卯GalNAc-T18全長基因中PCR 得到目的片段，PCR反應(yīng)條件為94°C 3min， 94°C 30s， 56°C 30s， 68°C 30s， 25 個循環(huán)，68°C 10min。目的片段經(jīng)Sal I 、 Not I雙酶切，割膠回收，以Ligation High 連接酶連接入經(jīng)Sal I 、 Not I雙酶切的pGEX-5X-1空載體，Ligation High連接酶購 自Toyobo公司，連接反應(yīng)條件16°C， 0. 5h。構(gòu)成pGEX-5X-1-shortT18原核表達(dá)載 體并轉(zhuǎn)化DH5a，使用含有100"g/ml氨芐青霉素的LB板，在37。C下過夜，篩選培 養(yǎng)；挑單菌落，抽提質(zhì)粒，測序。
步驟三、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中。
步驟四、在1L培養(yǎng)基溶液中保持37。C進(jìn)行培養(yǎng)，使大腸桿菌的OD值為1.0。大 腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)基溶液組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蛋白胨1.6%，酵母提取物1%， NaCl 0.5%;培養(yǎng)溫度為37。C。
步驟五、在大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)液中加入IPTG至0. 5mM， 26。C下誘導(dǎo)培 養(yǎng)3h。
步驟六、裂解大腸桿菌BL21 (DE3)
把1L誘導(dǎo)后的菌液離心收集后，用100ml Lysis buffer振蕩混勻，該緩沖液的 組分為pH值為7. 3的PBS，體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100， PMSF lmM;超聲波破 碎20次，每次5s。然后把破碎后的菌液在4。C條件下，10000rpm離心15min，收集 上清。如圖3所示，l為marker; 2為沒有用IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解后的蛋白上清；3 為用IPTG誘導(dǎo)后的菌體裂解后的蛋白上清。
步驟七、純化大腸桿菌BL21 (DE3)菌體裂解后的蛋白上清 使用GE Healthcare公司的GSTrap HP蛋白純化柱，先用5倍柱體積的PBS平衡 該柱，接著讓蛋白上清通過該柱，再用5倍柱體積的PBS沖洗該柱，然后用5倍柱體 積的還原性谷胱甘肽溶液洗脫，還原性谷胱甘肽溶液的組分為50mM Tris-HCl, 10mM 還原性谷胱甘肽，pH值為8.0，然后UV檢測，收集洗脫峰。如圖4所示，其中，1 為marker; 2為未純化的IPTG誘導(dǎo)后的菌體裂解后的蛋白上清；3為穿出峰，即未被 GSTrap HP柱結(jié)合的蛋白；4為洗脫峰，即用還原性谷胱甘肽從GSTr即HP柱上洗脫 下的蛋白，是純化的ppGalNAc-T18重組蛋白。 步驟八、用純化的抗原蛋白對家兔進(jìn)行免疫
每次用抗原蛋白200u g， 2星期一次；3個月后取血，3000rpra離心15分鐘得到 抗血清c
步驟九、純化從免疫家兔中取得的ppGalNAc-T18抗血清
使用GE Healthcare公司的Hitrap Protein A HP抗體純化柱；先用10倍柱體 積的結(jié)合液平衡該柱，結(jié)合液成分為20mM Na3P04，其pH值為7.0，接著讓 ppGalNAc-T18抗血清通過該柱，再用5倍柱體積的結(jié)合液沖洗該柱，然后用5倍柱體 積的洗脫液洗脫，洗脫液成分為0. 1M Na3C6H507 ， pH值為4. 0， UV檢測，收集洗脫峰。 如圖5所示，1為marker; 2為未純化的ppGalNAc-T18抗血清；3為純化后的 ppGalNAc-T18抗體。
本實施例所得抗體是用ppGalNAc-T18的莖部一段蛋白做抗原得到的，抗體不與 和ppGalNAc-T18同源性極高的ppGalNAC-T17等發(fā)生交叉反應(yīng)，更不與其它的 ppGalNAc-T發(fā)生反應(yīng)。所得抗體不僅可以免疫變性后的卯GalNAc-T18蛋白，而且可 以免疫具有活性的具天然構(gòu)像的ppGalNAc-T18蛋白。圖1和圖2是用Western Blotting和免疫熒光反應(yīng)來鑒定本發(fā)明的抗體。如圖1所示，a圖中1為轉(zhuǎn)染 Flag-ppGalNAc-T2質(zhì)粒的293T細(xì)胞；2為轉(zhuǎn)染Flag-ppGalNAc-T17質(zhì)粒的293T細(xì)胞； 3為轉(zhuǎn)染Flag-ppGalNAc-T18質(zhì)粒的293T細(xì)胞；b圖中1為轉(zhuǎn)染Flag-ppGalNAc-T2 質(zhì)粒的293T細(xì)胞；2為轉(zhuǎn)染Flag-卯GalNAc-T17質(zhì)粒的293T細(xì)胞；3為轉(zhuǎn)染 Flag-ppGalNAc-T18質(zhì)粒的293T細(xì)胞。圖2為在QG56細(xì)胞中用ppGalNAc-T18抗體 所做的免疫熒光染色圖。
本實施例所得卯GalNAc-T18抗體不僅可以免疫變性的卯GalNAc-T18蛋白，而且 還可以免疫細(xì)胞中具活性的ppGalNAc-T18蛋白，在QG56細(xì)胞中顯示了卯GalNAc-T18 蛋白與高爾基體的共定位。 實施例2
本實施例中步驟一到步驟四以及步驟六到步驟九均同實施例1，本實施例與實施 例l所不同之處在于步驟四中，培養(yǎng)大腸桿菌的OD值為1.2;步驟五中， 在大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)液中加入IPTG至0.3mM，誘導(dǎo)時間為4h。
本實施例所得到的抗體不與和卯GalNAc-T18同源性極高的卯GalNAc-T17等發(fā)生 交叉反應(yīng)，更不與其它的ppGalNAc-T發(fā)生反應(yīng)。所得抗體不僅可以免疫變性后的 卯GalNAc-T18蛋白，而且可以免疫具有活性的具天然構(gòu)像的ppGalNAc-T18蛋白。
實施例3
本實施例中步驟一到步驟四以及步驟六到步驟九均同實施例1，本實施例與實施 例l所不同之處在于步驟四中，培養(yǎng)大腸桿菌的0D值為0.8;步驟五中， 在大腸桿菌BL21 (DE3)培養(yǎng)液中加入IPTG至0.2mM，誘導(dǎo)時間為5h。
本實施例所得到的抗體不與和ppGalNAc-T18同源性極高的卯GalNAc-T17等發(fā)生 交叉反應(yīng)，更不與其它的ppGalNAc-T發(fā)生反應(yīng)。所得抗體不僅可以免疫變性后的 卯GalNAc-T18蛋白，而且可以免疫具有活性的具天然構(gòu)像的ppGalNAc_T18蛋白。
序列表
<110>上海交通大學(xué)
〈120〉 ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法 〈160> 4
〈170〉 Patentln Version 2.1 <210> 1 〈211〉 78 〈212〉 PRT
〈213〉人種(Homo sp.) 〈400> 1
Arg Gly Gin Glu Pro Ala Pro Asp Lys Lys Leu Glu Glu Asp Lys 15 10 15
Gly Asp Thr Leu Lys lie lie Glu Arg Leu Asp His Leu Glu Asn
20 25 30
Val lie Lys Gin His lie Gin Glu Ala Pro Ala Lys Pro Glu Glu
35 40 45
Ala Glu Ala Glu Pro Phe Thr Asp Ser Ser Leu Phe Ala His Trp
50 55 60
Gly Gin Glu Leu Ser Pro Glu Gly Arg Arg Val Ala Leu Lys Gin
65 70 75
Phe Gin Tyr
<210> 2
<211> 234
<212> DNA
〈213〉人種(Homo sp.)
CGGGGGCAGG AGCCGGCGCC CGACAAGAAG CTGGAGGAAG ACAAAGGGGA CACTCTGAAG 60
ATTATTGAGC GGCTGGACCA CCTGGAGAAT GTCATCAAGC AGCACATTCA AGAGGCTCCT 120
GCCAAGCCTG AGGAGGCAGA GGCCGAGCCC TTCACAGACT CCTCTCTGTT TGCACACTGG 180
GGCCAGGAGC TCAGCCCCGA AGGCCGGCGC GTGGCCCTGA AGCAATTCCA GTAC 234
〈210> 3 〈211〉 28 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 〈220>
<223〉 PCR上游引物 〈400〉 3
CAGCGGTCGA CTCCGGGGGC AGGAGCCG 28
〈210〉 4 <211〉 30 〈212>腿 〈213〉人工序列 <220>
〈223〉 PCR下游引物 <400> 4
GGCATGCGGC CGCTCGTACT GGAATTGCTT 30
權(quán)利要求
1、一種ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一、對ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T17的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，確定抗原序列shortT18；步驟二、根據(jù)抗原序列和質(zhì)粒多克隆位點設(shè)計引物，從ppGalNAc-T18全長基因PCR產(chǎn)物中得到目的片段；目的片段經(jīng)Sal I、Not I雙酶切，割膠回收，用連接酶連接入經(jīng)Sal I、Not I雙酶切的pGEX-5X-1空載體，構(gòu)成pGEX-5X-1-shortT18原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)；挑單菌落，抽提質(zhì)粒，測序；步驟三、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中；步驟四、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)；步驟五、誘導(dǎo)培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)；步驟六、收集誘導(dǎo)后的菌體，用緩沖液振蕩混勻，超聲波破碎，離心并收集上清；步驟七、純化得到的蛋白上清；步驟八、用純化的蛋白對家兔進(jìn)行進(jìn)行免疫，取血，離心得到抗血清；步驟九、純化抗血清，得到ppGalNAc-T18抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其 特征是，步驟一中，所述的抗原序列shortT18的氨基酸序列為RGQEPAP腦LEEDKGDTLKI IERLDHLENVIKQHIQEAPAKPEEAEAEPFTDSSLFAHWGQELSPEGRRVALKQFQY。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法， 其特征是，步驟二中，所述的引物序列為上游引物為，5， - CAGCGGTCGACTCCGGGGGCAGGAGCCG-3'; 下游引物為，5， - GGCATGCGGCCGCTCGTACTG GAATTGCTT-3，。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法， 其特征是，步驟二中，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)中氨芐青霉素使用濃度為100 u g/ml，培養(yǎng)溫度為37'C,培養(yǎng)時間為12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法， 其特征是，步驟四中，所述大腸桿菌BL21 (DE3)的0D值為0.8-1.2;大腸桿菌 BL21 (DE3)培養(yǎng)基溶液組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為蛋白胨1.6%，酵母提取物1%， NaCl 0.5%;培養(yǎng)溫度為37。C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法， 其特征是，步驟五中，所述的誘導(dǎo)具體為加入IPTG 0. lmM -0. 5mM，誘導(dǎo)溫度 為26°C，誘導(dǎo)時間為3h -5h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法， 其特征是，步驟六中，菌體振蕩所用的緩沖液組分為pH值為7.3的PBS，體積 分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100， lmM的PMSF。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法， 其特征是，步驟七中，所述純化具體步驟為使用GE Healthcare公司的GSTrap HP蛋白純化柱，先用5倍柱體積的PBS平衡該柱，接著讓蛋白上清通過該柱， 再用5倍柱體積的PBS沖洗該柱，然后用5倍柱體積的還原性谷胱甘肽溶液洗脫， 還原性谷胱甘肽溶液的組分為50mM Tris-HC1， 10mM還原性谷胱甘肽，pH值為 8.0，然后UV檢測，收集洗脫峰。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其 特征是，步驟八中，所述的取血是在對家兔免疫后第3個月時進(jìn)行。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法， 其特征是，步驟九中，所述純化的具體步驟為使用GE Healthcare公司的Hitrap Protein A HP抗體純化柱，先用10倍柱體積的結(jié)合液平衡該柱，結(jié)合液成分為 20mM Na3P04 ，其pH值為7. 0，接著讓卯GalNAc-T18抗血清通過該柱，再用5 倍柱體積的結(jié)合液沖洗該柱，然后用5倍柱體積的洗脫液洗脫，洗脫液成分為 0. 1M Na3C6H507 ， pH值為3. 0-6. 0, UV檢測，收集洗脫峰。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其具體步驟為通過序列比對確定抗原序列，構(gòu)建pGEX-5X-1-shortT18重組表達(dá)質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，在BL21(DE3)中表達(dá)目的蛋白，純化得到重組蛋白，之后用純化的蛋白免疫家兔，取血離心得到相應(yīng)的抗血清，對抗血清純化得到ppGalNAc-T18抗體。該抗體不與ppGalNAc-T18同源性極高的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，可用于細(xì)胞免疫熒光、Western Blotting檢測。
文檔編號C07K16/40GK101386650SQ20081020193
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月30日
發(fā)明者延 張, 棟 邵 申請人:上海交通大學(xué)