專利名稱：識(shí)別增殖性人肝細(xì)胞的抗體、增殖性人肝細(xì)胞和功能性人肝細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)發(fā)明涉及到識(shí)別增殖性人肝細(xì)胞的抗體和人肝細(xì)胞。更詳細(xì)地講，本申請(qǐng)發(fā)明涉及到特異性識(shí)別具有克隆性增殖能力的人肝細(xì)胞，對(duì)于從人肝細(xì)胞組分離增殖性肝細(xì)胞有用的單克隆抗體，通過(guò)使用該抗體分離的增殖性人肝細(xì)胞，將該增殖性人肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)為分化肝細(xì)胞的方法，通過(guò)該方法分化誘導(dǎo)的功能性人肝細(xì)胞以及備有該功能性人肝細(xì)胞的肝細(xì)胞試劑盒和體外型人工肝臟。
背景技術(shù)：
肝臟具有500多種以上的多種多樣的特異功能。作為肝臟的主要功能如血漿蛋白質(zhì)的合成分泌、通過(guò)糖異生和糖原代謝進(jìn)行血糖調(diào)節(jié)、脂質(zhì)合成、尿素合成、膽汁合成分泌、解毒等。
攝入到體內(nèi)的很多物質(zhì)在肝臟中代謝。在醫(yī)藥品開(kāi)發(fā)的領(lǐng)域中，醫(yī)藥品候補(bǔ)物質(zhì)在肝臟受到什么樣的代謝，對(duì)肝臟和其他臟器或組織有什么樣影響等是必需的資料。另外，到目前為止，很多化學(xué)物質(zhì)被合成也釋放到環(huán)境。闡明這些物質(zhì)每一個(gè)、或復(fù)合后對(duì)人體有什么樣的影響對(duì)于社會(huì)也是非常重要的，對(duì)于這樣的化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體的影響的評(píng)價(jià)也需要對(duì)肝功能的毒性試驗(yàn)。
在以醫(yī)藥品候補(bǔ)物質(zhì)為首的化學(xué)物質(zhì)的安全性試驗(yàn)和藥物代謝試驗(yàn)中，目前可以使用小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。特別在醫(yī)藥品開(kāi)發(fā)中，在進(jìn)入以人為對(duì)象的第一相試驗(yàn)之前，有義務(wù)使用動(dòng)物進(jìn)行毒性試驗(yàn)和安全性試驗(yàn)，試驗(yàn)需要大量的時(shí)間和勞力，投資額也巨大。
然而，通過(guò)這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的資料不能保證直接可以應(yīng)用于人。事實(shí)上，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中認(rèn)為沒(méi)有毒性的物質(zhì)對(duì)人表現(xiàn)出毒性的事例很多，而相反的場(chǎng)合也有。因此，到目前為止，很多醫(yī)藥品候補(bǔ)物質(zhì)在進(jìn)入以人為對(duì)象的第一相試驗(yàn)后處于開(kāi)發(fā)中止，而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中由于毒性強(qiáng)在進(jìn)入臨床試驗(yàn)前變成開(kāi)發(fā)中止的物質(zhì)中實(shí)際上認(rèn)為對(duì)人沒(méi)有毒性的個(gè)案也存在很多。
人們認(rèn)為這起因于人的肝臟中的代謝功能和小鼠或大鼠的肝臟的代謝功能不同。最近，已經(jīng)可以使用人肝細(xì)胞進(jìn)行體外代謝試驗(yàn)或毒性試驗(yàn)了?？墒?，從通過(guò)不能用于移植的腦死亡患者的肝臟或腫瘤摘出等的切除肝得到的人肝細(xì)胞的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于需要。因此，人肝細(xì)胞的增殖技術(shù)的開(kāi)發(fā)在醫(yī)藥品開(kāi)發(fā)中非常必要。
而大量的人肝細(xì)胞的必要性在體外型人工肝臟中也同樣。人工肝臟是通過(guò)人工方式代行肝臟功能的醫(yī)療裝置，將吸附、透析、過(guò)濾等依據(jù)物理化學(xué)原理的人工作用和通過(guò)摘出肝或肝組織的灌流產(chǎn)生的生物學(xué)作用組合的雜合型人工肝臟的開(kāi)發(fā)正全力進(jìn)行著。在進(jìn)行這樣的人工肝臟開(kāi)發(fā)時(shí)，在用于使物理化學(xué)方面的功能提高的膜或回路的性能提高的同時(shí)，可適用于人的大量肝細(xì)胞的供給是不可缺的。然而，人的肝細(xì)胞到目前為止一直認(rèn)為對(duì)成熟個(gè)體分離的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)是不可能的。即，因?yàn)閷?duì)于粘附依賴性的成熟肝細(xì)胞，為了進(jìn)行該細(xì)胞的傳代操作從培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行剝離時(shí)會(huì)造成很大損傷，再使他粘附培養(yǎng)基質(zhì)更困難。與此相反，本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)明了從由人肝臟分離的正常肝細(xì)胞分離具有克隆性的增殖能力的小型肝細(xì)胞，對(duì)該小型肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，再將該培養(yǎng)肝細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)之后使肝細(xì)胞增殖的方法，獲得了專利(特開(kāi)平08-112092號(hào)公報(bào)；日本專利第3266766號(hào)；美國(guó)專利第6,004,810號(hào)、特開(kāi)平10-179148號(hào)公報(bào)；日本專利第3211941號(hào)、特開(kāi)平7-274951公報(bào)；日本專利第3157984號(hào)、特開(kāi)平9-313172號(hào)公報(bào)；日本專利第3014322號(hào))。另外相關(guān)的論文也已經(jīng)發(fā)表(Chise Tateno，and Katsutoshi YoshizatoGrowth and differentiation in culture of clonogenic hepatocytes thatexpress both phenotypes of hepatocytes and biliary epithelial cells.American Journal of Pathology 1491593-1605，1996.Hiroshi Hino，Chise Tateno，Hajime Sato，Chihiro Yamasaki，Shigeru Katayama，Toshihiko Kohashi，Akio Aratani，Toshimasa Asahara，Kiyohiko Dohi，and Katsutoshi YoshizatoA long-term culture of human hepatocyteswhich show a high growth potential and express their differentiatedphenotypes.Biochemical and Biophysical Research Communications256184-191，1999.Chise Tateno，Kaori Takai-Kajihara，ChihiroYamasaki，Hajime Sato，and Katsutoshi YoshizatoHeterogeneity ofgrowth potential of adult rat hepatocytes in vitro.Hepatology 3165-74，2000.Shigeru Katayama，Chise Tateno，Toshimasa Asahara，andKatsutoshi YoshizatoSize-dependent in vivo growth potential of adultrat hepatocytes.American Journal of Pathology 15897-105，2001.)。
這一先前申請(qǐng)專利發(fā)明的方法是提供用于在體外使肝細(xì)胞增殖，得到大量的人肝細(xì)胞的新手段的方法，但存在著在長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)中幾種肝功能下降的問(wèn)題。而該小型肝細(xì)胞在以清蛋白表達(dá)量、化學(xué)物質(zhì)代謝酶細(xì)胞色素P450活性等為指標(biāo)時(shí)，也存在著不能分化為具有與正常肝細(xì)胞同等功能的肝細(xì)胞(功能性肝細(xì)胞)的問(wèn)題。由于這一原因，雖然作為例如維持肝功能的藥劑的篩選體系，或就長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后仍保存的特定功能進(jìn)行藥劑的毒性或藥效進(jìn)行試驗(yàn)的體系是有用的，但作為代替人肝功能的肝細(xì)胞，或作為雜合型人工肝臟的材料還存在不充分的地方。
而具有增殖能力的小型肝細(xì)胞除了使用上述以前申請(qǐng)發(fā)明記載的那樣的離心分離的方法(對(duì)低速離心分離的上清中的細(xì)胞進(jìn)行分離的方法)之外，也可以通過(guò)淘析器或FACS等細(xì)胞分級(jí)裝置採(cǎi)取。通過(guò)這樣手段得到的細(xì)胞不只是增殖性肝細(xì)胞，而是與其他細(xì)胞(例如，在低速離心得到的上清含有的星形細(xì)胞等非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞)的混合物。因此，需要可以實(shí)質(zhì)上只獲得增殖性人肝細(xì)胞的手段。
本申請(qǐng)發(fā)明就是借鑒以上那樣的事情做成的發(fā)明，將提供特異性識(shí)別增殖性人肝細(xì)胞的單克隆抗體作為課題。
另外，本申請(qǐng)發(fā)明將提供增殖性人肝細(xì)胞的分離方法，以及通過(guò)該方法得到的增殖性人肝細(xì)胞作為課題。
另外，本申請(qǐng)發(fā)明將提供使增殖性人肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)為功能性人肝細(xì)胞的方法，利用該方法得到的功能性人肝細(xì)胞以及功能性人肝細(xì)胞的利用作為課題。

發(fā)明內(nèi)容
作為用于解決上述課題的第1發(fā)明，本申請(qǐng)?zhí)峁┨禺愋宰R(shí)別增殖性人肝細(xì)胞的單克隆抗體。第1發(fā)明的單克隆抗體的一個(gè)例子是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體。
作為第2發(fā)明，提供產(chǎn)生第1發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。該雜交瘤細(xì)胞的一個(gè)例子是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)。
作為第3發(fā)明，提供增殖性人肝細(xì)胞的分離方法，其特征是由人肝細(xì)胞組分離上述第1發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞。
作為第4發(fā)明，提供用上述第3發(fā)明的方法分離的增殖性人肝細(xì)胞。
另外作為第5發(fā)明，提供增殖性人肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，該方法是分化誘導(dǎo)上述第4發(fā)明的增殖性人肝細(xì)胞的方法，其特征是至少進(jìn)行以下手段中的一方。
(a)增殖性人肝細(xì)胞的球體培養(yǎng)；以及(b)向增殖性人肝細(xì)胞導(dǎo)入肝細(xì)胞核因子4(HNF4)基因作為第6發(fā)明，提供用上述第5發(fā)明的方法分離的功能性人肝細(xì)胞。
另外作為第7發(fā)明，提供含有上述第6發(fā)明的功能性人肝細(xì)胞的細(xì)胞試劑盒。
另外作為第8發(fā)明，提供充填了上述第6發(fā)明的功能性人肝細(xì)胞的雜合型人工肝臟。
而在本發(fā)明中所謂的「增殖性人肝細(xì)胞」指的是在培養(yǎng)條件下(invitro)，形成作為單一細(xì)胞種群的集落，進(jìn)行增殖使集落增大的人肝細(xì)胞。另外，其增殖在集落構(gòu)成細(xì)胞是單一種類這一點(diǎn)上，有時(shí)也稱之為「克隆性增殖」。另外，這樣細(xì)胞是通過(guò)傳代培養(yǎng)可以進(jìn)一步增加細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞。
而在本發(fā)明中所謂「功能性肝細(xì)胞」指的是在人體內(nèi)(in vivo)或原代培養(yǎng)(in vitro)的具有與正常肝細(xì)胞同等程度功能的細(xì)胞，更具體指的是至少「清蛋白表達(dá)量」以及「細(xì)胞色素P450活性」實(shí)質(zhì)上與正常細(xì)胞同等。
本發(fā)明中的其他用語(yǔ)和概念在發(fā)明的實(shí)施方式的說(shuō)明和實(shí)施例中有詳細(xì)的規(guī)定。另外為了實(shí)施本發(fā)明使用的各種各樣的技術(shù)，除了明確給出其資料的技術(shù)外，只要是同行根據(jù)眾所周知的文獻(xiàn)都可以容易而且確實(shí)地實(shí)施。例如，本發(fā)明的基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)在Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Sping Harbor Laboratory Press，New York，1989；Ausubel，F(xiàn).M.etal.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，N.Y，1995等有記載。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是對(duì)由不同年齡患者採(cǎi)取的肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的增殖曲線。
圖2是為了制作單克隆抗體，作為抗原使用的培養(yǎng)人肝細(xì)胞的相差顯微鏡圖像。
圖3是通過(guò)熒光抗體染色觀察到的雜交瘤K8223培養(yǎng)上清在人肝組織中的反應(yīng)性的圖像。
圖4是通過(guò)FACS對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清No.23在剛分離的人肝細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析的結(jié)果。
圖5是分別收集、培養(yǎng)與雜交瘤培養(yǎng)上清No.23反應(yīng)的細(xì)胞組(R2)和不反應(yīng)的細(xì)胞組(R3)時(shí)的相差顯微鏡圖像。
圖6是通過(guò)FACS對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清No.23在傳代培養(yǎng)人肝細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析的結(jié)果。
圖7是單層培養(yǎng)和球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞分別在培養(yǎng)第1天(上段)和第7天(下段)的相差顯微鏡圖像。
圖8是表示在從人肝臟剛分離的肝細(xì)胞、單層培養(yǎng)的傳代培養(yǎng)肝細(xì)胞、以及球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞的各個(gè)細(xì)胞中人型P450基因或GAPDH基因表達(dá)量的曲線圖。
圖9是表示單層培養(yǎng)和球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞的清蛋白分泌量隨時(shí)間的變化的曲線圖。
圖10是表示在導(dǎo)入了HNF4基因的培養(yǎng)人細(xì)胞中人型P450基因的表達(dá)量的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
第1發(fā)明的單克隆抗體其特征是特異性識(shí)別形成集落的同時(shí)增殖的人肝細(xì)胞。更詳細(xì)地講，該單克隆抗體其特征是特異性識(shí)別形成集落的同時(shí)增殖，而且可向功能性人肝細(xì)胞分化的人肝細(xì)胞。此時(shí)的所謂「特異性識(shí)別」指的是只與上述的人肝細(xì)胞結(jié)合，而不與其他細(xì)胞和/或不具有上述特征的人肝細(xì)胞結(jié)合。
第1發(fā)明的單克隆抗體是可以通過(guò)眾所周知的方法從本申請(qǐng)第2發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞獲得。雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體可以根據(jù)眾所周知的單克隆抗體制作方法(「單克隆抗體」，長(zhǎng)宗香明、寺田弘共著、廣川書(shū)店、1990年；“Monoclonal Antibody”James W.Goding，thirdedition，Academic Press，1996)，按照例如以下步驟制作。
1雜交瘤細(xì)胞的制作用含有傳代培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞的免疫原免疫哺乳動(dòng)物，根據(jù)需要可以適當(dāng)進(jìn)行追加免疫，對(duì)動(dòng)物充分致敏。然后從該動(dòng)物中摘出抗體產(chǎn)生細(xì)胞(淋巴細(xì)胞或脾臟細(xì)胞)，獲得該細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株的融合細(xì)胞。然后從這些融合細(xì)胞中選擇產(chǎn)生目的單克隆抗體的細(xì)胞，通過(guò)培養(yǎng)可以得到雜交瘤細(xì)胞。以下對(duì)各工序進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
a)免疫原的制備對(duì)通過(guò)膠原酶從正常肝組織分離到的人肝細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，作為免疫原。人肝細(xì)胞優(yōu)選使用可進(jìn)行4次以上，優(yōu)選是6次以上傳代的，例如從15歲以下的人肝組織分離的肝細(xì)胞。
b)動(dòng)物免疫作為被免疫動(dòng)物，可以使用眾所周知的在雜交瘤制作法中使用的哺乳動(dòng)物。具體來(lái)說(shuō)，如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但從與摘出的抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞容易取得等觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用小鼠或大鼠作為被免疫動(dòng)物。而實(shí)際使用的小鼠和大鼠的系統(tǒng)沒(méi)有特別限制，使用小鼠時(shí)，可以使用例如各系統(tǒng)A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB、129等，使用大鼠時(shí)可以使用例如Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。其中如果考慮到與下述的骨髓瘤細(xì)胞的融合適合性，小鼠的BALB/c系統(tǒng)，大鼠的Low系統(tǒng)作為被免疫動(dòng)物特別合適。另外這些小鼠或大鼠在免疫時(shí)的周齡優(yōu)選為5～12周齡。
動(dòng)物的免疫可以通過(guò)將作為免疫原的傳代人肝細(xì)胞約104～108個(gè)注射到動(dòng)物的皮下或腹腔內(nèi)進(jìn)行。免疫原投給的程序因被免疫動(dòng)物的種類、個(gè)體差異等而有所不同，一般來(lái)說(shuō)，投給免疫原次數(shù)為1～6次，多次投給時(shí)投給間隔優(yōu)選為1～2周。
c)細(xì)胞融合在無(wú)菌條件下從上述投給程序的最終免疫日后1～5日的被免疫動(dòng)物取出含有抗體產(chǎn)生細(xì)胞的脾臟細(xì)胞或淋巴細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)眾所周知的方法從這些脾臟細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
然后，對(duì)抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞沒(méi)有特別限制，可以從眾所周知的細(xì)胞株中選用合適的。但考慮到從融合細(xì)胞選擇雜交瘤時(shí)的便利性，優(yōu)選使用其選擇已經(jīng)確立的HGPRT(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株。即，來(lái)自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS-1)、P3X63-Ag8、U1(P3U1)、X63-Ag8、653(X63.653)、SP2/O-Ag14(SP2/O)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO，BU.1等，來(lái)自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等，來(lái)自人的U266AR(SKO-007)、GM1500 GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合根據(jù)眾所周知的方法可以在不使細(xì)胞存活率極度降低的條件下適宜實(shí)施。這樣的方法如可以使用在聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中對(duì)抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合的化學(xué)方法，利用電刺激的物理方法等。
融合細(xì)胞和非融合細(xì)胞的選擇優(yōu)選是通過(guò)例如眾所周知的HAT(次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷)選擇法進(jìn)行。該方法在使用在氨甲蝶呤存在下不能存活的HGPRT缺損株的骨髓瘤細(xì)胞獲得融合細(xì)胞時(shí)是有效的。即，通過(guò)將未融合細(xì)胞和融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，有選擇地保留了對(duì)氨甲蝶呤具有抗性的融合細(xì)胞，而且可以使其增殖。
d)雜交瘤的篩選對(duì)產(chǎn)生目的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選可以通過(guò)眾所周知的酶免疫檢定法(EIAEnzyme Immunoassay)、放射線免疫測(cè)定法(RIARadio Immunoassay)、熒光抗體法等進(jìn)行。
通過(guò)這樣篩選，可以得到分別產(chǎn)生與具有高增殖能力的人肝細(xì)胞特異結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞群。
而篩選后的雜交瘤可以通過(guò)甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、有限稀釋法等眾所周知的方法進(jìn)行篩選，用于產(chǎn)生抗體。
通過(guò)象以上那樣方法得到的雜交瘤細(xì)胞可以在液氮中或-80℃以下的冷庫(kù)中以冷凍狀態(tài)保存。作為這樣的雜交瘤細(xì)胞的具體例子，本申請(qǐng)?zhí)峁┬∈?小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)。
2單克隆抗體的獲得和純化通過(guò)用眾所周知的方法對(duì)上述1制作的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得只與增殖性人肝細(xì)胞特異結(jié)合的單克隆抗體。
培養(yǎng)，可以在例如上述克隆法中使用的同樣組成的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或?yàn)榱耸箚慰寺】贵w大量生產(chǎn)，也可以向小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞，從腹水中棌取單克隆抗體。
這樣得到的單克隆抗體可以通過(guò)硫銨鹽析法、凝膠過(guò)濾法、離子交換層析法、親和層析法等進(jìn)行純化。
作為雜交瘤的具體例子，本申請(qǐng)?zhí)峁┥鲜鲭s交瘤細(xì)胞小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)，而作為單克隆抗體的具體例子，提供雜交瘤細(xì)胞小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體。
第3發(fā)明是增殖性人肝細(xì)胞的分離方法，其特征是從人肝細(xì)胞組分離收集上述第1發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞。人肝細(xì)胞組可以通過(guò)例如膠原酶灌流法等眾所周知的方法從人肝臟中分離，可作為置于培養(yǎng)條件下的原代細(xì)胞、或?qū)υ?xì)胞進(jìn)行1～8次傳代培養(yǎng)的傳代細(xì)胞。或者，該人肝細(xì)胞組也可以是本申請(qǐng)發(fā)明人提出的專利發(fā)明(特開(kāi)平08-112092號(hào)公報(bào)；日本專利第3266766號(hào)；美國(guó)專利第6,004,810號(hào)、特開(kāi)平10-179148號(hào)公報(bào)；日本專利第3211941號(hào)、特開(kāi)平7-274951公報(bào)；日本專利第3157984號(hào)、特開(kāi)平9-313172號(hào)公報(bào)；日本專利第3014322號(hào))中的「含有小型人肝細(xì)胞的細(xì)胞組」。即，在這些專利發(fā)明中的小型人肝細(xì)胞中包括星形細(xì)胞等非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞、以及用于小型人肝細(xì)胞的培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)共培養(yǎng)的Swiss 3T3細(xì)胞等。通過(guò)使用第1發(fā)明的單克隆抗體，可以從這樣的細(xì)胞組更有效地對(duì)增殖性人肝細(xì)胞進(jìn)行分離。
增殖性肝細(xì)胞的分離可以通過(guò)使用酶、放射性同位素、磁株、或熒光色素等標(biāo)記的單克隆抗體接觸上述的人肝細(xì)胞組，分離發(fā)出標(biāo)記信號(hào)的細(xì)胞進(jìn)行。在該方法中，由于在離心分離或細(xì)胞分級(jí)裝置等中幾乎沒(méi)有細(xì)胞負(fù)荷，所以可以以幾乎無(wú)損傷的狀態(tài)獲得增殖性人肝細(xì)胞。而作為標(biāo)記使用的酶只要滿足轉(zhuǎn)換數(shù)大、與抗體結(jié)合也穩(wěn)定、使底物特異著色等條件的酶，沒(méi)有特別限制，通常的EIA中使用的酶，例如可以使用過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶等。另外也可以使用酶抑制物質(zhì)或輔酶等。這些酶和抗體結(jié)合可以通過(guò)使用馬來(lái)酰亞胺化合物等架橋劑的眾所周知的方法進(jìn)行。作為底物可以根據(jù)使用的酶的種類使用眾所周知的物質(zhì)。例如作為酶使用過(guò)氧化物酶時(shí)，可以使用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，而作為酶使用堿性磷酸酶時(shí)，可以使用對(duì)硝基苯酚等。作為放射性同位素可以使用125I或3H等通常RIA中使用的同位素。作為熒光色素可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)或四甲基羅丹明熒光素(TRITC)等通常在熒光抗體法中使用的熒光色素。另外，標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)在使用酶時(shí)加由于酶分解作用而發(fā)色的底物，通過(guò)對(duì)底物的分解量進(jìn)行光學(xué)測(cè)定，求酶活性，將其換算為結(jié)合抗體量，從與標(biāo)準(zhǔn)值的比較可以算出抗體量。使用放射性同位素時(shí)，通過(guò)閃爍掃描計(jì)數(shù)器等測(cè)定放射性同位素發(fā)出的放射線量。而在使用熒光色素時(shí)，可以通過(guò)組合了熒光顯微鏡的測(cè)定裝置測(cè)定熒光量。
通過(guò)以上方法，可以得到本申請(qǐng)的第4發(fā)明的「增殖性人肝細(xì)胞」。該增殖性人肝細(xì)胞在培養(yǎng)條件下形成集落的同時(shí)增殖活躍，另外也是具有向功能性人肝細(xì)胞分化能力的細(xì)胞。這樣的功能性人肝細(xì)胞可以通過(guò)第5發(fā)明的方法由增殖性人肝細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)。另外，增殖性人肝細(xì)胞也可以通過(guò)作為實(shí)施例1的單克隆抗體制作時(shí)作為免疫原使用的人肝細(xì)胞的獲得方法得到，但在該實(shí)施例1的方法的情形中也有可能含有非增殖性細(xì)胞。使用本發(fā)明的單克隆抗體的方法是在實(shí)質(zhì)上可以只分離增殖性人肝細(xì)胞方面的優(yōu)越的方法。
第5發(fā)明的方法其特征是進(jìn)行以下手段(a)或(b)，或(a)和(b)。
(a)增殖性人肝細(xì)胞的球體培養(yǎng)所謂「球體」指的是數(shù)百個(gè)細(xì)胞集合后形成組織構(gòu)造的細(xì)胞的集合體。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)以下所示的方法使細(xì)胞成為3維的細(xì)胞組，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞組進(jìn)行培養(yǎng)。作為獲得球體的眾所周知的方法，如在基底膜(MATRIGELTMMatrix、ベクトン·デイツキンソン)、正負(fù)荷的培養(yǎng)器(プライマリア、ベクトン·デイツキンソン)、U底培養(yǎng)器(スフエロイド·MS？0096S、スミロン)上的培養(yǎng)或通過(guò)滾瓶的回轉(zhuǎn)培養(yǎng)等。可以培養(yǎng)6～15日左右。
(b)肝細(xì)胞核因子4(HNF4)向增殖性人肝細(xì)胞的導(dǎo)入肝細(xì)胞核因子4(hepatocyte nuclear factor 4HNF4)是與在肝細(xì)胞中表現(xiàn)出特異功能的基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，Bell，G.I.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88(4)1484-1488，1991)、人HNF4a的序列已眾所周知(例如，GenBank/NM_000457)。還有HNF4 b(GenBank/X87871)、HNF4c(GenBank/X 87872)的cDNA序列也都眾所周知。另外小鼠HNF4cDNA(GenBank/NM_008261)、大鼠HNF4cDNA(GenBank/X 57133)等也都眾所周知。因此，將這些眾所周知的HNF4 cDNA重組到真核細(xì)胞表達(dá)載體中，將該載體通過(guò)例如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖等眾所周知的方法導(dǎo)入到增殖性人肝細(xì)胞，可以導(dǎo)入HNF4基因?；蛘?，通過(guò)依據(jù)使用例如對(duì)生物體識(shí)別分子進(jìn)行提示的中空納米粒子、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等基因療法(ex vivo)的方法也可以導(dǎo)入HNF4基因。HNF4基因cDNA可以通過(guò)使用根據(jù)那些已知序列制作的探針，對(duì)人等的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選獲得。得到的cDNA可以通過(guò)例如PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBN(Nucleic acid sequencebased amplification)法、TMA(Transcription-mediated amplification)法以及SDA(Strand Displacement Amplification)法等通常進(jìn)行的基因擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)使用根據(jù)已知序列做成的引物組，以從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離的mRNA為模板的RT-PCR(ReverseTranscriptase-PCR)法也可以獲得充足量的目的cDNA。
通過(guò)以上的分化誘導(dǎo)方法，就象下面實(shí)施例所示的那樣，可以得到與人體內(nèi)或原代培養(yǎng)中人正常細(xì)胞同等程度的功能性，具體來(lái)說(shuō)具有充足量的清蛋白表達(dá)和細(xì)胞色素P450活性的第6發(fā)明的功能性肝細(xì)胞。另外，通過(guò)以上分化誘導(dǎo)產(chǎn)生的功能性人肝細(xì)胞也可以用例如與在下面實(shí)施例1中制備免疫原人肝細(xì)胞的方法同樣的方法得到的傳代培養(yǎng)細(xì)胞(形成集落，可傳代培養(yǎng)的肝細(xì)胞)實(shí)施。但是，在這樣的傳代培養(yǎng)細(xì)胞中也有可能包含非增殖性細(xì)胞。
通過(guò)使用用以上方法得到的第6發(fā)明的功能性人肝細(xì)胞，可以提供在藥物代謝試驗(yàn)和安全性試驗(yàn)等中使用的人肝細(xì)胞試劑盒(第7發(fā)明)以及雜合型人工肝臟(第8發(fā)明)。另外使用在雜合型人工肝臟中使用的模件(充填人肝細(xì)胞的模件)，可以回收人肝細(xì)胞生產(chǎn)的有用物質(zhì)。
眾所周知肝細(xì)胞試劑盒根據(jù)細(xì)胞的種類和用途有各種各樣，只要是同行，通過(guò)采用第6發(fā)明的人肝細(xì)胞和眾所周知的細(xì)胞試劑盒的構(gòu)成，可以很容易制作第7發(fā)明的細(xì)胞試劑盒。另外模件和混雜型人工臟器的構(gòu)成也眾所周知，只要是同行可以很容易制作第8發(fā)明的人工肝臟等。
實(shí)施例以下給出實(shí)施例，對(duì)本申請(qǐng)發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)而且具體的說(shuō)明，但本申請(qǐng)發(fā)明并不限定于以下例子。
1.人肝細(xì)胞的培養(yǎng)通過(guò)膠原酶灌流法從人肝臟組織得到細(xì)胞分散液。將細(xì)胞分散液經(jīng)低速離心分離(50g，2分鐘)，將該沉淀級(jí)分用添加了胎牛血清、人血清、EGF、尼克酰胺、活性持續(xù)型維生素C的Dulbecco’s modifiedEagle’s medium(DMEM)，與經(jīng)絲裂霉素C處理后的Swiss 3T3細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)。Swiss 3T3細(xì)胞每10日添加一次。從培養(yǎng)第7天時(shí)開(kāi)始觀察到人肝細(xì)胞的集落。將增殖到鋪滿的肝細(xì)胞用EDTA/Trypsin進(jìn)行傳代。傳代如用小孩的肝細(xì)胞可以傳代6-9次，而60歲以上的患者的肝細(xì)胞只能傳代3-4次(圖1)。將表現(xiàn)出更高增殖能力的小孩(12歲)的肝細(xì)胞用作抗原(圖2)。
2.動(dòng)物的免疫利用上述方法，在培養(yǎng)皿上使3-5次傳代培養(yǎng)的小孩(12歲)肝細(xì)胞增加。將增殖至鋪滿的細(xì)胞(約1×107個(gè))用PBS(磷酸緩沖鹽類溶液)洗凈后，除去PBS，用細(xì)胞刮棒攪和回收，懸浮于約1ml PBS中。然后將他注入6周齡的Balb/c鼠的腹腔內(nèi)。再于20天后或30天后用同樣方法進(jìn)行免疫。
3.細(xì)胞融合經(jīng)2次免疫后，看到抗體效價(jià)上升，第3次免疫(boost)72小時(shí)后，從1只免疫動(dòng)物摘出脾臟，採(cǎi)取脾臟細(xì)胞。對(duì)該脾臟細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞(細(xì)胞名NS-1)進(jìn)行細(xì)胞融合，向96孔板播種372孔進(jìn)行培養(yǎng)。
4.雜交瘤的篩選1次篩選(ELISA、組織染色)通過(guò)ELISA測(cè)定得到的融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)抗原的反應(yīng)性。測(cè)定通過(guò)以下方法實(shí)施。將作為抗原使用的傳代培養(yǎng)肝細(xì)胞播種到96孔板，培養(yǎng)后用PBS洗凈，使其干燥，預(yù)先保存在-80℃下，使培養(yǎng)上清與其反應(yīng)。然后使酶標(biāo)記的抗鼠IgG或抗鼠IgM抗體反應(yīng)，加入底物，發(fā)色，測(cè)定其吸光度。結(jié)果融合細(xì)胞372個(gè)樣品的吸光度的平均值為0.149(SD0.099)，將其中吸光度在0.20以上(81個(gè)樣品，約20％)的樣品作為陽(yáng)性。另外由于通過(guò)目視，即使吸光度為0.15以上也可確認(rèn)發(fā)色，所以對(duì)于0.15～0.20的樣品(46個(gè)樣品)進(jìn)行組織染色確認(rèn)了反應(yīng)性。只將其中感興趣的表現(xiàn)出深染色帶的13個(gè)樣品作為陽(yáng)性樣品。對(duì)選擇的陽(yáng)性樣品94個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)大后進(jìn)一步培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清后，將細(xì)胞冷凍保存。
5.2次篩選(ELISA、組織染色)通過(guò)與1次篩選同樣的ELISA測(cè)定由在1次篩選中選擇的94樣品擴(kuò)大后的培養(yǎng)上清對(duì)抗原的反應(yīng)性，選擇陽(yáng)性樣品88個(gè)樣品。再通過(guò)組織染色研究這些樣品在組織中的反應(yīng)性。就其中含有與肝細(xì)胞的細(xì)胞膜或門靜脈區(qū)的肝細(xì)胞特異反應(yīng)的雜交瘤的樣品，或通過(guò)從其中克隆得到的集落的培養(yǎng)上清對(duì)剛分離的人肝細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行研究。
就組織中門靜脈區(qū)的肝細(xì)胞膜染色的雜交瘤培養(yǎng)上清No.23在剛分離的肝細(xì)胞表面中的反應(yīng)性使用FACS(Fluorescence activated cellsorting)進(jìn)行解析。通過(guò)用該樣品的培養(yǎng)上清對(duì)通過(guò)膠原酶灌流、低速離心從成年人男性(46歲和49歲)的肝臟得到的細(xì)胞在4℃下處理30分鐘，然后于4℃下進(jìn)行30分鐘的FITC標(biāo)記的抗鼠IgG抗體處理，可用FACS進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞組的一部分(1～2％)細(xì)胞與該樣品反應(yīng)(圖4)。在此，將這些細(xì)胞組作為R2收集，沒(méi)有反應(yīng)的細(xì)胞組作為R3收集，進(jìn)行培養(yǎng)。另外，分類收集前的肝細(xì)胞也同樣進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果在分類收集前的肝細(xì)胞中，就象上述那樣，從培養(yǎng)到第7天時(shí)觀察到集落形成。而在R3級(jí)分中沒(méi)有觀察到形成集落的細(xì)胞，在與No.23反應(yīng)的R2級(jí)分中，觀察到許多集落(圖5)。另外，通過(guò)FACS對(duì)傳代培養(yǎng)人肝細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行研究時(shí)，約80％的細(xì)胞呈陽(yáng)性(圖6)。即，認(rèn)為不識(shí)別傳代培養(yǎng)人肝細(xì)胞當(dāng)中在培養(yǎng)過(guò)程中分化的細(xì)胞，只識(shí)別增殖性肝細(xì)胞。由此表明，在No.23中可能含有特異性識(shí)別形成集落的細(xì)胞的雜交瘤。就通過(guò)克隆從No.23樣品得到的集落也利用FACS對(duì)在剛分離的肝細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析。結(jié)果得到3個(gè)表現(xiàn)出同樣反應(yīng)性的克隆。將來(lái)自其中的一個(gè)克隆(小鼠-小鼠雜交瘤K8223)作為專利生物于2002年3月6日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(委托號(hào)FERM P-18752)，另外于2003年3月20日進(jìn)行了國(guó)際保藏(委托號(hào)FERM BP-8334)。
6.單克隆抗體的制作通過(guò)培養(yǎng)上述的雜交瘤(K8223株)細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞注射到鼠腹腔內(nèi)，通過(guò)從腹水採(cǎi)集單克隆抗體，得到與增殖性人肝細(xì)胞特異結(jié)合的單克隆抗體。
實(shí)施例2增殖性人肝細(xì)胞的分離使用實(shí)施例1得到的單克隆抗體，從通過(guò)膠原酶灌流法從人肝組織分離的人肝細(xì)胞組分離增殖性人肝細(xì)胞。具體來(lái)說(shuō)，用實(shí)施例1得到的單克隆抗體對(duì)通過(guò)膠原酶灌流、低速離心從人肝臟組織得到的細(xì)胞于4℃下處理30分鐘，然后于4℃下進(jìn)行30分鐘FITC標(biāo)記鼠IgG抗體處理，用FACS檢測(cè)反應(yīng)。將與該抗體反應(yīng)的細(xì)胞組作為R2收集，沒(méi)有反應(yīng)的細(xì)胞組作為R3收集，用與實(shí)施例1.1同樣的方法進(jìn)行培養(yǎng)。另外分別收集前的肝細(xì)胞也同樣進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果在分別收集前的肝細(xì)胞中，從培養(yǎng)到第7天時(shí)開(kāi)始觀察到集落形成，但也觀察到了沒(méi)有形成集落的肝細(xì)胞。而在R3級(jí)分中沒(méi)有觀察到形成集落的細(xì)胞，在與該單克隆抗體反應(yīng)的R2級(jí)分中，觀察到許多集落。由以上結(jié)果可以確認(rèn)通過(guò)使用本發(fā)明的方法可以有效地從分離肝細(xì)胞組分離增殖性肝細(xì)胞。
實(shí)施例3球體形成導(dǎo)致增殖性人肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)1.肝細(xì)胞的球體形成將實(shí)施例2得到的增殖性人肝細(xì)胞播種到基底膜(MATRIGELTMMatrix、ベクトン·デイツキンソン)上，每1cm21×105個(gè)，于添加了胎牛血清、EGF、活性持續(xù)型維生素C的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。肝細(xì)胞在培養(yǎng)第1天于基底膜上形成球體(圖7上段)。
2.人型P450基因表達(dá)的解析將培養(yǎng)人肝細(xì)胞播種到基底膜上后，于第7天(圖7下段)回收球體。從該球體提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。合成對(duì)應(yīng)于6種人型P450分子(CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4)的各個(gè)基因cDNA的引物，用PRISM 7700 Sequence Detector(ABIPRISMTM公司)，對(duì)各個(gè)mRNA的表達(dá)量進(jìn)行定量。另外，從人肝臟剛分離的肝細(xì)胞和單層培養(yǎng)的增殖性人肝細(xì)胞也同樣，對(duì)P450基因表達(dá)進(jìn)行定量。
結(jié)果確認(rèn)球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞與單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞相比，各種人型P450的基因表達(dá)高。另外一部分人型P450基因表現(xiàn)出與剛分離的正常人肝細(xì)胞同等程度的P450基因表達(dá)(圖8)。
3.清蛋白分泌量的解析每3日回收一次球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞和單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞的各個(gè)培養(yǎng)上清，用定量ELISA分析(Bethyl Laboratories Inc.)測(cè)定培養(yǎng)基中的人清蛋白濃度。
結(jié)果與單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞比較，球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞在培養(yǎng)第6天以后表現(xiàn)出高的清蛋白分泌量(圖9)。
4.P450酶活性的解析從球體培養(yǎng)開(kāi)始后第22天向培養(yǎng)基中添加鹽酸(500μg/ml)利多卡因，溫育24小時(shí)?；厥张囵B(yǎng)基，通過(guò)HPLC測(cè)定培養(yǎng)基中的利多卡因代謝產(chǎn)物MEGX量。對(duì)于單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞也進(jìn)行同樣的測(cè)定。
結(jié)果在單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中沒(méi)有檢測(cè)到MEGX，但在球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測(cè)到了MEGX(8.3μg/ml/24小時(shí)、1.7μg/105cell/24小時(shí))，由此結(jié)果確認(rèn)球體培養(yǎng)的肝細(xì)胞具有P450酶活性(化學(xué)物質(zhì)代謝酶活性)。
實(shí)施例4
通過(guò)HNF4基因?qū)脒M(jìn)行增殖性人肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)1.基因?qū)朐谂囵B(yǎng)第1天通過(guò)腺病毒載體(Q·BIO gene公司)以感染復(fù)數(shù)(MOI)0、1、5、10、20、50、100的比例使人HNF4αcDNA(GenBank/X87870)感染實(shí)施例2得到的增殖性人肝細(xì)胞。
2.人型P450基因表達(dá)的解析回收腺病毒感染后第7天的細(xì)胞，與實(shí)施例3-2同樣對(duì)各種人型P450基因的表達(dá)量進(jìn)行定量。
結(jié)果確認(rèn)人型P450基因的表達(dá)量增加依賴于感染量(圖10)。
產(chǎn)業(yè)上利用可能性就象以上詳細(xì)說(shuō)明的那樣，通過(guò)本申請(qǐng)發(fā)明提供特異性識(shí)別具有增殖性的人肝細(xì)胞的單克隆抗體，通過(guò)使用該抗體分離的增殖性人肝細(xì)胞，通過(guò)對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)得到的功能性人肝細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種增殖性人肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，是分化誘導(dǎo)如下的增殖性人肝細(xì)胞的方法，所述的增殖性人肝細(xì)胞是從人肝細(xì)胞分離下述抗體識(shí)別的細(xì)胞，所述抗體是特異性識(shí)別存在于從成人肝臟分離的肝細(xì)胞組中且具有克隆性增殖能和向功能性肝細(xì)胞的分化能的增殖性人肝細(xì)胞的抗體，其特征是至少進(jìn)行以下手段中的一種，(a)增殖性人肝細(xì)胞的球體培養(yǎng)；以及(b)向增殖性人肝細(xì)胞導(dǎo)入肝細(xì)胞核因子4(HNF4)基因。
2.權(quán)利要求1的增殖性人肝細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其中，抗體是由雜交瘤細(xì)胞小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體。
3.一種用權(quán)利要求1或2的方法分化誘導(dǎo)的功能性人肝細(xì)胞。
4.一種含有權(quán)利要求3的功能性人肝細(xì)胞的細(xì)胞試劑盒。
5.一種充填了權(quán)利要求4的功能性人肝細(xì)胞的雜合型人工肝臟。
全文摘要
本發(fā)明提供特異性識(shí)別形成集落的同時(shí)增殖的人肝細(xì)胞的單克隆抗體、用該抗體分離人肝細(xì)胞的方法、將分離的增殖性人肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)為功能性人肝細(xì)胞的方法。另外本申請(qǐng)的方法提供通過(guò)上述方法獲得的增殖性人肝細(xì)胞和功能性肝細(xì)胞，以及含有該細(xì)胞的細(xì)胞試劑盒以及雜合型人工肝臟。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1920011SQ20061009406
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2003年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者向谷知世, 吉里勝利, 山崎千尋 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu), 財(cái)團(tuán)法人廣島縣產(chǎn)業(yè)振興機(jī)構(gòu)