專利名稱：一種分離純化熊果酸、齊墩果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物分離的技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及了一種從苦丁茶中提取并純化其主要的活性成分熊果酸、齊墩果酸，同時(shí)得到一定純度的茶多酚副產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
苦丁茶是我國民間的一種傳統(tǒng)的植物藥茶，在我國已經(jīng)有2000多年的飲用歷史，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，苦丁茶在對心血管作用、抗氧化作用、降血脂作用、降血糖作用、增強(qiáng)免疫功能的作用、抗應(yīng)激、抗疲勞作用、抗菌作用、微量元素的保健及藥用功能、拮抗支氣管平滑肌的收縮作用、毒理作用等很多方面都有很好的療效，因而有較好的開發(fā)前景。
苦丁茶的成分比較復(fù)雜，除了茶多酚、氨基酸、兒茶素、糖脂、維生素等與普通茶葉相同的成分之外，還含有較多的三萜皂苷類成分，例如其中主要的活性成分熊果酸和齊墩果酸。
熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，又名烏索酸，烏蘇酸，純品為白色針狀結(jié)晶，分子式為C30H48O3，分子量為456.68，化學(xué)名稱為3β-羥基-熊果烷-12-烯-28-羧酸，熊果酸不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。藥理研究證明，熊果酸具有顯著的抗致癌、抗促癌和免疫作用，能降低高血脂癥、防治動(dòng)脈粥樣硬化以及由其引起的心腦血管疾病，因而熊果酸極有可能成為低毒高效的新一代抗癌、抗心腦血管疾病藥物。
齊墩果酸是熊果酸的同分異構(gòu)體，又稱土當(dāng)歸酸，化學(xué)名稱為3-羥基上土當(dāng)歸-12-烯-28-羧酸。齊墩果酸也具有保肝降酶、降血脂、抗炎利尿和促進(jìn)免疫等藥理作用，是國家非處方藥目錄收載的肝病輔助用藥。
山楂、女貞子和梔子等多種植物葉或者果實(shí)中都含有一定量的熊果酸和齊墩果酸。已報(bào)道的提取方法主要以有機(jī)溶液浸提結(jié)合一定分離手段為主，例如CN1358733以乙醇回流提取、活性炭脫色、干燥等相結(jié)合的方法得到女貞葉中的熊果酸，雖然該發(fā)明較簡便，但只能得到熊果酸粗品；CN1453289以乙醇提取、丙酮沖洗、醇類重結(jié)晶的方法得到泡桐葉中的熊果酸，操作過程中涉及一定的有機(jī)溶劑且提取效率一般；CN1569885以乙醇提取、石油醚和乙酸乙酯溶解、活性炭吸附分離提取杜鵑葉中的熊果酸，過程中涉及有機(jī)溶劑且得到的熊果酸含量較低；CN1508149以乙醇提取、沉降劑沉降、膜分離、大孔吸附以及有機(jī)溶液選擇溶解的方法得到苦丁茶中的總?cè)扑岷托芄?、齊墩果酸單品，分離純化方法有所創(chuàng)新，但苦丁茶中的茶多酚類物質(zhì)對熊果酸、齊墩果酸的后續(xù)分離造型較大的干擾，從而造成分離方法仍較為復(fù)雜。這些方法實(shí)現(xiàn)過程中均要使用一定的有機(jī)溶劑甚至是有毒的有機(jī)溶劑，且這些方法往往分離效率不高，產(chǎn)品的純度也有一定的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有分離純化技術(shù)復(fù)雜且分離效率不高等不足而提出了一種工藝簡便、分離效率高的以水提和醇提相結(jié)合的分離純化熊果酸、齊墩果酸的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為基于苦丁茶中多酚類成分易溶于水而目標(biāo)成分熊果酸、齊墩果酸不溶于水，且提取液中多酚類物質(zhì)的存在對后續(xù)分離純化工藝造成一定的干擾從而造成純化工藝的復(fù)雜，首次提出利用該溶解性的性質(zhì)，在傳統(tǒng)醇提苦丁茶之前，加入純水提取過程，通過浸提和抽濾，在第一步就將三萜酸與多酚類物質(zhì)有效分離開來，降低了后續(xù)分離純化工作的難度；另外，采用無機(jī)陶瓷微濾膜代替有機(jī)微濾膜澄清苦丁茶提取液，相對于有機(jī)膜，無機(jī)陶瓷膜具有化學(xué)穩(wěn)定性好及抗微生物能力的優(yōu)點(diǎn)，一般不與微生物發(fā)生作用，本身無毒，不污染被分離體系，特別適用于食品藥物類體系的分離過程，而且，乙醇溶液在無機(jī)陶瓷膜內(nèi)較好的溶脹性也有利于澄清過濾過程的進(jìn)行；最后結(jié)合納濾濃縮，大孔樹脂吸附和過濾結(jié)晶等技術(shù)，從苦丁茶中提取并純化其主要的活性成分熊果酸、齊墩果酸，同時(shí)得到茶多酚副產(chǎn)品。
本發(fā)明具體技術(shù)方案如下A)將苦丁茶葉片烘干，粉碎磨至細(xì)顆粒狀，以純水為提取液，在沸水水浴中提取，過濾，將過濾得到的濾渣，以乙醇溶液為溶劑，在沸水水浴中回流提取后過濾，濾液采用微濾、納濾得到濃縮液；B)將濃縮液注入大孔吸附樹脂層析，吸附、洗脫后干燥，得到三萜酸粗品，將三萜酸粗品加入純水中，在沸水浴中提取，過濾，所得沉淀加入乙醇溶解后，首先調(diào)節(jié)pH值至堿性過濾后濾液調(diào)節(jié)pH值至酸性，結(jié)晶得到三萜酸產(chǎn)品；C)三萜酸產(chǎn)品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸騰，趁熱過濾，所得不溶物經(jīng)水洗后在乙醇中重結(jié)晶得到熊果酸單體產(chǎn)品，過濾所得濾液經(jīng)濃縮析晶得到齊墩果酸單體產(chǎn)品。
其中步驟A中苦丁茶水提液過濾后所得到的濾液，經(jīng)過微濾膜澄清、納濾濃縮后所得濃縮液注入聚酰樹脂層析柱，通過吸附洗脫后干燥得到茶多酚產(chǎn)品。
茶葉的烘干溫度為40℃～60℃度，烘干至恒重，粉碎磨至細(xì)顆粒狀(80-100目)。
本發(fā)明中步驟A所涉及的苦丁茶的水提和醇提實(shí)驗(yàn)，通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察水提時(shí)間、水提次數(shù)、醇提時(shí)間、醇提次數(shù)和加入純水和乙醇與苦丁茶葉粉末的液固比這五個(gè)因素在不同水平下對所得醇提液中熊果酸、齊墩果酸濃度的影響，得到最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，從而最大限度的利用苦丁茶中所含有的熊果酸和齊墩果酸。純水的加入量(mL)與所提取的苦丁茶葉質(zhì)量(g)的液固比為10～100倍，沸水水浴中提取0.5～2小時(shí)。醇提時(shí)乙醇溶液的濃度為80％以上，加入量(mL)與所提取的苦丁茶葉質(zhì)量(g)的液固比為10～100倍，優(yōu)選提取兩到三次。每次提取時(shí)間為2～3小時(shí)。步驟A中的微濾過程采用膜孔徑為50nm～500nm的陶瓷膜在30℃～50℃，膜面流速在2～3m/s，錯(cuò)膜壓力在0.15～0.2MPa進(jìn)行。步驟A中的納濾過程采用截留分子量為300～500納濾膜進(jìn)行濃縮。
其中步驟B中首先調(diào)節(jié)PH值到8～11范圍內(nèi)，過濾后將濾液pH值調(diào)節(jié)至2～5，所得沉淀物即三萜酸粗品。
本發(fā)明中所涉及到的濃縮、析晶的工藝條件參照現(xiàn)有的一般技術(shù)。
本發(fā)明中熊果酸、齊墩果酸含量分析方法以高效液相色譜法測定苦丁茶中齊墩果酸的含量，色譜條件為ZORBAX ECLIPSE XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇-水-磷酸二氫鈉(90∶10∶0.1)；流動(dòng)相用微濾膜過濾；檢測波長λ＝220nm；流速0.6mL/min；柱溫為25℃。
(1)茶多酚含量分析方法基于多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成藍(lán)紫色絡(luò)合物的性質(zhì)，采用分光光度計(jì)在波長λ＝540nm處測定其吸光度，以此計(jì)算茶多酚的含量。
有益效果1、本發(fā)明首次提出了純水提取與乙醇溶液回流提取相結(jié)合的方法，在提取過程第一步即有效的分離了苦丁茶中兩大主要的有效成分—三萜酸和茶多酚，不僅有效的強(qiáng)化了有效成分的溶出，而且大大減少了后續(xù)分離過程的難度，從而縮短了提取時(shí)間，簡化了提取步驟；2、本發(fā)明采用無機(jī)陶瓷微濾膜代替有機(jī)微濾膜澄清苦丁茶提取液，相對于有機(jī)膜，無機(jī)陶瓷膜具有化學(xué)穩(wěn)定性好及抗微生物能力的優(yōu)點(diǎn)，一般不與微生物發(fā)生作用，本身無毒，不污染被分離體系，特別適用于食品藥物類體系的分離過程，同時(shí)，乙醇溶液在無機(jī)陶瓷膜內(nèi)較好的溶脹性也有利于澄清過濾過程的進(jìn)行，因此，無機(jī)陶瓷膜的應(yīng)用改善了分離過程的效果。采用微濾、納濾等新型分離技術(shù)，不僅避免了使用有機(jī)溶劑，實(shí)現(xiàn)了綠色的提取過程，而且避免了有機(jī)溶劑和苛刻的操作條件對有效成分的破壞；采用大孔吸附樹脂層析柱分離系統(tǒng)，乙醇溶液洗脫，有效的分離出總?cè)扑?；總?cè)扑岽制?，?jīng)水洗，乙醇溶解、堿化、酸化等過程，得到高純度的總?cè)扑幔?
3、采用熱甲醇溶液選擇性溶解提取，簡化了熊果酸和齊墩果酸單體提取的分離工藝；苦丁茶粉水提液經(jīng)過微濾澄清、納濾濃縮，加入吸附樹脂吸附，得到一定純度的茶多酚副產(chǎn)品。整個(gè)分離過程除了甲醇和乙醇溶液，未用到任何有機(jī)溶劑，實(shí)現(xiàn)了分離純化過程的綠色化，并且在得到熊果酸、齊墩果酸單體產(chǎn)品的同時(shí)，得到茶多酚副產(chǎn)品。


圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
將苦丁茶葉片于40℃干燥，粉碎機(jī)粉碎實(shí)驗(yàn)例1A)取5克苦丁茶粉末，加入100mL純水為提取液，在沸水水浴中提取1小時(shí)，過濾，將過濾得到的濾渣，以100mL無水乙醇溶液為溶劑，在沸水水浴中回流提取兩次，每次2小時(shí)，提取液過濾，濾液采用500nm陶瓷膜在操作溫度為40℃、膜面流速3m/s和操作壓力0.18MPa條件下澄清，檢測得到澄清液中熊果酸濃度為0.428mg/mL，齊墩果酸濃度為0.149mg/mL，澄清液采用截留分子量為400的納濾膜濃縮10倍得到濃縮液中熊果酸濃度為3.878mg/mL，齊墩果酸濃度為1.246mg/mL；B)將濃縮液注入大孔吸附樹脂層析，以乙醇淋洗，收集乙醇洗脫液，該洗脫液經(jīng)濃縮干燥得到三萜酸粗品；將三萜酸粗品加入純水中，在沸水浴中提取1h，過濾，所得沉淀加入乙醇溶解，以NaOH調(diào)節(jié)pH值至10后過濾，所得濾液以H2SO4調(diào)節(jié)Ph值至4后結(jié)晶得到三萜酸產(chǎn)品；C)三萜酸產(chǎn)品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸騰，趁熱過濾，所得不溶物經(jīng)水洗后在乙醇中重結(jié)晶得到熊果酸單體產(chǎn)品，該熊果酸單體純度為92％，過濾所得濾液經(jīng)濃縮析晶得到齊墩果酸單體產(chǎn)品，該齊墩果酸單體純度為90％。
實(shí)驗(yàn)例2A)取3克苦丁茶粉末，加入100mL純水為提取液，在沸水水浴中提取1小時(shí)，過濾，將過濾得到的濾渣，以100mL無水乙醇溶液為溶劑，在沸水水浴中回流提取三次，每次2小時(shí)，提取液過濾，濾液采用500nm陶瓷膜在操作溫度為40℃、膜面流速2.5m/s和操作壓力0.15MPa條件下澄清，檢測得到澄清液中熊果酸濃度為0.286mg/mL，齊墩果酸濃度為0.101mg/mL，澄清液采用截留分子量為300的納濾膜濃縮10倍得到濃縮液中熊果酸濃度為2.437mg/mL，齊墩果酸濃度為0.923mg/mL；B)將濃縮液注入大孔吸附樹脂層析，以乙醇淋洗，收集乙醇洗脫液，該洗脫液經(jīng)濃縮干燥得到三萜酸粗品；將三萜酸粗品加入純水中，在沸水浴中提取1h，過濾，所得沉淀加入乙醇溶解，以NaOH調(diào)節(jié)pH值至10.5后過濾，所得濾液以H2SO4調(diào)節(jié)Ph值至4后結(jié)晶得到三萜酸產(chǎn)品；C)三萜酸產(chǎn)品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸騰，趁熱過濾，所得不溶物經(jīng)水洗后在乙醇中重結(jié)晶得到熊果酸單體產(chǎn)品，該熊果酸單體純度為93％，過濾所得濾液經(jīng)濃縮析晶得到齊墩果酸單體產(chǎn)品，該齊墩果酸單體純度為90％。
實(shí)驗(yàn)例3A)取5克苦丁茶粉末，加入100mL純水為提取液，在沸水水浴中提取1小時(shí)，過濾，將過濾得到的濾渣，以100mL無水乙醇溶液為溶劑，在沸水水浴中回流提取一次，每次2小時(shí)，提取液過濾，濾液采用500nm陶瓷膜在操作溫度為40℃、膜面流速2m/s和操作壓力0.1MPa條件下澄清，檢測得到澄清液中熊果酸濃度為0.147mg/mL，齊墩果酸濃度為0.191mg/mL，澄清液采用截留分子量為500的納濾膜濃縮10倍得到濃縮液中熊果酸濃度為1.025mg/mL，齊墩果酸濃度為1.306mg/mL；B)將濃縮液注入大孔吸附樹脂層析，以乙醇淋洗，收集乙醇洗脫液，該洗脫液經(jīng)濃縮干燥得到三萜酸粗品；將三萜酸粗品加入純水中，在沸水浴中提取1h，過濾，所得沉淀加入乙醇溶解，以NaOH調(diào)節(jié)pH值至11后過濾，所得濾液以H2SO4調(diào)節(jié)Ph值至5后結(jié)晶得到三萜酸產(chǎn)品；C)三萜酸產(chǎn)品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸騰，趁熱過濾，所得不溶物經(jīng)水洗后在乙醇中重結(jié)晶得到熊果酸單體產(chǎn)品，該熊果酸單體純度為90％，過濾所得濾液經(jīng)濃縮析晶得到齊墩果酸單體產(chǎn)品，該齊墩果酸單體純度為89％。
權(quán)利要求
1.一種分離純化熊果酸、齊墩果酸的方法，其具體步驟如下A)將苦丁茶葉片烘干，粉碎磨至細(xì)顆粒狀，以純水為提取液，在沸水水浴中提取，過濾，將過濾得到的濾渣，以乙醇溶液為溶劑，在沸水水浴中回流提取后過濾，濾液采用微濾、納濾得到濃縮液；B)將濃縮液注入大孔吸附樹脂層析，吸附、洗脫后干燥，得到三萜酸粗品，將三萜酸粗品加入純水中，在沸水浴中提取，過濾，所得沉淀加入乙醇溶解后，首先調(diào)節(jié)pH值至堿性，過濾后濾液調(diào)節(jié)pH值至酸性，結(jié)晶得到三萜酸產(chǎn)品；C)三萜酸產(chǎn)品在沸水浴中以甲醇回流提取至沸騰，趁熱過濾，所得不溶物經(jīng)水洗后在乙醇中重結(jié)晶得到熊果酸單體產(chǎn)品，過濾所得濾液經(jīng)濃縮析晶得到齊墩果酸單體產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟A中苦丁茶水提液過濾后所得到的濾液，經(jīng)過微濾澄清、納濾濃縮后所得濃縮液經(jīng)聚酰樹脂層析柱吸附洗脫干燥得到茶多酚產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟A中水提時(shí)純水的加入量(mL)與加入的苦丁茶粉末質(zhì)量(g)的液固比為10～100倍，沸水水浴中提取時(shí)間為0.5～2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟A中醇提時(shí)乙醇溶液的濃度為80％以上，加入量(mL)與苦丁茶粉末質(zhì)量(g)的液固比為10～100倍，每次提取時(shí)間為2-3小時(shí)，提取2-3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟A中微濾過程采用膜孔徑為50nm～500nm的陶瓷膜在30℃～50℃，膜面流速為2～3m/s，錯(cuò)膜壓力在0.15～0.2MPa進(jìn)行；步驟A中的納濾過程采用截留分子量為300～500的納濾膜進(jìn)行濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于首先調(diào)節(jié)PH值到8～11范圍內(nèi)，過濾后將濾液pH值調(diào)節(jié)至2～5，所得沉淀物即三萜酸粗品。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種從苦丁茶中提取熊果酸、齊墩果酸的方法。該方法以海南產(chǎn)苦丁茶為原料，首先以純水提取，過濾，所得濾渣以乙醇回流提取，醇提液采用無機(jī)膜過濾方法除去其中大分子雜質(zhì)，超濾所得滲透液經(jīng)納濾濃縮、大分子樹脂層析柱吸附洗脫、洗脫液濃縮結(jié)晶，得到總?cè)扑岽制?，所得總?cè)扑岽制方?jīng)水洗、乙醇溶解、堿化、酸化、再次水洗、重結(jié)晶后得到總?cè)扑?，所得總?cè)扑岙a(chǎn)品經(jīng)甲醇溶解致沸騰，趁熱過濾，所得濾液經(jīng)濃縮析晶得到齊墩果酸單體產(chǎn)品，所得沉淀物經(jīng)水洗，乙醇溶解結(jié)晶得到熊果酸單體產(chǎn)品。上述苦丁茶水提液過濾所得濾液經(jīng)超濾澄清、納濾濃縮、聚酰樹脂選擇性吸附、洗脫，所得洗脫液經(jīng)濃縮得到一定純度的茶多酚單品。
文檔編號(hào)C07H17/00GK101016328SQ20071002006
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者邢衛(wèi)紅, 徐南平, 王玨 申請人:南京工業(yè)大學(xué)