專利名稱：來源于擬南芥的缺磷誘導(dǎo)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來源于擬南芥的缺磷誘導(dǎo)基因及其編碼蛋白與其在提高植物吸磷能力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，它不僅是植物細(xì)胞中ATP、核苷酸和磷脂的重要組成成份，而且在能量轉(zhuǎn)移、蛋白激活和碳氮代謝中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用。但是，由于磷在土壤中極易被固定，因此土壤中磷的濃度非常低，大約為2-10μM，擴(kuò)散到根表面的磷更低，很難被植物利用，因而磷成為限制農(nóng)作物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的最主要缺素之一。實(shí)踐中通過大量施磷肥來滿足植物生長需要，但會(huì)引起局部水資源污染，造成水的富營養(yǎng)化和增加農(nóng)產(chǎn)品成本。因此，鑒定和分離磷高效吸收利用相關(guān)基因，研究其生物學(xué)功能，利用生物技術(shù)和遺傳學(xué)的方法，改良農(nóng)作物耐低磷能力和提高磷的吸收利用效率，對(duì)培育資源節(jié)約型的磷高效農(nóng)作物新品種，有著重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來源于擬南芥的缺磷誘導(dǎo)基因。
本發(fā)明所提供的缺磷誘導(dǎo)基因，名稱為AtAPL1(Acid phosphatase-like gene 1)，來源于擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由840個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-837位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
其基因組基因，是下述核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO3由1459個(gè)堿基組成，自5′端第44-190位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5′端第191-314位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5′端第315-436位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5′端第437-508位堿基為該基因組基因的第二個(gè)內(nèi)含子，自5′端第509-710位堿基為該基因組基因的第三個(gè)外顯子，自5′端第711-887位堿基為該基因組基因的第三個(gè)內(nèi)含子，自5′端第888-1256位堿基為該基因組基因的第四個(gè)外顯子，自5′端第1-43位堿基為該基因組基因的5’非編碼區(qū)(UTR)，自5′端第1257-1459位堿基為該基因組基因的3’非編碼區(qū)。
所述缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1的啟動(dòng)子，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動(dòng)所述缺磷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO4由1232個(gè)堿基組成。
本發(fā)明缺磷誘導(dǎo)基因的編碼蛋白(AtAPL1)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物吸磷能力功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO1由279個(gè)氨基酸殘基組成。
所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
含有本發(fā)明基因和啟動(dòng)子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增本發(fā)明基因和啟動(dòng)子中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物吸磷能力的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物吸磷能力的方法，是將所述缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1或與AtAPL1具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物吸磷能力獲得提高。
在上述提高植物吸磷能力的方法中，所述缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1既可為AtAPL1的cDNA序列，也可為AtAPL1的基因組基因序列；與AtAPL1具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列，是將AtAPL1的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長序列同樣有效地發(fā)揮作用。基因序列變化或縮短的方法，以及測試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
所述缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1或其同源序列可通過含有AtAPL1或其同源序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pJIT163-hGFP、pCAMBIA系列載體、PER8、PX6、pBI系列載體、pBin系列載體或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pUC系列載體或pBluescript系列載體等。
使用AtAPL1或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子，玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻actin1啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可為種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng)子，如2S1啟動(dòng)子(GenBank號(hào)NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank號(hào)M64633.1，GI349405)啟動(dòng)子；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受ABA、乙烯或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
其中，以pJIT163-hGFP為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有AtAPL1的植物表達(dá)載體為pBINPLUS::AtAPL1。
攜帶有本發(fā)明缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
此外，通過將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1或與AtAPL1具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官既可來源于擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草等雙子葉植物，也可來源于玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。
本發(fā)明提供了一個(gè)來源于擬南芥的缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1及其編碼蛋白。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，AtAPL1過表達(dá)株系的含磷量極顯著高于野生型植株，AtAPL1過表達(dá)后增加了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)磷的吸收，從而可改善植株的磷營養(yǎng)狀況，使得植株的株高、莢數(shù)和粒數(shù)與野生型植株相比均得到明顯增加。此外，由于過表達(dá)AtAPL1可增加植物的吸磷能力，因而在同樣的土壤肥力條件下，AtAPL1轉(zhuǎn)基因植物可以少施肥料，減少土壤污染，節(jié)約自然資源。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白將在植物，特別是油菜、棉花、小麥、水稻和番茄等糧食和經(jīng)濟(jì)作物的品種改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1A為擬南芥在缺少N、P、K、Mg、Fe不同營養(yǎng)元素脅迫處理3天后AtAPL1基因在根和葉中表達(dá)水平的RT-PCR檢測結(jié)果圖1B為擬南芥在2.5mM磷和0mM磷條件下AtAPL1基因在不同時(shí)間段根和葉中表達(dá)水平的RT-PCR檢測結(jié)果圖1C為擬南芥在不同磷濃度下處理3天后AtAPL1基因在根和葉中的表達(dá)水平的RT-PCR檢測結(jié)果圖2為含有缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1的啟動(dòng)子及GUS基因的重組載體PAtAPL1::GUS的結(jié)構(gòu)示意3為轉(zhuǎn)PAtAPL1::GUS擬南芥在正常和缺磷條件下培養(yǎng)的植株的GUS染色結(jié)果圖4為轉(zhuǎn)PAtAPL1::GUS擬南芥在缺磷條件下培養(yǎng)的植株各個(gè)組織的GUS染色結(jié)果圖5為缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1過表達(dá)載體pBINPLUS::AtAPL1的結(jié)構(gòu)示意6為5個(gè)成熟期AtAPL1過表達(dá)擬南芥株系與野生型植株地上部含磷量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。
實(shí)施例1、缺磷誘導(dǎo)基因AtAPL1的獲得在ATS培養(yǎng)基(配方5mM KNO3，2mM MgSO4，2mM Ca(NO3)2，2.5mM KH2PO4，70μMH3BO3，14μM MnCl2，1μM ZnSO4，0.5μM CuSO4，10μM NaCl，0.2μM Na2MoO4，40μM FeSO4，43mM蔗糖，4.7mM MES，8g/1000mL瓊脂，pH調(diào)成6.0)上播種擬南芥野生型Columbia，4℃春化3天后，在21℃，16h光照/8h黑暗的光照培養(yǎng)間生長7天，然后分成兩組，分別轉(zhuǎn)移至正常ATS培養(yǎng)基和缺磷的ATS培養(yǎng)基中處理3天，最后提取在兩種生長條件下的植株的根系RNA進(jìn)行擬南芥ATH1基因組芯片雜交(擬南芥芯片從Affymetrix公司購買，芯片雜交由上海晶泰生物技術(shù)有限公司完成)。對(duì)芯片雜交數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中一個(gè)基因(位點(diǎn)At1g17710)在缺磷誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)強(qiáng)度比在正常供磷條件下增加142倍。然后，對(duì)該基因序列進(jìn)行BLASTX分析，分析結(jié)果顯示該基因與番茄、水稻和擬南芥中編碼酸性磷酸酶的基因在氨基酸水平上的的同源性分別高達(dá)75％、62％和59％。因此，將該基因命名為類酸性磷酸酶基因AtAPL1(Acid phosphatase-likegene 1)。該基因位于擬南芥第一染色體，其基因組基因具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，由1459個(gè)堿基組成，自5′端第44-190位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5′端第191-314位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5′端第315-436位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5′端第437-508位堿基為該基因組基因的第二個(gè)內(nèi)含子，自5′端第509-710位堿基為該基因組基因的第三個(gè)外顯子，自5′端第711-887位堿基為該基因組基因的第三個(gè)內(nèi)含子，自5′端第888-1256位堿基為該基因組基因的第四個(gè)外顯子，自5′端第1-43位堿基為該基因組基因的5’非編碼區(qū)(UTR)，自5′端第1257-1459位堿基為該基因組基因的3’非編碼區(qū)。該基因的cDNA具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，由840個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-837位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，蛋白分子量大小約為31.6kD。
實(shí)施例2、AtAPL1專一受缺磷誘導(dǎo)表達(dá)的檢測一、不同缺素處理為檢測在擬南芥根和葉中AtAPL1基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)是否只受磷調(diào)控，對(duì)野生擬南芥幼苗分別進(jìn)行缺氮、磷、鉀、鎂、鐵處理(缺P、Mg和Fe處理方法在ATS培養(yǎng)基中分別不加KH2PO4，MgSO4和FeSO4；缺N處理方法用5mM KCl和2mM CaCl2取代ATS培養(yǎng)基中的5mM KNO3和2mM Ca(NO3)2，以補(bǔ)償培養(yǎng)基中Ca2+的濃度；缺K處理方法用2.5mM NH4NO3和2.5mM NaH2PO4取代ATS培養(yǎng)基中的5mM KNO3和2.5mM KH2PO4，以補(bǔ)償培養(yǎng)基中的N和P離子濃度)，具體方法為首先，將野生型擬南芥種子用1％的NaClO消毒15分鐘，然后用滅菌的蒸餾水清洗4次，再用1g/1000mL的瓊脂懸浮后，播種在磷含量在2.5mM的ATS正常培養(yǎng)基上。4℃春化3天后，轉(zhuǎn)移至16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗、22-24℃的培養(yǎng)間，培養(yǎng)皿垂直放置，當(dāng)擬南芥在正常加磷的ATS培養(yǎng)基中生長7天后，再將其轉(zhuǎn)移至上述分別缺N，P，K，Mg和Fe處理的ATS培養(yǎng)基和正常ATS培養(yǎng)基(對(duì)照，CK)中繼續(xù)生長3天，然后收集葉片和根系，在液氮中速凍，用Trizol試劑提取總RNA，用RT-PCR法分析AtAPL1基因的表達(dá)水平，以AtACT2為量參，其中，PCR擴(kuò)增AtAPL1的引物序列為F(上游引物)5′-GCTTCTCCCAACAATGCC-3′和R(下游引物)5′-TTCTCCTCTCCTTCCTCTGAT-3′；PCR擴(kuò)增AtACT2的引物序列為F1(上游引物)5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′和R1(下游引物)5′-CTCGGCCTTGGAGATCCACATC-3′。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1A所示，在缺氮、缺磷、缺鉀、缺鎂和缺鐵脅迫處理植株中，只有在缺磷條件下可檢測到AtAPL1基因的轉(zhuǎn)錄，證明AtAPL1基因在擬南芥根和葉中的轉(zhuǎn)錄受磷專一調(diào)控。
二、不同時(shí)間段處理把在正常ATS培養(yǎng)基生長7天的擬南芥幼苗分別轉(zhuǎn)移至正常ATS培養(yǎng)基和不加磷的ATS培養(yǎng)基生長不同時(shí)間(0小時(shí)(對(duì)照，ck)，6小時(shí)，12小時(shí)，1天，3天和5天)，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣(葉片和根系)，然后把在缺磷ATS培養(yǎng)基生長5天的幼苗重新轉(zhuǎn)移至正常加磷的ATS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長1天和3天。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取在正常ATS培養(yǎng)基和缺磷ATS培養(yǎng)基上生長幼苗的葉片和根系，在液氮中速凍，用Trizol試劑提取總RNA，用與步驟一相同的RT-PCR方法進(jìn)行AtAPL1基因的表達(dá)譜分析。分析結(jié)果如圖1B所示(“+”含磷，“-”不含磷)，缺磷后12小時(shí)AtAPL1即開始在葉片中上調(diào)表達(dá)，而在根中缺磷1天后AtAPL1上調(diào)表達(dá)，到缺磷5天后AtAPL1在根和葉中表達(dá)量達(dá)最大。當(dāng)把在缺磷培養(yǎng)基中生長5天后的植株重新轉(zhuǎn)移至磷充足的ATS培養(yǎng)基中，AtAPL1基因表達(dá)關(guān)閉，進(jìn)一步證明AtAPL1基因的轉(zhuǎn)錄受磷專一調(diào)控。
三、不同磷濃度處理為檢測培養(yǎng)基中的磷濃度對(duì)AtAPL1基因表達(dá)豐度的影響，將野生型擬南芥的種子播種在正常加磷的ATS培養(yǎng)基中生長7天后，將幼苗轉(zhuǎn)移至磷含量分別為0，0.05，0.1，0.25，1.0，2.5和10mM的ATS培養(yǎng)基中繼續(xù)生長3天，然后收集葉片和根系，在液氮中速凍，用Trizol試劑提取總RNA，用與步驟一相同的RT-PCR方法進(jìn)行AtAPL1基因的表達(dá)譜分析。分析結(jié)果如圖1C所示，在根中，AtAPL1基因只在不加磷的ATS培養(yǎng)基中生長的植株中強(qiáng)烈表達(dá)；在葉片中，未加磷時(shí)表達(dá)量最大，隨磷濃度的增加，AtAPL1基因的轉(zhuǎn)錄豐度下降，到正常供磷1mM或過量供磷10mM時(shí)還能檢測到AtAPL1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
實(shí)施例3、AtAPL1基因原位表達(dá)模式分析用Promoter-GUS轉(zhuǎn)基因的方法進(jìn)行AtAPL1基因的原位表達(dá)模式分析，具體方法包括以下步驟一、AtAPL1基因啟動(dòng)子的分離根據(jù)擬南芥的基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增AtAPL1基因啟動(dòng)子的特異引物F2(上游引物)5′-GAATTCCTTACCTCAAGAAGAGTGTCG-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoR I識(shí)別位點(diǎn))和R2(下游引物)5′-GTCGACTCTATCAGATACAATG-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Sal I識(shí)別位點(diǎn))，然后提取Columbia生態(tài)型擬南芥的基因組DNA并以此為模板，在引物F2和R2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增AtAPL1基因的啟動(dòng)子片段并在序列的兩端分別添加限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I識(shí)別位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增體系為DNA 2μl(約10ng)，10×ExTaq緩沖液2.5μl，dNTPs(2.5mM)2.0μl，引物F2(10μM)0.5μl，引物R2(10μM)0.5μl，ExTaq(5u/μl，購自TaKaRa公司)0.2μl，H2O 17.3μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)橄?4℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃1.5分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小約位1232bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化該目的片段，將其連接到pMD18-T(購自Takara公司)載體中，得到攜帶AtAPL1基因啟動(dòng)子的重組載體，對(duì)其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的AtAPL1基因啟動(dòng)子片段，具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，由1232個(gè)堿基組成，將該啟動(dòng)子命名為PAtAPL1。
二、含有PAtAPL1和GUS基因的載體PAtAPL1::GUS的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因植株的獲得1、含有PAtAPL1和GUS基因的載體PAtAPL1::GUS的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I雙酶切步驟一獲得攜帶AtAPL1基因啟動(dòng)子的重組載體，回收純化得到1232bp的啟動(dòng)子片段，再將其與經(jīng)同樣酶雙酶切的載體pCAMBIA1381(CAMBIA，Canberra，Australia)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定，得到插入序列及位置均正確的攜帶AtAPL1基因啟動(dòng)子的重組載體，將其命名為PAtAPL1::GUS，該載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示(Promoter表示PAtAPL1)。
2、PAtAPL1::GUS轉(zhuǎn)基因植株的獲得將PAtAPL1::GUS轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用擴(kuò)增啟動(dòng)子的引物F2和R2進(jìn)行菌落PCR鑒定，經(jīng)擴(kuò)增得到大小為1232bp DNA片段的為陽性克隆，對(duì)陽性克隆進(jìn)行大量培養(yǎng)，通過蘸花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，當(dāng)代收獲的為T0代轉(zhuǎn)基因種子。將T0代轉(zhuǎn)基因種子在含有50mg/L抗生素Hygromycin和150mg/LTimenten的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，得到T1代轉(zhuǎn)基因陽性植株，成熟后得到T1代種子。再將T1代種子播種在含有50mg/L抗生素Hygromycin的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)基因陽性植株成熟后得到T2代種子。最后，將T2代種子播種在含有50mg/L抗生素Hygromycin的MS培養(yǎng)基上，全部為綠苗的株系為PAtAPL1::GUS轉(zhuǎn)基因純合系，其所獲得的種子為T3代。
三、PAtAPL1啟動(dòng)GUS基因表達(dá)選步驟二獲得的5個(gè)T3代PAtAPL1::GUS轉(zhuǎn)基因純合系，將種子播種在ATS培養(yǎng)基上使其發(fā)芽，生長7天后，將幼苗分別移到正常ATS培養(yǎng)基(對(duì)照)或缺磷的ATS培養(yǎng)基(不含KH2PO4的ATS培養(yǎng)基)中繼續(xù)生長3天，然后取整株進(jìn)行GUS染色，用70％的乙醇脫綠后，進(jìn)行鏡檢觀察并照相。檢測結(jié)果如圖3所示，正常供磷條件下整株檢測不到GUS活性，而在缺磷條件下，葉片、表皮毛和根系都能檢測到很強(qiáng)的GUS活性，特別是在開花期的根、莖、葉、花和幼嫩的莢果全部檢測到很強(qiáng)的GUS活性(見圖4)，在花器官中，花萼、花絲、部分花粉粒和柱頭被染色。
實(shí)施例4、檢測過表達(dá)AtAPL1對(duì)植物的影響用下述轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)檢測過表達(dá)AtAPL1對(duì)植物的影響，具體過程包括以下步驟一、AtAPL1基因的全長CDS的獲得以缺磷處理的擬南芥根系的cDNA為模板，在引物F3(上游引物)5′-GGATCCATGGCTAAGAATAACAAC-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn))和R3(下游引物)5′-CCCGGGTCACTTGACCAAATTTAAAG-3′(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Sma I識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增兩端分別添加限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I識(shí)別位點(diǎn)的AtAPL1基因的全長cDNA片段，其中，PCR擴(kuò)增體系為cDNA 2μl(約10ng)，10x ExTaq緩沖液2.5μl，dNTPs(2.5mM)2.0μl，引物F3(10μM)0.5μl，引物R3(10μM)0.5μl，ExTaq(5u/μl)0.2μl，H2O 17.3μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)橄?4℃預(yù)變性3分鐘；然后94℃50秒，52℃50秒，72℃1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小約852bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化該目的片段，將其連接到pMD18-T(購自Takara公司)載體中，對(duì)該重組載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的AtAPL1基因全長CDS，具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，將該攜帶有AtAPL1基因全長CDS的重組載體命名為pMD18-AtAPL1。
二、利用35S強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建過表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I對(duì)步驟一獲得的攜帶有AtAPL1基因全長CDS的重組載體pMD18-AtAPL1進(jìn)行雙酶切，回收并純化852bp的AtAPL1基因全長CDS片段(帶2個(gè)酶切位點(diǎn))，將其與經(jīng)相同酶雙酶切切去hGFP的載體pJIT163-hGFP(Liu etaL.Molecular and functional characterization of sulfiredoxin homologs fromhigher plants.Cell Research(2006)16287-296)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切和菌落PCR鑒定正確的質(zhì)粒用Xho I和Kpn I雙酶切，得到帶有目的片段的中間載體片段，再與Sal I(與Xho I是同尾酶)和Kpn I雙酶切的pBINPLUS連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和Sma I雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定，得到插入序列及位置均正確的攜帶AtAPL1基因全長CDS的重組載體，將其命名為pBINPLUS::AtAPL1，該載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示。
三、AtAPL1轉(zhuǎn)基因株系生育性狀及含磷量的統(tǒng)計(jì)將pBINPLUS::AtAPL1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，用擴(kuò)增全長CDS的引物F3和R3進(jìn)行菌落PCR鑒定，經(jīng)擴(kuò)增得到大小為852bp(帶2個(gè)酶切位點(diǎn))DNA片段的為陽性克隆，對(duì)陽性克隆進(jìn)行大量培養(yǎng)，通過蘸花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)3代篩選獲得5個(gè)AtAPL1基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合系(OE22-8、OE28-12、OE34-2、OE8-7和OE25-1)，當(dāng)植株接近成熟時(shí)，調(diào)查這5個(gè)AtAPL1過表達(dá)株系與野生型植株的生育性狀(株高、單株莢數(shù)和單莢粒數(shù))，每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)10-20株，平行測3次，其中3個(gè)過表達(dá)株系OE28-12、OE34-2和OE25-1的株高與野生型植株的差異達(dá)到顯著水平，而且這3個(gè)過表達(dá)株系的單株莢數(shù)顯著高于野生型植株(Col)，所有過表達(dá)株系的單莢粒數(shù)(單株所有莢的平均粒數(shù))極顯著高于野生型植株(見表1，**表示過表達(dá)株系與野生型之間的差異達(dá)1％的極顯著水平，*表示過表達(dá)株系與野生型之間的差異達(dá)5％的顯著水平)。測定上述AtAPL1過表達(dá)株系和野生型植株的含磷量，結(jié)果如圖6所示(**表示過表達(dá)株系與野生型之間的差異達(dá)1％的極顯著水平，*表示過表達(dá)株系與野生型之間的差異達(dá)5％的顯著水平)，其中4個(gè)AtAPL1過表達(dá)株系的含磷量極顯著高于野生型植株，說明基因AtAPL1過表達(dá)后增加了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)磷的吸收，從而改善了植株的磷營養(yǎng)狀況，使得植株的株高、莢數(shù)和粒數(shù)也得到明顯增加。
表1 5個(gè)AtAPL1基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合系的株高、單株莢數(shù)和單莢粒數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

序列表<160>4<210>1<211>279<212>PRT<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Ala Lys Asn Asn Asn Ile Val Ile Val Phe Asp Phe Asp Lys Thr1 5 10 15Ile Ile Asp Val Asp Ser Asp Asn Trp Val Val Asp Glu Leu Gly Phe20 25 30Thr Asp Leu Phe Asn Gln Leu Leu Pro Thr Met Pro Trp Asn Ser Leu35 40 45Met Asn Arg Met Met Lys Glu Leu His Asp His Gly Lys Thr Ile Glu50 55 60Glu Ile Lys Gln Val Leu Arg Arg Ile Pro Ile His Pro Arg Val Ile65 70 75 80Pro Ala Ile Lys Ser Ala His Ala Leu Gly Cys Glu Leu Arg Ile Val85 90 95Ser Asp Ala Asn Thr Leu Phe Ile Glu Thr Ile Ile Glu His Leu Gly100 105 110Ile Gly Glu Phe Phe Ser Glu Ile Asn Thr Asn Pro Gly Leu Val Asp115 120 125Glu Gln Gly Arg Leu Ile Val Ser Pro Tyr His Asp Phe Thr Lys Ser130 135 140Ser His Gly Cys Ser Arg Cys Pro Pro Asn Met Cys Lys Gly Leu Ile145 150 155 160Ile Asp Arg Ile Gln Ala Ser Leu Thr Lys Glu Gly Lys Thr Ser Lys165 170 175
Met Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Ala Gly Asp Tyr Cys Pro Ser Leu Gly180 185 190Leu Lys Ala Glu Asp Tyr Met Met Pro Arg Lys Asn Phe Pro Val Trp195 200 205Asp Leu Ile Ser Gln Asn Pro Met Leu Val Lys Ala Thr Val Arg Asp210 215 220Trp Thr Asp Gly Glu Asp Met Glu Arg Ile Leu Met Glu Ile Ile Asn225 230 235 240Glu Ile Met Ser Ser Glu Glu Gly Glu Glu Asn Asp Lys Met Leu Ser245 250 255Ser Glu Asn Cys Lys Ile Ser Val Gly Ile Val His Glu Pro Ile Gln260 265 270Val Pro Leu Asn Leu Val Lys275<210>2<211>840<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2atggctaaga ataacaacat cgtgatcgtc ttcgattttg acaagacaat catcgatgta 60gacagcgata attgggtcgt ggatgaactt ggtttcactg atttgttcaa ccagcttctc120ccaacaatgc cttggaactc tctcatgaat cggatgatga aggagcttca tgatcatggt180aaaaccattg aagaaatcaa acaagtcctt aggagaatcc caattcatcc acgtgtcatc240ccagccatca aatctgctca tgctttaggg tgcgagctga gaatagtgag cgacgcaaac300acgttgttca tcgaaacaat cattgaacat ctcgggattg gtgagttttt ctccgagatt360aacacaaatc caggacttgt agatgaacaa ggaagattaa tagtctctcc ttaccatgac420ttcaccaaat cttctcatgg ttgctctcgt tgccctccta acatgtgcaa gggtttaata480atcgatagga ttcaagcttc tctaacgaaa gaagggaaga cgagcaagat gatctatctt540ggagatggtg ctggtgatta ctgtcccagt cttggactca aagctgaaga ttacatgatg600ccaaggaaga atttcccggt ttgggatttg attagtcaaa atcccatgtt ggttaaggct66a
accgttagag attggaccga tggagaagat atggagagga tactaatgga aataatcaac720gaaattatgt catcagagga aggagaggag aatgacaaga tgttgagctc tgaaaactgc780aagatatctg ttgggattgt tcatgaacct attcaagttc ctttaaattt ggtcaagtga840<210>3<211>1459<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3gaaatcgata aaacagtacc tataaaacat tgtatctgat agaatggcta agaataacaa 60catcgtgatc gtcttcgatt ttgacaagac aatcatcgat gtagacagcg ataattgggt120cgtggatgaa cttggtttca ctgatttgtt caaccagctt ctcccaacaa tgccttggaa180ctctctcatg gtttgttttg ttcatccatc tctaactctt ctctgtttcg gtttctctag240ggctttgtta cgttggtcta tatatgttca tcagtcataa cactaaatcc ttatttggtt300ttatttcaaa acagaatcgg atgatgaagg agcttcatga tcatggtaaa accattgaag360aaatcaaaca agtccttagg agaatcccaa ttcatccacg tgtcatccca gccatcaaat420ctgctcatgc tttagggtaa aaatccatgt taaattcctc attcttcgtt tgataacacg480gtactgaatc atacgacata atatttaggt gcgagctgag aatagtgagc gacgcaaaca540cgttgttcat cgaaacaatc attgaacatc tcgggattgg tgagtttttc tccgagatta600acacaaatcc aggacttgta gatgaacaag gaagattaat agtctctcct taccatgact660tcaccaaatc ttctcatggt tgctctcgtt gccctcctaa catgtgcaag gtactgcagt720tacactaatc tcatattgat tgattagttc aaaagataag atttgtcatt actattttca780gggattttgg gaaacttttt ggtgtaaaat atattatctt tgattctgtt atgagtcaat840atggacctat ctgtgtgcta aattaatact aaattttgtt tatacagggt ttaataatcg900ataggattca agcttctcta acgaaagaag ggaagacgag caagatgatc tatcttggag960atggtgctgg tgattactgt cccagtcttg gactcaaagc tgaagattac atgatgccaa 1020ggaagaattt cccggtttgg gatttgatta gtcaaaatcc catgttggtt aaggctaccg 1080ttagagattg gaccgatgga gaagatatgg agaggatact aatggaaata atcaacgaaa 1140ttatgtcatc agaggaagga gaggagaatg acaagatgtt gagctctgaa aactgcaaga 1200tatctgttgg gattgttcat gaacctattc aagttccttt aaatttggtc aagtgattga 1260tgaaaacaag aaattgaaga tttttgtttt gtattcgaga tattcttcat gcaattatgt 1320
aagatgtcta aagatgaatg gttcatgcac gttaagtgat ttcttttttt tgtatacgta1380attaagggat ctccttcgga ggagcgtcta gctaccacgg aagcttaatg ggctcatttt1440tcgtatcact tctttaatt 1459<210>4<211>1232<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>4cttacctcaa gaagagtgtc gagggcaaca ttaatattac gtaacttaat ttgatttctg 60ctaagaaaaa tgaaatgttt gccaattgag gtagtggatg cagtgaaatg tagttttttc120gtggtgccac aagatttaca actagatata aaatattatg ttccttgttc tatatcacaa180tctaaagaca cgaggaagag aaataaaaga agcttgtttt gatgcgtctc ttctgataat240gtctgataga agtatattat tttatagata gaggattaca cacacacaca cacatttgtt300ttgttgtcat gctaagactt gtttggttag aatactttta attgttattg aagaaatcaa360atacagatga atattgaaag atgtggctac caaatgaaaa gatgatgtga tccttaaccc420ctagaatatt ctttctgctt acaattgtga tttgtcactc aatattcctt ccaagttgca480accttattcc ttcctagtgc cttctgatgc aattcccata tatttcgata aatttcatgt540ttttaagttt aaatccaatc gagtatgaat gttgtggttt ttacaattaa ctttatcgat600caaatgtgtg acataaagca actatcccat gcacatttat ttatttttca tcccatgata660aatcaaaact tattcatacg ataaacacca atatattcat tttgcatttt ttactttttt720tgggttgcgt attaaaagaa aaataaacct ttttgggtaa cggattttat tttcctttaa780taaaaatgaa aataatgacg aaaacgcata aataggtgga atattctttt tttttatctt840attccattcc ggtgtcttct caaatctcaa ctgcctaaat cccactaaat aaaactttta900acaagccaaa ctaaataata cccacaaaat aaaccaaaga gtcatcaaca ccgttggatc960agtataccta gtcaatgttt gacacataaa cgtcatcaga tctaacggtt caaaagatac 1020gaatcatatc agattaggat tcttaattat ctatcttacc ttgcgtttga cggtaagtaa 1080tattccaatg gcatcttcct cgaaagatcc ctattcgtct ctagcctttt caccttctct 1140cactcgtata tatatcacat tcttcttctc caaattccat aatcatacag aaatcgataa 1200aacagtacct ataaaacatt gtatctgata ga 123權(quán)利要求
1.來源于擬南芥的缺磷誘導(dǎo)基因，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于其基因組基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述基因編碼的蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物吸磷能力功能的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1或2所述基因的啟動(dòng)子，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有啟動(dòng)所述缺磷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求1或2所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
6.含有權(quán)利要求4所述啟動(dòng)子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
7.一種提高植物吸磷能力的方法，是將權(quán)利要求1或2所述缺磷誘導(dǎo)基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物吸磷能力獲得提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述缺磷誘導(dǎo)基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列通過含有該基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pJIT163-hGFP、p3301、PER8、PX6、pBI系列載體、pBin系列載體、pCAMBIA系列載體、pUC系列載體或pBluescript系列載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體為pBINPLUS::AtAPL1。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)來源于擬南芥的缺磷誘導(dǎo)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)擬南芥的缺磷誘導(dǎo)基因及其編碼蛋白與其在提高植物吸磷能力中的應(yīng)用。該基因的cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物吸磷能力功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白將在植物，特別是油菜、棉花、小麥、玉米、水稻和番茄等經(jīng)濟(jì)作物的品種改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101050462SQ20071006508
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日
發(fā)明者趙婷, 凌宏清 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所