專利名稱：嗜血桿菌屬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體之基因的分子克隆，特別是涉及來(lái)自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的克隆。
相關(guān)申請(qǐng)的參考文獻(xiàn)本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1993年12月29日的共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/175116的部分連續(xù)申請(qǐng)，而它本身又是申請(qǐng)日為1993年11月8日的共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)08/148,968部分連續(xù)申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
有莢膜的流感嗜血桿菌b型株是幼齡兒童中細(xì)胞性腦膜炎和其它侵入性感染的主要原因。然而，無(wú)莢膜的或不可分型的流感嗜血桿菌(NTHi)引起大范圍的人類疾病，包括中耳炎、會(huì)厭炎、肺炎和氣管支氣管炎。以結(jié)合到白喉毒素(Berkowitz et al.，1987。在本申請(qǐng)的全文中，圓括號(hào)內(nèi)提及的各種參考文獻(xiàn)更充分地描述了與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)狀態(tài)。各次引證的全部文獻(xiàn)目錄資料見(jiàn)說(shuō)明書(shū)最后，緊接權(quán)利要求之前。這些參考文獻(xiàn)的說(shuō)明書(shū)引用到本說(shuō)明書(shū)中以供參考)，破傷風(fēng)類毒素(Classon et al.，1989和US專利4,496,538)或腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白質(zhì)(Black et al.，1991)上的流感嗜血桿菌b型莢膜多糖為基礎(chǔ)的疫菌在減輕流感嗜血桿菌b型誘導(dǎo)的腦膜炎中有效，但對(duì)NTHi誘導(dǎo)的疾病無(wú)效(Bluestone，1982)。
中耳炎是幼年兒童最常見(jiàn)的疾病，60-78％的兒童在不到2歲的經(jīng)歷中有1到3次耳朵感染。慢性中耳炎引起兒童聽(tīng)力、談話和認(rèn)識(shí)損傷。流感嗜血桿菌感染在急性中耳炎病例中占大約30％，在慢性中耳炎中占大約60％。僅在美國(guó)，每年治療中耳炎使用的抗生素和手術(shù)過(guò)程(如扁桃體切除術(shù)，腺體切除術(shù)和鼓室口腔管插入)花費(fèi)1到2億美元。而且，許多中耳炎的病原體變得對(duì)抗生素治療產(chǎn)生抗性。因此需要一種對(duì)中耳炎有效的預(yù)防疫菌。流感嗜血桿菌的不定型菌株也是在老年人和對(duì)呼吸道感染特別敏感的其他個(gè)體中引起肺炎的重要病原體。因此，需要作為免疫原性制品中有用成分的來(lái)自流感嗜血桿菌的抗原，以便提供保護(hù)抵抗流感嗜血桿菌的許多血清型。
鐵是許多細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成份。一些人類病原體，如流感嗜血桿菌、Branhanella catarrhalis、腦膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)和不致病的共生奈瑟氏菌屬菌株可利用人轉(zhuǎn)鐵蛋白作為鐵來(lái)源(Schryvers，1988；Schryvers and Lee，1989；Mickelsen andSparling，1981)。細(xì)菌轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體(TfR)由2條鏈(Tbp1和Tbp2)組成。在流感嗜血桿菌菌株中，Tbp1的分子量是大約100,000，而Tbp2的分子量是可變的。根據(jù)菌株不同從60,000到90,000之間變動(dòng)(Schryvers and Gray-Owen，1992；Holland er al.，1992)。據(jù)認(rèn)為流感嗜血桿菌轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)受鐵和/或高鐵血紅素的的調(diào)控(Mortonet al.，1993)且已鑒定推斷的fur結(jié)合位點(diǎn)(Braun and Hantke，1991)在tbp2上游。在受鐵(包括腦膜炎奈瑟氏菌TfR)負(fù)調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了這一序列(Legrain et al.，1993)。該啟動(dòng)子后面是tbp2和tbp1基因，這種排列方式也存在于其它細(xì)菌TfR操縱子中(Legrain etal.，1993；Witoh et al.，1993)。封閉轉(zhuǎn)鐵蛋白受體接近其鐵來(lái)源的抗體可能阻止細(xì)菌生長(zhǎng)。另外，抗TfR的調(diào)理或殺菌抗體也可經(jīng)過(guò)另一種可選擇的機(jī)制提供保護(hù)作用。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其片段，其組成鏈或其衍生肽是防止流感嗜血桿菌疾病的候選疫苗。用含佛氏佐劑的腦膜炎奈瑟氏菌TfR蛋白質(zhì)免疫小鼠可抵抗同源攻擊感染，在被動(dòng)轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中抗TfR抗血清是有殺菌和保護(hù)性(Danve et al.，1993)。用重組A.pleuropneunoniae Tbp2免疫的豬可抵抗同源攻擊感染但不能抵抗異源攻擊感染(Rossi-Campos et al.，1992)。這些資料表明了以TfR為基礎(chǔ)的疫苗在抵抗疾病中的效率。令人滿意的是提供該DNA分子的序列，它編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，及與轉(zhuǎn)鐵蛋白的部分相應(yīng)的肽，以及含有用于診斷的該序列的載體，免疫接種和產(chǎn)生診斷和免疫學(xué)試劑。
脊髓灰質(zhì)炎病毒是細(xì)小核糖核酸病毒科一個(gè)屬的一種腸道病毒。該病毒有3個(gè)不同的血清型，每種血清型含多個(gè)病毒株。烈性菌株是麻痹性脊髓灰質(zhì)炎的病原體。減少了引起麻痹癥潛力的減毒病毒株和滅活的烈性病毒株用作疫苗。病毒感染引起長(zhǎng)期保護(hù)性粘膜免疫。用滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗接種也引起粘膜免疫應(yīng)答。
脊髓灰質(zhì)炎病毒的結(jié)構(gòu)已知，在病毒株和血清型中它高度保守。也已測(cè)定了一些其它細(xì)小核糖核酸病毒(屬于細(xì)小核糖核酸病毒科一些屬的病毒)的結(jié)構(gòu)并表明與脊髓灰質(zhì)炎病毒的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在脊髓灰質(zhì)炎病毒的衣殼上可表達(dá)外源抗原決定基(Hurdin er al.，1992)且這一工作推廣到其它細(xì)小核糖核酸病毒。表達(dá)抗原決定基一般是短而明確的連續(xù)抗原決定基，它們大多數(shù)在其它細(xì)小核糖核酸病毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒抑制抗原性位點(diǎn)I(NAgI)或相當(dāng)位點(diǎn)上表達(dá)。這一位點(diǎn)包括連接脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白VP1 β鏈B和C的環(huán)(BC環(huán))。VP1的BC環(huán)是9個(gè)氨基酸的表面暴露環(huán)。它可被取代且可用至少25個(gè)異源氨基酸延伸(Murdin et al.，1991)。產(chǎn)生高效價(jià)且具有免疫原性的表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗原決定基的雜交或嵌合的脊髓灰質(zhì)炎病毒可用作為疫苗和作為產(chǎn)生免疫學(xué)試劑的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及編碼嗜血桿菌屬菌株轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的純化的和分離的核酸分子或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)片段或類似物。本文提供的核酸分子可用于特異性檢測(cè)嗜血桿菌屬及用于診斷嗜血桿菌屬感染。本文提供的純化的和分離的核酸分子(如DNA)也用于以重組DNA方式表達(dá)TfR基團(tuán)，用于以經(jīng)濟(jì)的方式提供純化的和分離的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體亞基，片段或其類似物。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其亞基或片段或其類似物以及編碼它們的核酸分子和含有該核酸分子的載體可用于抵抗由嗜血桿菌屬引起的疾病之免疫原性組合物中，用于嗜血桿菌感染的診斷以及作為產(chǎn)生免疫學(xué)試劑的工具。根據(jù)本發(fā)明的方面產(chǎn)生的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的單克隆抗體或單價(jià)特異性抗血清(抗體)對(duì)于嗜血桿菌屬感染的診斷，嗜血桿菌屬的特異性檢測(cè)(例如體外和體內(nèi)試驗(yàn))以及嗜血桿菌屬引起的疾病的治療有用。
與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體部分相應(yīng)的肽或其類似物在抗嗜血桿菌屬引起的疾病的免疫屬性組合物，嗜血桿菌屬感染的診斷和作為產(chǎn)生免疫學(xué)試劑的工具中有用。根據(jù)本發(fā)明的方面產(chǎn)生的抗這些肽的單克隆抗體或抗血清對(duì)于嗜血桿菌屬感染的診斷，嗜血桿菌屬的特異性檢測(cè)(例如，體外和體內(nèi)試驗(yàn))以及用于作為對(duì)嗜血桿菌屬引起的疾病之治療的被動(dòng)免疫有用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了編碼嗜血桿菌屬菌株，更具體地說(shuō)，一種流感嗜血桿菌菌株，特別是流感嗜血桿菌b型菌株(如流感嗜血桿菌b型菌株DL63，Eagan或MinnA)或流感嗜血桿菌不可分型菌株(如流感嗜血桿菌菌株P(guān)AK 12085，SB33，SB12，SB29，SB30或SB32)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的片段或類似物的純化和分離的核酸分子。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，核酸分子可僅編碼嗜血桿菌菌株Tbp1蛋白質(zhì)或僅編碼嗜血桿菌菌株Tbp2蛋白質(zhì)。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施例中，該核酸可編碼具有在產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的細(xì)菌中保守的保守氨基酸序列的嗜血桿菌屬菌株轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的片段。這種保守的氨基酸序列可具有包含在下面表2和3中所示的流感嗜血桿菌b型菌株Eagan的肽以及流感嗜血桿菌其它菌株的相應(yīng)肽中的氨基酸序列內(nèi)的氨基酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了具有一種純化和分離的核酸分子，該分子的DNA序列選自(a)圖3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQID NOS 1、2、3、4、105、108、110、112、114)所列的任一DNA序列或任一所說(shuō)序列的互補(bǔ)DNA序列；(b)編碼圖3、4、5、6、7、8、9、10或11(SEQ ID NOS 5、6、7、8、9、10、11、12、106、107、109、111、113、115)所列的一個(gè)氨基酸序列的DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列；(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)中限定的任一DNA序列雜交的DNA序列。(c)中限定的DNA序列優(yōu)選與(a)和(b)中限定的DNA序列的任何一個(gè)具有至少大約90％的序列同一性。
另一方面，本發(fā)明包括適于轉(zhuǎn)化宿主，包含本文提供的核酸分子的載體。該載體可以是具有ATCC保藏號(hào)75803的質(zhì)普DS-712-1-3或具有ATCC保藏號(hào)75607的質(zhì)粒JB-1042-7-6之特征的一個(gè)載體。
質(zhì)?？蛇m于在異源或同源宿主中以脂化或非脂化的形式表達(dá)所編碼的的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其片段或類似物。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種適于轉(zhuǎn)化宿主的表達(dá)載體，它含有本文提供的核酸分子的表達(dá)載體以及與該核酸分子有效連接用于經(jīng)宿主表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)片段或類似物的表達(dá)裝置。在本發(fā)明該方面的具體實(shí)施例中，核酸分子可編碼嗜血桿菌屬菌株基本上完整的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)，僅編碼其Tbp1蛋白質(zhì)或僅編碼Tbp2蛋白質(zhì)。表達(dá)裝置可包括編碼用于從宿主分泌轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)片段或類似物之引導(dǎo)序列的核苷酸部分。該表達(dá)裝置還可包括編碼用于從宿主表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)片段或類似物的脂化形式之脂化信號(hào)的核酸部分。表達(dá)質(zhì)?？梢跃哂匈|(zhì)粒JB-1468-29，JB-1600-1或JB-1424-2-8所鑒定的特征。宿主可選自(例如)大腸桿菌(E.coli)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、嗜血桿菌屬、真菌、酵母或桿狀病毒，且可使用Semliki Forest病毒表達(dá)系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有本文提供的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的宿主。該宿主可選自JB-1476-2-1，JB-1437-4-1和JB-1607-1-1。本發(fā)明進(jìn)一步包括可用轉(zhuǎn)化的宿主生產(chǎn)的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)或其片段或類似物。
在下面更詳細(xì)的描述中，產(chǎn)生了互相分離的Tbp1和Tbp2蛋白質(zhì)受體。因此本發(fā)明的另一方面提供了一種不含嗜血桿菌屬菌株Tbp2蛋白質(zhì)的分離和純化的嗜血桿菌屬菌株Tbp1蛋白質(zhì)和一種不含嗜血桿菌屬菌件Tbp1蛋白質(zhì)的分離和純化的嗜血桿菌屬菌株Tbp2蛋白質(zhì)。嗜血桿菌屬菌株可以是流感嗜血桿菌b型或流感嗜血桿菌不可分型菌株。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了與部分轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相對(duì)應(yīng)的合成肽。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種具有不少于6個(gè)氨基酸且不多于150個(gè)氨基酸，并含有僅與細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)類似物部分相應(yīng)的氨基酸序列的合成肽。細(xì)菌菌株優(yōu)選是嗜血桿菌屬菌株，特別是流感嗜血桿菌菌株，具體地說(shuō)是流感嗜血桿菌b型菌株或流感嗜血桿菌不可分型菌株。
本文提供的肽可以包含在產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的細(xì)菌，包括嗜血桿菌屬菌株中保守的氨基酸序列。該肽可包括氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO74)或LEGGFYG(SEQ ID NO85)。本文提供的肽可具有選自在下文表2或3中提供的流感嗜血桿菌b型Eagan菌株的氨基酸序列和流感嗜血桿菌其它菌株中相應(yīng)的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種免疫原性組合物，它包含至少一種選自至少一種本文提供的核酸分子，至少一種本文提供的重組蛋白質(zhì)，至少一種如本文提供的純化和分離的Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)，至少一種如本文提供的合成肽和至少一種如本文提供的活載體的活性成份以及其藥用上可接受的載體(carriex)或其載體(vector)。當(dāng)給宿主用藥時(shí)，至少一種活性成份產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
本文提供的免疫原性組合物可配成疫苗，用于體內(nèi)用藥以防止產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌病原體引起的疾病。為達(dá)到這一目的，組合物可配成微粒、膠囊或脂質(zhì)體制品。作為另一可選擇方法，提供的組合物可與靶分子結(jié)合用于傳遞給免疫系統(tǒng)的特異性細(xì)胞或傳遞到粘膜表面。免疫原性組合物可包括許多活性成份以抵抗由許多種類的產(chǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體細(xì)菌產(chǎn)生的疾病。免疫原性組合物可進(jìn)一步包含一種佐劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了用于誘導(dǎo)抵抗由嗜血桿菌屬或產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的其它細(xì)菌引起的感染和疾病的方法，包括給敏感宿主(如人類)施用有效量的上面提到的免疫原性組合物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種對(duì)重組蛋白質(zhì)，分離和純化的Tbp1蛋白質(zhì)或Tbp2蛋白質(zhì)，合成肽或免疫原性組合物具特異性的抗血清或抗體。
另一方面，提供一種將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體傳遞給宿主的活載體，包含一種含有上述核酸分子的載體。該載體可選自沙門氏菌屬(Salmonella)、BGC、腺病素、痘病毒、牛痘病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒。特別是該載體可以是脊髓灰質(zhì)炎病毒，該核酸分子可編碼具有LEGGFYGP(SEQ ID NO74)或LEGGFYG(SEQ ID NO85)的氨基酸序列的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體片段。本發(fā)明進(jìn)一步包括具有pT7TBP2A，pT7TBP2B，pT7TBP2C或pT7TBP2D(ATCC保藏號(hào)75931，75932，75933，75934的鑒定特征的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的另一方面提供了一種不產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的嗜血桿菌菌株。該菌株可包含編碼失去功能(如經(jīng)過(guò)插入誘變)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的基因。該嗜血桿菌屬菌株可以是已減毒的菌株，這種減毒菌株可包含用于傳遞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的載體。
如上所述，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了嗜血桿菌屬菌株，優(yōu)選流感嗜血桿菌菌株的新Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)，它們是分離和純化的形式且彼此分離。本發(fā)明的另一方面提供了一種用于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的方法。因此，在該另一方面中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)嗜血桿菌屬菌株的分離和純化的Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)的方法，包含的步驟有(a)提供一種重組宿主，在包含體中表達(dá)Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)，但不同時(shí)表達(dá)兩者；(b)使宿主生長(zhǎng)以提供細(xì)胞團(tuán)；(c)破碎細(xì)胞團(tuán)以提供細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；(d)分級(jí)分離細(xì)胞溶胞產(chǎn)物以提供第一上清和第一沉淀，第一上清基本上包含可溶性宿主蛋白質(zhì)的大部分；(e)從第一沉淀中分離第一上清；(f)選擇性地提取第一沉淀以基本上從中去掉全部可溶性宿主蛋白質(zhì)和宿主膜蛋白質(zhì)，從而提供第二上清和含包含體的提取沉淀；(g)從提供沉淀中分離第二上清；(h)增溶提取沉淀以提供增溶的提取物；(i)分級(jí)分離增溶的提取物以提供含Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)的組分。
可對(duì)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物分級(jí)分離以提供第一上清，第一沉淀可用至少一種去污劑提取來(lái)處理。
以凝膠過(guò)濾分級(jí)分離溶解的提取物以提供含Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)的組分，隨后可對(duì)它進(jìn)行透析以去掉至少該去污劑以提供Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化的溶液。


參考附圖以下面的描述可進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中圖1A顯示了流感嗜血桿菌b型菌株DL63轉(zhuǎn)鐵蛋白受體操縱子的2個(gè)質(zhì)?？寺?pBHT1和bBHT2)的限制性圖譜。
圖1B顯示了含有來(lái)自流感嗜血桿菌b型菌株Eagan的TfR基因的克隆S-4368-3-3和JB-901-5-3的限制性圖譜。
圖1C顯示了含有來(lái)自流感嗜血桿菌b型菌株MinnA的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的克隆DS-712-1-3的限制性圖譜。
圖1D顯示了含有來(lái)自不可分型的流感嗜血桿菌菌株P(guān)AK 12085的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的克隆JB-1042-7-6的限制性圖譜。
圖2說(shuō)明了鑒定的菌株克隆Tbp1和Tbp2基因的構(gòu)建和限制性圖譜以及在單個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下由2個(gè)基團(tuán)(tbp1和tbp2)串聯(lián)形成操縱子的TfR操縱子之遺傳構(gòu)建，還描繪了用于探測(cè)嗜血桿菌屬菌件TfR基因文庫(kù)的pBHT2 3.0kb的DNA片段。
圖3顯示了來(lái)自流感嗜血桿菌b型DL63菌株的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因核苷酸序列(SEQ ID NO1)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO5-Tbp1和SEQ ID NO6-Tbp2)。下面劃線的氨基酸序列相應(yīng)于以氨基酸測(cè)序鑒定的Tbp1肽。推斷的信號(hào)序列以上面劃雙線表示并相應(yīng)于Tbp1的殘基1到17和Tbp2的1至25。
圖4顯示了來(lái)自流感嗜血桿菌b型菌株Eagan的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO7-Tbp1和SEQ ID NO8-Tbp2)。推斷的-35，-10和核糖體結(jié)合位置序列上面劃線。
圖5顯示了來(lái)自流感嗜血桿菌b型菌株MinnA的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO9-Tbp1和SEQ ID NO10-Tbp2)。上面劃線處是推斷的-35，-10和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。
圖6顯示了來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株P(guān)AK 12085的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO4)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO11-Tbp1和SEQ ID NO12-Tbp2)。上面劃線處是推斷的-35，-10和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。
圖7顯示了來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株SB33的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的核苷酸序列(SEQ ID NO105)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ IDNO107-Tbp2)。
圖8顯示了來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株SB12和Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO108)的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO109-Tbp2)。
圖9顯示了來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株SB29的Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO110)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ IN NO111-Tbp2)。
圖10顯示了來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株SB30和Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO112)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO113-Tbp2)。
圖11顯示了來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株SB32的Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO114)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO115-Tbp2)。
圖12A顯示了來(lái)自流感嗜血桿菌菌株Eagan(SEQ ID NO116)、MinnA(SEQ ID NO117)、PAK 12085(SEQ ID NO118)和SB33(SEQ ID NO119)tbp2基因的啟動(dòng)子區(qū)和5’端的核苷酸序列。下面劃線處為用于經(jīng)PCR擴(kuò)增tbp2基因的編碼鏈引物(SEQ ID NO120)。
圖12B顯示了來(lái)自流感嗜血桿菌菌株Eagan(SEQ ID NO121)、MinnA(SEQ ID NO122)、DL63(SEQ ID NO123)PAK 12085(SEQ ID NO124)、SB12(SEQ ID NO125)、SB29(SEQ ID NO126)、SB30(SEQ ID NO127)、SB32(SEQ ID NO128)tbp1基因間隔區(qū)和5’端的核苷酸序列。下面劃線處為用于經(jīng)PCR擴(kuò)增tbp2基因的非編碼鏈引物(SEQ ID NO129)。
圖13顯示了來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株SB12、SB29、SB30、SB32和SB33的PCR擴(kuò)增的tbp2基因的瓊脂糖凝膠分析。泳道1是SB33、泳道2是SB12、泳道3是SB29、泳道4是SB30、泳道5是SB32。
圖14顯示了來(lái)自流感嗜血桿菌菌株Eagan、DL63、PAK 12085和SB33(SEQ ID NOs7、5、11和106)，腦膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982(SEQ ID NOS94和95)和淋病奈瑟氏菌菌株FA19(SEQ IDNOs96)的Tbp1氨基酸序列的比較。
圖15顯示了來(lái)自流感嗜血桿菌菌株Eagan、DL63、PAK 12085、SB12、SB29、SB30和SB32((SEQ ID NOS8、6、12、109、110、112、114)，腦膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982(SEQ ID NOS97和98)。淋病奈瑟氏菌菌株FA19和Actinobacillus Pleuropneumoniae菌株AP205和AP37(SEQ ID NOS99和100)Tbp2氨基酸序列的比較。
圖16A顯示了流感嗜血桿菌Tbp1蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，圖16B顯示了流感嗜血桿菌Tbp2蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖17顯示了從E.coli中表達(dá)流感嗜血桿菌b型Eagan Tbp1的質(zhì)粒JB-1468-29的構(gòu)建方式。
圖18顯示了從E.coli中表達(dá)流感嗜血桿菌b型Eagan Tbp2的質(zhì)粒JB-1424-2-8的構(gòu)建方式。
圖19顯示了用于構(gòu)建質(zhì)粒JB1428-2-8的寡核苷酸對(duì)(SEQ IDNOS130和131)。
圖20顯示了用于構(gòu)建Tbp1和Tbp2表達(dá)質(zhì)粒的寡核苷酸對(duì)A(SEQID NOS86和87)、B(SEQ ID NOs88和89)、C(SEQ ID NOS90和91)和D(SEQ ID NOs92，93)的序列。
圖21顯示了在大腸桿菌中表達(dá)流感嗜血桿菌菌株SB12、Tbp2的質(zhì)粒JB-1600-1的構(gòu)建方式。
圖22顯示了從大腸桿菌中表達(dá)嗜血桿菌屬b型Eagan Tbp1蛋白質(zhì)，Eagan Tbp2蛋白質(zhì)和不可分型流感嗜血桿菌SB12 Tbp2蛋白質(zhì)得到的產(chǎn)物的SDS-PAG凝膠。泳道1，JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1)在t0；泳道2，JB-1476-2-1在t＝4h的誘導(dǎo)；泳道3，200kDa，116kDa，97.4kDa，66kDa，45kDa和31kDa的分子標(biāo)準(zhǔn)品；泳道4，JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2)在t0；泳道5，JB-1437-4-1在t＝4h誘導(dǎo)；泳道6，JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2)在t0；泳道7，JB-1607-1-1在t＝4h誘導(dǎo)。
圖23顯示了從大腸桿菌中表達(dá)出的重組Tbp1和Tbp2的純化方式。
圖24顯示了以圖23的方法純化的重組Tbp1和Tbp2的純度的分析。泳道1含分子量大小標(biāo)準(zhǔn)品(106、80、49.5、32.5、27.5、18.5kDa)，泳道2是大腸桿菌總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。泳道3是溶解的包含體。泳道4是純化的Tbp1或Tbp2。
圖25顯示了小鼠rTbp1(上排)和rTbp2(下排)的免疫原性。圖26顯示了在Vestern印跡試驗(yàn)中抗Eagan rTbp1抗血清與各種流感嗜血桿菌菌株的反應(yīng)性，泳道1，BL21/DE3；泳道2，SB12-EDDA；泳道3，SB12+EDDA；泳道4，SB29-EDDA；泳道5，SB29+EDDA；泳道6，SB33-EDDA；泳道7，SB33+EDDA；泳道8，Eagan-EDDA；泳道9，Eagan+EDDA；泳道10，B.catarrhalis 4223-EDDA；泳道11，B.catarrhalis 4223+EDDA；泳道12，腦膜炎奈瑟氏菌608-EDDA；泳道13，腦膜炎奈瑟氏菌608+EDDA；泳道14，表達(dá)重組Eagan Tbp1的經(jīng)誘導(dǎo)的JB-1476-2-1；泳道15，分子量標(biāo)記物。在與流感嗜血桿菌菌株SB12、SB29、SB33和Eagan相對(duì)應(yīng)的泳道3、4、5、7、8和9中，特異性的～95kDa帶與抗Tbp1抗血清發(fā)生反應(yīng)；在泳道10和11中～110kDa的帶與B.catarrhalis菌株4223相對(duì)應(yīng)；在泳道12和13中～80kD的帶與腦膜炎奈瑟氏菌608相對(duì)應(yīng)。
圖27顯示了在Western印跡試驗(yàn)中抗Eagan rTbp2抗血清與各種流感嗜血桿菌菌株的反應(yīng)性。泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)品；泳道2，誘導(dǎo)的JB-1437-4-1表達(dá)的重組Eagan Tbp2；泳道3，SB12-EDDA；泳道4，SB29+EDDA；泳道5，SB29-EDDA；泳道6，SB29+EDDA；泳道7，SB30-EDDA；泳道8，SB30+EDDA；泳道9，SB32-EDDA；泳道10，SB33-EDDA；泳道11，SB33+EDDA；泳道12，PAK-EDDA；泳道13，PAK+EDDA；泳道14，Eagan-EDDA；泳道15，Eagan+EDDA；在泳道3、6、7、8、13、14和15(即菌株SB12、SB29、SB30、PAK和Eagan)中60-70kDa的特異性帶與抗Tbp2抗血清反應(yīng)。
圖28顯示了用于生產(chǎn)不產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的流感嗜血桿菌的質(zhì)粒pUHIT1KFH和pUHIT1KFP的構(gòu)建。
圖29顯示了編碼表達(dá)來(lái)自轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的，在產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的細(xì)菌中保守之抗原決定基的嵌合的脊髓灰質(zhì)炎病毒的質(zhì)粒的構(gòu)建。
圖30是Western印跡，顯示了用表達(dá)來(lái)自轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的蛋白質(zhì)的，在產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的細(xì)菌中保守之抗原決定基的脊髓灰質(zhì)炎病毒嵌合體免疫接種兔產(chǎn)生的抗血清的反應(yīng)性。A組顯示了考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠，顯示在E.coli中表達(dá)的來(lái)自流感嗜血桿菌SB12的純化的重組Tbp2(泳道1)，來(lái)自Branhamella catarrhalis菌株4223純化的Tbp2(泳道2)，限鐵條件下生長(zhǎng)的B.catarrhalis 4223的總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(泳道3)，在非限鐵條件下生長(zhǎng)的E.coli JM109總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(泳道5)。B組顯示了使用在第27天從用PV1 TBP2A免疫的兔(兔40、41、42)中收集的血清合并液的復(fù)制凝膠Wetern的印跡結(jié)果。C組顯示了從相同兔預(yù)先抽血的合并血清的結(jié)果，它顯示了輕微的特異性免疫反應(yīng)性。
在上面的一些附圖中，下列縮寫用于命名限制性核酸內(nèi)切酶特異性的特定位點(diǎn)R，Eco RI；Ps，Pst I；H，Hind III；Bg，Bgl；Nde，Nde I；Ear，Ear I；和Sau，Sau 3AI。
在圖28中，下列縮寫用于命名限制性核酸內(nèi)切酶特異性的具體位點(diǎn)A，Acc I；B，Bam HI；E，Eco RI；O，Xho I；H，Hind III；Ps，Pst I；V，Eco RV；X，Xba I；G，Bgl II；S，Sal I；K，Kpn I；和S*，Sac I。
具體實(shí)施例方式
任何嗜血桿菌屬菌株都可方便地用于提供純化和分離的核酸，該核酸可以是DNA分子形式，包含至少一部分編碼本發(fā)明實(shí)施例中所鑒定的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的核酸。這類菌株一般可從臨床來(lái)源和細(xì)菌培養(yǎng)物保藏中心(如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)獲得。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)可從嗜血桿菌屬菌株以Schryvers(1989)，Ogunnaviwo schryvers(1992)和美國(guó)專利5 141743(本文引用其主題內(nèi)容以供參考)所述的方法分離。盡管在專利US5 141 743中對(duì)合適的方法提供了詳細(xì)的描述，但下面仍對(duì)該方法作簡(jiǎn)要的概述。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的分離經(jīng)過(guò)從表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合活性的細(xì)菌菌株中分離膜部分并以包含將轉(zhuǎn)鐵蛋白預(yù)先結(jié)合到膜部分上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體上，溶解膜，固相化轉(zhuǎn)鐵蛋白并從固相轉(zhuǎn)鐵蛋白上分離轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的一系列步驟的親和法純化轉(zhuǎn)鐵蛋白受體來(lái)實(shí)現(xiàn)。另一可選擇方法，受體蛋白可經(jīng)過(guò)對(duì)上述方法的修改來(lái)分離。其中不用預(yù)先結(jié)合步驟而在溶解緩沖液中含高濃度的鹽以便能用固相轉(zhuǎn)鐵蛋白直接分離，如Ogunnariwo和Schryvers(1992)所述。
在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)鐵蛋白受體”用于定義Tbp1和/或Tbp2蛋白質(zhì)族，它包括那些包括在各種菌株(例如嗜血桿菌屬)中天然存在的氨基酸序列的氨基酸序列發(fā)生變異的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的其它細(xì)菌來(lái)源包括但不局限于奈瑟氏菌屬，Branhanella，Pasteurella和Actinobacillus的種類。這些細(xì)菌中有些(如果并非全部)含有Tbp1和Tbp2兩種蛋白質(zhì)。包含編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體至少一部分的純化和分離的DNA分子也包括那些編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體功能類似物的DNA分子。在本申請(qǐng)中，如果第一個(gè)蛋白質(zhì)與第二個(gè)蛋白質(zhì)或肽具有免疫學(xué)相關(guān)性和/或具有相同功能，那么在第一個(gè)蛋白質(zhì)或肽是第二個(gè)蛋白質(zhì)的功能類似物。例如，功能類似物可以是該蛋白質(zhì)的片段或其取代，增加或缺失突變體。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體從流感嗜血桿菌b型菌株DL63中分離并以Schryver(1989)，Ogunnariwo Schrtvers(1992)和美國(guó)專利5141743所述的親和層析方法純化。分離和純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體用于在免中產(chǎn)生抗TfR抗血清。機(jī)械剪切流感嗜血桿菌b型菌株DL63染色體DNA，加入EcoRI連接頭，構(gòu)建λZAP表達(dá)文章。用抗TfR免抗血清篩查文庫(kù)并獲得具有重疊限制性圖譜的2個(gè)陽(yáng)性克隆(pBHIT1和pBHIT2)(圖1A和圖2)。對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序并鑒定了兩個(gè)大型開(kāi)架閱讀框(圖2)。流感嗜血桿菌DL63的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因Tbp1和Tbp2(SEQ ID NO1)的核苷酸序列和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO5-Tbp1和SEQ ID NO6-Tbp2)如圖3所示。序列分析表明組成2個(gè)基因(Tbp1和Tbp2)TfR操縱子串聯(lián)排列并以單個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄(具體在圖2和圖3中顯示)。Tbp2蛋白質(zhì)分子量的變化取決于種類而Tbp1蛋白質(zhì)具有更恒定的分子量，雖然在具有TfR基因的各種細(xì)菌中有一些可變性。Tbp1的分子量范圍一般從94到106,000，而Tbp2的分子量變化相當(dāng)大，從58到98,000。
對(duì)流感嗜血桿菌DL63的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)行了N末端和溴化氰片段氨基酸測(cè)序。Tbp2的N端被封閉，但經(jīng)過(guò)Tbp1測(cè)序鑒定了其氨基酸序列并在圖3的蛋白質(zhì)序列中以下面劃線表示。這些肽序列是GluThr Gln Ser Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Ile Ser Ser Glu Val Asp Thr(如圖3所示，SEQ ID NO101)和Leu Gln Leu Asn Leu Glu Lys LysIle Gln Gln Asn Trp Leu Thr His Gln Ile Als Phe(如圖3所示，SEQ IDNO102)。
在圖3中以上面劃雙線表示Tbp1的信號(hào)序列和Tbp2推定的信號(hào)序列。Tbp1推定的信號(hào)序列是Met Thr Lys Lys Pro Tyr Phe Arg LeuSer Ile Ile Ser Cys Leu Leu Ile Ser Cys Tyr Val Lys Ala(SEQ ID NO103)。Tbp2推斷的信號(hào)序列是Met Lys Ser Val Pro Leu Ile Ser Gly GlyLeu Ser Phe Leu Leu Ser Ala(SEQ ID NO104)。Tbp2 N端區(qū)所得的氨基酸序列表明它是脂蛋白質(zhì)。
制備流感嗜血桿菌b型菌株Eagan染色體DNA并產(chǎn)生文庫(kù)。以用Sau 3AI部分清化的DNA構(gòu)建第一文庫(kù)，分離大小為～5-10kb的片段并克隆進(jìn)以pUC為基礎(chǔ)的質(zhì)粒中。從克隆到λZAP的EcoRI限制性染色體DNA片段構(gòu)建第二文庫(kù)。用圖2所示的pBHIT克隆的5’片段探測(cè)的兩個(gè)文庫(kù)，得到稱為S-4368-3-3和JB-901-5-3的流感嗜血桿菌Eagan TfR基因的部分克隆。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在圖1B和2中顯示了編碼流感嗜血桿菌b型菌株Eagan Tbp1和Tbp2的質(zhì)?？寺-4368-3-3和JB-901-5-3。流感嗜血桿菌b型菌株Eagan Tbp1和Tbp2基因的DNA序列(SEQ ID NO2)和其推定的氨基酸序列(SEQID Nos7和8)如圖4所示，Tbp2序列是操縱子的第一個(gè)基因。在圖4中，上面劃線處為推定的-35，-10和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。
制備流感嗜血桿菌b型菌株MinnA染色體DNA，用Sau 3AI部分消化DNA，分離10-20kb大小的片段并克隆進(jìn)EMBL3的BanHI位點(diǎn)。用pBHIT克隆的5’片段(圖2)探測(cè)文庫(kù)并獲得了編碼TfR全長(zhǎng)的克隆(DS-712-1-3)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在圖1C和2中顯示了編碼流感嗜血桿菌b型菌株MinnA Tbp1和Tbp2的質(zhì)?？寺S-712-1-3。來(lái)自流感嗜血桿菌b型菌株MinnA Tbp1和Tbp2的DNA序列(SEQID NO3)和其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO9-Tbp1和SEQ IDNO10-Tbp2)如圖5所示，其中在操縱子中，Tbp2序列是第一個(gè)基因。在圖5中，上面劃線處為推定的-35，-10和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。
從不可分型流感嗜血桿菌菌株P(guān)AK 12085制備染色體DNA，用Sau 3AI部分消化DNA，分離10-20kb大小的片段，并克隆進(jìn)EMBL3的BamHI位點(diǎn)。用pBHIT克隆片段(圖2)探測(cè)文庫(kù)并獲得了編碼TfR的全長(zhǎng)克隆(JB-1042-7-6)。克隆JB-1042-7-6的限制性圖譜如圖1D和2所示，來(lái)自流感嗜血桿菌PAK 12085 Tbp1和Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO4)和其推定的氨基酸序列如圖6所示(SEQ IDNos11，12)，Tbp2序列在前。在圖6中，上面劃線處為推定的-35，-10和核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。
從來(lái)自中耳炎的不可分型流感嗜血桿菌菌株SB33制備染色體DNA。用Sau 3AI部分消化DNA，分離10-20kb大小的片段，并克隆進(jìn)EMBL3的BamHI位點(diǎn)。用pBHIT克隆片段(圖2)探測(cè)文庫(kù)，獲得了編碼TfR全長(zhǎng)的克隆(JB-1031-2-9)。克隆JB-1031-2-9的限制性圖譜如圖2所示，來(lái)自流感嗜血桿菌SB33的Tbp1和Tbp2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO4)和其推定的氨基酸序列如圖7所示(SEQ IDNOs11，12)，Tbp2序列在前面。發(fā)現(xiàn)SB 33 tbp2基因有單個(gè)堿基缺失，導(dǎo)致在殘基126處讀框移位且導(dǎo)致產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在成熟前在殘基168位截短。
對(duì)來(lái)自中耳炎NTHi菌株SB12、SB29、SB30和SB32的tbp2基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序。
來(lái)自不可分型流感嗜血桿菌菌株SB12(SEQ ID NO105)，SB29(SEQ ID NO108)，SB30(SEQ ID NO110)和SB32(SEQ ID NO112)的tbp2基因的核苷酸序列分別如圖8、9、10和11所示。
發(fā)現(xiàn)所有擴(kuò)增的tbp2基因編碼全長(zhǎng)的Tbp2蛋白質(zhì)，表明菌株SB33的缺陷型tbp2基因是不典型的。
所有3個(gè)流感嗜血桿菌b菌株在tbp2和tbp1之間具有相同的長(zhǎng)僅13bp的短間隔序列。但NTHi菌株P(guān)AK 12085和SB33具有27bp的較長(zhǎng)間隔序列(圖12)。
菌株SB12具有13bp的間隔序列，與在流感嗜血桿菌b菌株中所發(fā)現(xiàn)的相同，而菌株SB32、SB30和SB32含有較長(zhǎng)的間隔序列，正如在其它NTHi菌株P(guān)AK 12085和SB33中所發(fā)現(xiàn)的(27-30bp)(圖2B)。所有9個(gè)菌株在其tbp2和bp1基因之間具有13bp序列保守的共同核心。
鑒定了靠近流感嗜血桿菌Tbp1氨基末端的五肽序列(圖12)，它與T0nB盒相似。最近已克隆和測(cè)序了流感嗜血桿菌tonB基因(Jarosiket al.，1994)。
在圖14中比較了流感嗜血桿菌菌株Eagan/MinnA、DL63、PAK12085和SB33菌株Tbp1的氨基酸序列。Eagan和MinnA的Tbp1蛋白質(zhì)相同，有912個(gè)氨基酸，DL63有914個(gè)殘基，PAK 12085有914個(gè)殘基，SB33有911個(gè)殘基。流感嗜血桿菌Tbp1蛋白質(zhì)具有高度保守性，有95-100％的序列相同。流感嗜血桿菌菌株Eagan/MinnA、DL63、PAK 12085、SB12、SB29、SB30和SB32的Tbp2氨基酸序列在圖15中作了比較。Eagan和MinnA的Tbp2蛋白質(zhì)相同且含有660個(gè)氨基酸，DL63的Tbp2含644個(gè)殘基，PAK 12085的Tbp2含654個(gè)殘基。在SB33 tbp2基因中有單個(gè)堿基的缺失，導(dǎo)致在殘基126處讀框移位，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在殘基168處成熟前截短。經(jīng)過(guò)直接對(duì)PCR擴(kuò)增的染色體DNA測(cè)序證實(shí)了該堿基的丟失。除了Eagan和MinnA相同外，Tbp2蛋白質(zhì)序列較少保守，只有66-70％同一性，但有一些保守的短片段序列，可以圖15中作出鑒定。發(fā)現(xiàn)所有來(lái)自菌株SB12、SB29、SB30和SB32的PCR擴(kuò)增的tbp2基因編碼全長(zhǎng)的tbp2蛋白質(zhì)。在推導(dǎo)的Tbp2蛋白質(zhì)中存在序列和大小不均一性，其中SB12有648個(gè)氨基酸，SB32有631個(gè)殘基，SB30有630個(gè)殘基，SB32有631個(gè)殘基。
測(cè)定了推導(dǎo)的Eagan Tbp1和Tbp2二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖16A和16B)。兩種蛋白質(zhì)都有幾個(gè)跨膜區(qū)，Tbp1跨膜20次，Tbp2跨膜12次。在Tbp1氨基末端區(qū)域鑒定了3個(gè)暴露的保守抗原決定基(DNEVTGLGK-(SEQ ID NO43，EQVLN/DIRDLTRYD-SEQ ID NO139和140，GAINEIEYENVKAVEISK-SEQ ID NO141)，在C端區(qū)鑒定了1個(gè)(GI/VYNLF/LNYRYVTVE-SEQ ID NO142和143)。在人病原體的Tbp2蛋白質(zhì)內(nèi)只能鑒定3個(gè)較小的保守區(qū)域CS/LGGG(G)SFD-SEQ ID NO75，144和15(在N端)，LE/SGGFY/FGP-SEQ IDNO74和146(位于內(nèi)部)，VVFGAR/K-SEQ ID NO83和84(位于C末端)。
嗜血桿菌屬菌株之間的Tbp2氨基酸序列有變化這一發(fā)現(xiàn)使得可將嗜血桿菌屬分成以相同Tbp2氨基酸序列定義的亞組。這一發(fā)現(xiàn)允許合理地選擇最少數(shù)的Tbp1和/或Tbp2序列或合成肽以用于免疫組合物，他們遞呈嗜血桿菌屬菌株中該亞型共有的抗原決定基例如該免疫組合物可用于免疫由嗜血桿菌屬和其它產(chǎn)生與嗜血桿菌屬種Tbp1和Tbp2具有序列相似性的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌引起的疾病。因此，最少數(shù)目的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，類似物、片段和/或肽可用于免疫許多和全部嗜血桿菌屬菌株和其它產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌性病原體。
另外，比較了來(lái)自不同細(xì)菌病原體(流感嗜血桿菌b型、不可分型流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌和Actinobacillus(Haemophilus)Pleuropneuaoniae)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的氨基酸序列，如圖14和15所示。這一分析揭示了在所有這些細(xì)菌中保守的Tbp1和Tbp2區(qū)域。一些這類保守的序列包含在表2和3的肽中。具體地說(shuō)，序列DNEVTGLGK(SEQ ID NO43)，EQVLNIRDLTRYDPGI(SEQID NO44)EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD(SEQID NO45)，GAINEIEYENVKAVEISKG(SEQ ID NO46)，GALAGSV(SEQ ID NO47)在Tbp1中保守(表1和圖14)。在Tbp2中特別保守的序列包括LEGGFYGP(SEQ ID NO74)，CSGGGSFD(SEQID NO75)，YVYSGL(SEQ ID NO76)，CCSNLSYVKFG(SEQID NO77)，F(xiàn)LLGHRT(SEQ ID NO78)，EFNVOF(SEQ ID NO79)，NAFTGTA(SEQ ID NO80)，VNGAFYG(SEQ ID NO81)，ELGGYF(SEQ ID NO82)，VVFGAR(SEQ ID NO83)，和VVFGAK(SEQ ID NO84)(表3和圖15)。
在不同細(xì)菌病原體中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)保守序列的發(fā)現(xiàn)允許選擇具有特定氨基酸序列的最小數(shù)目的抗原(包括以合成肽的形式)來(lái)免疫由具有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的病原體引起的疾病。這類細(xì)菌除了上面所列舉的外，還包括奈瑟氏菌屬的其它種類，如淋病奈瑟氏菌以及Branhamella包括Branhanella catarrhalis。在許多細(xì)菌性病原體中該保守的氨基酸序列允許產(chǎn)生TfR特異性抗體，包括單克隆抗體，來(lái)識(shí)別大多數(shù)(如果不是全部的話)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。生產(chǎn)抗與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體保守部分相對(duì)應(yīng)的肽的抗血清。該抗血清識(shí)別Branhamellacatarrhalis中的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。這種抗血清對(duì)于檢測(cè)和中和大部分(如果并非全部)產(chǎn)生TfR蛋白質(zhì)的細(xì)菌有用。也用于對(duì)由該病原體引起的疾病進(jìn)行被動(dòng)免疫。使用該保守的氨基酸序列的診斷檢驗(yàn)和試劑盒對(duì)于檢測(cè)許多(如果并非全部)產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌有用。
含前述氨基酸序列的抗原決定基可經(jīng)過(guò)使用含該序列的合成肽，或經(jīng)過(guò)使用表達(dá)該序列的活載體或經(jīng)過(guò)直接施用編碼該氨基酸序列的核酸分子傳遞到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中。
流感嗜血桿菌b型菌株Eagan、MinnA，DL63和不可分型菌株P(guān)AK12085的Tbp1蛋白質(zhì)內(nèi)含保守氨基酸序列的一些肽如表2所示?？挂恍┻@類肽的抗體在豚鼠中產(chǎn)生(表4)。含流感嗜血桿菌b型菌株Eagan，MinnA，DL63和不可分型菌株P(guān)AK 12085的Tbp2蛋白質(zhì)內(nèi)保守氨基酸序列的肽如表3所示。抗一些這類肽的抗體在豚鼠中產(chǎn)生(表4)。
將Tbp1和Tbp2基因的編碼序列克隆進(jìn)合適的表達(dá)載體中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。使用T7表達(dá)系統(tǒng)從E.coli中表達(dá)重組Tbp1和Tbp2。將編碼成熟Eagan Tbp1蛋白質(zhì)的tbp1基因克隆到閱讀框中T7啟動(dòng)子后面產(chǎn)生質(zhì)粒JB-1468-29，如圖17所示。當(dāng)導(dǎo)入BL21/DE3細(xì)胞并用IPTG或乳糖誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)Eagan Tbp1蛋白質(zhì)，如圖22所示。
將編碼成熟Tbp2蛋白質(zhì)的tbp2基因克隆到框架中T7啟動(dòng)子后面產(chǎn)生質(zhì)粒JB-1424-2-8，如圖18所示。當(dāng)導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞中并按如上所述誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)出顯示于圖22中的Tbp2蛋白質(zhì)。
以PCR擴(kuò)增來(lái)自菌株NTHi SB12的tbp2基因。所得的擴(kuò)增DNA在成熟蛋白質(zhì)前含有已證實(shí)的流感嗜血桿菌Tbp2信號(hào)序列。編碼信號(hào)序列和成熟蛋白質(zhì)的SB12 tbp2基因克隆進(jìn)pT-7表達(dá)系統(tǒng)，如圖21所示。當(dāng)所得的質(zhì)粒(JB-1600-1)導(dǎo)入E.coli BL21/DE3細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)SB21 Tbp2，如圖22所示。
在E.Coli中以我含體形體產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)Tbp1和Tbp2以圖23所示的程序純化。純化的蛋白質(zhì)至少為大約70％純，如圖24所示。用純化的重組Tbp1和Tbp2蛋白質(zhì)在小鼠中進(jìn)行免疫原性研究。兩種蛋白質(zhì)以3-10μg劑量在小鼠中引起較好的免疫應(yīng)答(圖25)。
產(chǎn)生的抗一種流感嗜血桿菌菌株的重組Tbp1或Tbp2的抗血清與其它菌株發(fā)生交叉反應(yīng)，使其成為有使用潛力的診斷試劑(圖26和27)。
圖28所示的質(zhì)粒pUHITIKFH和pUHITKFP含有克隆進(jìn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體操縱子內(nèi)的可選擇的抗生素抗性標(biāo)記并構(gòu)建成由于插入而失活的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體操縱子。這些質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化嗜血桿菌屬以產(chǎn)生實(shí)施例19所述的不產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體Tbp1和/或Tbp2的菌株。這種菌株在體外和體內(nèi)檢測(cè)和診斷實(shí)踐中用作陰性對(duì)照(因?yàn)樗a(chǎn)不產(chǎn)生TfR。這種菌株也期望是可用于體內(nèi)生長(zhǎng)而減毒的并用作活疫苗以抵抗嗜血桿菌屬引起的疾病。
如上所述，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)抗原決定基可經(jīng)過(guò)使用表達(dá)該氨基酸序列的活載體傳遞給免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，該活載體可以是脊髓灰質(zhì)炎病毒。在圖29中解釋了表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)抗原決定基，包括Tbp2 LEGGFYGP(SEQ ID NO74)的保守的抗原決定基的雜交脊髓灰質(zhì)炎病毒的構(gòu)建。該病毒被產(chǎn)生的抗插入氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO74)(表5)的肽的抗體識(shí)別表明讀病毒以抗原性可識(shí)別的形式表達(dá)該序列。PV1TBP2A和PV1TBP2B也受產(chǎn)生的抗流感嗜血桿菌菌株DL63 tbp2的兔抗血清的中和，表明至少這兩種病毒以可被抗該蛋白質(zhì)的抗體識(shí)別的形式表達(dá)該序列。所有的病毒受抗PV1血清的中和，表明脊髓灰質(zhì)炎中和抗原性位點(diǎn)1的改變不明顯地影響該病毒上的其它抗原性位點(diǎn)。而且經(jīng)過(guò)用脊髓灰質(zhì)炎病毒嵌合體PV1TBP2A或PV1TBP2B免疫產(chǎn)生的免抗血清識(shí)別插入氨基酸序列LEGGFYGP(SEQ ID NO74)的肽。這表明PV1TB2A和PV1TBP2B表達(dá)的序列具有免疫原性且誘導(dǎo)能識(shí)別合成肽內(nèi)相同序列的抗體。
至于圖30，A組顯示了SDS PAGE凝膠，顯示了在大腸桿菌中表達(dá)的流感嗜血桿菌菌株SB12純化的重組tbp2(泳道1)，從Branhamellacatarrhalis菌株4223純化的tbp2(泳道2)，限鐵B.Catarrhalis菌株4223的細(xì)胞總?cè)馨a(chǎn)物(泳道3)，限鐵大腸桿菌JM109的總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(泳道4)和在非限鐵條件下生產(chǎn)的大腸桿菌JM109總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(泳道5)。B組顯示了復(fù)制凝膠的Western印跡結(jié)果，其中使用了用PV1TBP2A免疫的免血清合并液。在泳道1和2中與純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白強(qiáng)烈反應(yīng)，在泳道3中有相似大小的斑帶。與任何大腸桿菌蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的反應(yīng)(泳道4和5)。C組顯示了從相同免預(yù)行抽血的合并血清的結(jié)果，顯示出輕微的特異性反應(yīng)。這些結(jié)果表明PV1TBP2A能誘導(dǎo)對(duì)流感嗜血桿菌和B.catarrhalis轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)特異性的抗血清，該抗血清能區(qū)分B.Catarrhalis與大腸桿菌，后者不表達(dá)等價(jià)蛋白質(zhì)。
含有編碼本文描述的實(shí)施例例舉的嗜血桿菌屬種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體至少一部分的純化和分離的DNA分子在下列方面具有優(yōu)勢(shì)-用于體內(nèi)和體外特異性鑒定嗜血桿菌屬菌株的核酸探針。
-由該DNA分子編碼的產(chǎn)物可用于作為診斷試劑，作為用于產(chǎn)生嗜血桿菌屬特異性的抗血清的抗原。該抗原用于免疫接種以抵抗由嗜血桿菌屬種類引起的疾病以及用于(例如)檢測(cè)嗜血桿菌屬感染。
-以本文所述的實(shí)施例例舉的與部分轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相對(duì)應(yīng)的肽在用作診斷試劑，用來(lái)產(chǎn)生嗜血桿菌屬特異性的抗血清，用于免疫接種以抵抗由嗜血桿菌屬種類引起的疾病和(例如)用于檢測(cè)嗜血桿菌屬感染的抗原時(shí)有優(yōu)勢(shì)。
由本發(fā)明的核酸分子編碼的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其片段和類似物，以及含有與在嗜血桿菌屬各分離物和其它產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞中保守的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體部分相對(duì)應(yīng)的序列的肽，在診斷和免疫由任何產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌菌株引起的疾病中有用。特別是，含序列LEGGFYGP的肽在許多產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌病原體的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)中保守并適于診斷和免疫由產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞引起的疾病。這類細(xì)菌包括(但不限于)嗜血桿菌屬，奈瑟氏菌屬(包括腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌)和Branhamella(包括B.catarrhalis)種類。
本發(fā)明的各種實(shí)施例在對(duì)諸如嗜血桿菌屬感染和產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的其它細(xì)菌病原體感染的免疫、診斷和治療以及免疫學(xué)試劑的生產(chǎn)領(lǐng)域中有許多用途。對(duì)這些用途進(jìn)一步的非限制性討論在下面進(jìn)一步提供。
1.疫苗制備和使用可從本文公開(kāi)的免疫原性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其類似物和片段和/或肽制備適于用作疫苗的免疫原性組合物。該疫苗引起產(chǎn)生包括抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體和調(diào)理或殺菌抗體之抗體的免疫應(yīng)答。如果用嗜血桿菌屬或其它產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌攻擊感染接種的受試者，抗體結(jié)合到轉(zhuǎn)鐵蛋白受體上從而阻斷了為存活所必須的細(xì)菌鐵來(lái)源。而且調(diào)理或殺菌抗TfR抗體也可以選擇另一種機(jī)制提供保護(hù)。
含肽類的疫苗是本領(lǐng)域公知的，例如見(jiàn)美國(guó)專利4601903；4599231；4599230和4596792；本文引用所有這些文獻(xiàn)以供參考。包括疫苗的免疫原組合物可制備成注射劑，液體溶液或乳液。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其類似物和片段和/或肽可以和與該轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、片段、類似物或肽相配伍的藥用賦形劑混合。這類賦形劑可包括水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇及其組合。免疫原組合物和疫苗可進(jìn)一步含有輔助物質(zhì)。如加濕或乳化劑，pH緩沖劑或增強(qiáng)疫苗效力的佐劑。免疫原性組合物和疫苗可經(jīng)腸胃外途徑，皮下或肌內(nèi)注射用藥。作為另一種選擇方法，根據(jù)本發(fā)明形成的免疫原組合物可以以在粘膜表面引起免疫反應(yīng)的方式配制或傳遞。因此，可經(jīng)諸如鼻內(nèi)或口服(消化道內(nèi))途徑將免疫組合物施用到粘膜表面。為傳遞給免疫系統(tǒng)的特異性細(xì)胞或粘膜表面免疫原性組合物可以與靶分子結(jié)合來(lái)提供。一些這類靶分子包括菌株B12和細(xì)胞毒素片段(如WO 92/17167(Biotech Australia Pty.Ltd)所述)和單克隆抗體(如美國(guó)專利5194254(Barber et al)所述)。作為另一種可選擇方法，也可使用包括栓劑或口服配方的其它用藥方式。對(duì)于栓劑，結(jié)合物和載體可包括(例如)polyalkalene glycols或甘油三酯?？诜浞桨ㄒ话闶褂玫馁x形劑，例如藥用級(jí)糖精，纖維素和碳酸鎂。這些組合物的形式可以是溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊，緩釋制劑或粉末，且含有10-95％的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，片段，類似物和/或肽。
以與配方劑量相配伍的方式施用疫苗，其施用量應(yīng)是治療上有效的，保護(hù)性的和免疫原性的。施用量取決于所治療的受試者，例如包括個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體且如果需要的話產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。所需施用的活性成份的準(zhǔn)確量取決于醫(yī)生的判斷。然而，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，合適的劑量范圍易于確定，可以是微克級(jí)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其類似物和片段和/或肽。初次用藥和加強(qiáng)劑量用藥的合適方式也可變化，但應(yīng)包括初次用藥后接著進(jìn)行隨后的用藥。疫苗的劑量也可取決于用藥途徑并可根據(jù)宿主的大小而變化。
編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的核酸分子也可直接用于經(jīng)直接施用DNA進(jìn)行免疫，例如經(jīng)過(guò)注射用于遺傳免疫或經(jīng)過(guò)構(gòu)建活載體，例如沙門氏菌屬、BCG、腺病毒、癌病毒、牛痘病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒。用于將異源性抗原攜帶進(jìn)免疫系統(tǒng)的一些活載體的討論見(jiàn)諸如O’Hagan(1992)的討論。用于將DNA直接注射進(jìn)受試者以進(jìn)行遺傳免疫的方法在諸如Ulmer et al.，1993的文章中進(jìn)行了描述。
肽類的體內(nèi)應(yīng)用首先需要對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，因?yàn)殡念惐旧砜赡懿痪邆渥銐蜷L(zhǎng)的血清和/或組織半壽期和/或足夠的免疫原性。這種化學(xué)修飾的肽本文稱為“肽類似物”。術(shù)語(yǔ)“肽類似物”引伸為肽的任何功能化學(xué)等價(jià)物，其特征為就本發(fā)明的實(shí)踐而言其體內(nèi)或體外穩(wěn)定性和/或效力和免疫原性增加。本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽類似物”也引伸為本文所述的肽的任何氨基酸衍生物。本文預(yù)期的肽類似物的生產(chǎn)程序包括但不限于對(duì)側(cè)鏈的修飾，在肽合成期間插入非天然氨基酸和/或其衍生物和使用交聯(lián)劑和其它將構(gòu)象限制強(qiáng)加到肽或其類似物上的方法。
本發(fā)明預(yù)期的側(cè)鏈修飾的例子包括氨基修飾，如經(jīng)過(guò)與乙醛反應(yīng)接著用NaBH4還原進(jìn)行還原性烷基化；用甲基乙酰亞胺酰胺化；用乙酸酐乙?；挥们杷猁}使氨基氨甲?；?；用2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苯基化；用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐使氨基烷基化；用5’磷酸吡哆醛使賴氨酸吡哆?；又肗aBH4還原。
精氨酸殘基上的胍基可經(jīng)過(guò)用諸如2，3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛的試劑形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物進(jìn)行修飾。
羧基可經(jīng)過(guò)形成鄰?；愲医又苌芍T如相應(yīng)的酰胺進(jìn)行碳二亞氨活化來(lái)修飾。
巰基的修飾方法有例如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；過(guò)甲酸氧化成磺基丙氨酸；與其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；與順丁烯二酰亞胺，順丁烯二酸酐或其它取代的順丁烯二酰亞胺反應(yīng)；使用4氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞-4硝基酚和其它汞制劑形成汞制劑衍生物；用氰酸鹽在堿性pH下進(jìn)行氨甲?；?。
色氨酸殘基可經(jīng)過(guò)(例如)用N溴琥珀酰亞胺氧化或用2-羥-5-硝基芐基溴或磺酰鹵使吲哚環(huán)繞基化進(jìn)行修飾。酪氨酸殘基可經(jīng)過(guò)用四硝基甲烷硝化進(jìn)行改變以形成3-硝基酷氨酸衍生物。
組氨酸殘基咪唑環(huán)的修飾可經(jīng)過(guò)碘乙酸衍生物烷基化或用焦碳酸二乙酯進(jìn)行乙酯基化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在肽合成期間摻入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、t-丁基甘氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥(niǎo)氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基己酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。
如果抗原與佐劑共同施用，可明顯改進(jìn)免疫原性，通常使用百分之0.05至1.0的磷酸鹽溶液-緩沖鹽水。佐劑增強(qiáng)抗原的免疫原性，但其本身并不具有免疫原性。佐劑可經(jīng)過(guò)將抗原局部保留在靠近用藥的位點(diǎn)以產(chǎn)生貯存效應(yīng)利于緩慢，持久地釋放抗原到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中來(lái)發(fā)揮作用。佐劑也可將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吸引到抗原貯存點(diǎn)并刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
很多年來(lái)免疫刺激試劑或佐劑用于改善宿方主對(duì)諸如疫苗的免疫應(yīng)答。內(nèi)部佐劑(如脂多糖)一般是用作疫苗的殺死的或減毒的細(xì)菌成份。外部佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑，一般與抗原以非共價(jià)鍵結(jié)合并配成增強(qiáng)宿主的免疫應(yīng)答。因此已鑒定了佐劑增強(qiáng)對(duì)經(jīng)腸胃外途徑傳遞的抗原的免疫應(yīng)答。然而一些這類佐劑有毒性，可引起不期望的副作用，使得它們不適用于人類和許多動(dòng)作。事實(shí)上，只有氫氧化鋁和磷酸鋁(一般籠統(tǒng)地稱為鋁)常規(guī)用作人類和獸醫(yī)疫苗的佐劑。鋁在增強(qiáng)對(duì)diptheria和破傷風(fēng)類毒素抗體中的效力即將建立，且最近鋁已用作HBsAg疫苗的佐劑。盡管鋁在一些用途中的有用性已充分形成，但它也有局限性。例如，鋁對(duì)流感免疫接種無(wú)效且不能持續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。以鋁作佐劑的抗原誘導(dǎo)的抗體在小鼠中主要是IgG1類，它對(duì)一些疫苗試劑提供的保護(hù)不是最佳的。
大范圍的外部佐劑可誘導(dǎo)對(duì)抗原的有效免疫應(yīng)答。這些包括與膜蛋白質(zhì)抗原復(fù)合的皂苷(免疫刺激復(fù)合物)，含礦物油的pluronic聚合體，殺死的分枝桿菌和礦物油Freund氏完全佐劑，細(xì)菌產(chǎn)物，如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)以及脂A和脂質(zhì)體。
為了有效地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答(HIR)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)，將免疫原在佐劑中乳化。許多佐劑有毒性，誘導(dǎo)肉芽瘤，急性和慢性炎癥(Freund氏完全佐劑，F(xiàn)CA)，細(xì)胞溶解(皂苷和pluronic聚合物)和熱原性，關(guān)節(jié)炎和前眼色素層炎(LPS和MDP)。盡管FCA是一種優(yōu)良的佐劑并在研究中廣泛使用，但由于其毒性不允許將它用于人類或獸醫(yī)疫苗。
理想的佐劑所需的特征包括(1).無(wú)毒性；
(2).刺激長(zhǎng)期免疫應(yīng)答的能力；(3).生產(chǎn)簡(jiǎn)便和在長(zhǎng)期貯存中穩(wěn)定；(4).如果需要，對(duì)以各種途徑施用的抗原誘導(dǎo)CMI和HIR兩者的能力；(5).與其它佐劑協(xié)同作用；(6).與抗原遞呈細(xì)胞群體(APC)選擇性相互作用的能力；(7).特異性地誘發(fā)合適的IH1或IH2細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)的能力；(8).選擇地增強(qiáng)針對(duì)抗原的合適抗體類型水平(例如IgA)的能力。
于1989年8月8日授權(quán)給Lockhoff等的美國(guó)專利4855283(本文引用以供參考)教導(dǎo)了包括N糖基酰胺，N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯的糖脂類似物，其中每種都在糖殘基上被氨基酸取代，將它們作為免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑。因此，Lockhoff等1991報(bào)道了與天然存在的糖脂表現(xiàn)出相似結(jié)構(gòu)的N-糖脂類似物，如葡糖鞘脂和葡糖甘油脂，在單純皰疹病毒疫苗和假狂犬病病毒疫苗中能誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)。以長(zhǎng)鏈烷基胺和通過(guò)異頭碳原子直接與糖類相連接的脂肪酸合成了一些糖脂以模仿天然存在的脂殘基的功能。
授權(quán)給Moloney(本文稱為受讓人)的美國(guó)專利4258029(本文引用以供參考)教導(dǎo)了十八烷基酪氨酸鹽酸(OTH)與破傷風(fēng)類毒素和福爾馬林滅活的I、II和III型脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗混合時(shí)充當(dāng)佐劑。另外，Nixon-George等1990報(bào)道了與重組肝炎B表面抗原混合的芳香族氨基酸的十八烷基酯增強(qiáng)宿主對(duì)肝炎B病毒的免疫反應(yīng)。
合成肽的脂化也用于增強(qiáng)其免疫原性。因此，Wiessuller 1989描述了將含有與口蹄疫病毒蛋白質(zhì)同源之序列的肽偶聯(lián)到佐劑三次脂酰基-5-甘油-半胱氨酰絲氨酰絲氨酸上作為革蘭氏陰性菌脂蛋白N端部分的合成類似物。而且Deres等1989報(bào)道了用由來(lái)自流感病毒核蛋白經(jīng)過(guò)連接到脂肽N-軟脂?；?S-[2，3-雙(軟脂?；?-(2RS)-丙基-[R]-半胱氨酸(TPC)上修飾的合成肽組成的合成脂肽疫苗體內(nèi)引發(fā)病毒特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。
2.免疫試驗(yàn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，其類似物和片段和/或肽在包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，RIA和其它非酶聯(lián)抗體結(jié)合試驗(yàn)或本領(lǐng)域已知的用于檢測(cè)抗細(xì)菌性嗜血桿菌屬TfR和/或肽的抗體的方法之免疫試驗(yàn)中用作為免疫原，抗原。在ELISA試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，類似物，與TfR蛋白部分相應(yīng)的片段和/或肽在選定的表面固相化，例如能結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的表面，如聚苯乙烯微滴定板的孔中。洗滌去掉未完全吸附的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，類似物，片段和/或肽后，將非特異性蛋白質(zhì)如已知對(duì)試驗(yàn)樣品是免疫原中性的牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白溶液結(jié)合到選定的表面上。這樣使固相表面的非特異性吸附位點(diǎn)封閉，因而減少了由抗血清與表面的非特異性結(jié)合引起的本底。除了待檢測(cè)的是特定細(xì)菌種類外，選定的肽優(yōu)選來(lái)自表2或表3的保守區(qū)域以增強(qiáng)種間交叉檢測(cè)。在檢測(cè)特定種類的情況下，選擇的肽是特定種類TfR所獨(dú)有的。一般情況下，肽范圍為12個(gè)殘基以上優(yōu)選14個(gè)到30個(gè)殘基。然而一些情況下肽的混合物既可用作疫苗免疫原又可作為診斷試劑。事實(shí)上來(lái)自保守區(qū)和/或非保守區(qū)的肽混合物可用于提供種交叉保護(hù)和/或診斷。在這種情況下，肽免疫原混合物通常稱為用作疫苗或診斷試劑的“雞尾酒”制品。
然后將固定表面與樣品如待測(cè)臨床或生物學(xué)材料以有助于免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的方式接觸。這可包括用稀釋劑如BSA，牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)/Tween稀釋樣品。然后在諸如25°到37℃檔的溫度下將樣品保溫2到4小時(shí)。保溫后，洗滌接觸樣品的表面以去掉非免疫復(fù)合物質(zhì)。洗滌程序可包括用諸如BPS/Tween或硼酸緩沖液的溶液洗滌。
在試驗(yàn)樣品和結(jié)合的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，類似物，片段和/或肽之間形成特異性免疫復(fù)合物并隨后洗滌后，可將免疫復(fù)合物與對(duì)第一抗體具有特異性的第二抗體接觸來(lái)檢測(cè)免疫復(fù)合物的形成甚至形成量。如果試驗(yàn)樣品來(lái)自人類，第二抗體是對(duì)人免疫球蛋白具有特異性的抗體且一般是IgG。為了提供檢測(cè)手段，第二抗體可具有相聯(lián)活性，如酶促活性，例如當(dāng)與合適的生色底物保溫時(shí)產(chǎn)生顏色反應(yīng)。使用(例如)可見(jiàn)光潛分光光度計(jì)測(cè)量顏色產(chǎn)生的程度可實(shí)現(xiàn)定量。
3.作為雜交探針的序列的應(yīng)用含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因序列的本發(fā)明的核苷酸序列現(xiàn)有使得可從嗜血桿菌的任何種類和其它具有轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的細(xì)菌中鑒定和克隆轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因。
包含本發(fā)明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的序列的核苷酸序列對(duì)于其與其它TfR基因互補(bǔ)序列選擇性地形成雙螺旋分子的能力是有用的。根據(jù)本申請(qǐng)，可使用各種雜交條件以獲得不同程度選擇性的針對(duì)其它TfR基因的探針。對(duì)于高度選擇性，可使用相當(dāng)嚴(yán)格的條件以形成雙螺旋，如低鹽和/或高溫度條件，例如由0.02M到0.15M NaCl，溫度在大約50℃到70℃之間提供的條件。對(duì)于有些應(yīng)用，需要不太嚴(yán)格的雜交條件，如0.15M至0.9M鹽，溫度在大約20℃到55℃之間變化。也可經(jīng)過(guò)加入增加量的甲酰胺使雜交雙螺旋去穩(wěn)定來(lái)產(chǎn)生更嚴(yán)格的雜交條件。因此，具體雜交條件應(yīng)該易于操作，并且選擇的方法一般取決于所需的結(jié)果。一般情況下，在50％甲酰胺存在下的常規(guī)雜交溫度是對(duì)于與靶片段有95到100％同源探針為42℃，對(duì)于有90到95％同源的為37℃，對(duì)于有85到90％同源為32℃。
在臨床診斷實(shí)踐中，本發(fā)明TfR基因核酸序列可與合適的工具結(jié)合使用，如一種標(biāo)記物，用于檢測(cè)雜交的。本領(lǐng)域已知大范圍的各種合適的指示劑工具，包括放射活性，酶促或其它配體，如抗生物素蛋白/生物素，它們可提供可檢測(cè)的信號(hào)。在一些診斷實(shí)踐中，可使用酶標(biāo)記如脲酶，堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶來(lái)代替放射活性標(biāo)記。對(duì)于酶標(biāo)記，比色指示劑底物是已知的，可用它提供一種肉眼或分光光度術(shù)可見(jiàn)的裝置來(lái)鑒定與含有TfR基因序列樣品的特異性雜交。
本發(fā)明的TfR基因的核酸序列作為雜交探針，用于作不溶液雜交和運(yùn)用固相程序的實(shí)施例在運(yùn)用固相程序的實(shí)施例中，來(lái)自樣品，如臨床樣品，包括滲出液，體液(例如，血清，羊膜液，中耳滲出液，痰，支氣管腫泡灌洗液)或甚至組織的試驗(yàn)DNA(或RNA)吸附或否則附著在選定的基質(zhì)或表面上。然后用選定的含有本發(fā)明TfR基因或其片段的核酸序列的探針在所需條件下對(duì)固定的單鏈核酸進(jìn)行特異性雜交。選自的條件取決于以特定標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)的具體情況。所需的標(biāo)準(zhǔn)取決于(例如)G+C含量，靶核酸類型，核酸來(lái)源，雜交探針的大小等。洗滌雜交表面去掉非特異性結(jié)合的探針?lè)肿雍?，以?biāo)記工具檢測(cè)或甚至定量特異性雜交。至于肽的選擇，優(yōu)選選擇在嗜血桿菌屬種類中保守的核酸序列部分，如編碼圖8、9、13和14及特別是在表2和表3中列出的保守肽序列的核酸序列。選定的探針可以是至少18bp且可以是在30bp到90bp長(zhǎng)的范圍中。
4.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的表達(dá)含有來(lái)自與宿主細(xì)胞相容的種類的復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體用于在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因。該載體通常攜帶一個(gè)復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的序列。例如，可使用含有編碼氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因的pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而提供鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)便方法。pBR322質(zhì)粒或其它微生物質(zhì)?；蚴删w也可含有(或修飾成含有)可被宿主細(xì)胞用來(lái)表達(dá)其自身蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。
另外，含有與宿主相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體可用作與這些宿主相關(guān)的轉(zhuǎn)化載體。例如，在λGEMTM-11中的噬菌體可用于制備能用來(lái)轉(zhuǎn)化宿主如大腸桿菌LE392的重組噬菌體載體。
通常用于重組DNA構(gòu)建的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang et al.，1978；Itakura et al.，1977；Goeddel et al.，1979；Goeddel et al.，1980)以及其它微生物啟動(dòng)子，如T7啟動(dòng)子系統(tǒng)(美國(guó)專利4952496)。關(guān)于啟動(dòng)子核酸序列的詳情是已知的，技術(shù)人員能夠?qū)⑺鼈兣c基因有效地連接，所用的具體啟動(dòng)子的選擇一般取決于所需的結(jié)果。適合于表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因，其片段或變異體的宿主包括大腸桿菌，芽孢桿菌屬種類，嗜血桿菌屬，真菌，酵母，也可使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選以重組方法制備蛋白質(zhì)，尤其是當(dāng)從嗜血桿菌屬種培養(yǎng)物中純化的天然存在的TfR蛋白質(zhì)可能包含微量有毒物質(zhì)或其它污染物時(shí)。在異源系統(tǒng)中使用重組方法生產(chǎn)的TfR蛋白質(zhì)可避免這一問(wèn)題，因?yàn)橐源朔椒═fR蛋白質(zhì)可從宿主中以能夠減少純化物質(zhì)中的污染物的方式分離。在這一方面用于表達(dá)的具體所需宿主包括不具有LPS，因而無(wú)內(nèi)毒素的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。這類宿主包括芽孢桿菌屬種類并且對(duì)于生產(chǎn)非熱原性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，片段或其類似物特別有用。而且，重組方法生產(chǎn)允許Tbp1或Tbp2或其片段的生產(chǎn)互相分離這與存在于嗜血桿菌屬中的正常結(jié)合的蛋白質(zhì)不同。
生物學(xué)保藏本文描述和提及的含有編碼來(lái)自流感嗜血桿菌菌株的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體至少一部分的一些質(zhì)粒根據(jù)布達(dá)佩斯條約在本申請(qǐng)申請(qǐng)日前保藏在位于美國(guó)馬里蘭州Rockville的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。保藏的質(zhì)粒樣品在以本美國(guó)專利申請(qǐng)為基礎(chǔ)的專利同意下對(duì)公眾是可獲得的。本文描述和要求的本發(fā)明的范圍不受保藏的質(zhì)粒的限制，因?yàn)楸２貙?shí)踐只試圖作為對(duì)本發(fā)明的解釋。任何編碼與本申請(qǐng)所述相似或等價(jià)的抗原的等價(jià)或相似質(zhì)粒在本發(fā)明范圍內(nèi)。
保藏概述

嗜血桿菌菌株Hib菌株Eagan可從Connaught Laboratories Limited，1755 SteelesAve.W.，Willowdale，Ontario，Canada M2R 3T4獲得。
Hib菌株MinnA從Missouri 63110，St.Louis街道兒童醫(yī)院，華盛頓醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)系Robert Munson博士的保藏品中獲得。
Hib菌株DL63從University of Texas Southwestern Medical Center，5323 Harry Hines Boulevard，Dallas，Texas 75235-9048微生物學(xué)系EricHansen博士的保藏品中獲得。
PAK 12085從RObert Munson博士的保藏品(出處同上)中獲得。
SB12、29；30、32和33從Department of Pediatrics，School ofMedicine，Saint Louis University Medical Centre，St.Louis，Missouri63104的Stephem Barenkamp博士的保藏品中獲得。
實(shí)施例上面的說(shuō)明書(shū)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一般性描述。經(jīng)過(guò)參考下面具體實(shí)施例可獲得更完全的了解。這些實(shí)施例的描述僅用作解釋的目的而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。形式的改變和等價(jià)替換視為出于具體情況的考慮或?qū)е卤憷?。盡管本文使用了特定的術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)是描述性的而不是用于限制的目的。
在本說(shuō)明書(shū)和這些實(shí)例中使用但未清楚描述的分子遺傳學(xué)，蛋白質(zhì)生物化學(xué)，免疫學(xué)和發(fā)酵技術(shù)方法在科技文獻(xiàn)中進(jìn)行了充分的報(bào)道且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
實(shí)施例1本實(shí)施例描述了流感嗜血桿菌菌株DL63，Eagan，MinnA，PAK12085和SB33在Mueller-Hiuton瓊脂或在Harkness等1992年所述的腦心浸出培養(yǎng)基上生長(zhǎng)流感嗜血桿菌菌株。
A.以流感嗜血桿菌b型DL63提取染色體DNA染色體DNA制備如下。在Beckman J14離心機(jī)中以8000rpm離心15分鐘沉淀250ml培養(yǎng)物。用200ml 50mM Tris-HCl pH 8.0洗滌沉淀，如前離心，重懸于12.5ml 50mM Tris-HCl，50mM EDTA pH 8.0中，在-20℃冷凍。然后向冷凍的細(xì)胞沉淀中加入1.25ml含10mg/ml溶菌酶溶液的0.25M Tris-HCl，pH 8.0。融化沉淀并在冰上保溫45分鐘。接著加入2.5ml含1mg/ml蛋白酶K的0.5％SDS，0.4M EDTA，50mM Tris-HCl pH 7.5的溶液。混合物在50℃保溫1小時(shí)并偶爾攪拌。用15ml Tris-緩沖酚提取溶胞產(chǎn)物一次，然后加入1.5ml 3M乙酸鈉和30ml乙醇以沉淀DNA。使DNA纏繞到玻璃棒上，經(jīng)搖動(dòng)過(guò)夜溶于12.5ml含0.2mg/ml RNAse A的50mM Tris-HCl，1mm EDTA，pH 7.5中。用等體積的氯仿提取樣品一次，沉淀并如上所述纏繞。DNA溶于2ml 50mMTirs-HCl，1mm EDTA，pH 7.5中并貯存于4℃。
B.從流感嗜血桿菌b型Eagan中提取染色體DNA經(jīng)離心沉淀50ml培養(yǎng)物，沉淀重懸于25ml TE(10mM Tris，1mMEDTA，pH 7.5)中，2×5ml等份試樣用于染色體制備。向每份等份試樣中加入0.6ml 10％的十二烷基肌氨酸鈉和0.15ml 20mg/ml的蛋白酶K，樣品在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。用Tris-飽和酚提取溶胞產(chǎn)物一次并用扶氯仿∶異戊醇(24∶1)提取3次。合并水相得到7ml終體積。然后加入0.7ml 3M乙酸鈉(pH 5.2)和4.3ml異丙醇，以沉淀且纏繞DNA并用70％乙醇漂洗，干燥并重懸于1ml水中。
C.從流感嗜血桿菌Eagan，MinnA，PAK 12085和SB33中提取染色體DNA以5000rpm在4℃離心15-20分鐘從50ml培養(yǎng)物中沉淀細(xì)胞。細(xì)胞沉淀重懸于10ml TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中并加入鏈霉蛋白酶和SDS至終濃度分別為500μg/ml和1％。樣品在37℃保溫4小時(shí)至得到清亮的溶胞產(chǎn)物。溶胞產(chǎn)物用Tris飽和酚提取一次，用Tris飽和酚/氯仿(1∶1)提取一次，用氯仿提取一次。最終水相在2×500ml 1M NaCl中4℃透析24小時(shí)，更換一次緩沖液。并在2×500ml TE中4℃透析24小時(shí)，更換一次緩沖液。最終透析物分成等份試樣備用。
實(shí)施例2本實(shí)施例描述染色體文庫(kù)的制備A.流感嗜血桿菌DL63-N2AP文庫(kù)在帶25號(hào)針頭的1ml注射器中機(jī)械剪切溶于TE中的100μg流感嗜血桿菌DL63染色體DNA。經(jīng)過(guò)加入45μl 10×S1核苷酸緩沖液(2MNaCl，500mM NaOAc，pH 4.5，10mM ZnSO4，5％甘油)，1.7μl 100U/μl的S1核酸酶，加入至終體積405μl并在37℃保溫15分鐘使剪切的DNA純端化。樣品用酚/氯仿提取一次，用氯仿提取一次并加入1ml乙醇沉淀DNA。樣品在冰上保溫10分鐘或在-20℃過(guò)夜，在微量離心機(jī)中離心30分鐘收獲DNA。用70％乙醇洗滌并干燥。使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)NA序列的EcoRI位點(diǎn)甲基化。向該甲基化DNA中加入5μl 100mM MgCl28μl dNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)和4μl 5U/μlKlenow?；旌衔镌?2℃保溫30分鐘。加入450μl STE(0.1M NaCl，10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，混合物用酚/氯仿提取一次，用氯仿提取一次，再加入1ml乙醇沉淀DNA。樣品在冰上保溫10分鐘或-20℃過(guò)夜。在微量離心機(jī)中離心30分鐘收獲DNA，用70％乙醇洗滌并干燥。
將DNA重懸于7μl TE中，并向溶液中加入14μl磷酸化EcoRI接頭(200μg/μl)，3μl 10×連接緩沖液，3μl 10mM ATP和3μl T4 DNA連接酶(4U/μl)。樣品在4℃保溫過(guò)夜，然后在68℃保溫10分鐘以滅活連接酶。向混合物中加入218μl H2O，45μl 10×通用緩沖液和7μl30U/μl的EcoRI。37℃保溫1.5小時(shí)后，加入1.5μl 0.5M EDTA，混合物放于冰上。
在蔗糖梯度中分離不同大小的DNA，合并含6-10kb DNA的組分。合并的DNA用乙醇沉淀并重懸于5μl TE緩沖液中。在5μl的終體積中用1μg ZAP II載體在4℃與200ng插入DNA連接2-3天。使用GigapackII Gold(Stratagene)包裝連接混合物并涂布在NZY平板上的大腸桿菌SURE細(xì)胞上。滴定文庫(kù)，擴(kuò)增后在0.3％氯仿中貯存于4℃。
B.流感嗜血桿菌Eagan-pUC文庫(kù)用實(shí)施例1C的方法從流感嗜血桿菌Eagan制備的染色體DNA用Sau 3A I消化2、5和10分鐘，樣品在制備的瓊脂糖凝膠上電泳。切下含有3-10kb長(zhǎng)DNA片段的凝膠片并以標(biāo)準(zhǔn)凍融程序提取DNA。pUC8:2(在多克隆位點(diǎn)上具有增加的Bgl II和Xba I限制性酶位點(diǎn)的pUC)的質(zhì)粒DNA用BamH I和Bgl II消化并用小牛堿性磷酸酶(CAP)脫磷酸化。將流感嗜血桿菌Eagan DNA片段連接進(jìn)pUC中，混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)胞。
C.流感嗜血桿菌Eagan-λZAP文庫(kù)按實(shí)施例1B制備的流感嗜血桿菌Eagan染色體DNA用EcoRI消化并在制備的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行大小分離。切下與7-23kb DNA片段相對(duì)應(yīng)的凝膠片，在含3ml TAE(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA)的透析管中以14V電洗脫DNA過(guò)夜。DNA沉淀兩次并重懸于水中，隨后用EcoRI消化的λ2AP II DNA連接過(guò)夜。使用Grgapack II包裝試劑盒(Stratagene)包裝連接混合物并涂布在大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞上。滴定文庫(kù)，擴(kuò)增后在0.3％氯仿中貯存于4℃。
D.EMBL3文庫(kù)按實(shí)施例1C制備流感嗜血桿菌MinnA染色體DNA(10μg)，用Sau3A I(40單位)消化2、4和6分鐘，然后在含10-30％蔗糖梯度的TNE緩沖液(20mM Tris-HCl，5mM NaCl，1mM EDTA，pH 8)中進(jìn)行大小分離。合并含大于5kb DNA片段的組分并沉淀。在第二次實(shí)驗(yàn)中，染色體DNA(2.6μg)用Sau3A I(4單位)消化1、2和3分鐘并采用制備性瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行大小分離。切下含10-20kb DNA片段的凝膠切片并用標(biāo)準(zhǔn)凍/融技術(shù)提取DNA。合并2次實(shí)驗(yàn)大小分離的DNA用于與EMBL3的/BamH I臂(Promega)連接。使用Gigapack II包裝試劑盒包裝連接混合物并涂布到大腸桿菌LE392細(xì)胞上。滴定文庫(kù)，然后擴(kuò)增并在0.3％氯仿中4℃貯存。
按實(shí)施例1C制備的流感嗜血桿菌PAK 12085或SB33的染色體DNA用Sau 3A I(0.5單位/10μg DNA)在37℃消化15分鐘并以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小分離。切下與15-23kb DNA片段相對(duì)應(yīng)的凝膠片并在含3ml TAE的透析管中以14V電洗脫DNA過(guò)夜。沉淀DNA 2次，并重懸于水中，接著用EMBL3 BamH I臂(Promega)連接過(guò)夜。使用λ體外包裝試劑盒(Amersham)根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)包裝連接混合物并涂布到大腸桿菌NM539細(xì)胞上。滴定文庫(kù)，然后擴(kuò)增并在0.3％氯仿存在下貯存于4℃。
實(shí)施例3本實(shí)施例描述文庫(kù)的篩選A.流感嗜血桿菌DL63-λZAP表達(dá)文庫(kù)Tbp1和Tbp2蛋白質(zhì)在固相λ轉(zhuǎn)鐵蛋白(hTf)上進(jìn)行親和純化。簡(jiǎn)單地說(shuō)，根據(jù)廠家方案制備一個(gè)20ml hTf-Sepharose柱用于將蛋白質(zhì)配體耦聯(lián)到CNBr活化的Sepharose(Sigma)上。用3倍柱體積的50mM Tris-HCl，1M NaCl，6M鹽酸胍pH 8.0洗滌所得的基質(zhì)以去掉非共價(jià)結(jié)合的hTf。然后用50mM Tris-HCl，pH 8.0平衡柱了并使用1ml在含檸檬酸鈉和重碳酸鈉各100mM pH 8.6的緩沖液中的10mg/mlFeCl3使結(jié)合的hTf裝載鐵，接著用2倍柱體積的50mM Tris-HCl，1MNaCl，pH 8.0洗滌。按以前所述(Schryvers et al.，1989)以生長(zhǎng)于缺鐵培養(yǎng)基的流感嗜血桿菌菌株DL63制備總細(xì)菌膜(300mg總蛋白)。在50mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 8.0中將膜稀釋成2mg/ml并經(jīng)過(guò)加EDTA至15mM及十二烷基肌氨酸鈉NL97至1.5％使之溶解。以40,000xg離心1小時(shí)后，將上清液上樣到hTf柱上并用10倍柱體積的50mM Tris-HCl，1M，NaCl，10mM EDTA，0.5％十二烷基肌氨酸鈉pH8.0洗滌柱。使用含2M GnHCl的相同緩沖液洗脫受體蛋白質(zhì)，洗脫組分在25mM碳酸氫銨緩沖液中充分透析(更換5次緩沖液)，凍干并貯存于-20℃。分離的蛋白質(zhì)用以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在新西蘭白兔中產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性抗血清。簡(jiǎn)單地說(shuō)，兔經(jīng)皮下途徑免疫3次，間隔為2周，使用完全佛氏佐劑進(jìn)行第一次注射并用不完全佛氏佐劑進(jìn)行隨后的注射。
將DL63λZAP文庫(kù)涂布到大腸桿菌SURE細(xì)胞上并將噬菌斑轉(zhuǎn)移到預(yù)先浸泡在10mM IPTG中的硝酸纖維素膜上以從pBluescript Lac2啟動(dòng)子上誘導(dǎo)表達(dá)。在用多克隆抗TfR抗血清和辣根過(guò)氧化物酶連接的羊抗兔IgG探測(cè)前使用含0.5％脫脂乳的50mM Tris-HCl，150mMNaCl，150mM NaCl，pH 7.5封閉濾膜。經(jīng)過(guò)3輪篩選對(duì)噬菌斑純化并經(jīng)體內(nèi)切除程序(Short et al.，1988)回收重組pBluescript質(zhì)粒(pBHIT1和pBHIT2；圖1A和2)。
B.Eagan，MiinA和PAK 12085非表達(dá)文庫(kù)(i)流感嗜血桿菌Eagan-pUC文庫(kù)的篩選使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用圖2描述的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的5’pBHIT2探針探測(cè)濾膜。該探針用洋地黃毒苷(dig，Boehringer Mannheim)按廠家說(shuō)明進(jìn)行了標(biāo)記。將幾個(gè)推斷的克隆點(diǎn)印跡到硝酸纖維素上并使用相同的5’pBHIT2探針進(jìn)行第二輪篩選。以限制性酶切圖譜分析第二輪推斷的克隆并選擇克隆S-4368-3-3(圖18，圖2)用于序列分析。
(ii)流感嗜血桿菌Eagan-λZAP文庫(kù)的篩選使用LB平板和0.7％瓊脂覆蓋層將噬菌體文庫(kù)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)涂布到XLI Blue細(xì)胞(stratagene)上。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，濾膜在真空中80℃烘焙2小時(shí)以固定DNA。用洋地黃毒苷標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(圖2)的5’pBHIT2探針，濾膜在42℃預(yù)雜交4小時(shí)，然后在42℃用標(biāo)記的探針雜交過(guò)夜。在68℃洗滌濾膜，放射自顯影后，選擇一些噬菌斑用于第二輪篩選。根據(jù)λZAP系統(tǒng)(Promega)提供的方案體內(nèi)切割第二輪推定的噬菌斑的噬菌粒DNA。獲得了四個(gè)具有相同～2.5kb Eco RI插入片段的克隆，其中在圖B，圖2中的JB-901-5-3是一個(gè)例子。也擴(kuò)增了推斷的噬菌斑并以500ml培養(yǎng)物中純化噬菌體DNA。經(jīng)過(guò)用Xba I消化切開(kāi)插入的DNA并克隆進(jìn)用Xba I消化和脫磷酸化的pUC8:2(在其多克隆位點(diǎn)含有另一Bgl II和Xba I位點(diǎn)的pUC8)中?？寺B-911-3-2(圖17)含流感嗜血桿菌Eagan TfR操縱子的3’一半序列。
(iii)篩選EMBL 3文庫(kù)使用含0.7％上層瓊脂糖的NZCYM作覆蓋物將流感嗜血桿菌MinnA文庫(kù)涂布到NZCYM平板上的LE392細(xì)胞上。按標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⑹删咿D(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，加工濾膜并用以洋地黃毒苷標(biāo)記的5’pBHIT2探針(圖2)探測(cè)。將推斷的噬菌斑涂布培養(yǎng)并用相同程序進(jìn)行第二和第三輪篩選。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從500ml培養(yǎng)物中制備噬菌斑DNA，以Sal I消化切割插入的DNA并克隆進(jìn)pUC以產(chǎn)生克隆DS-712-1-3(圖1C和2)。
使用含0.7％瓊脂糖的NZCYM作覆蓋物將流感嗜血桿菌PAK12085文庫(kù)涂布到NZCYM平板上的LE392細(xì)胞上。將噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，加工該濾膜并用洋地黃毒苷標(biāo)記的5’pBHIT2探針(圖2)探測(cè)。將推斷的噬菌斑涂布培養(yǎng)并使用相同程序進(jìn)行第二輪篩選。以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從500ml培養(yǎng)物中制備噬菌斑DNA，經(jīng)過(guò)用Sal I消化切下的DNA插入序列并克隆進(jìn)pUC以產(chǎn)生克隆JB-1042-7-6(圖10和2)。
使用含0.7％瓊脂糖的NZCYM作為覆蓋物將流感嗜血桿菌SB33文庫(kù)涂布到NZCYM平板上的LE392細(xì)胞上。將噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，加工該濾膜并用洋地黃毒苷標(biāo)記的5’pBHT2探針(圖2)探測(cè)。將推斷的噬菌斑涂布培養(yǎng)并使用相同的程序進(jìn)行第二輪篩選。以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從500ml培養(yǎng)物中制備噬菌斑DNA。經(jīng)過(guò)用Sal I消化切下的DNA插入序列并克隆進(jìn)pUC以產(chǎn)生克隆JB-1031-2-9(圖2)。
實(shí)施例4本實(shí)施例描述TfR操縱子Tbp1和Tbp2基因的測(cè)序。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從克隆pBHIT 1，pBHIT 2，S-4368-3-3，JB-901-5-3，DS-712-1-3，JB-1042-7-6，JB-1031-2-9制備質(zhì)粒DNA。在ABI型380BDNA合成儀上合成17-25個(gè)堿基長(zhǎng)的寡核苷酸測(cè)序引物，經(jīng)使用從Applied Biosystems Inc.獲得并根據(jù)廠家建議使用的OPC柱色譜純化。使用ABI型370A DNA序列儀和染料終止子化學(xué)根據(jù)廠家方法測(cè)序該樣品。菌株DL63的TfR操縱子的序列如圖3所示，菌株Eagan的相應(yīng)序列如圖4所示，圖5是菌株MinnA的相應(yīng)序列，圖6是PAK 12085的相應(yīng)序列，圖7是SB33的相應(yīng)序列。
實(shí)施例5本實(shí)施例描述了不可分型流感嗜血桿菌菌株SB12，SB29，SB30和SB32 tbp2基因的PCR擴(kuò)增。
按上面所述制備不可分型流感嗜血桿菌菌株SB12，SB29，SB30和SB32的染色體DNA。TfR基因排列成具tbp2的后面接著tbp1的操縱子(見(jiàn)圖12A和12B)。合成針對(duì)tbp2 5’端和tbp1編碼序列5，端逆向互補(bǔ)的寡核苷酸。引物是與Tbp2先導(dǎo)序列MKSVPLISGS(SEQID NO147)相應(yīng)的GGATCCATATGAAATCTGTACCTCTTATCTCTGGT(SEQ IDNO120)和與Tbp1先導(dǎo)序列MTKK(SEQ ID NO138)及部分間隔序列(圖12A和12B)逆向互補(bǔ)的TCTAGAAGCTTTTTTAGTCATTTTTAGTATTCCAT(SEQ ID NO137)。在含有10mM Tris/HCl pH 8.3，50mM氯化鉀和1.5mM氯化鎂的緩沖液中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每100μl反應(yīng)混合物含5ng染色體DNA，1μl每種引物，5單位擴(kuò)增tap DNA聚合酶(Perkin ElmerCetus)和0.4mM dNTPs(Perkin Elmer Cetus)。循環(huán)條件是94℃1.0分鐘，45℃2.0分鐘和72℃1.5分鐘循環(huán)25次。對(duì)每種樣品擴(kuò)增特異性的2kb片段(圖13)。SB33 DNA用作陽(yáng)性對(duì)照(泳道1)。用于擴(kuò)增Tbp2基因的染色體DNA是泳道1，SB33；泳道2，SB12；泳道3，SB29；泳道4，SB30；泳道5，SB32。將片段克隆進(jìn)TA克隆載體(Invitrogen)內(nèi)并測(cè)定其核苷酸序列。菌株SB12(SEQ ID NO108)，SB29(SEQ ID NO110)，SB30(SEQ ID NO112)和SB32(SEQ IDNO114)的Tb2核酸序列分別如圖8、9、10和11顯示。
實(shí)施例6本實(shí)施例描述了轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸序列的比較和經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白有效暴露的抗原決定基的鑒定。
在圖14中，顯示了流感嗜血桿菌b型Eagan，DL63，不可分型流感嗜血桿菌菌株P(guān)AK 12085和SB33，腦膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982(Legrain et al.，1993)和淋病奈瑟氏菌FA19(Cornelissen et al.，1992)Tbp1氨基酸序列的比較。這一分析揭示了在所有這些細(xì)菌中保守的Tbp1區(qū)域。
在圖15中，顯示了流感嗜血桿菌b型菌株Eagan，DL63，不可分型流感嗜血桿菌PAK 12085，SB12，SB29，SB30和SB32，腦膜炎奈瑟氏菌菌株B16B6和M982，淋病奈瑟氏菌FA19和Actinobacillus(Haemophilus)pleuropneumoniae(Gerlach et al.，1992)205和37的Tbp2氨基酸序列的比較。這一分析揭示了在所有這些細(xì)菌中保守的Tbp2區(qū)域。
使用Chou和Fasman公式(1978)進(jìn)行蛋白質(zhì)二緩結(jié)構(gòu)分析，使用Hopp公式(1986)進(jìn)行親水性/疏水性分區(qū)。該值來(lái)自七肽窗口平均值，且在每個(gè)片段的中點(diǎn)分區(qū)。圖16A顯示了流感嗜血桿菌b型Eagan Tbp1預(yù)期的二級(jí)結(jié)構(gòu)，圖16B顯示了流感嗜血桿菌b型EaganTbp2預(yù)期的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用上面所述的程序得到了圖16A和16B描繪的預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。然而，本發(fā)明還不能證實(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)就是這些圖中所描繪的。
經(jīng)過(guò)序列比較鑒定了一些不同細(xì)菌中Tbp1和Tbp2蛋白質(zhì)保守的抗原決定基，分析在圖14和1 5中所示。一些這類保守的抗原決定基包括TBP1DNEVTGLGKSEQ ID NO43TBP1EQVLNIRLTRYDPGI SEQ ID NO44TBP1GAINEIEYENVKAVEISKG SEQ ID NO45TBP1GALAGSV SEQ ID NO46TBP2LEGGFYGP SEQ ID NO74TBP2CSGGGSFD SEQ ID NO75TBP2YVYSGL SEQ ID NO76TBP2CCSNLSYVKFG SEQ ID NO77TBP2FLLGHRT SEQ ID NO78TBP2EFNVDF SEQ ID NO79TBP2NAFTGTA SEQ ID NO80TBP2VNGAFYG SEQ ID NO81TBP2LEGGYF SEQ ID NO82TBP2VVFGAR SEQ ID NO83而且結(jié)合預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在Tbp1中鑒定了4個(gè)保守的暴露的抗原決定基，在Tbp2中監(jiān)定了兩個(gè)。它們是Tbp1DNEVTGLGKSEQ ID NO43Tbp1EQVLN/DIRDLTRYD SEQ ID NOS139和140Tbp1GAINEIEYENVKAVEISK SEQ ID NO141Tbp1GI/VYNLF/LNYRYVTWE SEQ ID NOS142和143Tbp2CS/LGGG(G)SFDSEQ ID NOS75，144和145Tbp2LE/SGGFY/FGP SEQ ID NOS74和146含有上述保守氨基酸序列的蛋白質(zhì)，多肽或肽在診斷實(shí)踐中作為檢測(cè)裝置，作為檢測(cè)或防止由產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的細(xì)菌引起的疾病中的免疫原特別有用。對(duì)于免疫接種，可將特別說(shuō)明的氨基酸序列以蛋白質(zhì)或肽或活傳遞載體的形式遞呈給免疫系統(tǒng)，例如可使用沙門氏菌，BCG，腺病素，痘病毒，牛痘病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒。
實(shí)施例7本實(shí)施例描述了從大腸桿菌表達(dá)Eagan Tbp1的質(zhì)粒JB-1468-29的構(gòu)建。
質(zhì)粒S-4368-3-3(圖1B和2)和JB-911-3-2(圖17)分別含Eagantbp1基因的5’和3’部分。圖17描述了質(zhì)粒JB-1468-29的構(gòu)建方法。用于JB-1468-29構(gòu)建的寡核苷酸序列如圖20所示(SEQ ID NOS86和87)。經(jīng)電穿孔將質(zhì)粒JB-1468-29導(dǎo)入大腸桿菌菌株BL21/DE3以產(chǎn)生菌株JB-1476-2-1。
JB-1476-2-1在YT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并按標(biāo)準(zhǔn)方案用IPTG誘導(dǎo)。為了制備用于免疫原性和其它研究的Tbp1，菌株JB-1476-2-1在含3％葡萄糖的NZCYM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。將1∶40的接種物加入新鮮的不含葡萄糖的NZCYM培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)物生長(zhǎng)到A578＝0.3。加入乳糖至1％并將培養(yǎng)物誘導(dǎo)4小時(shí)。JB-1476-2-1總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物SDS-PAGE分析如圖22所示。泳道1，t0時(shí)的JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1)；泳道2，誘導(dǎo)t＝4h JB-1476-2-1時(shí)；泳道3，分子量標(biāo)記200kD，116kDa，97.4kDa，66kDa，45kDa和31kDa；泳道4，t0時(shí)的JB-1437-4-1(T7/EaganTbp2)；泳道5，誘導(dǎo)t＝4h JB-1437-4-1時(shí)的；泳道6，t0時(shí)的JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2)；泳道7，誘導(dǎo)t＝4h時(shí)的JB-1607-1-1。
實(shí)施例8本實(shí)施例描述了從大腸桿菌中表達(dá)Eagan Tbp2的質(zhì)粒JB-1424-2-8的構(gòu)建。
在圖18中，顯示了含有流感嗜血桿菌b型Eagan完整tbp2基因的質(zhì)粒S-4368-3-3。圖18描述了質(zhì)粒JB-1424-2-8，圖19顯示了所用的寡核苷酸。經(jīng)電穿孔將質(zhì)粒JB-1424-2-8導(dǎo)入大腸桿菌菌株BL21/DE3以產(chǎn)生大腸桿菌菌株JB-1437-4-1。用IPTG或乳糖誘導(dǎo)時(shí)，大腸桿菌JB-1437-4-1表達(dá)Tbp2，如圖22所示。泳道1，t0時(shí)的JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1)；泳道2，JB-1476-2-1(誘導(dǎo)t＝4h)；泳道3，分子量標(biāo)記200kD，116kDa，97.4kDa，66kDa，45kDa和31kDa；泳道4，t0時(shí)的JB＝1437-4-1(T7/Eagan Tbp2)；泳道5，JB-1 437-4-1(誘導(dǎo)t＝4h)；泳道6，t0時(shí)的JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2)；泳道7，誘導(dǎo)t＝4h時(shí)的JB-1607-1-1。
實(shí)施例9本實(shí)施例描述了編碼位于Tbp2序列前的脂蛋白前導(dǎo)序列的質(zhì)粒的構(gòu)建。
用于構(gòu)建含有在Tbp2前的來(lái)自E.coli lpp(SEQ ID NO88和89)，rlpB(SEQ ID NO90和91)和pal(SEQ ID NO92和93)的指蛋白的前導(dǎo)序列之質(zhì)粒的寡核苷酸如圖20所示。構(gòu)建的質(zhì)粒和產(chǎn)生的相應(yīng)的菌株如下面表1所示。
實(shí)施例10本實(shí)施例描述了從大腸桿菌表達(dá)SB12 Tbp2的質(zhì)粒JB-1600-1的構(gòu)建。
質(zhì)粒DS-1047-1-2(圖21)含有PCR擴(kuò)增的SB12 tbp2基因。以Nde I到EcoRI的限制性片段切下tbp2基因并插入到pT7-7表達(dá)載體中以產(chǎn)生質(zhì)粒JB-1600-1。電穿孔進(jìn)BL21/DE3細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)SB12 Tbp2的大腸桿菌菌株JB-1607-1-1。用IPTG或乳糖誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)SB12Tbp2，如圖22所示。泳道1，t0時(shí)的JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1)；泳道2，JB-1476-2-1(誘導(dǎo)t＝4h)；泳道3；分子量標(biāo)記200kD，116kDa，97.4kDa，66kDa，45kDa和31kDa；泳道4，t0時(shí)的JB-1437-4-1(T7/EaganTbp2)；泳道5，誘導(dǎo)t＝4h時(shí)的JB-1437-4-1；泳道6，t0時(shí)的JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2)；泳道7，t＝4h誘導(dǎo)時(shí)的JB-1607-1-1。
實(shí)施例11本實(shí)施例描述了Tbp1和Tbp2的提取和純化。
Tbp1和Tbp2的純化方法如圖23所示。兩種重組蛋白質(zhì)都以大腸桿菌中包含體的形式被表達(dá)且純化方式相同。按實(shí)施例7制備Tbp1和實(shí)施例8制備Tpb2所述方法制備的從500ml 50ml 50mM Tris-HCl，pH8.0中并經(jīng)聲處理破碎(3×10分鐘，70％工作循環(huán))。提取物在20,000xg下離心30分鐘，棄去含＞95％可溶性大腸桿菌蛋白質(zhì)的所得上清液。
在50ml含0.5％Triton X-100和10mM EDTA的50mM Tris ph 8.0中進(jìn)一步提取所得的沉淀(圖23，PPT1)。以20,000xg離心30分鐘后，棄去含殘余可溶性蛋白質(zhì)和主要膜蛋白的上清液。上述提取后獲得的沉淀(圖23，PPT2)含有包含體。將Tbp1和Tbp2蛋白質(zhì)溶于含0.1％SDS和5mM DTT的50mM Tris，pH 8.0中。離心后，再用含0.1％SDS和5mM DTT的50mM Tris，pH 8.0平衡的Superdex 200凝膠過(guò)濾柱上進(jìn)一步純化所得的上清液。以SDS PAGE分析餾分，將含純化的Tbp1或Tbp2的組分用50mM Tris pH 8.0在4℃下透析過(guò)夜，然后以20,000xg離心30分鐘。在這些條件下該蛋白質(zhì)仍是可溶性，純化的Tbp1和Tbp2貯存于-20℃。
純化方法的SDS-PAGE分析如圖24所示。泳道1，預(yù)先染色的分子量蛋白標(biāo)記(106，80，49.5，32.5，27.5，18.5kDa)；泳道2，大腸桿菌總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；泳道3，可溶性包含體；泳道4，純化的Tbp1或Tbp2。
實(shí)施例12本實(shí)施例描述了重組Tbp1和Tbp2在小鼠中的免疫原性研究。
5只Bal b/c小鼠組在第1、29和43天經(jīng)皮下(s.c.)注射AlPO4(1.5mg/劑量)的按實(shí)施例11所述制備的純化rTbp1或rTbp2(1μg至10μg)。在第14、28、42和56天取血樣用于經(jīng)ELA進(jìn)行抗rTbp1和抗-rTbp2抗體滴度分析。免疫原性研究的結(jié)果如圖25所示。
實(shí)施例13本實(shí)施例描述了用于測(cè)定小鼠血清中抗rTbp1和抗-rTbp2抗體的EIAs建立。
基本上按Panezutti et al.，(1993)所述測(cè)定抗rTbp1和抗-rTbp2抗體滴度。微滴定孔用按實(shí)施例11所述制備的0.5μg rTbp1或rTbp2在室溫下包被16h。然后用0.1％(w/v)BSA的PBS進(jìn)行封閉。系列稀釋血清并加入到孔中，然后在室溫下保溫1小時(shí)。與辣根過(guò)氧化物酶連接的羊抗小鼠IgG(Fc特異性)抗體親和純化的F(ab’)2片段用作第二抗體。使用四甲基聯(lián)苯胺(TMB/H2O2)進(jìn)行墨色反應(yīng)并在FlowMultiskan MCC微板閱讀器上在450nm(使用540nm作為參照波長(zhǎng))下測(cè)吸光率。抗血清的反應(yīng)滴度定義為持續(xù)地顯示出比預(yù)先免疫血清樣品增加2倍的吸光率的稀釋度的倒數(shù)。
實(shí)施例14本實(shí)施例描述了用重組Eagan Tbp1免疫接種產(chǎn)生的抗Tbp1抗血清與流感嗜血桿菌各種菌株的交叉反應(yīng)性。
以SDS PAGE凝膠分離生長(zhǎng)于含NAD和血紅素(Harkness et al.，1992)±EDDA的BHI培養(yǎng)基中的流感嗜血桿菌菌株總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用針對(duì)純化的重組Eagan Tbp1產(chǎn)生的豚鼠抗tbp1抗血清(圖26)進(jìn)行探測(cè)。泳道1，BL21/DE3；泳道2，SB12-EDDA；泳道3，SB12+EDDA；泳道4，SB29-EDDA；泳道5，SB29+EDDA；泳道6，SB33-EDDD；泳道7，SB33+EDDA；泳道8，Eagan-EDDA；泳道9，Eagan+EDDA；泳道10，B.catarrhalis 4223-EDDA；泳道11，B.catarrhalis 4223+EDDA；泳道12，腦膜炎奈瑟氏菌608-EDDA；泳道13，腦膜炎奈瑟氏菌608+EDDA；泳道14，誘導(dǎo)JB-1476-2-1表達(dá)的重組Eagan Tbp1；泳道15，分子量標(biāo)記。與抗Tbp1抗血清反應(yīng)的特異性～95kDa帶，在相應(yīng)于流感嗜血桿菌菌株SB12、SB29、SB33和Eagan的泳道3、4、5、7、8和9中，泳道10和11中～110kDa帶，相應(yīng)于B.catarrhalis菌株4223，泳道12和13中～80kDa帶，相應(yīng)于腦膜炎奈瑟氏菌608。
實(shí)施例15本實(shí)施例描述了用重組Eagan Tbp2免疫產(chǎn)生的抗Tbp2抗血清與流感嗜血桿菌各種菌株的交叉反應(yīng)性。
在SDS PAGE凝膠上分離生長(zhǎng)于含NAD和血紅素(Harkness etal.，1992)±EDDA的BHI培養(yǎng)基的流感嗜血桿菌菌株總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用針對(duì)純化的重組Eagan Tbp2產(chǎn)生的豚鼠抗Tbp2抗血清進(jìn)行探測(cè)(圖27)。泳道1，分子標(biāo)記；泳道2，誘導(dǎo)JB-1437-4-1表達(dá)的重組Eagan Tbp2；泳道3，SB12-EDDA；泳道4，SB12+EDDA；泳道5，SB29-EDDA；泳道6，SB29+EDDA；泳道7，SB30-EDDD；泳道8，SB30+EDDA；泳道9，SB32-EDDA；泳道10，SB33+EDDA；泳道11，SB33+EDDD；泳道12，PAK-EDDA；泳道13，PAK+EDDA；泳道14，Eagan-EDDA；泳道15，Eagan+EDDA；與抗Tbp2抗血清反應(yīng)的大約60～70kDa的特異性帶在與嗜血桿菌屬菌株SB12、SB29、SB30、PAK和Eagan相對(duì)應(yīng)的泳道3、6、7、8、13、14和15上。
實(shí)施例16
本實(shí)施例描述了與Tbp2和Tbp1中保守區(qū)相對(duì)應(yīng)的合成肽的合成。
在圖14和15中分別比較了Tbp1和Tbp2的推測(cè)的氨基酸序列。這種比較鑒定了在表2和3中所示的上述轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)氨基酸序列保守區(qū)，合成了含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體部分的肽。經(jīng)過(guò)在含有編碼所說(shuō)肽的核酸之重組載體在合適宿主中表達(dá)或以標(biāo)準(zhǔn)肽合成法可實(shí)現(xiàn)這種合成。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用ABI 430A肽合成儀和使用廠家推薦的條件的最優(yōu)化t-Boc化學(xué)合成肽，使用氫氟酸(HF)從樹(shù)脂上裂解肽。使用以2ml/分的流速在40分鐘內(nèi)在0.1％三氟乙酸(TFA)中形成的15至55％乙腈梯度在Vydac C4半制備柱(1×30cm)上以反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化肽。以分析型HPLC判斷在生化和免疫學(xué)研究中所用的全部合成肽是＞95％的純度。在Waters Pico-Tag系統(tǒng)中進(jìn)行氨基酸成份分析，結(jié)果與理論組成較好地吻合。
實(shí)施例17本實(shí)施例描述了在試驗(yàn)動(dòng)物中合成肽的免疫原性。
在第0天用在佛氏完全佐劑中乳化的，按實(shí)施例16所述制備的100μg肽經(jīng)肌內(nèi)免疫豚鼠，接著使用在佛氏不完全佐劑中乳化的相同量的肽在第+14和+28天進(jìn)行加強(qiáng)注射。在第42+天獲取血清樣品，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定抗體滴度。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用溶于50μg包被緩沖液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)中的500ng任一特定肽在室溫下包被微滴定板的孔(Nunc，Immunoplate，Nunc，Denmark)16小時(shí)。然后用含0.1％(w/v)BSA的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)在室溫下封閉該板30分鐘。系列稀釋抗血清，加入各孔中并在室溫下保溫1小時(shí)。去掉抗血清后，用含0.1％(w/v)Tween-20和0.1％(w/v)BSA的PBS洗滌該板5次。用洗滌緩沖液稀釋(1/8,000)與辣根過(guò)氧化物酶(Jackson Immuno Research Labs Inc.PA)連接的羊抗豚鼠IgG抗體F(ab’)2，加到微滴定板上。室溫下保溫1小時(shí)后，用洗滌緩沖液洗滌平板5次。使用溶于H2O2(ADI，Tornoto)中的底物四甲基苯胺(TMB)使該平板顯色，用1N H2SO4終止反應(yīng)，使用Titretek MultiskanII(Flow Labs.，Virginia)在450nm下測(cè)定光密度。在這些ELISA中包括2個(gè)32氨基酸殘基的無(wú)關(guān)肽作為陰性對(duì)照。試驗(yàn)以一式三份進(jìn)行，每份抗血清的反應(yīng)滴度定義為持續(xù)顯示出比陰性對(duì)照增加2倍光吸收值的稀釋度。在豚鼠中產(chǎn)生的抗血清對(duì)用于免疫的肽具有單一特異性。免疫后獲得的血清滴度如表4所示。
本發(fā)明的肽包含在表2和3中所示的任一單拷貝或含多拷貝的其類似物肽。肽可包含選自表2和3所示的多個(gè)不同肽或其類似物且包括合適的載體分子。優(yōu)選的保守區(qū)的肽可用于形成抗體，因?yàn)槊庖叩幕蚱渌愋偷慕Y(jié)合試驗(yàn)可用于檢測(cè)嗜血桿菌屬的一些種類。因此，表2和3列出了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的一些其它保守區(qū)用于鑒定在診斷，免疫和醫(yī)學(xué)治療中有用的其它肽。
實(shí)施例18本實(shí)施例描述了針對(duì)與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體保守區(qū)相對(duì)應(yīng)的肽產(chǎn)生的抗血清識(shí)別Branhamella Catarrhalis轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的能力。
用與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體保守部分相對(duì)應(yīng)的肽免疫接種豚鼠，獲得的抗血清在實(shí)施例17中描述。Branhamella catarrhalis總細(xì)胞提取物用特異性識(shí)別該細(xì)菌轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的肽特異性抗血清免疫印跡。用Tbp2 N末端肽和Tbp2-25肽免疫豚鼠所得的抗肽抗血清特異性地識(shí)別Branhamella catarrhalis Tbp2蛋白質(zhì)和在大腸桿菌中以質(zhì)?？寺BHIT2表達(dá)的重組Tbp2?？寺BHIT2表達(dá)以氨基酸80開(kāi)始的Tbp2的截短變體(即NKKFYSG SEQ ID NO105)。因此，pBHIT2的Tbp2蛋白質(zhì)僅能被針對(duì)第二抗原決定基LEGGFYGP(TBP2-25)產(chǎn)生的抗體識(shí)別。這一分析表明與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體保守區(qū)相對(duì)應(yīng)的肽在對(duì)大多數(shù)(如果并非全部)產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)菌檢測(cè)中有用以及作為包括用于產(chǎn)生抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的免疫反應(yīng)和抵抗由該細(xì)菌引起的疾病的疫苗在內(nèi)的免疫原性組合物中的成份有用。
采用ELISA檢驗(yàn)這些兔的血清對(duì)插入序列LEGGFYGP(SEQ IDNO74)的肽或流感嗜血桿菌菌株DL63 Tbp2的抗性。ELISA板用肽或蛋白質(zhì)包被，然后用5％脫脂乳封閉。將在含0.05％tween-20，1％干乳的磷酸緩沖鹽中系列2倍稀釋的血清在板上37℃保溫2小時(shí)。接著將平板在含0.05％tween-20的磷酸緩沖鹽水中沖洗5次。用辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)連續(xù)的猴抗兔IgG在室溫下探測(cè)洗滌過(guò)的平板30分鐘。然后用含0.05％tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次。向全部孔中加入HRPO底物后室溫下黑暗中放置30分鐘，然后經(jīng)加入50μl 1M硫酸終止顯色。經(jīng)過(guò)在450nm下測(cè)吸光率來(lái)測(cè)定顏色。
實(shí)施例19本實(shí)施例描述了不產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的流感嗜血桿菌菌株的產(chǎn)生。
將pBHIT1中插入的2.55 EcoRI片段亞克隆進(jìn)pUC4K的EcoRI位點(diǎn)，導(dǎo)致從該載體中去掉了Tn903卡那霉素抗性(Kan)表達(dá)盒(pUHIT1；圖28)。這一亞克隆步驟有利于隨后將含Kan基因盒的Hinc II或Pst I pUC4K片段插入到pUHIT1的Hind III或Pst I位點(diǎn)，因?yàn)樵谟糜诋a(chǎn)生pUHIT1KFH和pUHIT1KFP的構(gòu)建體中兩者都是單一位點(diǎn)(圖28)。用EcoRI消化去掉間斷的基因序列后，使用以前描述的M-IV培養(yǎng)基(Bracak et al.，1991)經(jīng)轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建體導(dǎo)入流感嗜血桿菌野生型基因組中，在含20μg/ml卡那霉素的BHINH瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例20本實(shí)施例描述了表達(dá)蛋白受體抗原決定基的脊髓灰質(zhì)炎病毒的構(gòu)建。
將脊髓灰質(zhì)炎病毒1型Mahoney菌株(PV1-M)基因組堿基1175至2956的cDNA克隆用限制性酶Sau I和Hind III剪切。這些酶切下含堿基2754至2786的片段，該片段編碼PV1-M氨基酸1094至1102，如圖29所示。在本申請(qǐng)中，我們使用四位數(shù)字編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒氨基酸；例如1095是衣殼蛋白VP1的氨基酸95。經(jīng)過(guò)用編碼流感嗜血桿菌Tbp2氨基酸的合成寡核苷酸取代切除的片段來(lái)構(gòu)建編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體氨基酸序列的新雜交體cDNA克隆。用限制性酶NheI和SnaB I剪切新雜交體cDNA克隆，它切下包括人脊髓灰質(zhì)炎病毒堿基2471至2956的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體DNA序列的雜交片段。用Nhe I和SnaBI剪切PV1-M完整基因組的cDNA克隆(例如pT7XLD或pT7CMCB)以切下脊髓灰質(zhì)炎病毒堿基2471至2956的片段。然后用包含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體DNA序列的雜交片段代替切下的片段以產(chǎn)生基因組PV1-M堿基2754至2786被編碼包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體氨基酸的雜交BC環(huán)的堿基取代的雜交cDNA克隆，如圖29所示。
質(zhì)粒pT7XLD和來(lái)自pT7XLD的克隆(如pT7CMCB)在PV1-M cDNA 5’端含有酶T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列。使用T7 RNA聚合酶按Van der Werf et al.，所述制備包括編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體氨基酸任意堿基的PV1-M cDNA之RNA轉(zhuǎn)錄體。用這些RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞產(chǎn)生4個(gè)活的雜交病毒，命名為PV1TBP2A、PV1TBP2B、PV1TB2C和PV1TB2D用pT7CMCB轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染產(chǎn)生來(lái)自轉(zhuǎn)染的野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒，命名為PV1XLD(圖29)。
PV1TBP2A、PV1TBP2B、PV1TBP2C和PV1TBP2D的抗原性特性如表5所示。它們都被針對(duì)插入了序列LEGGFYGP(SEQ ID NO74)的肽產(chǎn)生的豚鼠抗血清中和，這表明這些病毒以抗原性可識(shí)別的形式表達(dá)這一序列。為了生產(chǎn)抗血清，用在磷酸鋁(3mg/ml)中配制的含200μg肽的500μl體積以IM免疫雌性豚鼠。動(dòng)物在第1、14、28和42天免疫并在第0、28、42和56天抽血。血清來(lái)自第56天抽的血。PV1TBP2A和PV1TBP2B也被針對(duì)流感嗜血桿菌DL63 Tbp2產(chǎn)生的兔抗血清中和，表明至少這兩種病毒以被針對(duì)該蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體可識(shí)別的形式表達(dá)該序列。所有病毒都被抗PV1血清中和，表明脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗原性位點(diǎn)I的改變不明顯影響病毒上的其它抗原性位點(diǎn)。
實(shí)施例21本實(shí)施例描述了用于誘導(dǎo)抗Tbp2的高清度的抗血清的脊髓灰質(zhì)炎病毒雜交體的使用。
用CsC1純化的PV1TBP2A接種兔(兔(#40、41、42)。注意盡管所用的病毒是活的，但脊髓灰質(zhì)炎病毒在兔中不復(fù)制且觀察到的任一反應(yīng)都是針對(duì)滅活抗原的有效反應(yīng)。在第1天，用溶于弗氏完全佐劑中的1μg病毒在背部經(jīng)皮下接種兔，在第14天，用含1μg病毒的弗氏不完全佐劑在背部皮下接種來(lái)加強(qiáng)免疫兔。在第0到(預(yù)抽血)和第27天對(duì)兔抽血。每次接種的病毒劑量是2.5×107pfu，這一值從A260值測(cè)定，大約為3.0×1011病毒粒子。它相當(dāng)于0.5pmol病毒或30pmol LEGGFTG(SEQ ID NO74)抗原決定基，因?yàn)槊總€(gè)病毒粒子表達(dá)60拷貝的該抗原決定基。
說(shuō)明書(shū)小結(jié)小結(jié)本說(shuō)明書(shū)，本發(fā)明提供了含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的分離和純化的DNA分子，這些轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的序列和其所得的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體部分相應(yīng)的肽。該基因，DNA序列，重組蛋白質(zhì)和肽在診斷、免疫和診斷及兔疫學(xué)試劑的生產(chǎn)中有用。可制備以表達(dá)的重組Tbp1和/或Tbp2，其部分或來(lái)自假定序列的肽為基礎(chǔ)的疫苗用于防止由產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的病原菌引起的疾病。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可進(jìn)行修改。
表1

表2預(yù)測(cè)的抗原性Tbp1肽

表2(續(xù))

1.流感嗜血桿菌b型菌株Engan Tbp1序列的殘基數(shù)(如圖8所示)2.加入半胱氨酸有助于偶聯(lián)到載體蛋白質(zhì)(例如KLH)上表3預(yù)測(cè)保守的抗原性Tbp2肽

表3(續(xù))

1.流感嗜血桿菌B型Engan菌株Tbp2序列的殘基數(shù)(如圖9所示)
表4豚鼠抗體與Tbp1和Tbp2肽的應(yīng)答

表5抗Tbp2和抗肽的血清對(duì)脊髓在質(zhì)炎病毒/Tbp2雜交病毒的中和活性

aRb @PV1是針對(duì)PV1×LD產(chǎn)生的兔免疫血清合并液。用3份連續(xù)的3μg劑量的重組流感嗜血桿菌DL63轉(zhuǎn)鐵蛋白接合蛋白2在第1、14和28天免疫兔516。在第0天(D0)第42天(D42)收集血清。用4個(gè)連接劑量的200μg肽在第1、14、28和42天免疫豚鼠。在第0天(D0)和56天(D56)收集血清。豚鼠561和562接受了含序列LEGGFYGP(SEQ ID NO74)的肽。豚鼠558、559和556接受了含無(wú)關(guān)序列的對(duì)照肽。
b滴度是在對(duì)100TCID 毒的病毒中和試驗(yàn)中產(chǎn)生50％終點(diǎn)的血清稀釋度的反函數(shù)。
表6用PV1TBP2A或PV1TBP2B免疫的兔的肽特異性IgG滴度

a.滴度是產(chǎn)生A450至少為背景值2倍的最大稀釋度的倒數(shù)背景值是不含兔血清的試驗(yàn)孔中A450的平均值b.兔10和11的滴度指用PV1 Mahoney免疫3次后在第42天提取的血清。按兔40到45免疫兔10和11，除了增加的加強(qiáng)劑量在第28天用藥。
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1.一種肽，它具有不少于6個(gè)氨基酸且不超過(guò)150個(gè)氨基酸，并且含有在產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的細(xì)菌中保守的氨基酸序列，所述保守序列是DNEVTGLGK，EQVLNIRDLTRYDPGI，EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD，GAINEIEYENVKAVEISKG，GALAGSV，LEGGFYGP，CSGGGSFD，LEGGFYG，YVYSGL，CCSNLSYVKFG，F(xiàn)LLGHRT，EFNVDF，NAFTGTA，VNGAFYG，ELGGYF，VVFGAR或VVFGAK；其中所述肽是TVGKKTYQVEACCSNLSYVKFGM。
全文摘要
提供了編碼嗜血桿菌屬菌株轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)或該轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的片段或類似物的純化和分離的核酸。該核酸序列可用于生產(chǎn)不含來(lái)自一般含Tbp1或Tbp2蛋白質(zhì)之細(xì)菌的污染物以達(dá)到診斷或醫(yī)學(xué)治療的目的。而且，該核酸分子可用于感染的診斷。還提供了重組的Tbp1或Tbp2及其純化方法。提供了表達(dá)用于免疫接種的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白質(zhì)的活載體。
文檔編號(hào)C07K14/285GK1990503SQ200610093598
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期1994年11月7日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月8日
發(fā)明者S·盧斯莫爾, R·哈克內(nèi)斯, A·施里弗斯, P·莊, S·格雷-奧文, Y·－P·楊, A·默丁, M·克萊恩 申請(qǐng)人:康諾特實(shí)驗(yàn)室有限公司