專利名稱：擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因nrt2.1及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域。具體為擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Nitrate transporters, NRTs)家族關(guān)鍵基因NRT2.1在低氮脅迫下的反應(yīng)和作用機(jī)理，以及該基因在營養(yǎng)高效植物新品種培育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:氮是植物必需的營養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、酶等的組成成分。氮素供應(yīng)不足會影響植物的生長發(fā)育，限制農(nóng)作物的產(chǎn)量；而氮肥施用過量則使氮素利用率下降，不僅造成資源浪費，而且引起環(huán)境污染。通過挖掘植物自身遺傳潛能，克隆耐低氮和氮素營養(yǎng)高效的基因，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育氮素利用效率提高的新品種是解決這一問題的重要途徑之一。擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科、蕓薹屬植物，它不僅是第一個完成基因組序列測定的模式植物(Athanasios Theologis.et al., Nature, 2000,408:791-826)，而且具有植株小，生長周期短，種子數(shù)量多，基因組小且易于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，自花授粉而又易于雜交等優(yōu)點。因此在植物分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)基因相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中，擬南芥被作為模式植物廣泛加以研究和應(yīng)用。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Nitrate transporters, NRTs)是一類專司硝態(tài)氮吸收、運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在一個由7個成員組成的NRT2基因家族。之前的研究證明NRT2.1基因為高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(ffenbin Li et al., Plant Physio-logy,January2007, Vol.143, pp.425-433)。但至今還未見低氮條件下該基因調(diào)控根系發(fā)育的報道。 發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明提供一個擬南芥高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，以及該基因?qū)Φ偷{迫的反應(yīng)和生理機(jī)制。所提供的高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因為NRT2.1 (AT1G08090)。上述基因具有SEQ ID N0.1的堿基序列。上述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。NRT2.1 基因的 T-DNA 插入突變體 salk_008278 是從 ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)定購獲得。通過PCR鑒定獲得純合插入突變體,通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。通過上述鑒定，獲得NRT2.1基因T-DNA插入突變體salk_008278的純合株系，并以之為材料進(jìn)行低氮處理，觀察低氮表型并拍照。然后分別統(tǒng)計野生型和突變體的側(cè)根數(shù)量。


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圖1顯示野生型和突變體PCR和RT-PCR檢測的電泳結(jié)果，結(jié)果表明所獲NRT2.1基因T-DNA插入突變體株系salk_008278為純合插入株系，其轉(zhuǎn)錄本被敲除。圖2顯示野生型和突變體低氮處理7天的表型照片及側(cè)根數(shù)統(tǒng)計結(jié)果，結(jié)果表明在高蔗糖/低氮素(7.5% sucrose,0.1mM NH4+，和0.1mM NO3O的培養(yǎng)條件下，突變體側(cè)根顯著多于野生型(P = 0.044)。
具體實施方式
:下面結(jié)合實驗方法和數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。1.擬南芥幼苗培養(yǎng):野生型和突變體種子分別用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的種子放入4°C冰箱春化2天后點布于含I %瓊脂的MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基上,置于22°C光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長。2.純合突變體的鑒定:DNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。取約0.5g擬南芥新鮮葉片，研磨成糊狀，加 400 μ I SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-Hcl, PH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ; 12，000r/min,離心3min ;取上清,加等體積異丙醇輕輕搖晃,靜置30min ；13, OOOr/min,離心5min ;棄上清,用lml95%乙醇沖洗1-2次后，自然風(fēng)干,加去離子水30 μ 1，4°C保存?zhèn)溆?。RNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研缽、槍頭、離心管等一應(yīng)物品事先用I % DEPC水 浸泡過夜后高溫高壓滅菌備用。取新鮮幼苗約Ig左右，于液氮中研磨成粉狀，加Iml TRIZOL提取液混勻，靜置IOmin ;4°C下12，OOOr/min離心IOmin ;取上清加300 μ I氯仿混勻，靜置IOmin后4°C下12, OOOr/min離心15min,樣品分為3層，RNA位于上層水相中；取500 μ I水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，加等體積異丙醇沉淀 10-20min ; 12，OOOr/min 離心 IOmin,棄上清;用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7，OOOr/min 離心2min,晾干Imin左右，加60 μ I無RNase水，輕輕震蕩使RNA溶解，_70°C冰箱保存?zhèn)溆?。RT-PCR:所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#kl621)購自 Fermentas。First strand cDNAsynthesis:管中加入 RNAly 1，oligo (dT)18primerlμ I, RNase-free waterI μ I,65 °C 處理 5min 后迅速冰浴冷卻；然后再加 5XReaction buffer4 μ I, Ribolock RNaseinhibitor(20u/μ I)I μ I,IOmM dNTP Mix2μ I, RevertAid H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ I) I μ 1，42°C反應(yīng) 60min ;70°C終止反應(yīng) 5min，產(chǎn)物于 _20°C冰箱保存?zhèn)溆?。PCR檢測:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我們設(shè)計了 2對引物，I對用于T-DNA插入檢測(LPl:5 ' -TTTGATAGGTTTTACGGACGG-3 '，RPl:5 ' -AGGCATCATCTCGGGTTTAAC-3 ')并結(jié)合T-DNA左邊界通用引物L(fēng)Bb 1.3:5 ' -ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3 '，通過PCR鑒定獲得純合插入突變體。另外I對用于轉(zhuǎn)錄本檢測(LP2:5 ' -GTCACCGGTAGAGAACAAAGC-3 ' ；RP2:5 ' -CTCTGTACCTTTCACTGGATCTGT-3 ' )。PCR 反應(yīng)體系如下:10 X buffer buffer2 μ I，dNTP0.8 μ I，Primer LP/RP 各 I μ I，DNAl μ I，dH2014 μ I，Taq 酶 0.2 μ I。PCR 程序如下:94°C，3min ； (94°C，45sec ；58°C，45sec ；72°C, 60sec) X 30cycles ；72°C, 5min。產(chǎn)物采用 I %(W/V)瓊脂糖凝膠電泳分離，恒壓IOOV電泳20min，用BIO-RAD凝膠成像掃描儀拍照記錄檢
測結(jié)果。 PCR和RT-PCR檢測的結(jié)果表明我們鑒定到NRT2.1基因T-DNA插入突變體salk_008278的純合插入株系,其轉(zhuǎn)錄本被敲除。3.低氮處理:在含I %瓊脂的固體MS培養(yǎng)基上生長5天的幼苗，轉(zhuǎn)移到含有0.1mM NH4+、0.1mMN03_和7.5%蔗糖的培養(yǎng)基上，野生型和突變體各轉(zhuǎn)5-6株，排列整齊以便于觀察表型。低氮培養(yǎng)基包括 ImM KH2PO4, ImM MgSO4,0.25mM CaCl2,0.1mM Na-Fe-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ImM KCl, 30mMH3B03, 5mM MnSO4, ImM ZnSO4, ImM CuSO4, 0.7mMNa2MoO4,0.1mMNH40.1mM NOf 和 7.5%蔗糖，用 NaOH 調(diào) PH 值至 5.7-5.75。22°C光照培養(yǎng)7天后拍照，統(tǒng)計側(cè)根量等指標(biāo)。結(jié)果表明在高鹿糖/低氮素(7.5% sucrose, 0.1mM NH4+,和0.1mM NO3O培養(yǎng)條件下，突變體側(cè)根顯著多于野生型(P = 0.044)。這說明高蔗糖/低氮素條件刺激了突變體側(cè)根的發(fā)育，有助于 對氮素的吸收。
權(quán)利要求
1.擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NRT2.1，其堿基序列如SEQ ID Nol0
2.權(quán)利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NRT2.I編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No2。
3.權(quán)利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NRT2.I敲除突變體的低氮處理方法及條件。
4.權(quán)利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NRT2.I敲除突變體在低氮處理下所獲得的表型及其相關(guān)試驗數(shù)據(jù)。
5.權(quán)利要求1所述的擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NRT2.I在制備耐低氮及氮素營養(yǎng)高效轉(zhuǎn) 基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域。具體為擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NRT2.1耐低氮功能的驗證，以及該基因在耐低氮和氮素營養(yǎng)高效植物新品種培育中的應(yīng)用。本發(fā)明以模式植物擬南芥為材料，利用NRT2.1基因T-DNA插入突變體salk_008278的純合株系研究NRT2.1基因在植物低氮高效方面的功能。實驗結(jié)果顯示NRT2.1基因敲除突變體在高蔗糖/低氮素(7.5％sucrose，0.1mM NH4NO3)培養(yǎng)條件下，突變體側(cè)根顯著多于野生型(P＝0.044)。說明NRT2.1基因在植物應(yīng)答低氮脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的作用，預(yù)計該基因的過量表達(dá)可提高植物的耐低氮能力并在植物氮素營養(yǎng)高效分子育種中具有較大的經(jīng)濟(jì)價值。
文檔編號C12N15/29GK103255146SQ20131004742
公開日2013年8月21日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者徐江, 徐小棟, 張少斌, 東方陽, 魯黎明, 王西瑤, 遲志海, 洪雪, 麻艷超, 趙明, 丁在松, 付金東 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所