專利名稱：擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擬南芥的質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的應(yīng)用，屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鉀在煙株體內(nèi)是多種酶的活化劑，細胞內(nèi)有50多種酶或完全依賴于K+或受K+的激活，K+可調(diào)節(jié)植株的許多生理功能，如增強光合作用，增強植株體內(nèi)物質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運，提高植株抗性，維持細胞膨壓，調(diào)節(jié)氣孔的運動，提高CO2的同化率，促進光合作用和光合產(chǎn)物的運輸，明顯提高煙株體內(nèi)糖的含量，糖含量的增加既能提高細胞的滲透勢，增強抗旱能力，又能使冰點下降，減少霜凍危害，提高抗寒性。鉀還對增強作物抗病蟲能力也有明顯作用，鉀可使細胞壁增厚，提高細胞壁木質(zhì)化程度，阻止或減少病原菌的入侵和昆蟲的危害，同時增強植物根系的吸鉀能力對于提高鉀肥利用率具有重要意義。
鉀含量是優(yōu)質(zhì)煙葉的指標之一，隨著煙葉含鉀量提高，煙氣中煙草熱分解產(chǎn)物種類和數(shù)量顯著減少，致香物質(zhì)增多，焦油等有害物質(zhì)減少，從而降低了卷煙制品對人體健康的影響。調(diào)查資料表明不同產(chǎn)區(qū)煙葉含鉀量差異直接反應(yīng)了煙葉品質(zhì)差異，美國煙葉的含鉀量一般為4-5％，巴西為3-4％，而我國煙葉的平均含鉀量為1-2％，很少超過2％。一般認為優(yōu)質(zhì)烤煙煙葉含鉀量應(yīng)大于2.5％，我國煙葉含鉀量過低已成為制約我國煙草科技發(fā)展的技術(shù)難題。
H+-ATPase也稱Na+-K+泵，其功能是把新陳代謝所產(chǎn)生的過剩H+泵出胞外，在維持細胞內(nèi)H+濃度的同時，與通道蛋白協(xié)同作用維持細胞內(nèi)高K+低Na+的內(nèi)部環(huán)境，Nass等從酵母上分離到NHX1基因，證實該基因在液泡膜上編碼H+-ATPase質(zhì)子泵基因，Gaxiola等從擬南芥上克隆AtNHX1基因，向酵母營養(yǎng)缺陷性中導(dǎo)入AtNHX1基因可恢復(fù)其耐鹽能力，Aspe等(1999)將帶有強啟動子的AtNHX1基因?qū)缛霐M南芥獲得AtNHX1基因高度表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥，Zhang和Blumwald研究發(fā)現(xiàn)AtNEX1轉(zhuǎn)化番茄可表現(xiàn)明顯的抗鹽性。
目前未有關(guān)于擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是公開來自擬南芥的質(zhì)子泵基因具有提高轉(zhuǎn)化植物根系吸鉀能力的功能。
本發(fā)明的第二個目的是提供進行擬南芥的質(zhì)子泵基因轉(zhuǎn)化的高效植物表達載體。
本發(fā)明的第三個目的是提供通過基因修飾手段(轉(zhuǎn)擬南芥的質(zhì)子泵基因AtNHX1)提高煙葉含鉀量方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的應(yīng)用。
本發(fā)明公開了擬南芥AtNHX1基因具有增強植株根系吸鉀能力的功能，發(fā)現(xiàn)將該基因?qū)霟煵菘梢燥@著提高轉(zhuǎn)化煙草材料的煙葉含鉀量，最高的煙草品系煙葉含鉀量可提高到4.59％，而同品種未轉(zhuǎn)化煙草煙葉含鉀量僅為1.3％，增加幅度達到極顯著，這一研究成果對于煙草行業(yè)提高煙葉品質(zhì)、增加香氣、降低焦油等有害物質(zhì)具有重要意義。
一種進行擬南芥的質(zhì)子泵基因轉(zhuǎn)化的高效植物表達載體，它包含序列表SeQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明通過BamHI和SacI雙酶切和T4連接酶將AtNHX1基因插入具有相同酶切位點的表達載體中，構(gòu)建了植物表達雙元載體pYF6588，該載體保留了雙元載體的主要元件，包括來源于廣宿主載體pVS1的復(fù)制區(qū)域(pVS1 rep)和復(fù)制穩(wěn)定區(qū)域(pVS1 sta)以及T-DNA的左右邊界序列。在新構(gòu)建的載體上，外源基因表達單元附加了一個煙草染色質(zhì)附著SAR序列，利于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳；用CaMV 35S+TMV Omega leader sequence控制帶Catalase基因內(nèi)含子的Km抗性基因的表達，作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標記基因；用煙草的Ubi.U4基因啟動子控制帶Catalase基因內(nèi)含子的GUS基因表達，作為報告基因，用帶Ω翻譯增強子的雙CaMV 35S啟動子和nos終止子控制AtNHX1基因的表達，增強了基因的表達效率。
一種提高植物根系吸鉀能力、增加葉片含鉀量的方法，包括1)構(gòu)建AtNHX1植物表達載體，它包含序列表中SeQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)將含AtNHX1基因的植物表達載體導(dǎo)入植物細胞；獲得吸鉀能力增強的轉(zhuǎn)基因后代，包括植物各部分組織。
根據(jù)擬南芥AtNHX1基因結(jié)構(gòu)區(qū)域，應(yīng)用生物軟件設(shè)計該基因閱讀框序列引物，將擬南芥幼根總RNA反轉(zhuǎn)錄，并以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用PCR方法擴增得到約1700bp的特異片段，將片段切膠回收后插入測序載體，并進行序列分析，在GenBank網(wǎng)中查詢與曾報道的擬南芥AtNHX1基因序列完全一致，通過BamHI和SacI雙酶切、T4連接酶構(gòu)建AtNHX1基因的植物表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對煙草進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了Km抗性轉(zhuǎn)基因煙草26株(T0代)，經(jīng)目的基因引物PCR和GUS染色檢測陽性材料23株，對各轉(zhuǎn)化材料的T1代煙葉含鉀量檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化材料的煙葉含鉀量顯著提高。
本發(fā)明采用的提高植物吸鉀能力的方法是把基因轉(zhuǎn)化到植物細胞中，轉(zhuǎn)化的植物細胞再生成小植株。
其中的植物可以是雙子葉也可以是單子葉植物，但由于鉀含量對煙葉香氣和煙氣中焦油含量關(guān)系密切，所以對煙草作為受體植物意義更大。其轉(zhuǎn)化過程是通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，采用葉盤法進行。
本發(fā)明的優(yōu)點是首次發(fā)現(xiàn)并公開了擬南芥的質(zhì)子泵基因具有提高轉(zhuǎn)化植物根系吸鉀能力的功能，并提供了含有該基因的植物表達載體的構(gòu)建方法和提高植物含鉀量的方法。本發(fā)明能夠有效解決我國煙葉含鉀量過低這個制約我國煙草科技發(fā)展的技術(shù)難題。
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作的本領(lǐng)域任何等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


圖1為植物表達載體pYF6588的構(gòu)建方法圖。
圖2為AtNHX1基因表達載體pYF6588的結(jié)構(gòu)圖。
圖3為AtNHX1基因表達載體的菌落PCR圖。
圖4為AtNHX1表達載體的酶切驗證圖。
圖5為轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色鑒定6為轉(zhuǎn)AtNHX1基因煙草植株的PCR擴增圖。
圖7為轉(zhuǎn)化材料幼根RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物熒光定量PCR分析圖。
圖8為AtNHX1基因熒光定量PCR標準曲線圖。
具體實施例方式
實施例涉及的材料及來源1.擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞種，由上海農(nóng)科院提供；2.煙草(Nicotiana tabacum)品種龍煙911，K326由黑龍江煙草研究所提供；3.T/A克隆載體pMD18-T購自TAKARA公司，pCAMBIA-1201質(zhì)粒、DH5α大腸桿菌菌株由上海農(nóng)科院保存，遺傳轉(zhuǎn)化用的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404購自美國Clontech公司。
4.總RNA提取試劑盒、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒純化柱、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、Ex-taq耐高溫DNA聚合酶、脫氧核糖核酸酶DNase I、熒光定量PCR試劑SYBRRT-PCR Kit購自TaKaRa公司，其它主要化學(xué)試劑為美國Sigma公司或國產(chǎn)AR級試劑。
實施例1設(shè)計AtNHX1基因相關(guān)引物1.用于擴增擬南芥的質(zhì)子泵基因(AtNHX1)的引物序列上游5’-AAAGGATCCAACATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAAC-3’ SEQ ID No.3下游5’-AAAGAGCTCTCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGGG-3’SEQ ID No.4引物5’端分別設(shè)計BamHI和SacI的酶切位點；2.用于轉(zhuǎn)化材料PCR檢測引物序列AtNHX1-Z5′-CGGTCTGATAAGTGCGTATG-3′SEQ ID No.5AtNHX1-F5′-GTTCTGGTGCGGTAATAGGT-3′SEQ ID No.6擴增片段長度為650bp；3.用于mRNA轉(zhuǎn)化煙草的熒光定量PCR擴增引物AtNHX1-SA5′-CCTATTACCGCACCAGAACG-3′SEQ ID No.7AtNHX1-SB5′-GGTCGCATGAAGGAGTCATC-3′SEQ ID No.8實施例2擬南芥總RNA提取與純化取擬南芥幼根1g加液氮在研缽中研碎成粉末狀，放入1.5ml微量離心管中；用Promega總RNA提取試劑盒提取總RNA，按說明書操作，凝膠電泳判斷所提取RNA質(zhì)量。
實施例3AtNHX1基因的PCR合成以實施例2獲得的擬南芥總RNA提取物為模板，用Oligo DT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用擬南芥質(zhì)子泵基因(AtNHX1)的閱讀框的上游和下游引物， Ex-taq DNA聚合酶按常規(guī)反應(yīng)條件進行PCR擴增。
實施例4擴增產(chǎn)物測序?qū)CR擴增產(chǎn)物與T-載體(pMD18-T)連接，轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)藍白斑篩選的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并對酶切鑒定正確的片段進行核苷酸全序列測定，擬南芥的質(zhì)子泵基因為SEQ ID No.1所示的堿基序列，其閱讀框核苷酸序列長度為1617bp，其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)如序列表中SeQ ID No.2所示的氨基酸序列，為538個氨基酸。
實施例5構(gòu)建植物表達載體參閱圖1和圖2所示，通過BamHI和SacI雙酶切，將AtNHX1基因從克隆載體pMD18-T上切下，利用T4連接酶插入具有相同酶切位點的pCAMBIA-1201載體中，構(gòu)建AtNHX11基因的植物雙元載體pYF6588。
實施例6農(nóng)桿菌細胞的轉(zhuǎn)化與鑒定取200μl感受態(tài)細胞于eppendorf管；加入10μg質(zhì)粒DNA，混勻；冰浴30分鐘，立即放入液氮中冰凍5分鐘；立即放入37℃水浴5分鐘；加入YEB培養(yǎng)基1mL，28℃，150rpm搖床培養(yǎng)2-3小時；在YEB固體培養(yǎng)基(kan 50mg/L，rif 50mg/L)涂板；28℃下暗培養(yǎng)2-3天；對單菌落進行菌落PCR擴增、將菌落PCR表現(xiàn)陽性的菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行BamHI和SacI限制性內(nèi)切酶酶切驗證，結(jié)果見圖3和圖4。取酶切驗證陽性的菌液700μl，加入等體積甘油，在-70℃長期保存。
實施例7農(nóng)桿菌的活化挑取含外源基因插入的農(nóng)桿菌單菌落于3ml YEP培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)到OD600≈0.9，500rpm離心5min，收集沉淀重懸在新鮮YEP中，繼續(xù)培養(yǎng)到OD600≈0.5，然后進行植物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株篩選。
實施例8轉(zhuǎn)化煙草采用葉盤法，取無菌苗葉片剪成約5mm×5mm的小塊，置于50ml OD值0.3-0.5的農(nóng)桿菌液中感染5-8min后取出，置于滅菌過的濾紙上吸干，放置在9cm培養(yǎng)皿的兩層濾紙中間，滴入MSO液體培養(yǎng)基，保持濕潤，22℃黑暗共培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)接到第一次篩選培養(yǎng)基(含6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Km 50mg/L+Cb 250mg/L)上光照培養(yǎng)20d，再轉(zhuǎn)到第二次篩選培養(yǎng)基(含6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Km 100mg/L+Cb 250mg/L)上光照培養(yǎng)30d，取第二次篩選培養(yǎng)后抗性芽葉片少許，按Jefferson方法進行GUS染色鑒定，切下GUS染色陽性芽插入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Km 25mg/L+Cb 25mg/L)上光照培養(yǎng)30d，即可生根形成陽性苗。自然光溫下練苗3-5天移栽到育苗缽中，成活后移栽到溫室中。
實施例9轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色鑒定通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草品種K326 AtNHX1基因遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得Km抗性轉(zhuǎn)基因煙草26株(T0代)，其中經(jīng)目的基因引物PCR、Southern雜交、熒光定量PCR分析和GUS染色陽性材料23株(見圖5)。
實施例10AtNHX1轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定以抽提的GUS染色陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株總DNA為模板，以AtNHX1Z和AtNHX1F為引物，通過PCR擴增檢測轉(zhuǎn)基因植株中的AtNHX1基因。PCR擴增條件94℃ 6min預(yù)變性后，94℃30s變性，62℃退火40s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃后終延伸10min，擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖6所示，其PCR片段與引物擴增DNA片段相吻合，證明外源基因被整合到煙草基因組中。PCR擴增的結(jié)果顯示，45株GUS染色陽性煙草植株中DNA38株可擴增出650bp左右的特異性擴增片段，證明AtNHX1基因已成功導(dǎo)入煙草基因組中。
實施例11轉(zhuǎn)化材料中AtNHX1基因的轉(zhuǎn)錄水平隨機從PCR擴增和GUS染色陽性不同轉(zhuǎn)化材料中取6個轉(zhuǎn)化單株，將其煙苗幼根總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與拷貝數(shù)為105、104、103、102、101標準參比DNA和未轉(zhuǎn)化DNA提取物同時進行熒光定量PCR擴增，擴增結(jié)果如圖7所示。
根據(jù)標準參比DNAS1、S2、S3、S4、S5和S0所建立的Ct值與DNA拷貝數(shù)的標準曲線如圖8所示，直線回歸方程為Y＝-23X+8.56； 相關(guān)系數(shù)r2＝0.991，由此計算出各PCR反應(yīng)液中所含目標序列的拷貝數(shù)，見表1。
表1各轉(zhuǎn)化材料幼根mRNA水平

由表1數(shù)據(jù)可以看出，未轉(zhuǎn)化對照沒有出現(xiàn)熒光信號，導(dǎo)入的AtNHX1基因在6個轉(zhuǎn)化煙草材料的T1代幼根中均有mRNA轉(zhuǎn)錄，且轉(zhuǎn)化株2、4、3、6、1、5號之間mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異不大，說明AtNHX1基因已在煙草基因組中成功轉(zhuǎn)錄。
實施例12煙葉含鉀量的測定各T0代轉(zhuǎn)化材料溫室培養(yǎng)分別采種，將各材料的T1代種子育苗，移栽前分株取樣提取DNA進行AtNHX1基因PCR檢測，陽性煙苗移栽至隔離圃，并以同品種未轉(zhuǎn)化煙草做對照，取樣測定土壤肥力指標，確定施肥水平為氮(45kg/ha)、磷(90kg/ha)、鉀(135kg/ha)，每小區(qū)30株，按小區(qū)采收，取第7-12片葉烘烤后，隨機取中檸3等級樣品應(yīng)用Aliance流動分析儀進行煙葉內(nèi)在成分化驗分析，結(jié)果見表2。
表2煙葉含鉀量的測定結(jié)果

由上表可以看出，與未轉(zhuǎn)對照相比，AtNHX1基因的煙草轉(zhuǎn)化材料的煙葉含鉀量顯著增加，增加幅度為67％。最高的NH02材料含鉀量提高更為顯著，比對照材料的平均值高100％。
序列表<110>黑龍江省煙草科學(xué)研究所<120>擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的應(yīng)用<130>
<160>8<170>Patentln version 3.3<210>1<211>1617<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgttggatt ctctagtgtc gaaactgcct tcgttatcga catctgatca cgcttctgtg 60gttgcgttga atctctttgt tgcacttctt tgtgcttgta ttgttcttgg tcatcttttg120aaagagaata gatggatgaa cgaatccatc accgccttgt tgattgggct aggcactggt180gttaccattt tgttgattag taaaggaaaa agctcgcatc ttctcgtctt tagtgaagat240cttttct tcatatatctttt gccacccatt atattcaatg cagggtttca agtaaaaaag300aagcagtttt tccgcaattt cgtgactatt atgctttttg gtgctgttgg gactattatt360tcttgcacaa tcatatctct aggtgtaaca cagttcttta agaagttgga cattggaacc420tttgacttgg gtgattatct tgctattggt gccatatttg ctgcaacaga ttcagtatgt480acactgcagg ttctgaatca agacgagaca cctttgcttt acagtcttgt attcggagag540ggtgttgtga atgatgcaac gtcagttgtg gtcttcaacg cgattcagag ctttgatctc600acccacctaa accacgaagc tgcttttcat cttcttggaa acttcttgta tttgtttctc660ctaagtacct tgcttggtgc tgcaaccggt ctgataagtg cgtatgttat caagaagcta720tactttggaa ggcactcaac tgaccgagag gttgccct tatgatgcttat ggcgtatctt780tcttatatgc ttgctgagct tttcgacttg agcggtatcc tcactgtgtt tttctgtggt840attgtgatgt cccattacac atggcacaat gtaacggaga gctcaagaat aacaacaaag900catacctttg caactttgtc atttcttgcg gagacattta ttttcttgta tgttggaatg960
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Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly Phe85 90 95Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe Val Thr Ile Met Leu100 105 110Phe Gly Ala Val Gly Thr Ile Ile Ser Cys Thr Ile Ile Ser Leu Gly115 120 125Val Thr Gln Phe Phe Lys Lys Leu Asp Ile Gly Thr Phe Asp Leu Gly130 135 140Asp Tyr Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys145 150 155 160Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu165 170 175Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Val Phe180 185 190Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Thr His Leu Asn His Glu Ala Ala195 200 205Phe His Leu Leu Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Leu Leu Ser Thr Leu210 215 220Leu Gly Ala Ala Thr Gly Leu Ile Ser Ala Tyr Val Ile Lys Lys Leu225 230 235 240Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met Met Leu245 250 255Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Phe Asp Leu Ser Gly260 265 270Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr Thr Trp275 280 285His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Ile Thr Thr Lys His Thr Phe Ala290 295 300Thr Leu Ser Phe Leu Ala Glu Thr Phe Ile Phe Leu Tyr Val Gly Met305 310 315 320
Asp Ala Leu Asp Ile Asp Lys Trp Arg Ser Val Ser Asp Thr Pro Gly325 330 335Thr Ser Ile Ala Val Ser Ser Ile Leu Met Gly Leu Val Met Val Gly340 345 350Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Ala Lys355 360 365Lys Asn Gln Ser Glu Lys Ile Asn Phe Asn Met Gln Val Val Ile Trp370 375 380Trp Ser Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn385 390 395 400Lys Phe Thr Arg Ala Gly His Thr Asp Val Arg Gly Asn Ala Ile Met405 410 415Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Cys Leu Phe Ser Thr Val Val Phe Gly420 425 430Met Leu Thr Lys Pro Leu Ile Ser Tyr Leu Leu Pro His Gln Asn Ala435 440 445Thr Thr Ser Met Leu Ser Asp Asp Asn Thr Pro Lys Ser Ile His Ile450 455 460Pro Leu Leu Asp Gln Asp Ser Phe Ile Glu Pro Ser Gly Asn His Asn465 470 475 480Val Pro Gln Pro Asp Ser Ile Arg Gly Phe Leu Thr Arg Pro Thr Arg485 490 495Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Gln Phe Asp Asp Ser Phe Met Arg Pro500 505 510Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val Pro Gly Ser Pro Thr515 520 525Glu Arg Asn Pro Pro Asp Leu Ser Lys Ala530 535
<210>3<211>37<212>DNA<213>人工合成<400>3aaaggatcca acatgttgga ttctctagtg tcgaaac 37<210>4<211>34<212>DNA<213>人工合成<400>4aaagagct ctcaagccttac taagatcagg aggg 34<210>5<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>5cggtctgata agtgcgtatg 20<210>6<211>20<212>DNA
<213>人工合成<400>6gttctggtgc ggtaataggt 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>7cctattaccg caccagaacg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>8ggtcgcatga aggagtcatc 20
權(quán)利要求
1.擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的應(yīng)用，其特征在于所述擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1具有序列表SeQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1提高植物根系吸鉀能力的應(yīng)用，其特征在于所述擬南芥質(zhì)子泵基因AtNHX1編碼序列表SeQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.一種進行擬南芥的質(zhì)子泵基因轉(zhuǎn)化的高效植物表達載體，它包含序列表SeQ ID No.1所示的核苷酸序列。
5.一種提高植物根系吸鉀能力、增加葉片含鉀量的方法，包括1)構(gòu)建AtNHX1植物表達載體，它包含序列表中SeQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)將含AtNHX1基因的植物表達載體導(dǎo)入植物細胞；獲得吸鉀能力增強的轉(zhuǎn)基因后代，包括植物各部分組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提高植物根系吸鉀能力、增加葉片含鉀量的方法，其特征在于所述植物為雙子葉或單子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提高植物根系吸鉀能力、增加葉片含鉀量的方法，其特征在于所述植物為煙草。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種提高植物根系吸鉀能力、增加葉片含鉀量的方法，其特征在于所述將含AtNHX1基因的植物表達載體導(dǎo)入植物細胞是通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，采用葉盤法進行。
全文摘要
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并公開了擬南芥的質(zhì)子泵基因具有提高轉(zhuǎn)化植物根系吸鉀能力的功能，并提供了含有該基因的植物表達載體的構(gòu)建方法和提高植物含鉀量的方法。本發(fā)明的優(yōu)點是首次發(fā)現(xiàn)并公開了擬南芥的質(zhì)子泵基因具有提高轉(zhuǎn)化植物根系吸鉀能力的功能，并提供了含有該基因的植物表達載體的構(gòu)建方法和提高植物含鉀量的方法。本發(fā)明能夠有效解決我國煙葉含鉀量過低這個制約我國煙草科技發(fā)展的技術(shù)難題。
文檔編號C07K14/415GK1884539SQ200610012208
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日
發(fā)明者郭兆奎, 姚泉洪, 萬秀清, 顏培強, 李麗杰 申請人:黑龍江省煙草科學(xué)研究所