專(zhuān)利名稱(chēng)：擬南芥基因iar1在鐵營(yíng)養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擬南芥基因IAR1的應(yīng)用，尤其涉及一種擬南芥基因IAR1在植物 鐵營(yíng)養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵是人們最早發(fā)現(xiàn)的微量元素，發(fā)現(xiàn)至今已有兩千多年的歷史，鐵在地球上現(xiàn)存 的原核生物和真核生物的生命活動(dòng)中具有不可替代的功能，鐵對(duì)于任何生物有機(jī)體來(lái)說(shuō)都 是必不可少的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素。植物輕度缺鐵會(huì)導(dǎo)致葉綠素合成減少，光合速率降低，嚴(yán)重缺 鐵時(shí)，葉綠素合成停止，新葉變黃，生物量大幅度下降。植物缺鐵不僅影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育， 造成作物減產(chǎn)。植物是人和動(dòng)物地鐵營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源，植物缺鐵可動(dòng)物和人類(lèi)對(duì)鐵的吸收， 從而導(dǎo)致貧血病的發(fā)生。 盡管地殼中鐵的豐度很高，但土壤中的鐵由于受土壤溶液的pH值及氧分壓的影 響，幾乎都是以難溶于水的Fe3+形式存在，因此，如果沒(méi)有主動(dòng)的調(diào)節(jié)機(jī)制使植物獲得充足 的鐵，大多數(shù)植物便會(huì)表現(xiàn)出缺鐵癥狀，造成農(nóng)作物的減產(chǎn)，是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世 界約有40%的土壤缺鐵，北美大陸、地中海沿岸、前蘇聯(lián)南部、南美的部分地區(qū)都嚴(yán)重缺鐵。 我國(guó)南起四川盆地，北至內(nèi)蒙古高原，東至淮北平原，西到黃土高原及甘肅、青海、新疆，都 有缺鐵現(xiàn)象的發(fā)生。雖然土壤缺鐵只在一定的土類(lèi)和地區(qū)存在，但由于總面積較大，所以植 物缺鐵失綠成為全世界普遍關(guān)注的問(wèn)題，也是植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
研究表明，植物對(duì)鐵離子的吸收通過(guò)以下兩種方式完成對(duì)于雙子葉植物和非禾 本科單子葉植物而言，缺鐵會(huì)在根系產(chǎn)生多種生理及形態(tài)的變化，如根系Fe3+還原酶活性 的增加，凈質(zhì)子分泌量的增加，有機(jī)酸及酚類(lèi)物質(zhì)的分泌；以及產(chǎn)生根尖膨大、根毛增多、根 表產(chǎn)生轉(zhuǎn)移細(xì)胞等，即所謂的機(jī)理I ;對(duì)于禾本科植物而言，根系對(duì)缺鐵的反應(yīng)為植物鐵載 體(phytosiderophores)釋放量的增加。植物鐵載體對(duì)于根系鐵的吸收和跨膜運(yùn)輸有不可 替代的作用，這一吸收過(guò)程被稱(chēng)為機(jī)理II 。 隨著分子遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，人們通過(guò)突變體的分析技術(shù) 分離得到了一系列與土壤鐵離子吸收有關(guān)的基因，如從擬南芥中分離克隆了Fe"還原酶基 因(froh) 、Fe"螯合物還原酶的FR02基因、Fe"轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因IRT1，從豌豆(Pisumsativum) 根中的Fe2+專(zhuān)一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Ritl等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物，組成了一套鐵離子還原和吸 收體系。 在供鐵充足的條件下，機(jī)理I的植物首先通過(guò)Fe3+螯合物將溶解性的Fe3+螯合并 還原為Fe"，才能被吸收利用。在缺鐵脅迫的條件下，土壤中溶解性的Fe3+很少，機(jī)理I植 物通過(guò)激活一種特異的H+-ATPas而使土壤酸化，從而增加鐵的可溶性，才能夠通過(guò)根部還 原酶將Fe"螯合和還原。因此，缺鐵條件下，機(jī)理I植物吸收鐵的一個(gè)前提條件是通過(guò)分泌 作用使土壤酸化，增加鐵離子的溶解和吸收；因此，植物根際酸化能力對(duì)土壤鐵營(yíng)養(yǎng)的吸收 和利用起到十分關(guān)鍵的作用。雖然已有包括鐵還原和運(yùn)輸有關(guān)的一批基因已經(jīng)得到克隆和 功能驗(yàn)證，但是，直接參與調(diào)節(jié)缺鐵引起的根際酸化的基因至今未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥基因IAR1在植物鐵營(yíng)養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng) 用。 同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因IAR1在培育抗缺鐵和抗旱植物 新品種方面的應(yīng)用。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種擬南芥基因IARl在植物鐵營(yíng) 養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng)用。所述的基因IARl，其在Genebank中的編號(hào)為ATlG70690，該基因的CDS序列全長(zhǎng)
為900bp，編碼300個(gè)氨基酸的蛋白。 所述的基因參與H202相關(guān)植物缺鐵反應(yīng)過(guò)程。 所述基因的序列及其序列的全部或部分開(kāi)放讀碼框ORF序列的不同應(yīng)用載體。
同時(shí)，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種擬南芥基因IAR1在培育抗缺鐵植物新品 種方面的應(yīng)用。 所述的IAR1基因及該基因中的部分片斷連接在有關(guān)表達(dá)載體，以及通過(guò)不同的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物。 所述的IAR1基因的部分序列或功能區(qū)域片斷構(gòu)建RNAi抑制表達(dá)載體，獲得相應(yīng) 的轉(zhuǎn)基因植物。 所述的基因由分析和尋找同源和同功能的基因及其相應(yīng)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因品 系的獲得。 本發(fā)明通過(guò)用遠(yuǎn)紅外成像技術(shù)，篩選得到了土壤取鐵敏感擬南芥突變體iarl，克 隆得到了 IAR1基因(atlg70690)，采用GUS組織定位和GFP融合蛋白的細(xì)胞定位的方法，分 析IAR1基因的細(xì)胞和組織表達(dá)特性，構(gòu)建由CaMV35S啟動(dòng)子控制的超表達(dá)IAR1轉(zhuǎn)基因植 株，比較分析轉(zhuǎn)基因植株的表型和IAR1基因可能的生物學(xué)功能，從分子水平上植物根際酸 化和植物抗缺鐵反應(yīng)的關(guān)系。 本發(fā)明從缺鐵反應(yīng)敏感擬南芥突變體中克隆堅(jiān)定了一個(gè)可調(diào)節(jié)缺鐵誘導(dǎo)土壤根 際酸化有關(guān)的IAR1基因(atlg70690)，為進(jìn)一步分析和尋找同功能基因、構(gòu)建相關(guān)基因的 轉(zhuǎn)化載體和獲得抗缺鐵植物新品種提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得鐵營(yíng)養(yǎng) 高效利用植株，構(gòu)建RNAi載體并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株，分析該轉(zhuǎn)基因植株的高效利用土 壤鐵營(yíng)養(yǎng)的特性。IAR1基因編碼一個(gè)受體激酶的受體區(qū)域，感受并調(diào)節(jié)植物的缺鐵和反應(yīng)。 IARl蛋白主要分布在維管系統(tǒng)和細(xì)胞膜上，感受土壤中鐵的含量變化和調(diào)節(jié)根際酸化，影 響和調(diào)節(jié)植物的抗缺鐵反應(yīng)。 蛋白作用分析表明，IAR1可特異的與土壤中的鐵離子結(jié)合，通過(guò)蛋白的氧化還原 狀態(tài)，感知鐵離子的含量變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜離子通道活性和離子跨膜運(yùn)輸，調(diào)節(jié)植物的抗 逆反應(yīng)。 本發(fā)明揭示和分析IAR1基因及其編碼的蛋白的功能，為分析和尋找與植物缺鐵 脅迫相關(guān)的根際酸化調(diào)節(jié)基因和蛋白以及相應(yīng)的同源基因和蛋白提供了手段和必要的基 礎(chǔ)及前提，比如通過(guò)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析等，同時(shí)可通過(guò)合成簡(jiǎn)并引物獲得同功能基因等； 也可以通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得同功能基因和序列；通過(guò)突變的方法增加、減少、替換若干堿基和氨基酸等；以及依據(jù)以上手段獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)化載體和獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株等。
本發(fā)明通過(guò)特定的篩選條件分離得到了缺鐵條件下調(diào)節(jié)擬南芥鐵吸收有關(guān)的根 際酸化基因IAR1， IAR1基因的表達(dá)控制擬南芥根際酸化能力和植物對(duì)鐵離子的吸收和利 用，影響植物抗缺鐵反應(yīng)和植物抗旱能力。IAR1基因的功能和作用的分析，為獲得轉(zhuǎn)基因鐵 高效作物新品系，提高植物的抗旱反應(yīng)提供了基礎(chǔ)和前提。


圖1為干旱條件下篩選得到的擬南芥葉片溫度升高突變體iarl (箭頭指示為篩選 得到的iarl突變體)； 圖2為缺鐵條件下，用雌二醇誘導(dǎo)IAR1誘導(dǎo)表達(dá)可抑制突變體根的生長(zhǎng)；增加擬 南芥根的缺鐵敏感特性(右圖為根生長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果)； 圖3為缺鐵條件下，誘導(dǎo)IAR1基因的表達(dá)，增加擬南芥突變體生長(zhǎng)，引起葉片失綠 和黃化的缺鐵敏感特性； 圖4為缺鐵條件下誘導(dǎo)IAR1基因表達(dá)植株喪失根際酸化能力(A處表示酸化程 度)； 圖5為IRA1基因表達(dá)可抑制區(qū)鐵敏感酵母突變體菌斑Frel、 Ftrl、 Fet3、 Fet4、 Fre2的酸化能力(B處表示酸化程度)。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 IAR1突變體的篩選、鑒定以及相關(guān)植株對(duì)鐵營(yíng)養(yǎng)的利用和抗旱反應(yīng) 采用遠(yuǎn)紅外成像技術(shù)，在干旱條件先篩選得到擬南芥葉片溫度較高的擬南芥突變
體iarl，克隆得到突變基因IARl為編號(hào)為ATlG70690 ;誘導(dǎo)該基因的過(guò)量表達(dá)，缺鐵培養(yǎng)基
可抑制相應(yīng)的擬南芥植株根生長(zhǎng)受抑制，同時(shí)引起植株葉片失綠和黃化的明顯缺鐵癥狀。
利用原子吸收方法測(cè)定缺鐵誘導(dǎo)條件下，可引起IAR1超表達(dá)植株對(duì)鐵離子積累量的減少，
引起植物明顯的缺鐵癥狀，H202存在條件下。(見(jiàn)圖1) 實(shí)施例2 IAR1對(duì)缺鐵誘導(dǎo)的根際酸化作用分析 通過(guò)構(gòu)建pCAMBIA1205互補(bǔ)載體獲得的超表達(dá)植株，結(jié)合T-DAN插入突變和誘導(dǎo)
IAR1超表達(dá)植株分析表明，超表達(dá)植株在缺鐵培養(yǎng)基上表現(xiàn)出比野生形擬南芥更敏感的缺
鐵癥狀，pH顯色劑指示培養(yǎng)基顯色表明，超表達(dá)植株缺乏鐵誘導(dǎo)的擬南芥根際酸化能力，表
明IAR1可能通過(guò)調(diào)節(jié)擬南芥根際酸化調(diào)節(jié)植物的鐵營(yíng)養(yǎng)的利用。 實(shí)施例3 基因的表達(dá)及定位分析 通過(guò)培養(yǎng)基缺磷、缺鋅、缺銅、缺鈣、缺錳等分析表明，IAR1基因?qū)θ辫F具有轉(zhuǎn)移的 反應(yīng)特性；通過(guò)半定量PCR分析表明，IAR1基因的表達(dá)可被培養(yǎng)基缺鐵所抑制，調(diào)節(jié)植物的 缺鐵誘導(dǎo)的根際酸化反應(yīng)；通過(guò)PCR擴(kuò)增IAR1基因的啟動(dòng)子并構(gòu)建相應(yīng)的GUS載體獲得相 應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株分析表明，IAR1基因主要在擬南芥的根部和葉片的維管表達(dá)。
實(shí)施例4
酵母表達(dá)試驗(yàn)IAR1基因功能分析 選用酵母表達(dá)體系，pYES2-IARl酵母表達(dá)載體。把基因轉(zhuǎn)到突變體和野生型酵母 中，其中以轉(zhuǎn)空載體的為對(duì)照。4天后看突變酵母的生長(zhǎng)情況。圖5所示，從上到下的酵母菌 株分別是Frel、Ftrl、Fetl、Fet2、Fre2的突變體和WT。結(jié)果是點(diǎn)在YPD加半乳糖誘導(dǎo)目的 基因表達(dá)的固體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)pYES2-IARl和轉(zhuǎn)pYES2空載體對(duì)酵母的表型基本沒(méi)有差異。 點(diǎn)在YPD加8mMBPDS和半乳糖固體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)pYES2-IARl在Frel、 Fet2和WT中酵母顏 色變紅，轉(zhuǎn)PYES2空載體到Frel和Fet2突變酵母中沒(méi)有此表型，轉(zhuǎn)pYES2-IARl和轉(zhuǎn)pYES2 空載體到酵母Ftrl、 Fetl、 Fre2、中基本沒(méi)有差異，也沒(méi)有酵母株變紅的表型，表明IAR1可 能與植物高親和性鐵利用有關(guān)。同時(shí)利用PH顯色劑指示培養(yǎng)基顯色表明，轉(zhuǎn)pYES2-IARl 表達(dá)載體的酵母菌株可以抑制酵母菌斑的酸化能力。
實(shí)施例5 蛋白的原核表達(dá)及其表達(dá)蛋白的鐵離子結(jié)合分析 為研究IAR1基因的表達(dá)蛋白和可能的蛋白的相互作用，先構(gòu)建pGEX-2TK-At218 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，獲得GST-IAR1融合蛋白；通過(guò)微量熱滴定 ITC和熒光淬滅滴定技術(shù)分析表明，原核表達(dá)IAR1蛋白可以和鐵離子結(jié)合引起蛋白的熵和 蛋白微結(jié)構(gòu)的變化，感受培養(yǎng)基的鐵離子濃度的變化。
權(quán)利要求
一種擬南芥基因IAR1在鐵營(yíng)養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬南芥基因IAR1在鐵營(yíng)養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng)用，其特征 在于所述的基因IARl，其在Genebank中的編號(hào)為ATlG70690，該基因的CDS序列全長(zhǎng)為 900bp，編碼300個(gè)氨基酸的蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1擬南芥基因IAR1在鐵營(yíng)養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng)用，其特征在于所 述的基因參與H202相關(guān)植物缺鐵反應(yīng)過(guò)程。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于含有所述基因的序列及其序列的全部或 部分開(kāi)放讀碼框ORF序列的不同應(yīng)用載體。
5. —種擬南芥基因IARl在培育抗干旱和缺鐵植物新品種方面的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IARl基因及該基因中的部分片斷 連接在有關(guān)表達(dá)載體，以及通過(guò)不同的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IAR1基因的部分序列或功能區(qū)域 片斷構(gòu)建RNAi抑制表達(dá)載體，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的基因由分析和尋找同源和同功能 的基因及其相應(yīng)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因品系的獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬南芥基因IAR1在鐵營(yíng)養(yǎng)利用及抗旱方面的應(yīng)用。本發(fā)明的缺鐵條件下調(diào)節(jié)擬南芥鐵吸收有關(guān)的根際酸化基因IAR1，IAR1基因的表達(dá)控制擬南芥根際酸化能力和植物對(duì)鐵離子的吸收和利用，影響植物抗缺鐵反應(yīng)和植物抗旱能力。IAR1基因的功能和作用的分析，為獲得轉(zhuǎn)基因鐵高效作物新品系，提高植物的抗旱反應(yīng)提供了基礎(chǔ)和前提。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101781660SQ200910064139
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2009年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日
發(fā)明者丁鵬, 劉浩, 安國(guó)勇, 宋純鵬, 張霖, 王棚濤, 王紅霞, 趙孝亮 申請(qǐng)人:河南大學(xué)