肺炎球菌?b型流感嗜血桿菌?百白破聯(lián)合疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肺炎球菌?b型流感嗜血桿菌?百白破聯(lián)合疫苗，其中制備方法用于制備包括肺炎球菌?b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗，肺炎球菌載體蛋白及b型流感嗜血桿菌載體蛋白、b型流感嗜血桿菌莢膜多糖及肺炎球菌莢膜糖，加入的莢膜多糖與b型流感嗜血桿菌載體蛋白質(zhì)量比介于5∶1和1∶5之間。采用該種聯(lián)合疫苗首創(chuàng)的實現(xiàn)了包括肺炎球菌在內(nèi)的五種抗原的同時免疫，肺炎球菌蛋白本身的作為毒力因子可誘導(dǎo)更強的免疫保護(hù)作用，對莢膜糖在免疫上起補充作用，從而增強了疫苗的免疫保護(hù)作用；同時肺炎球菌的自身蛋白可以避免與其他疫苗如白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生免疫沖突。
【專利說明】
肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗生產(chǎn)制備領(lǐng)域，尤其涉及聯(lián)合疫苗，具體是指一種肺炎球菌-b型 流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)簡稱肺炎球菌(Pneumococcus)，寄居于 正常人的鼻咽腔中，是細(xì)菌性大葉性肺炎、腦膜炎、中耳炎、肺炎、支氣管炎的主要病原菌。 肺炎球菌導(dǎo)致的疾病一直是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，在全世界范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率和 病死率，尤其是對2歲以下的兒童和老人。目前已上市的肺炎球菌莢膜糖疫苗和莢膜糖蛋白 質(zhì)結(jié)合疫苗，其設(shè)計都基于肺炎球菌莢膜糖，涵蓋了導(dǎo)致肺炎球菌性疾病的最常見血清型。 但肺炎球菌莢膜糖為胸腺非依賴性抗原(Thymus independent antigen，TI-Ag)，抗體反應(yīng) 主要依賴于其重復(fù)單位組成的線性表位，在無 T淋巴細(xì)胞輔助的情況下直接與B淋巴細(xì)胞表 面的IgM受體交聯(lián)，所誘導(dǎo)的抗體主要為IgM和IgG2,缺少較好的補體活化能力，抗體水平不 能維持足夠長的時間，且不能誘導(dǎo)免疫記憶，無法在2歲以下幼兒中產(chǎn)生免疫保護(hù)。莢膜糖 復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致每一個血清型的免疫原性不同，無法針對不同地區(qū)的不同人群產(chǎn)生足夠有 效的免疫應(yīng)答。肺炎球菌結(jié)合疫苗包括血清型別多，各型別用于結(jié)合的特異性結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo) 致其每個型別的結(jié)合方法相異。目前肺炎球菌常用的載體蛋白包括白喉類毒素;破傷風(fēng)類 毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、來自銅綠假單胞菌的外毒素 A; 外膜復(fù)合體c(0MPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、來自A組或者B組鏈球菌的C5a肽酶、流感 嗜血桿菌蛋白D;卵白蛋白；匙孔血藍(lán)蛋白（KLH);牛血清白蛋白（BSA)或者結(jié)核菌素的純化 的蛋白質(zhì)衍生物(pro);以及部分肺炎球菌自身的高保守性蛋白等。肺炎球菌對莢膜糖的修 飾及與載體蛋白的結(jié)合要在保證莢膜糖特異基團(tuán)不丟失、抗原性和免疫原性不受影響的前 提下進(jìn)行，同時為了避免糖鏈的過度交聯(lián)和結(jié)合物除菌過濾的要求，對莢膜糖及結(jié)合物分 子的大小應(yīng)當(dāng)有一定控制。整個工藝過程中需要加入多種化學(xué)試劑參與反應(yīng)，并且莢膜糖 蛋白結(jié)合疫苗的血清型覆蓋率低和非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研 究者開始關(guān)注其他方向的肺炎球菌疫苗開發(fā)。
[0003] 肺炎球菌蛋白疫苗已成為近十年來肺炎疫苗的研發(fā)主流，具有種屬特異性抗原為 基礎(chǔ)的疫苗廣受研發(fā)人員的重視，吸引了大量的目光。但由于蛋白本身的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) 的限制，很多肺炎球菌蛋白無法直接用于人體免疫，需要花費大量的人力和物力進(jìn)行研究 及臨床驗證。
[0004] 流感嗜血桿菌中b型流感嗜血桿菌侵襲力最強的一個血清型，是引起小兒嚴(yán)重感 染的重要致病菌，其感染對象主要是5歲以下兒童，尤其是2歲以下的嬰幼兒。Hib通過易感 者呼吸道傳播，定植于鼻咽部，可表現(xiàn)為無癥狀攜帶，持續(xù)數(shù)月，少部分人群則發(fā)生Hib侵襲 性疾病。Hib感染最常見的疾病為腦膜炎與肺炎，另外還包括骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎，會厭炎 及敗血癥等。Hib最重要的致病因子是其莢膜多糖PRP，能在Hib感染和克隆過程中提供生存 優(yōu)勢，抵抗補體介導(dǎo)的吞噬作用，抑制血清殺菌活性，逃脫鼻粘膜免疫，促進(jìn)細(xì)菌在人群中 的傳播。
[0005] Hib結(jié)合疫苗根據(jù)PRP長度、載體蛋白不同常見的有四種，其免疫原性各有特點： (1)以白喉類毒素蛋白為載體的結(jié)合疫苗(PRP-diphthena toxoid，PRP-D):與Hib多糖疫苗 免疫原性相似，具有一定的年齡特點，成人初次接種后就可產(chǎn)生較高水平的抗體，而>15月 的兒童雖可以產(chǎn)生較高水平抗體，但加強接種后無長期保持作用。（2)以B組腦膜炎雙球菌 胞膜蛋白為載體的結(jié)合疫苗(PRP-〇MP):PRP-〇MP對所有年齡組人群均有較好的免疫原性。 第1劑接種后，大多數(shù)人均能產(chǎn)生高水平的抗體。再次接種后的抗體效價亦大于PRP-D，Hb-0C，PRP-T，但PRP-0MP的抗體維持的時間短，且抗體峰值水平較Hb-〇C，PRP-T低。（3)以減毒 的白喉類毒素 CRM197為載體的結(jié)合疫苗(池-〇(：，？1^-〇^197):2月齡嬰兒第1劑接種產(chǎn)生的 抗體水平較低，但4和6月齡分別再次注射后可誘導(dǎo)出高水平的抗體，1年后抗體仍可維持一 定的水平。（4)以破傷風(fēng)類毒素為載體的結(jié)合疫苗(PRP-T):與Hb-〇C類似，在較大兒童及成 人，第1劑接種即可顯示較好的免疫原性。小嬰兒對第1劑接種免疫反應(yīng)較弱，第2劑及第3劑 再次接種后即能產(chǎn)生較高水平的抗體，且抗體水平維持時間較長。目前，國內(nèi)及國際上主要 使用的是PRP-CRM197，PRP-T兩種，PRP-T適用于大多數(shù)年齡段人群的Hib疫苗接種。
[0006] 由于肺炎球菌多糖-蛋白疫苗所使用的蛋白載體與b型流感嗜血桿菌相同或相似， 而使用同一載體蛋白很有可能在體內(nèi)引起多糖的免疫干擾，即給予多糖-蛋白質(zhì)綴合物或 將多糖-蛋白質(zhì)綴合物組合制成多價疫苗可能會出現(xiàn)問題。例如，據(jù)報導(dǎo)按照標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒接 種時間表，在一定劑量范圍內(nèi)用(游離)TT和肺炎球菌多糖-TT綴合物疫苗同時進(jìn)行免疫，并 對用破傷風(fēng)類毒素(ΤΤ)作為蛋白載體的流感嗜血菌b型多糖(PRP)疫苗進(jìn)行了試驗。當(dāng)肺炎 球菌疫苗的劑量增加時，對Hib綴合物疫苗的PRP多糖部分的免疫應(yīng)答降低，這表明很可能 通過使用同一載體蛋白引起了多糖的免疫干擾。因此為了避免這種免疫干擾的產(chǎn)生，提高 免疫應(yīng)答，便于流行病的防控，研發(fā)一種穩(wěn)定有效的多價聯(lián)合疫苗是本領(lǐng)域的重點研究方 向。
[0007] 百白破疫苗是我國現(xiàn)行的免疫規(guī)劃程序規(guī)定的針次最多、使用最廣泛的疫苗，包 括無細(xì)胞百白破及全細(xì)胞百白破兩種聯(lián)合疫苗，近年來無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗由于其良好 的免疫原性和安全性取代了全細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗而廣泛用于兒童的預(yù)防接種，已被納入 許多國家的常規(guī)免疫計劃中。但百白破疫苗由于其疫苗本身的性質(zhì)導(dǎo)致其具有多種副作 用，難以與其他疫苗進(jìn)一步聯(lián)合使用。賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)的五聯(lián)疫苗一度成為免疫學(xué) 歷史上的新高度，其中包括百白破疫苗及脊髓灰質(zhì)炎病毒及b型流感嗜血桿菌莢膜糖。
[0008] 肺炎球菌蛋白疫苗已成為近十年來肺炎疫苗的研發(fā)主流，具有種屬特異性抗原為 基礎(chǔ)的疫苗廣受研發(fā)人員的重視，吸引了大量的目光。但由于蛋白本身的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) 的限制，很多肺炎球菌蛋白無法直接用于人體免疫，需要花費大量的人力和物力進(jìn)行研究 及臨床驗證。蛋白疫苗利用生物工程技術(shù)合成蛋白抗原，蛋白抗原由于其選用的均為高度 保守的肺炎球菌特異性蛋白，從而消除了不同血清型之間的免疫差異，并且由于不需要其 他類型的通用蛋白載體，消除了現(xiàn)有的肺炎球菌疫苗不能與通用載體蛋白同類型的疫苗同 時聯(lián)合使用的障礙;其蛋白抗原本身也可以作為載體蛋白與肺炎球菌莢膜糖進(jìn)行綴合，因 此免疫效果更好，實現(xiàn)了特異性免疫與廣泛免疫的聯(lián)合實現(xiàn)。
[0009] 肺炎球菌由于其血清型多，導(dǎo)致其疫苗本身的抗原結(jié)構(gòu)大穩(wěn)定性差，難以與其他 疫苗聯(lián)合共存使用，并且現(xiàn)有的肺炎球菌莢膜糖蛋白結(jié)合疫苗均用白喉或破傷風(fēng)類毒素作 為蛋白載體，這種疫苗的主要成分為血清型特異性的莢膜糖，對未包含在疫苗內(nèi)的其他血 清型肺炎球菌感染無效，即缺乏交叉免疫保護(hù)效果;并將與已在兒童常規(guī)免疫接種中使用 的白喉及破傷風(fēng)疫苗產(chǎn)生干擾，破壞現(xiàn)有的免疫效果。因此研究一款自身免疫原性夠好能 夠穩(wěn)定存在并能與b型流感疫苗、百白破疫苗聯(lián)合起效的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白 破聯(lián)合疫苗成為了疫苗研發(fā)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供了一種能夠?qū)崿F(xiàn)五種疾病同時 預(yù)防的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法。
[0011] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制 備方法具有如下構(gòu)成：
[0012] 該肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法，其主要特點是，制備 方法用于制備包括肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗，具體 為：
[0013] a.將已純化備用的肺炎球菌載體蛋白及b型流感嗜血桿菌載體蛋白以質(zhì)量比1:1 的比例加入制備體系中，其中肺炎球菌載體蛋白為肺炎球菌表達(dá)的高保守性并具有免疫原 性的蛋白，與具有免疫原性的肺炎球菌莢膜糖綴合，b型流感嗜血桿菌載體蛋白為流感嗜血 桿菌的外膜D蛋白HiD;
[0014] b.加入b型流感嗜血桿菌莢膜多糖，加入的莢膜多糖與b型流感嗜血桿菌載體蛋白 質(zhì)量比介于5:1和1:5之間；
[0015] c.加入肺炎球菌莢膜糖，肺炎球菌血清型包括7種~23種血清型，其中6B型莢膜糖 的加入質(zhì)量是其余莢膜糖加入質(zhì)量的2倍，肺炎球菌莢膜糖加入質(zhì)量:b型流感嗜血桿菌莢 膜多糖加入質(zhì)量為1: (1.5~3);
[0016] d.按照本領(lǐng)域的常規(guī)手段制備肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗
[0017] e.百白破疫苗按照百白破現(xiàn)有疫苗的制備方法進(jìn)行制備。
[0018] 優(yōu)選地，肺炎球菌莢膜糖的血清型中包括：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12卩、14、158、17卩、18(：、19卩、19厶、20、22卩、23卩和/或33卩。
[0019] 優(yōu)選地，載體蛋白包括:肺炎球菌溶血蛋白及其改性衍生物，更優(yōu)選地包括改性肺 炎球菌溶血蛋白△ A146Ply、肺炎球菌溶血蛋白衍生物dPly;肺炎球菌表面蛋白及其改性衍 生物，更優(yōu)選地包括肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面蛋白C;肺炎球具表面黏附蛋白及其 改性衍生物，更優(yōu)選地包括肺炎球菌表面黏附蛋白A、肺炎球菌表面黏附蛋白C;或肺炎球菌 三組氨酸蛋白家族融合蛋白，更優(yōu)選地包括肺炎球菌三組氨酸蛋白PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、 PhtDE〇
[0020] 作為一種優(yōu)選的實施方式，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗包括肺 炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗，具體為：
[0021] a.肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為血清型包括4、6B、9V、14、18C、19F、23F 的7價肺炎球菌-肺炎球菌表面蛋白A(PspA)與b型流感嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白 的聯(lián)合疫苗；
[0022] b.無細(xì)胞百日咳疫苗為百日咳疫苗原液、白喉類疫苗為白喉類毒素和破傷風(fēng)類疫 苗為破傷風(fēng)類毒素，且百白破疫苗為懸混液。
[0023]作為另一種優(yōu)選地實施方式，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗 的聯(lián)合疫苗，具體為：
[0024] 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為血清型包括4、68、利、14、18(：、19?、23?的7 價肺炎球菌-肺炎球菌表面黏附蛋白A(PsaA)與b型流感嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白 的聯(lián)合疫苗。
[0025]作為另一種優(yōu)選地實施方式，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗 的聯(lián)合疫苗，具體為：
[0026] 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗包括4、68、利、14、18(：、19?、23?的7價肺炎球 菌-改性肺炎球菌溶血蛋白A A146Ply與b型流感嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白的聯(lián)合 疫苗。
[0027]作為另一種優(yōu)選地實施方式，本申請中所屬的肺炎球菌包括血清型為7價~23價， 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗還可以為：
[0028] 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗包括1、4、5、68、7?、利、14、18(：、19?、23?的10 價肺炎球菌_PspA/PsaA/AA146Ply或其他上述肺炎球菌載體蛋白與b型流感嗜血桿菌-流 感嗜血桿菌外膜D蛋白的聯(lián)合疫苗。
[0029]作為另一種優(yōu)選地實施方式，本申請中所屬的肺炎球菌包括血清型為7價~23價， 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗還可以為：
[0030] 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、 19F、23F的13價肺炎球菌-PspA/PsaA/AA146Ply或其他上述肺炎球菌載體蛋白與b型流感 嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白的聯(lián)合疫苗。
[0031] 作為另一種優(yōu)選地實施方式，本申請中所屬的肺炎球菌包括血清型為7價~23價， 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗還可以為：
[0032] 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗包括1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19F、19厶、20、22卩、23卩和33卩的23價肺炎球菌-?8口厶/?83厶/^厶146卩17 或其他上述肺炎球菌載體蛋白與b型流感嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白的聯(lián)合疫苗。
[0033] 本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于保護(hù)一種由上述肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破 聯(lián)合疫苗的制備方法所制備得到的聯(lián)合疫苗。
[0034] 優(yōu)選地，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為凍干劑型，用于作為肺炎球菌疫 苗的凍干制劑的凍干保護(hù)劑的為蔗糖。
[0035] 更優(yōu)選地，蔗糖在凍干原液中的初始濃度不大于20 % ;蔗糖的初始濃度不小于 60%，優(yōu)選為大于70 %。
[0036] 優(yōu)選地，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為不大于20 % ;較佳地，為4~ 20% ;作為一種較佳的實施方式，根據(jù)所需制備的疫苗的不同為7~10%、8~10%、10~ 15%或 12~15%;最佳為7%、8%、10%或 12%。
[0037] 優(yōu)選地，蔗糖選用工業(yè)級分析純或藥用級。
[0038] 進(jìn)一步優(yōu)選地，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗在臨用前將百白破 懸混液加入肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗凍干制劑中，將肺炎球菌-b型流感嗜血桿 菌聯(lián)合疫苗復(fù)溶，混合均勻后肌肉注射。
[0039] 優(yōu)選地，肺炎球菌多疫苗的血清抗體水平彡0.35yg/mL，b型流感嗜血桿菌的血清 抗體水平彡〇 · 15yg/mL。
[0040] 更優(yōu)選地，無細(xì)胞百日咳疫苗效價多4.0IU;白喉疫苗效價多30IU;破傷風(fēng)疫苗效 價彡40IU。
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首創(chuàng)的實現(xiàn)了可同時實現(xiàn)包括肺炎球菌在內(nèi)的五種抗原 的同時免疫的肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗，其中肺炎球菌疫苗的蛋白-莢 膜糖結(jié)合體可在不同的血清型間起到誘導(dǎo)交叉免疫保護(hù)作用;并且蛋白本身的作為毒力因 子可誘導(dǎo)更強的免疫保護(hù)作用，對莢膜糖在免疫上起補充作用，從而增強了疫苗的免疫保 護(hù)作用；同時肺炎球菌的自身蛋白可以避免與其他疫苗如白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗在體內(nèi)產(chǎn) 生免疫沖突，使得本結(jié)合疫苗的實現(xiàn)成為了可能。本結(jié)合疫苗提高了接種者的肺炎球菌感 染的免疫記憶應(yīng)答;肺炎球菌蛋白的加入使得肺炎球菌的免疫需要依賴胸腺免疫，因此使 得肺炎球菌的免疫實現(xiàn)了全年齡段及全部血清型的長效、全覆蓋式免疫;肺炎球菌莢膜糖 與肺炎球菌蛋白偶聯(lián)之后提高了體內(nèi)免疫應(yīng)答的速度及擴展了其免疫的深度和廣度，二者 之間的協(xié)同作用雖然沒有單獨每種疫苗的效果好，但減少了接種次數(shù)，提高了接種效率，減 輕了被接種者的身體負(fù)擔(dān)。實驗數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明中的肺炎球菌及b型流感嗜血桿菌的莢膜 糖加入順序?qū)Ρ韭?lián)合疫苗的制備成功與否十分重要，其中先加入肺炎球菌莢膜糖的情況下 由于其可與兩種載體蛋白均發(fā)生隨機綴合，因此無法實現(xiàn)b型嗜血桿菌疫苗的制備目的，只 有在先加入b型流感嗜血桿菌莢膜糖或兩種莢膜糖同時加入但b型流感嗜血桿菌遠(yuǎn)過量于 肺炎球菌莢膜糖時，才能夠?qū)崿F(xiàn)兩種疫苗的同時實現(xiàn)，加之在使用時可以配合百白破疫苗， 實現(xiàn)了五聯(lián)疫苗的同時免疫。肺炎球菌與b型流感嗜血桿菌疫苗、百白破疫苗的聯(lián)合從源頭 上解決了一系列下呼吸道感染性疾病，隨著肺炎球菌蛋白莢膜糖結(jié)合疫苗的不斷發(fā)展，該 聯(lián)合疫苗具有廣泛的推廣和實用價值，對肺炎球菌及相關(guān)疫苗的研究有著深遠(yuǎn)的影響。
【具體實施方式】
[0042] 為了能夠更清楚地描述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)行進(jìn)一步的 描述。
[0043] 本發(fā)明中由于使用肺炎球菌自身蛋白作為肺炎球菌莢膜糖的載體蛋白，因此解決 了肺炎球菌莢膜糖與b型流感嗜血桿菌莢膜多糖無法溫度共存的技術(shù)問題，故下列實施例 中僅對本
【發(fā)明內(nèi)容】
涉及改進(jìn)的部分進(jìn)行詳述，其他未提及步驟或原料來源同現(xiàn)有技術(shù)，在 此不做贅述。
[0044] 實施例1
[0045] 1.制備肺炎球菌莢膜多糖
[0046] a.取現(xiàn)有的7價肺炎球菌的常見致病血清型4、68、利、14、18(：、19?及23?的肺炎球 菌培養(yǎng)；
[0047] b.分別提純以上各種血清型肺炎球菌中抗原性強的莢膜多糖4、9V、14、19F&23F， 寡糖18C及多糖6B;
[0048] c.肺炎球菌滅活后離心收集上清液，經(jīng)超濾濃縮，根據(jù)各肺炎球菌血清型特性分 別加入適量(體積分?jǐn)?shù)為70%的)預(yù)冷乙醇，離心收集，得粗制莢膜糖;將粗制莢膜糖溶于乙 酸鈉溶液中，然后按1:2比例以冷酚混勻，離心去除蛋白，反復(fù)酚提5-6次，收集上清，用蒸餾 水透析，透析后液體加2mol/L氯化鈣溶液，加入乙醇攪拌，離心去除核酸，收集上清，補加乙 醇攪拌(終濃度80% )，離心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗滌沉淀，脫水干燥后得精制莢膜糖， 置-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0049] 2.制備肺炎球菌表達(dá)的高保守性并具有免疫原性蛋白AA146Ply
[0050] 根據(jù)GenBank公布的Ply基因（序列登錄號：X52474)，改性肺炎球菌溶血蛋白Δ A146Ply的設(shè)計引物序列如下：
[0051]
[0052] 其中劃線部分為相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點。
[0053] 根據(jù)常規(guī)實驗方法將Δ A146Ply基因 PCR擴增后，1 %凝膠電泳，回收目標(biāo)DNA片段， 將目標(biāo)DNA片段連接入pET-28a質(zhì)粒中，在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21內(nèi)轉(zhuǎn)化抽提重組DNA質(zhì) 粒，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，確定表達(dá)量及表達(dá)形式后進(jìn)行Ni-NTA樹 脂純化;采用0.2%福爾馬林溶液去除內(nèi)毒素，即溶血活性，得到去除內(nèi)毒素后的AA146Ply 蛋白。AA146Ply蛋白為Ply蛋白第146位丙氨酸缺失的改性蛋白，蛋白純度達(dá)到80%以上， 檢測證明具有免疫原性且殘留的內(nèi)毒素含量低于0. lEU/yg。
[0054] 3.制備b型流感嗜血桿菌莢膜多糖
[0055] a.采用CY培養(yǎng)基對Hib菌株1842在37 °C下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)甲醛滅活，離心取上 清后，利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)進(jìn)行沉淀。然后用0.5~1M的NaCl對復(fù)合物沉淀進(jìn) 行解離，添加冰乙醇至終濃度25% (v/v)，沉淀核酸，然后加冰乙醇至終濃度75% (v/v)，沉 淀得到粗多糖。
[0056] b.上述粗多糖用醋酸鈉溶液溶解，冷酚抽提5-6次，最后超濾濃縮去除苯酚殘留， 經(jīng)75 % (v/v)乙醇沉淀得到精糖，置-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0057] 4.制備b型流感嗜血桿菌表面蛋白HiD
[0058] 將HiD蛋白克隆至大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)并分離純化，具體包括：
[0059] a.目的基因的優(yōu)化和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0060] 在GenBank中獲取HiD基因序列并進(jìn)行優(yōu)化，加上Hi S標(biāo)簽后進(jìn)行全基因合成，將合 成的序列經(jīng)SacI和Ndel雙酶切后，定向克隆至同樣雙酶切的表達(dá)載體pET_30a( + )中，轉(zhuǎn)化 感受態(tài)大腸桿菌BL21Star(DE3)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆菌落，擴增培養(yǎng)后提取質(zhì) 粒，用Ndel和SacI雙酶切鑒定，并送測序，將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-30a-HiD。
[0061] b.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
[0062] 復(fù)蘇工程菌，以1:100的比例接種2 X LB培養(yǎng)基，在37 °C，237r/min下擴大培養(yǎng)，當(dāng) 菌體值約為12時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C誘導(dǎo)4h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析離心 收集誘導(dǎo)菌體，加入生理鹽水重懸洗滌2次，以1:10(g/mL)的比例加入05mol/LNaC15mmol/L 咪唑20mmol/Lro(pH7.4)的緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，8000 X g離心40min，收集上 清，于鎳離子層析柱中進(jìn)行純化，按說明書操作純化產(chǎn)物的及分析將載體pET-43. la( + )轉(zhuǎn) 化的大腸桿菌BL21Star(DE3)全菌體(對照)和將上步純化樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至 硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉搖床輕微振蕩封閉2h;加入His鼠源單抗（1:800稀釋），4°C 過夜;TBST清洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(l: 2000稀釋），室溫孵育lh;洗滌3次，DAB顯 色。
[0063] 5.多糖-蛋白綴合，制備肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗
[0064] a.將純化備用的AA146Ply及Hid以質(zhì)量比1:1的比例加入制備體系中；
[0065] b.加入b型流感嗜血桿菌莢膜多糖，加入的莢膜多糖與Hid質(zhì)量比為5:1;
[0066] c.加入7價肺炎球菌莢膜糖，其中6B型莢膜糖的加入質(zhì)量是其余莢膜糖加入質(zhì)量 的2倍，肺炎球菌莢膜糖加入質(zhì)量:b型流感嗜血桿菌莢膜多糖加入質(zhì)量為1:1.5。
[0067]以制備10mL疫苗原液為例，加入莢膜多糖4、9V、14、19F及23F各40μg，寡糖18C2μg 及多糖6B 80yg，Hib莢膜多糖60yg;Hid蛋白12yg; AA146Ply蛋白12yg。經(jīng)過凝膠層析柱純 化后進(jìn)行高效液相色譜分析該聯(lián)合疫苗，結(jié)果顯示所有血清型均有明顯的色譜峰，相鄰兩 峰之間分離度R>1.5,拖尾因子T的范圍為0.95~1.05,并且莢膜糖含量達(dá)到《中華人民共 和國藥典》2010版及本申請
【發(fā)明內(nèi)容】
中的最低要求含量。
[0068]需要指出的是，由于肺炎球菌蛋白與肺炎球菌莢膜糖、b性流感嗜血桿菌與Hid是 同源的，因此二者之間具有協(xié)同作用，但本發(fā)明中的蛋白與莢膜糖之間的綴合不僅限于上 述氨基還原法，只要是能實現(xiàn)該偶聯(lián)結(jié)果的方法均應(yīng)包括在本申請的發(fā)明范圍中。
[0069] 6.制備百白破疫苗
[0070] 由于本發(fā)明中的聯(lián)合疫苗以肺炎球菌疫苗與b型流感嗜血桿菌疫苗、百白破疫苗 減少相互影響，并且可以同時產(chǎn)生免疫為主要改進(jìn)方向，故與本實施例中可采用現(xiàn)有技術(shù) 制備百白破疫苗，具體方法在此不作贅述。但需要注意的是，本實施例中的百白破疫苗中無 細(xì)胞百日咳疫苗效價多4.0IU，白喉疫苗效價多30IU且破傷風(fēng)疫苗效價多40IU，且優(yōu)選為小 水針劑型，其中含無細(xì)胞百日咳疫苗效價不低于4.0IU，白喉疫苗效價不低于30IU，破傷風(fēng) 疫苗效價不低于40IU。
[0071] 將上述分別獲得的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗和百白破疫苗留用，以 《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進(jìn)行免疫原性、陽轉(zhuǎn)率等疫苗效價評估實驗，具 體實驗結(jié)果見后述。
[0072] 實施例2
[0073]本實施例與實施例1的區(qū)別僅在于:肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為凍干 劑型，其中蔗糖作為凍干骨架，其中蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量不大于20%，凍 干后得到肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗凍干制劑。故本實施例與實施例1的進(jìn)一步 不同在于，百白破疫苗可作為肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合凍干疫苗的復(fù)溶液，即臨用 前將百白破懸混液加入肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌凍干制劑中，復(fù)溶，混合均勻后肌肉注 射。
[0074]凍干步驟具體為：
[0075] 1.配制濃度為70%、經(jīng)121°C滅菌處理15min的蔗糖母液；
[0076] 2.將實施例1所得分離純化的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗置于無菌容器 內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖母液，使蔗糖濃度至10%，得混勻制備成含有蔗糖保護(hù)劑的病 毒原液半成品，再分別以1.0ml/瓶的規(guī)格灌裝于西林瓶內(nèi)以進(jìn)行后續(xù)的凍干工藝；
[0077] 3.將步驟2所得半成品進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍時快速降溫至_55°C，維持15h_20h;
[0078] 4.將步驟4所得預(yù)凍后半成品進(jìn)行第一階段干燥:升溫至_45°C~_40°C維持50h， 升溫至-40°C~_33°C維持22h;
[0079] 5.將步驟4所得第一階段干燥后半成品進(jìn)行第二階段干燥:設(shè)定不同時間內(nèi)升溫 至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持28h;再制備凍干原液中蔗糖濃度為10%的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，凍干疫苗的制備方法可參考現(xiàn)有技術(shù)制備，在此不做贅述。
[0080] 將上述分別獲得的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗和百白破疫苗留用，以 《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進(jìn)行免疫原性、陽轉(zhuǎn)率等疫苗效價評估實驗，具 體實驗結(jié)果見后述。
[0081 ] 實施例3
[0082] 本實施例與實施例1的區(qū)別在于，本實施例中的多糖添加順序為先添加肺炎球菌 莢膜糖，再添加 b型流感嗜血桿菌莢膜多糖。順序調(diào)換后b型流感嗜血桿菌莢膜多糖無色譜 峰，證明了肺炎球菌莢膜糖可以以Hid為載體蛋白進(jìn)行綴合，肺炎球菌先加入或兩種多糖按 原比例同時加入會形成競爭關(guān)系，影響b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的正常綴合過程，因此無 法實現(xiàn)本技術(shù)方案。
[0083] 實施例4
[0084] 本實施例與實施例3的區(qū)別在于，本實施例中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖與肺炎 球菌莢膜糖同時加入，Hib:ps質(zhì)量比為(4~10):1，即b型流感嗜血桿菌莢膜多糖遠(yuǎn)過量于 肺炎球菌莢膜糖，在同時加入綴合體系中時，競爭關(guān)系被質(zhì)量懸殊弱化。經(jīng)過凝膠層析柱純 化后進(jìn)行高效液相色譜分析該聯(lián)合疫苗，結(jié)果顯示所有血清型均有明顯的色譜峰，相鄰兩 峰之間分離度R>1.5,拖尾因子T的范圍為0.95~1.05，，并且莢膜糖含量達(dá)到《中華人民共 和國藥典》2010版及本申請
【發(fā)明內(nèi)容】
中的最低要求含量。
[0085] 將上述分別獲得的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗和百白破疫苗留用，以 《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進(jìn)行穩(wěn)定性、免疫原性等疫苗效價評估實驗，具 體實驗結(jié)果見后述。
[0086] 實施例5
[0087] 本實施例與實施例1的區(qū)別在于，肺炎球菌載體蛋白不同。本實施例中使用的蛋白 載體為肺炎球菌表面黏附蛋白A(PsaA)。其余步驟相同，在此不贅述。
[0088] 制備肺炎球菌表達(dá)的高保守性并具有免疫原性蛋白肺炎球菌表面黏附蛋白A (PsaA)
[0089] 根據(jù)GenBank公布的PsaA基因（序列登錄號:U53509)設(shè)計引物序列如下：
[0090]
[0091 ]其中劃線部分為相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點。
[0092]根據(jù)常規(guī)實驗方法將PsaA基因 PCR擴增后，1 %凝膠電泳，回收目標(biāo)DNA片段，將目 標(biāo)DNA片段連接入pET-28a質(zhì)粒中，在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21內(nèi)轉(zhuǎn)化抽提重組DNA質(zhì)粒， IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，確定表達(dá)量及表達(dá)形式后進(jìn)行Ni-NTA樹脂純 化;得到PsaA蛋白，測試濃度，蛋白純度達(dá)到80 %以上。
[0093]經(jīng)過凝膠層析柱純化后進(jìn)行高效液相色譜分析該聯(lián)合疫苗，結(jié)果顯示所有血清型 均有明顯的色譜峰，相鄰兩峰之間分離度R> 1.5，拖尾因子T的范圍為0.95~1.05，，并且莢 膜糖含量達(dá)到《中華人民共和國藥典》2010版及本申請
【發(fā)明內(nèi)容】
中的最低要求含量。
[0094] 將上述分別獲得的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗和百白破疫苗留用，以 《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進(jìn)行穩(wěn)定性、免疫原性等疫苗效價評估實驗，具 體實驗結(jié)果見后述。
[0095] 實施例6
[0096] 本實施例與實施例5的區(qū)別僅在于，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為凍干 劑型，其中蔗糖作為凍干骨架，其中蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量不大于20%，凍 干后得到肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗凍干制劑。故本實施例與實施例1的進(jìn)一步不 同在于，百白破疫苗可作為肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合凍干疫苗的復(fù)溶液，即臨用前 將百白破懸混液加入肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌凍干制劑中，復(fù)溶，混合均勻后肌肉注射。 [0097]經(jīng)過凝膠層析柱純化后進(jìn)行高效液相色譜分析該聯(lián)合疫苗，結(jié)果顯示所有血清型 均有明顯的色譜峰，相鄰兩峰之間分離度R> 1.5，拖尾因子T的范圍為0.95~1.05，，并且莢 膜糖含量達(dá)到《中華人民共和國藥典》2010版及本申請
【發(fā)明內(nèi)容】
中的最低要求含量。
[0098] 將上述分別獲得的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗和百白破疫苗留用，以 《中華人民共和國藥典》2010版中要求分別進(jìn)行穩(wěn)定性、免疫原性等疫苗效價評估實驗，具 體實驗結(jié)果見后述。
[0099] 對比例1
[0100] 采用市售七價肺炎球菌莢膜糖-蛋白綴合疫苗(商品名：沛兒)作為對比例，其用量 及使用方法同說明書，同上述各實施例所得疫苗一并進(jìn)行疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié) 果見后述。
[0101] 對比例2
[0102] 采用市售b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗(商品名:安爾寶)作為對比例，其用量及使用 方法同說明書，同上述各實施例所得疫苗一并進(jìn)行疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。
[0103] 對比例3
[0104] 采用市售百白破作為對比例(商品名:吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗），其用量及使用 方法同說明書，同上述各實施例所得疫苗一并進(jìn)行疫苗效價評估實驗，具體實驗結(jié)果見后述。
[0105] 疫苗效價評估實驗
[0106] 一、Western-blot分析肺炎球菌蛋白抗原性
[0107] 將抗八4146?17、抗？8 34小鼠血清分別進(jìn)行胃68七61'11-131〇1：分析，重組表達(dá)的八 A146Ply蛋白、PsaA蛋白可與小鼠血清發(fā)生免疫原性結(jié)合，在AA146Ply蛋白在53-kDa附近 見目的蛋白條帶，PsaA蛋白在37-kDa附近見目的蛋白條帶，表明表達(dá)的蛋白具有較好的抗 原性，都保留了兩種蛋白的抗原表位。
[0108] 二、穩(wěn)定性
[0109]液體肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗:4°C避光保存24個月，蛋白無變性，抗 原性良好。
[0110]凍干制劑肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗:-20°C避光保存24個月，蛋白無變 性，抗原性良好。 Com]三、免疫原性試驗
[0112] 將上述制備的結(jié)合疫苗以人用劑量稀釋10倍免疫14~18g的NIH小鼠，每組10只， 每一試驗疫苗用兩組，皮下注射結(jié)合疫苗，陰性對照組注射0.5ml無菌生理鹽水。0、14天2針 腹腔免疫，每次〇. 5ml，第28天采血，采用ELISA方法檢測血清抗上述所有莢膜多糖的抗體滴 度，檢測結(jié)果見表1，陽轉(zhuǎn)率結(jié)果見表2。
[0113] 表1
[0114]
[0115] 表2
[0116]
[0117]在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限 制性的。 序列表 <ιιο武漢博沃生物科技有限公司 <120>肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗 叫30> 2016 '160> 6 、'170> PaicnLln version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown
[0118] <220> <223> F-AA146Pty-N 端引物 <400> I ggaattGcat atggcaaata aageagtaaa t 31 <2i()> 2 <211> 29 <212> DNA <213〉Unknown <220> <223> R-AA146Ply-N 端引物 <400> 2 cgagcicgic altuciacc llalcctci 29 <210 3 <21 i> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> F-AA146Ply-C 端引物 3 cggcggccge atggcaaata aageagtaaa tg 3：2 <2I0> 4 <211> 36 <212> DNA
[0119] ^213- Unknown <220〉 <223> R-ΛA] 46Ply-C 端引物 <400> 4 ccctcgagtt actagicali ticlaccUa tcclct 36 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> F-PsaA 引物 <400> 5 calgccalgg cigctagcgg aaaaaaagal 30 <210> 6 <21 i> 29 <212> DNA
[0120] <213> Unkn〇wn <220> <223> R-PsaA 弓丨猶 '400，6 cgcaagclU latlllgcca aicctlcag 29
【主權(quán)項】
1. 一種肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于，制備方 法用于制備包括肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗，肺炎球 菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗的制備方法包括： a. 將已純化備用的肺炎球菌載體蛋白及b型流感嗜血桿菌載體蛋白以質(zhì)量比1:1的比 例加入制備體系中； b. 加入b型流感嗜血桿菌莢膜多糖，加入的莢膜多糖與b型流感嗜血桿菌載體蛋白質(zhì)量 比介于5:1和1:5之間； c. 加入肺炎球菌莢膜糖，其中6B型莢膜糖的加入質(zhì)量是其余莢膜糖加入質(zhì)量的2倍，肺 炎球菌莢膜糖加入質(zhì)量:b型流感嗜血桿菌莢膜多糖加入質(zhì)量為1: (1.5~3); 其中， 肺炎球菌血清型包括7種~23種血清型，b型流感嗜血桿菌載體蛋白為流感嗜血桿菌的 外膜D蛋白，肺炎球菌載體蛋白為肺炎球菌表達(dá)的高保守性并具有免疫原性的蛋白，與具有 免疫原性的肺炎球菌莢膜糖綴合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法，其 特征在于，肺炎球菌莢膜糖的血清型中包括：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 158、17卩、18(：、19卩、19厶、20、22卩、23卩和/或33卩。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法，其 特征在于，載體蛋白包括:肺炎球菌溶血蛋白及其改性衍生物、肺炎球菌表面蛋白及其改性 衍生物、肺炎球具表面黏附蛋白及其改性衍生物或肺炎球菌三組氨酸蛋白家族融合蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法，其 特征在于，肺炎球菌蛋白具體為:改性肺炎球菌溶血蛋白△ A146Ply、肺炎球菌溶血蛋白衍 生物dPly、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面黏附蛋白A或肺炎球菌三組氨酸蛋白PhtA、 PhtB、PhtD、PhtE、PhtDE。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制 備方法，其特征在于，肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗包括肺炎球菌-b型流感 嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗，具體為： a. 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為7價肺炎球菌-肺炎球菌表面蛋白A與b型流 感嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白的聯(lián)合疫苗； b. 無細(xì)胞百日咳疫苗為百日咳疫苗原液、白喉類疫苗為白喉類毒素和破傷風(fēng)類疫苗為 破傷風(fēng)類毒素，且百白破疫苗為懸混液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法，其 特征在于，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗，具體為： 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為7價肺炎球菌-肺炎球菌表面黏附蛋白A與b型 流感嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白的聯(lián)合疫苗。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方法，其 特征在于，肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗及百白破疫苗的聯(lián)合疫苗，具體為： 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為7價肺炎球菌-改性肺炎球菌溶血蛋白△ A146Ply與b型流感嗜血桿菌-流感嗜血桿菌外膜D蛋白的聯(lián)合疫苗。8. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎球菌_b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗的制備方 法所制備得到的聯(lián)合疫苗，其特征在于:聯(lián)合疫苗由權(quán)利要求1~7任一項制備方法制得。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于： 肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗為凍干劑型，用于作為肺炎球菌疫苗的凍干制劑的凍 干保護(hù)劑的為蔗糖。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的肺炎球菌-b型流感嗜血桿菌-百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于： 蔗糖在凍干原液中的初始濃度不大于20%。
【文檔編號】A61K39/08GK106039301SQ201610503169
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】劉昊智, 吳克, 王文灝, 袁軍
【申請人】武漢博沃生物科技有限公司