專利名稱：一種胡黃連苷i的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是200410098646.4發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原案申請(qǐng)日為2004年12月15日，原案發(fā)明名稱為胡黃連苷I在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用及其制劑和制備方法。本發(fā)明屬于中藥新藥研發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種胡黃連苷I的制備方法。

背景技術(shù)：
眾所周知，中國(guó)是一個(gè)乙肝疾病大國(guó)。目前，全世界估計(jì)有600種以上用于治療病毒性肝炎的藥物，但至今尚無(wú)令人滿意的治療藥物。世界衛(wèi)生組織西太平洋地區(qū)永遠(yuǎn)榮譽(yù)主席韓相泰博士表示，現(xiàn)時(shí)最常用的治療乙型肝炎藥物是細(xì)胞干擾素(Cytokine Interferon)及核苷類似物(Nucleoside Analogues)。常用的細(xì)胞干擾素包括干擾素-α，干擾素必須每天注射，副作用較多，包括出現(xiàn)頭痛及發(fā)燒等流感征狀、肌肉痛、抑郁及腹瀉等，用藥與否也取決于肝功能，若肝功能已嚴(yán)重?fù)p壞，則不適合使用干擾素。另一種細(xì)胞干擾素Peg-intron也在開始使用。至于常用的核苷類似物，則包括拉米夫定(Lamivudine)及阿德福韋(Adefovir)。拉米夫定被用作治療慢性乙型肝炎，屬口服藥物，副作用少，抑制病毒的效能高，但長(zhǎng)期服用會(huì)出現(xiàn)耐藥性，制造出變種的病毒。阿德福韋毒副作用少，此藥亦用于抑制愛(ài)滋病毒的研究，但研究發(fā)現(xiàn)大劑量服用會(huì)影響腎功能，腎功能不良者不宜使用。使用細(xì)胞干擾素與核萁類似物的缺點(diǎn)之一，都在于長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。部分調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的藥物例如胸腺肽(Thymosin)亦被發(fā)現(xiàn)有治療功效，但目前未被廣泛用作治療乙型肝炎，因?yàn)樵敿?xì)的治療功效不及其它藥物清楚，價(jià)格亦相當(dāng)昂貴。
到目前為止，沒(méi)有一種藥物對(duì)于抑制乙型肝炎有絕對(duì)效用。韓相泰博士認(rèn)為，在未來(lái)治療乙型肝炎的方法上，中草藥可以擔(dān)當(dāng)一個(gè)重要的角色。世界衛(wèi)生組織亦已將中藥治療乙型肝炎作為未來(lái)新導(dǎo)向，并希望以中西合璧作為未來(lái)的療法。因此人們把目光逐漸集中到中草藥治療乙肝上來(lái)。
中醫(yī)過(guò)去一直慣用中草藥治療乙型肝炎，應(yīng)用中藥治療肝炎已經(jīng)歷了長(zhǎng)期的實(shí)踐，也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。中草藥治療乙型肝炎價(jià)錢便宜、療效可靠而且副作用小，已越來(lái)越成為我國(guó)治療乙肝的主要藥物。乙型肝炎的中藥治療包括以下幾種方法(1)清肝利濕促進(jìn)黃疸消退；(2)活血化瘀改善肝臟微循環(huán)；(3)調(diào)理氣血調(diào)動(dòng)全身免疫機(jī)能；(4)健脾益腎改善肝炎的臨床癥狀；(5)滋陰、補(bǔ)氣，治療各種并發(fā)癥。但中草藥在治療乙型肝炎的有效性及安全性方面均欠缺科學(xué)數(shù)據(jù)。為此，迫切需要為眾多的乙型肝炎疾病患者提供藥理作用明確，藥效高，毒副作用低的治療乙型肝炎的藥物。
中藥胡黃連原出于《唐本草》謂其“大寒”，“主骨蒸勞熱，補(bǔ)脾膽，明目”?！缎滦薇静荨吩弧爸鞴钦魟跓?，補(bǔ)肝膽，明目，......厚腸胃”?！堕_寶本草》謂其“味苦、平、無(wú)毒”?！独谆馃椭扑幮越狻分校錃w經(jīng)“入肝、膽、胃三經(jīng)”?？娤Ｓ骸侗静萁?jīng)疏》曰“胡黃連，善除濕熱，......一切濕熱，邪熱，陰分伏熱所生諸病，莫不消除。”《藥品化義》曰“胡黃連，獨(dú)入血分而清熱。”《本草正義》言“濕火結(jié)聚，非此不能直達(dá)病所?！焙S連善除濕熱、消積聚，補(bǔ)肝膽，可清除慢性乙型肝炎的濕熱病邪，保肝膽以助除疫毒，為徹底治療本病提供了依據(jù)。
胡黃連是玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell干燥根莖，是多年生草本植物，生長(zhǎng)于高寒地區(qū)的巖石上及土堆中，或者淺土層的向陽(yáng)處，分布于四川西部，云南西北部、西藏南部。據(jù)文獻(xiàn)記載，胡黃連中含有環(huán)烯醚萜苷類、葫蘆素類、酚苷類，另外還含有少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黃連苷I(Picroside I)是屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物。有關(guān)胡黃連苷I的制備方法及其在制備治療乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明人采用傳統(tǒng)中醫(yī)理論和現(xiàn)代科學(xué)成果相結(jié)合，采用先進(jìn)的提取分離純化技術(shù)，從中藥胡黃連藥材中提取其治療乙肝的有效成分胡黃連苷I，使其含量超過(guò)90％，并對(duì)胡黃連苷I及其相應(yīng)的藥物制劑進(jìn)行了治療乙型肝炎的藥效學(xué)、藥理毒理學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該單體藥理作用清楚，具有抑制乙型肝炎病毒復(fù)制、保肝降酶、利膽退黃、免疫調(diào)節(jié)等效果，毒副作用極低，使用安全性高，可為廣大乙肝患者提供一種高效低毒的中藥新藥。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供胡黃連苷I的制備方法及其治療乙型肝炎的藥物劑型。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有胡黃連苷I的用于治療乙型肝炎的中藥組合物。
胡黃連苷I(Picroside I)屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物。該化合物為白色無(wú)定型粉末，易溶于水和甲醇，熔點(diǎn)100-102℃。分子式為C24H28O11，結(jié)構(gòu)式如下
本發(fā)明提供了具有工業(yè)價(jià)值的胡黃連苷I的制備方法。其分離純化方法快速、簡(jiǎn)單、實(shí)用，生產(chǎn)成本較低，極有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明提供的胡黃連苷I提取、分離、純化的方法如下 (1)提取取西藏胡黃連(Picrorhiza scrophulariiflora Pennell)和印度胡黃連(Picrorhiza kurroa Royle ex Benth)的干燥根莖或其粉碎品，用水、乙醇、丙酮等溶劑或其二種、多種混合溶劑提取，提取液在70℃以下減壓濃縮至干(或無(wú)有機(jī)溶劑)，加水至合適的體積，離心除沉淀，得上清液； (2)分離上清液通過(guò)常規(guī)處理好的吸附柱，分別用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集含薄層檢識(shí)有胡黃連苷I的洗脫液，70℃以下減壓濃縮、真空干燥，粉碎，得胡黃連苷I粗品； (3)純化將胡黃連苷I粗品用無(wú)水乙醇溶解，過(guò)濾，濾液拌入硅膠，水浴揮干溶劑，加載于硅膠柱頂端，用乙酸乙酯、丙酮或其二者的混合溶劑洗脫，收集流出液，減壓干燥，粉碎得胡黃連苷I樣品。
上述提取過(guò)程中所用的胡黃連藥材可以是純天然的藥材，也可以是人工繁殖的藥材。采用人工種植的胡黃連藥材可以保證藥材的來(lái)源穩(wěn)定，質(zhì)量可控，且可降低生產(chǎn)成本。
上述提取過(guò)程中所用的胡黃連藥材可以粉碎成10～30目大小的粒度，可以有利于有效成分的提取。
上述提取過(guò)程中所用的溶劑可以是水、乙醇、丙酮，既可以單獨(dú)使用，也可以以兩種或兩種以上的溶劑合并使用。采用的提取方法可以用回流、滲漉或者索氏提取器提取。
上述分離過(guò)程中所用的填充吸附柱的填料可以是非極性或弱極性的樹脂，如苯乙烯型(包括甲基苯乙烯型、乙基苯乙烯型)、丙烯腈型樹脂等，具體可采用D-101型、ZTC型、AB-8型等。
上述提取、分離、純化過(guò)程中的最優(yōu)條件可通過(guò)L9(34)正交表進(jìn)行正交篩選實(shí)驗(yàn)，以胡黃連苷I的含量和轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，篩選出最佳實(shí)驗(yàn)條件。
按照上述方法制得的胡黃連苷I樣品中胡黃連苷I含量在95％以上，轉(zhuǎn)移率在55％以上。提取結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明所述的胡黃連苷I在用于治療乙型肝炎時(shí)疾病時(shí)，可以單獨(dú)使用，也可以通過(guò)含有胡黃連苷I的藥物組合物的形式使用。
本發(fā)明提供的藥物組合物可按本領(lǐng)域內(nèi)已知方法制備，并可通過(guò)口服、舌下、經(jīng)皮、肌肉或皮下、皮膚粘膜、尿道、陰道或靜脈等途徑給藥。
本發(fā)明提供了以胡黃連苷I為活性成分，用于治療乙型肝炎的藥物制劑和相應(yīng)的藥物劑型。該藥物制劑是以上述胡黃連苷I為有效活性成分，并包括了藥劑學(xué)上可接受的其他輔料組分，其中所述的胡黃連苷I含量超過(guò)90％，最好高于95％。本發(fā)明的藥物制劑包括口服劑和非腸道給藥制劑，其中口服劑包括膠囊劑、口服液、口嚼劑、丸劑、片劑、顆粒劑等，非腸道給藥制劑包括注射液劑型及注射用凍干粉針劑型等。本發(fā)明的藥物制劑還包括局部給藥制劑，包括霜?jiǎng)?、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。本發(fā)明所述的劑型并不限于此。
在制備口服制劑時(shí)可選用的輔型劑可以是淀粉、糊精或環(huán)糊精、蔗糖、硬脂酸鹽等常規(guī)充填劑。在制備凍干粉針劑可以通過(guò)無(wú)菌噴霧干燥、低溫真空干燥、冷凍干燥等方法制備。各制劑的后期制備工藝及設(shè)備均屬制藥領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明對(duì)此不作限定，故在此不予詳述。
本發(fā)明的創(chuàng)造性在于通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)證明胡黃連苷I具有明顯的治療乙型肝炎的作用。為了證明胡黃連苷I對(duì)乙型肝炎有治療作用，包括對(duì)急性、慢性乙型肝炎的治療作用，發(fā)明人使用上所述方法制得的胡黃連苷I及相應(yīng)的藥物劑型，采用了不同的動(dòng)物模型，通過(guò)口服和注射途徑進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(1)對(duì)四氯化碳、D-胺基半乳糖和對(duì)乙酰氨基酚造成急性肝損傷大鼠和小鼠的肝臟有明顯的預(yù)防保護(hù)和治療作用；(2)對(duì)免疫性肝炎和四氯化碳造成慢性肝損傷大鼠的肝臟有明顯的預(yù)防保護(hù)和治療作用；(3)能明顯增加正常大鼠膽汁中的直接膽紅素含量，即有明顯的利膽作用；(4)可增加異硫氰酸-1-奈酯(ANIT)致黃疸性肝損傷小鼠血清中的直接膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量，即對(duì)異硫氰酸-1-奈酯致小鼠黃疸性肝損傷有明顯的治療作用；(5)能明顯增加正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)，對(duì)非特異性免疫功能具有明顯的增強(qiáng)作用；(6)可明顯增加在正常小鼠免疫器官重量，促進(jìn)溶血素的生成，具有增強(qiáng)體液免疫功能的作用；(7)對(duì)鴨乙型病毒性肝炎有明顯的治療作用；(8)能明顯降低2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙肝病毒表面抗原和e抗原的含量。
本發(fā)明的主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下 實(shí)驗(yàn)一注射用胡黃連苷I對(duì)D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的治療作用 通過(guò)檢測(cè)小鼠血清ALT、AST的變化來(lái)觀察注射用胡黃連苷I對(duì)D-氨基半乳糖(D-Galn)致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。取昆明種小鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、甘利欣組(50mg/kg)、注射用胡黃連甘-I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)三個(gè)劑量組，除空白對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射1000mg/kg的D-氨基半乳糖造成小鼠急性肝損傷，各給藥組于造模后1h，11h及21h按0.1mL/10g體積靜脈注射給藥，造模22h后，摘眼球取血測(cè)血清ALT、AST值，并計(jì)算肝臟系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)下表。
表1注射用胡黃連苷I對(duì)D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(

) 注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較△△△P＜0.001。
表2注射用胡黃連苷I對(duì)D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較△P＜0.05。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射用胡黃連苷I小、中、大三個(gè)劑量組與模型對(duì)照組相比，ALT、AST值均有顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
結(jié)論注射用胡黃連苷I對(duì)D-氨基半乳糖誘發(fā)的小鼠急性肝損傷有明顯的治療作用。
實(shí)驗(yàn)二注射用胡黃連苷I對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用 觀察注射用胡黃連苷I對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用。取Wistar大鼠雌雄各半，根據(jù)體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、甘利欣組(30mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)和大(10mg/kg)劑量組。各給藥組均尾靜脈注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥4周。給藥7天后，除空白對(duì)照組大鼠外，其余各大鼠均皮下注射25％CCl4花生油溶液2mL/kg，每周2次，共3周，造成慢性肝損傷模型。于末次給藥后24小時(shí)腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定血清ALT、AST、TP、ALB、MDA、SOD、GSH含量及肝糖原、肝羥脯氨酸。結(jié)果見(jiàn)下表。
表3注射用胡黃連苷I對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷血清AST、ALT的影響(

) 注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與空白對(duì)照組比較△△△P＜0.001。
表4注射用胡黃連苷I對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損TP、ALB的影響(

) 注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與空白對(duì)照組比較△△P＜0.01。
表5注射用胡黃連苷I對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷的肝糖原和肝臟羥脯氨酸的影響(

) 注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較△△△P＜0.001。
表6注射用胡黃連苷I對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷血清中MDA、SOD、GSH含量的影響(

) 注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與空白對(duì)照組比較△P＜0.05，△△△P＜0.001。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射用胡黃連苷I能明顯降低血清ALT、AST、MDA及肝羥脯氨酸，升高SOD、GSH、TP、ALB及肝糖原值，具有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001)。
結(jié)論注射用胡黃連苷I對(duì)CCl4致大鼠慢性肝損傷有明顯的預(yù)防保護(hù)作用。
實(shí)驗(yàn)三胡黃連苷I對(duì)四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的治療作用 觀察胡黃連苷I口服給藥對(duì)四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的治療作用。取Wistar大鼠采用四氯化碳(CCl4)造成慢性肝損傷后，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯組(150mg/kg)、胡黃連苷I小(15mg/kg)、中(30mg/kg)、大(60mg/kg)劑量組，并設(shè)立空白對(duì)照組平行操作。各組連續(xù)灌胃給藥，連續(xù)給藥4周。空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水。于末次給藥后24小時(shí)，各組動(dòng)物麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，分離血清，測(cè)血清ALT、AST、TP、ALB值，并取肝臟做病理組織檢查，測(cè)定肝臟羥脯氨酸及肝糖元含量。結(jié)果見(jiàn)下表。
表7胡黃連苷I對(duì)慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST、A/G的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001。
表8胡黃連苷I對(duì)慢性肝損傷大鼠肝糖元、羥脯氨酸含量及肝系數(shù)的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較，△△P＜0.01 △△△P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05 **P＜0.01***P＜0.001。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胡黃連苷I小、中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，ALT、肝羥脯氨酸明顯降低(P＜0.05)，肝糖元明顯升高(P＜0.05)；胡黃連苷I中、大劑量組與模型對(duì)照組比較AST、肝系數(shù)明顯降低，A/G比例明顯升高(P＜0.05)。病理檢查結(jié)果提示各給藥組與模型對(duì)照組比較無(wú)明顯差別。
結(jié)論胡黃連苷I對(duì)四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷有明顯的治療作用。
實(shí)驗(yàn)四注射用胡黃連苷I對(duì)正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 觀察注射用胡黃連苷I對(duì)正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。將ICR小鼠隨機(jī)分空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組(50mg/kg)、左旋咪唑組(30mmg/kg)、注射用胡黃連苷I小劑量組(5mg/kg)、中劑量組(10mg/kg)、大劑量組(15mg/kg)，共6組，環(huán)磷酰胺組每日按0.02mL/10g腹腔注射給藥，左旋咪唑組按0.2mL/10g灌胃給藥，注射用胡黃連苷I各劑量組均按0.1mL/10g體積尾靜脈注射相應(yīng)藥物，空白對(duì)照組尾靜脈注射等體積生理鹽水，每日一次，連續(xù)7天。末次給藥后24h，進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)，計(jì)算吞噬指數(shù)。同時(shí)取小鼠肝和脾臟進(jìn)行稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)下表 表9注射用胡黃連苷I對(duì)正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較△P＜0.05 △△P＜0.01 表10注射用胡黃連苷I對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器系數(shù)的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較△△△P＜0.001 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射用胡黃連苷I中、大劑量組與空白對(duì)照組比較，吞噬指數(shù)均有所上升，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異均具有顯著性(P＜0.05)，臟器系數(shù)則無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
結(jié)論注射用胡黃連苷I對(duì)非特異性免疫功能具有明顯的增強(qiáng)作用。
實(shí)驗(yàn)五注射用胡黃連苷I對(duì)正常小鼠體液免疫功能的影響 通過(guò)觀察注射用胡黃連苷I對(duì)正常小鼠溶血素生成的影響，來(lái)檢測(cè)其對(duì)體液免疫功能的影響。將ICR種小鼠按體重隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組，左旋咪唑(30mg/kg)組，環(huán)磷酰胺組(20mg/kg)組，注射用胡黃連苷I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)劑量組，其中除左旋咪唑組按0.2mL/10g灌胃給藥外，各組均按0.1mL/10g尾靜脈注射相應(yīng)藥物，連續(xù)8天。給藥第二天，各組小鼠腹腔注射CRBC懸液0.2mL，連續(xù)7天，于末次免疫后1h，取血進(jìn)行溶血素OD值測(cè)定，取胸腺、脾臟稱重、計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)下表。
表11注射用胡黃連苷I對(duì)正常小鼠免疫器官的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
表12注射用胡黃連苷I對(duì)正常小鼠溶血素含量的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與空白對(duì)照組比較注射用胡黃連苷I中、大劑量組溶血素OD值均明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異均有顯著性(P＜0.05、P＜0.001)。與空白對(duì)照組比較注射用胡黃連苷I大劑量組脾臟系數(shù)明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有非常顯著性(P＜0.01)。
結(jié)論注射用胡黃連苷I有增強(qiáng)正常小鼠體液免疫功能的作用。
實(shí)驗(yàn)六注射用胡黃連苷I對(duì)正常大鼠的利膽作用 通過(guò)觀察注射用胡黃連苷I對(duì)膽汁分泌量及膽汁中直接膽紅素含量的影響，研究注射用胡黃連苷I的利膽作用。方法 取Wistar雄性大鼠50只，體重220～240g，根據(jù)體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥苯丙醇膠丸組(250mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)和大(10mg/kg)劑量組，共5組。大鼠麻醉后打開腹腔，作膽總管插管引流膽汁，收集藥前0h～0.5h膽汁，然后分別從舌下靜脈給藥1mL/100g，收集給藥后0h～0.5h，0.5h～1.0h，1.0h～1.5h，1.5h～2.0h，2.0h～2.5h，2.5h～3.0h的膽汁流量并測(cè)定直接膽紅素含量。結(jié)果見(jiàn)下表。
表13注射用胡黃連苷I對(duì)大鼠膽汁流量的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與自身給藥前比較△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
表14注射用胡黃連苷I對(duì)大鼠膽汁直接膽紅素的影響(

) 注與空白對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與自身給藥前比較△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射用胡黃連苷I各劑量組與空白對(duì)照組相比，各時(shí)間段膽汁流量均有不同程度升高，且可明顯增加膽汁中的直接膽紅素含量(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001)。
結(jié)論注射用胡黃連苷I有明顯的利膽作用。
實(shí)驗(yàn)七注射用胡黃連苷I對(duì)異硫氰酸-1-奈酯致小鼠黃疸性肝損傷的治療作用 通過(guò)檢測(cè)小鼠血清總膽紅素(TBIL)、結(jié)合膽紅素(DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的變化來(lái)觀察注射用胡黃連苷I對(duì)黃疸性肝損傷的治療作用。昆明種小鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性茵梔黃(200mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)劑量組共6組，每組12只。除空白對(duì)照組外，其余各組均按0.1mL/10g灌服ANIT(100mg/kg)花生油溶液造成小鼠急性黃疸模型，造模后6h、24h、47h給藥三次。末次給藥后1小時(shí)(即造模后48小時(shí))，各組動(dòng)物摘眼球取血，離心血清測(cè)TBIL、DBIL、ALT、AST。取肝臟，稱重計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)下表。
表15注射用胡黃連苷I對(duì)ANIT致小鼠黃疸性肝損傷血清TBIL和DBIL的影響(

) 注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較△△△P＜0.001。
表16注射用胡黃連苷I對(duì)ANIT致小鼠黃疸性肝損傷血清ALT和AST的影響(

) 注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05；與空白對(duì)照組比較△△△P＜0.001。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射用胡黃連苷I中、大劑量組與模型對(duì)照組比較，血清TBIL、ALT值均明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理具有顯著性差異(P＜0.05)。其余各指標(biāo)與模型對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
結(jié)論注射用胡黃連苷I對(duì)小鼠黃疸性肝損傷有明顯的治療作用。
實(shí)驗(yàn)八注射用胡黃連苷I對(duì)鴨乙型病毒性肝炎的影響 觀察注射用胡黃連苷I對(duì)鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)6組，正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組(拉米夫定20mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)劑量組，除正常對(duì)照組外，其余各組均采用麻鴨乙肝模型，給藥采用靜脈途徑，分別檢測(cè)給藥前(T0)、給藥后第5天(T5)、第10天(T10)和停藥后第3天(P3)鴨血清中DHBV-DNA和前s表面抗原(DHBpresAg)的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三批。結(jié)果見(jiàn)下表。
表17注射用胡黃連苷I(HD-I)對(duì)鴨血清DHBV-DNA含量的影響 注*成對(duì)t檢驗(yàn)給藥組不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與未給藥前(T0)平均光密度值比較。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
△組間t檢驗(yàn)給藥組不同時(shí)間(T0、T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與模型組(T0、T5、T10、P3)平均光密度值比較?！鱌＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001 表19注射用胡黃連苷I(HD-I)對(duì)鴨血清DHBpresAg水平的影響 批 劑量鴨數(shù) 鴨血清DHBpresAg平均光密度值(

) 組別 次 (mg/kg) (只) T0 T5 T10 P3 模型組 121.392±0.156 1.267±0.2661.326±0.148 1.341±0.1913TC20 131.401±0.142 0.986±0.202***△△ 1.207±0.058*1.190±0.125***△ 1HD-I(小) 10 101.482±0.143 1.105±0.329*** 1.196±0.263** 1.186±0.258***HD-I(中) 20 9 1.400±0.120 0.977±0.264**△1.187±0.256*1.060±0.281**△HD-I(大) 40 101.429±0.260 0.111±0.4211.101±0.441*1.061±0.425*模型組 110.450±0.068 0.391±0.0720.392±0.059 0.397±0.0933TC20 140.434±0.077 0.400±0.0930.349±0.088** 0.320±0.0.092***△ 2HD-I(小) 10 120.507±0.077 0.449±0.1060.448±0.129 0.361±0.124**HD-I(中) 20 130.501±0.058 0.420±0.075* 0.392±0.044*** 0.396±0.079**HD-I(大) 40 140.493±0.066 0.435±0.059* 0.369±0.060*** 0.337±0.111*** 3模型組 100.741±0.079 0.732±0.0930.741±0.059 0.704±0.1123TC20 130.687±0.184 0.485±0.194***△△ 0.575±0.171**△△ 0.615±0.124*HD-I(小) 10 120.764±0.056 0.597±0.156***△ 0.614±0.111***△△ 0.607±0.116***△HD-I(中) 20 110.727±0.050 0.519±0.021***△△△ 0.636±0.106*△ 0.557±0.121***△△
注*成對(duì)t檢驗(yàn)給藥不同時(shí)間(T5、T10、P3)鴨血清DHBpresAg OD值與未給藥前(T0)OD值比較。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
△組間t檢驗(yàn)給藥組不同時(shí)間(T0、T5、T10、P3)鴨血清DHBpresAg OD值與模型組(T0、T5、T10、P3)OD值比較?！鱌＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)鴨血清中DHBV-DNA含量測(cè)定結(jié)果為三批實(shí)驗(yàn)中注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥后第5天、第10天和停藥后第3天的鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與給藥前比較有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01)；注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥后第5天、第10天和停藥后第3天的血清DHBV-DNA水平分別與相應(yīng)的模型組給藥后第5天、第10天和停藥后第3天相比均有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)，并具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。對(duì)鴨血清中DHBpresAg含量測(cè)定結(jié)果為三批實(shí)驗(yàn)中注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥后第5天、第10天和停藥后第3天的鴨血清DHBpresAg OD值與給藥前比較有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)；注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥后第5天、第10天和停藥后第3天的血清DHBpresAg水平分別與相應(yīng)的模型組給藥后第5天、第10天和停藥后第3天相比均有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)。
結(jié)論注射用胡黃連苷I體內(nèi)對(duì)鴨乙肝病毒具有較明顯的抑制作用。
實(shí)驗(yàn)九注射用胡黃連苷I對(duì)乙肝病毒抑制作用的體外研究 體外觀察注射用胡黃連苷I對(duì)乙肝病毒(HBV)是否具有抑制作用。用MTT法檢測(cè)注射用胡黃連苷I對(duì)2.2.15細(xì)胞的毒性；用ELISA方法檢測(cè)不同濃度注射用胡黃連苷I作用于2.2.15細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV相關(guān)抗原-表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的含量，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)和對(duì)抗原的半數(shù)抑制濃度(IC50)，以TC50和IC50的比值(即治療指數(shù))來(lái)評(píng)價(jià)藥物的有效性和安全性，TI＞2為安全有效。同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，空白對(duì)照組，及陽(yáng)性藥拉米夫定(3TC)組平行操作。結(jié)果見(jiàn)下表。
表20注射用胡黃連苷I對(duì)HbsAg和HBsAg的治療指數(shù) 注判定標(biāo)準(zhǔn)為TI＞2為有效；1≤TI≤2為有毒有效；TI＜1為毒性作用。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明三批實(shí)驗(yàn)注射用胡黃連苷I對(duì)HBsAg和HBeAg治療指數(shù)的平均值分別為2.97和4.83；陽(yáng)性藥拉米夫定對(duì)HBsAg的治療指數(shù)是4.83，對(duì)HBeAg沒(méi)有抑制作用。
結(jié)論注射用胡黃連苷I體外對(duì)HBV具有明顯的抑制作用。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胡黃連苷I不但具有較好的保肝降酶、利膽退黃和免疫調(diào)節(jié)作用，而且還具有顯著的抗乙肝病毒作用。
為了研究胡黃連苷I對(duì)機(jī)體可能存在的毒性作用，評(píng)價(jià)利用該單體制備成的中藥藥物的用藥安全性，本發(fā)明人進(jìn)行了一般毒性實(shí)驗(yàn)和特殊毒性實(shí)驗(yàn)。
一、一般毒性實(shí)驗(yàn) 1.急性毒性研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胡黃連苷I的注射劑型靜脈注射給藥對(duì)小鼠的LD50值為1040mg/kg，靜脈注射給藥對(duì)大鼠的LD50值為171.4mg/kg，腹腔注射給藥對(duì)大鼠的LD50為552mg/kg。藥物對(duì)動(dòng)物的重要組織和臟器無(wú)明顯急性毒性損傷。
2.長(zhǎng)期毒性研究 (1)胡黃連苷I注射劑型腹腔注射給藥對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性研究 共設(shè)4組，分別為溶劑對(duì)照組(等體積生理鹽水)，胡黃連苷I注射劑型的小40mg/(kg·d)、中150mg/(kg·d)和大300mg/(kg·d)三個(gè)劑量組，分別相當(dāng)于藥效學(xué)有效劑量的5倍、21倍、42倍。以動(dòng)物給藥前后的一般表現(xiàn)、體重、攝食量、血液學(xué)及血清生化指標(biāo)、尿常規(guī)、骨髓分類、臟器重量、臟器系數(shù)為檢測(cè)指標(biāo)，并輔以動(dòng)物各組織臟器的病理學(xué)檢查，綜合評(píng)價(jià)藥物的毒性情況。結(jié)果顯示，胡黃連苷I注射劑型大劑量組動(dòng)物體重增長(zhǎng)緩慢，其余各項(xiàng)指標(biāo)均正常。中、小劑量組動(dòng)物的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)亦未見(jiàn)明顯異常。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，三個(gè)劑量組動(dòng)物各組織臟器未見(jiàn)異常?？烧J(rèn)為中劑量以下為安全劑量。
(2)胡黃連苷I注射劑型靜脈滴注給藥對(duì)Beagle的長(zhǎng)期毒性研究 共設(shè)4組，分別為溶劑對(duì)照組(等體積生理鹽水)，胡黃連苷I注射劑型小20mg/(kg·d)、中77.46mg/(kg·d)和大150mg/(kg·d)三個(gè)劑量組。分別相當(dāng)于藥效學(xué)有效劑量的10、40和70倍。觀測(cè)指標(biāo)同上。結(jié)果顯示，大、中、小劑量組動(dòng)物各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)亦未見(jiàn)異常。病理檢測(cè)結(jié)果提示，三個(gè)劑量組動(dòng)物各重要組織臟器無(wú)明顯異常。
綜合上述兩個(gè)長(zhǎng)期毒性研究結(jié)果，我們認(rèn)為注射用胡黃連苷I毒性較低，安全范圍廣，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)藥效學(xué)有效劑量的范圍。
二、特殊毒性實(shí)驗(yàn) 1.胡黃連苷I的致突變作用研究 通過(guò)“鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)”、“中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)染色體畸變實(shí)驗(yàn)”和“小鼠骨髓嗜多染細(xì)胞微核形成實(shí)驗(yàn)”分別研究了胡黃連苷I在體外和體內(nèi)潛在的致突變性。結(jié)果表明，胡黃連苷I無(wú)論在體外還是體內(nèi)，均無(wú)明顯的直接或間接致突變作用。
2.胡黃連苷I的致畸作用研究 通過(guò)胡黃連苷I的致畸敏感期生殖毒性試驗(yàn)觀察胡黃連苷I在大鼠致畸敏感期連續(xù)給藥，是否可致畸胎發(fā)生。結(jié)果表明胡黃連苷I各劑量均無(wú)明顯的致畸作用。
綜上所述，胡黃連苷I毒副作用較小，藥理作用明確，它不但具有較好的保肝降酶、利膽退黃和免疫調(diào)節(jié)作用，而且還具有顯著的抗乙肝病毒作用，這是本發(fā)明的創(chuàng)造性所在之一，是國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品所不具備的特點(diǎn)。此外作為注射劑，該藥物起效迅速，對(duì)急性肝炎有良好的治療效果。作為口服劑，其主要優(yōu)點(diǎn)是較西藥如拉米夫定、阿西洛韋等毒性較小，宜長(zhǎng)期服用。上述實(shí)驗(yàn)證明胡黃連苷I為一種治療乙型肝炎包括急慢性乙型肝炎疾病的有效化合物，含有胡黃連苷I的藥物組合物是一味治療乙型肝炎疾病的良好藥物。
目前胡黃連可以采用人工種植的方法進(jìn)行繁殖，保證了藥材的來(lái)源穩(wěn)定，質(zhì)量可控，且大量種植與開發(fā)可降低生產(chǎn)成本。鑒于我國(guó)為乙肝大國(guó)，胡黃連苷I開發(fā)成治療乙型肝炎的藥物必將有較廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例 用以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例包含的內(nèi)容。
實(shí)施例1胡黃連苷I的制備方法 取胡黃連藥材3000g(藥材中胡黃連苷I含量3.19％)，粉碎成過(guò)10目篩的藥粉。用12倍藥材重量體積(v/w)的70％乙醇回流，所得滲漉液在60℃濃縮成相對(duì)密度為1.18～1.20的濃縮液，所得濃縮液加入水稀釋，離心，所得上清液以1.2L/Kg.h的速度通過(guò)D-101大孔吸附樹脂柱(樹脂徑∶高＝1∶10，樹脂用量為藥材重量的2.5倍)，待藥液完全流入樹脂后，依次用20倍藥材重量體積(v/w)的水、32倍藥材重量體積(v/w)15％乙醇洗脫雜質(zhì)，然后用20倍藥材重量體積(v/w)25％乙醇洗脫胡黃連苷I，收集洗脫液，60℃減壓濃縮，真空干燥，粉碎，再用無(wú)水乙醇將藥粉溶解，濾過(guò)，濾液拌入硅膠，60℃水浴揮干溶劑，加載于硅膠柱頂端(硅膠徑∶高＝1∶10，硅膠用量為1倍藥材重量)，用10倍藥材重量體積(V/W)乙酸乙酯洗脫，收集流出液，60℃減壓干燥，粉碎得胡黃連苷I樣品56.85g，胡黃連苷I含量95.24％，胡黃連苷I重量54.14g，胡黃連苷I轉(zhuǎn)移率5 6.5 7％。(注“L/Kg.h”表示每公斤藥材一小時(shí)流出液的體積數(shù)，下同。) 實(shí)施例2胡黃連苷I的制備方法 取胡黃連藥材84kg(藥材中胡黃連苷I含量3.19％)，粉碎成過(guò)10目篩的藥粉。用8倍藥材重量體積(v/w)的70％乙醇速度滲漉，所得滲漉液在60℃濃縮成相對(duì)密度為1.18～1.20的濃縮液，所得濃縮液加水稀釋，離心，所得上清液通過(guò)ZTC型樹脂柱，待藥液完全流入樹脂后，依次用18倍藥材重量體積(v/w)的水、25倍藥材重量體積(v/w)15％乙醇洗脫雜質(zhì)，然后用25倍藥材重量體積(v/w)25％乙醇洗脫，收集洗脫液，60℃減壓濃縮，真空干燥，粉碎，再用1倍藥材重量體積(v/w)無(wú)水乙醇將藥粉溶解，濾過(guò)，濾液拌入硅膠，60℃水浴揮干溶劑，加載于硅膠柱頂端，用10倍藥材重量體積(V/W)丙酮洗脫，收集流出液，60℃減壓干燥，粉碎得胡黃連苷I樣品1.55kg，胡黃連苷I含量95.30％，胡黃連苷I重量1.48kg，胡黃連苷I轉(zhuǎn)移率55.12％。
[實(shí)施例3]注射用胡黃連苷I制備工藝 處方胡黃連苷I60.0g，制成1000支。
制法取胡黃連苷I60.0g，加入注射用水約2800mL，65℃水浴使溶解，加入總配制量2.0‰活性炭(6.0g)，攪拌半小時(shí)，過(guò)濾，于濾器上加水至3000mL，繼以0.45μm、0.22μm微孔濾膜分級(jí)過(guò)濾，濾液以每瓶3mL定量分裝于10mL西林瓶中，冷凍干燥，回充高純度氮?dú)?，加塞，軋蓋，包裝，即得。
[實(shí)施例4]胡黃連苷I片劑制備工藝 處方共制成1000片，各組分及含量如下 黃連苷I30g 淀粉 180g 微晶纖維素 60g 乳糖 30g 硬脂酸鎂 1.5g 制法取胡黃連苷I樣品，其中胡黃連苷I含量超過(guò)90％，將其粉碎過(guò)80目篩，與淀粉、微晶纖維素、乳糖等混合均勻，用8％淀粉漿制軟材，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，質(zhì)檢，包裝，即得。
權(quán)利要求
1.一種胡黃連苷I的制備方法，其特征是
(1)提取取西藏胡黃連(Picrorhiza scrophulariiflora Pennell)和印度胡黃連(Picrorhiza kurroa Royle ex Benth)的干燥根莖或其粉碎品，用水、乙醇、丙酮溶劑或其二種、多種混合溶劑提取，提取液在70℃以下減壓濃縮至干，加水至合適的體積，離心除沉淀，得上清液；
(2)分離將所得的上清液通過(guò)常規(guī)處理好的吸附柱，分別用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集含薄層檢識(shí)有胡黃連苷I的洗脫液，70℃以下減壓濃縮、真空干燥、粉碎，得胡黃連苷I粗品；
(3)純化將胡黃連苷I粗品用無(wú)水乙醇溶解，過(guò)濾，濾液拌入硅膠，水浴揮干溶劑，加載于硅膠柱頂端，用乙酸乙酯、丙酮或其二者的混合溶劑洗脫，收集流出液，減壓干燥，粉碎得胡黃連苷I樣品，胡黃連苷I含量超過(guò)90％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于提取方法為回流、滲漉或者索氏提取器提取方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于分離過(guò)程中所用的填充吸附柱的填料是非極性或弱極性的樹脂，如苯乙烯型(包括甲基苯乙烯型、乙基苯乙烯型)、丙烯腈型樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于分離過(guò)程中所用的樹脂為D-101型、ZTC型、AB-8型。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥新藥研究開發(fā)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種胡黃連苷I的制備方法，該方法是采用先進(jìn)的提取分離純化技術(shù)，從中藥胡黃連藥材中提取其治療乙肝的有效成分胡黃連苷I，使其含量超過(guò)90％。本發(fā)明提供的胡黃連苷I的制備方法成本低廉、操作簡(jiǎn)便、極有利于工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H17/04GK101186627SQ20071016432
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2004年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日
發(fā)明者周亞偉 申請(qǐng)人:周亞偉