專利名稱：一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性多肽的制備方法，特別涉及一種利用基因重組技術(shù)制備人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的生物活性多肽的方法。
背景技術(shù)：
人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(英文名稱Human Keratinocyte Growth factor，簡稱KGF或KGF1)是目前已知能促使非成纖維上皮細(xì)胞(特別是角質(zhì)細(xì)胞)增殖的細(xì)胞因子。KGFmRNA的組織學(xué)分布有其特殊性來自胚胎、新生兒和成人上皮組織的幾種基質(zhì)成纖維細(xì)胞系中有KGFmRNA的表達(dá)，在人腎臟、胃腸道中也有表達(dá)，而在膠質(zhì)細(xì)胞、肺、腦和各種上皮細(xì)胞(包括鱗狀細(xì)胞癌、支氣管上皮細(xì)胞等)中未檢測到KGF mRNA。KGF mRNA的這種組織學(xué)分布提示KGF在真皮中產(chǎn)生而不在皮下。KGF對小鼠BALB/MK細(xì)胞具有促有絲分裂作用，同時KGF具有影響角質(zhì)細(xì)胞的分化和成熟。(Rubin et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86802-806(1989))。同時，KGF對非角質(zhì)上皮細(xì)胞也有刺激作用在體內(nèi)，KGF誘導(dǎo)正常皮膚附屬結(jié)構(gòu)(如皮質(zhì)細(xì)胞和毛囊細(xì)胞)，肝臟細(xì)胞和呼吸性膜上皮細(xì)胞(如II型肺細(xì)胞)的增生和分化，刺激腸黏膜細(xì)胞(如胃腺小腸腺產(chǎn)黏蛋白的杯狀細(xì)胞，結(jié)腸的隱窩細(xì)胞和腸道內(nèi)的其它上皮細(xì)胞)的增生和生長。(WO94/23032)。
目前KGF已經(jīng)用于人體血液性腫瘤放化療引起的消化道潰瘍的治療。
目前制備KGF主要用重組表達(dá)方法，在W90/108771、WO96/11951中有描述。
現(xiàn)有技術(shù)工藝步驟極其繁雜，同時，KGF對大腸桿菌宿主具有極強(qiáng)的毒性，KGF在普通的大腸桿菌中表達(dá)效率很低，為克服以上缺陷，本專利提供了一種利用融合表達(dá)的方法制備重組KGF的制備方法。該方法大大簡化了工藝，大大提高了KGF的產(chǎn)量，從而可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)KGF。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的方法，該方法包括以下步驟a.人工合成人角質(zhì)細(xì)胞生長因子氨基酸編碼區(qū)相對應(yīng)的基因；b.步驟a得到的基因與適宜的表達(dá)載體上的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferaseGST，)蛋白基因3′端融合，該基因中間部分含凝血酶或者腸激酶識別位點；c.將含有融合蛋白編碼基因的適宜的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌獲得基因工程菌；d.該基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后，經(jīng)提取層析純化步驟，制備出GST-KGF融合蛋白；e.再經(jīng)凝血酶或者腸激酶切割后，分離純化獲得重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子。
其中所述人工合成人角質(zhì)細(xì)胞生長因子氨基酸編碼區(qū)相對應(yīng)的基因是現(xiàn)有技術(shù)，可以通過現(xiàn)有技術(shù)獲得，如人工合成的方法。
步驟b.中所述谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferaseGST)蛋白基因是現(xiàn)有技術(shù)，可以在市場上購買得到，其中的GST蛋白和人角質(zhì)細(xì)胞生長因子之間通過腸激酶酶切識別位點-(ASP)N Lys-連接，結(jié)構(gòu)為X__(ASP)N Lys_KGF1，其中(Asp)為天冬氨酸，X為GST，n為2、3或者4。或所述融合蛋白中GST蛋白和人角質(zhì)細(xì)胞生長因子之間通過凝血酶識別位點X-P2-P3-Pro-P1.連接，連接方式為X-P2-P3-Pro-P1_KGF1，其中X為GST，P1為Arg或Lys，P2、P3為疏水性氨基酸(選自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp)，這里P2優(yōu)選Leu，P3優(yōu)選Val，其氨基酸序列優(yōu)選為X-Leu-Val-Pro-Arg-KGF1，其中X為GST。
本發(fā)明優(yōu)選的GST-KGF1融合蛋白的編碼DNA序列見序列表1和3。
本發(fā)明的GST-KGF1融合蛋白的氨基酸序列見序列表2和4。
本發(fā)明的制備方法，其特征在于，其中所述發(fā)酵是將合格的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子基因工程菌接種到發(fā)酵罐中培養(yǎng)，其中加入IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明的制備方法，其中所述提取層析純化步驟(1)包括離心收集菌體，破菌、離心收集破菌液上清的步驟，將收集的上清上Heparin親和層析柱，用平衡緩沖液洗去雜蛋白，然后用含適宜濃度的NaCl洗脫GST-KGF1融合蛋白，將洗脫的GST-KGF1融合蛋白上Sepharose 6B親和層析柱，用適當(dāng)濃度的GSH洗脫融合蛋白，所得融合蛋白用高純度的Enterkinase或Thrombin做酶切處理，將酶切的融合蛋白上SP Sepharose F.F.柱去掉GST蛋白，將得到的KGF1上Heparin親和層析柱層析，用含適宜濃度的NaCl洗脫KGF1，得到純度95％以上的純KGF1。
本發(fā)明還提供用本發(fā)明的方法制備的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的藥物組合物，該組合物是以藥物制劑形式存在的，優(yōu)選的是凍干注射劑，單位劑量的注射劑即每支注射劑，其配方組成如下角質(zhì)細(xì)胞生長因子6.6mg甘露醇 5～20mg檸檬酸(一水)2.1mg
檸檬鈉(二水) 2.94mg或角質(zhì)細(xì)胞生長因子 6.6mg甘露醇5～20mg磷酸二氫鈉0.93mg磷酸氫二鈉1.73mg氯化鈉10mg本發(fā)明是根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子一級結(jié)構(gòu)的氨基酸編碼序列(該序列可按照遺傳密碼的通用性、簡并性和大腸桿菌對遺傳密碼使用的偏好性原則進(jìn)行改變)，人工合成該雙鏈DNA全序列。本發(fā)明的主要特點在于，分別將該編碼基因片段克隆入適宜表達(dá)載體，(優(yōu)選的如pGEX-4T-3，可以從市場上買到)中構(gòu)建形成重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌，優(yōu)選的如BL21(DE3)(可以從市場上買到)，經(jīng)篩選得到的具有高表達(dá)能力的基因工程菌。該基因工程菌以GST為融合伴侶，融合表達(dá)KGF1，即形成GST-KGF1融合蛋白，所表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過適宜的步驟分離純化后，用適宜的具有特異序列識別能力的蛋白酶如用腸激酶(Enterkinase)或凝血酶(Thrombin)將KGF1從融合蛋白上切割下來，經(jīng)過高度分離純化，得到KGF1純品。經(jīng)過N-末端氨基酸序列測定、質(zhì)譜分子量測定、等電點測定、肽圖分析以及生物活性檢測等分析，結(jié)果表明我們所表達(dá)的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子與天然的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子各指標(biāo)完全一致。
本發(fā)明使用的分子克隆方法的基本原理，以及操作步驟中所使用的原料，溶劑，工具屬于現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域，如DNA的合成方法，酶切位點的選擇等，本發(fā)明使用的表達(dá)載體，宿主菌等都為商業(yè)化載體或菌種。
以上方法的具體操作步驟可以見本發(fā)明的實施例。
本發(fā)明的優(yōu)點主要表現(xiàn)在(1)、本發(fā)明中GST-KGF1融合蛋白以可溶的形式存在(以腸激酶Enterkinase識別序列連接)，從而大大簡化生產(chǎn)工藝和大大提高生產(chǎn)效率；(2)、通過上述工藝得到的KGF1，其結(jié)構(gòu)等理化特性和生物學(xué)活性與文獻(xiàn)報道的結(jié)構(gòu)完全一致，避免通常重組蛋白質(zhì)藥物N端前面多出一個Met甚至多個氨基酸殘基，從而可降低其免疫原性；


圖1pGEX-4T-3質(zhì)粒圖譜和多克隆位點及序列圖2pGEX-4T-3-KGF1重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖
圖3GST-E-KGF1融合蛋白(腸激酶識別序列)融合蛋白表達(dá)、腸激酶處理后純化的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子電泳圖譜
具體實施例方式以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實施例11.表達(dá)載體的選擇選用Novagen公司的pGEX系列表達(dá)載體如pGEX-4T-3作為表達(dá)載體，pGEX-4T-3是用于高效融合表達(dá)蛋白和多肽的大腸桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)，目的蛋白或多肽以225個氨基酸殘基的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)作為融合伴侶。(見附圖1)。
2.基因的設(shè)計和合成根據(jù)文獻(xiàn)報道的KGF1 DNA編碼序列(序列可根據(jù)遺傳密碼的通用性、簡并性原則改變，但不改變氨基酸組成和排列)設(shè)計編碼成熟人KGF1序列，同時在該序列的5’-端加上BamHI識別序列GGATCC和腸激酶(Enterokinase)酶切位點編碼序列或凝血酶(thrombin)酶切位點編碼序列；在3’端加上Xho I的識別序列CTCGAG；3.將上述合成的具有不同酶切位點的核酸片段分別插入到pGEX-4T-3的Kpn和Xho I位點由表達(dá)載體上的融合伴侶GST蛋白的編碼序列與插入的KGF1 DNA編碼序列共同形成序列2或序列4的NDA序列，該序列編碼的氨基酸序列為序列1和序列3，見序列表1、2、3、4。形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)篩選即得高效表達(dá)基因工程菌。有關(guān)操作方法參見《分子克隆手冊》冷泉港第二版；構(gòu)建圖譜見附圖24.將細(xì)菌接種到LB或其它適宜的培養(yǎng)基中，當(dāng)工程菌長到適宜濃度時如對數(shù)中期，加入適宜濃度的IPTG(如0.1～0.5mM)，可見明顯的融合蛋白表達(dá)條帶；5.將培養(yǎng)過夜的種子液，接種到發(fā)酵罐適宜的培養(yǎng)基(如LB、TB或其它適宜培養(yǎng)基中)中培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)至適宜的程度時，加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時間(如3-4小時)。離心收菌，將菌體懸浮在適宜的緩沖液中(如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCL緩沖液等)，超生波或高壓勻漿破菌。將破碎的菌液離心，收集上清液，棄沉淀。
將收集的上清上Heparin親和層析柱，用平衡緩沖液洗去雜蛋白，然后用含適宜濃度的NaCl洗脫GST-KGF1融合蛋白，將洗脫的GST-KGF1融合蛋白上Sepharose 6B親和層析柱，用適當(dāng)濃度的GSH洗脫融合蛋白，所得融合蛋白用高純度的Enterkinase或Thrombin做酶切處理，將酶切的融合蛋白上SP Sepharose F.F.柱去掉GST蛋白，將得到的KGF1上Heparin親和層析柱層析，用含適宜濃度的NaCl洗脫KGF1，得到純度95％以上的純KGF1。純化后得到的KGF1電泳附圖3
實施例2根據(jù)實施例1所得的rhKGF的理化性質(zhì)測定1、N-末端15個氨基酸序列測定將上述兩種方法得到的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子，進(jìn)行N-末端測定，測定結(jié)果如下N-Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met-Glu-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Leu-C與預(yù)期結(jié)果完全一致。
2、量質(zhì)譜測定采用FAB方法測定，兩種方法得到的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的分子量為，16278.5，與理論預(yù)測一致。
3、生物學(xué)活性測定利用KGF1促進(jìn)4MBr-5細(xì)胞增殖的特點進(jìn)行KGF1生物活性的測定。測得結(jié)果為

序列表<110>成都芝田生物工程有限公司<120>一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的生產(chǎn)方法<160>4<210>1<211>1101<212>DNA<213>人工序列<400>1atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt60ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa120tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat180ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac240atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg300gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt360gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa420acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat480gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa540aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca600tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat660ctggttccgc gttcctacga ctacatggaa ggtggtgaca tccgtgttcg tcgtctgttc720tgccgtaccc agtggtacct gcgtatcgac aaacgtggta aagttaaagg tacccaggaa780atgaaaaaca actacaacat catggaaatc cgtaccgttg ctgttggtat cgttgctatc840aaaggtgttg aatccgaatt ctacctggct atgaacaaag aaggtaaact gtacgctaaa900aaagaatgca acgaagactg caacttcaaa gaactgatcc tggaaaacca ctacaacacc960tacgcttccg ctaaatggac ccacaacggt ggtgaaatgt tcgttgctct gaaccagaaa1020ggtatcccgg ttcgtggtaa aaaaaccaaa aaagaacaga aaaccgctca cttcctgccg1080atggctatca cctaactcgag 1101<210>2<211>364<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln5 10 15Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu20 25 30His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys35 40 45Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp50 55 60
Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile65 70 75Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala80 85 90Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly95 100 105Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val110 115 120Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp125 130 135Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His140 145 150Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met155 160 165Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys170 175 180Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser185 190 195Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe200 205 210Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Ser215 220 225Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe230 235 240Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val245 250 255Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile260 265 270Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser275 280 285Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys290 295 300Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu305 310 315Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly320 325 330Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg335 340 345Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro350 355 360Met Ala Ile Thr364<210>3
<211>1122<212>DNA<213>人工序列<400>3atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660ctggttccgc gtggatccga tgacgatgac aagtcctacg actacatgga aggtggtgac 720atccgtgttc gtcgtctgtt ctgccgtacc cagtggtacc tgcgtatcga caaacgtggt 780aaagttaaag gtacccagga aatgaaaaac aactacaaca tcatggaaat ccgtaccgtt 840gctgttggta tcgttgctat caaaggtgtt gaatccgaat tctacctggc tatgaacaaa 900gaaggtaaac tgtacgctaa aaaagaatgc aacgaagact gcaacttcaa agaactgatc 960ctggaaaacc actacaacac ctacgcttcc gctaaatgga cccacaacgg tggtgaaatg 1020ttcgttgctc tgaaccagaa aggtatcccg gttcgtggta aaaaaaccaa aaaagaacag 1080aaaaccgctc acttcctgcc gatggctatc acctaactcg ag1122<210>4<211>371<212>PRT<213>人工序列<400>4Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln1 5 10 15Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu20 25 30His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys35 40 45Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp50 55 60Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile65 70 75Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala80 85 90Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly95 100 105Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val
110 115 120Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp125 130 135Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His140 145 150Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met155 160 165Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys170 175 180Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser185 190 195Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe200 205 210Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly215 220 225Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp230 235 240Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg245 250 255Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn260 265 270Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val275 280 285Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys290 295 300Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn305 310 315Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser320 325 330Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn335 340 345Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln350 355 360Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr365 370 37權(quán)利要求
1.一種人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的制備辦法，包括以下步驟a.人工合成人角質(zhì)細(xì)胞生長因子氨基酸編碼區(qū)相對應(yīng)的基因；b.步驟a得到的基因與適宜的表達(dá)載體上的GST蛋白基因3′端融合，中間含腸激酶或者凝血酶識別位點；c.將含有融合蛋白編碼基因的適宜的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌獲得基因工程菌；d.該基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后，經(jīng)提取層析純化步驟，制備出GST-KGF融合蛋白；e.再經(jīng)腸激酶或者凝血酶切割后，分離純化獲得重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，上述融合蛋白中GST蛋白和人角質(zhì)細(xì)胞生長因子之間通過腸激酶酶切識別位點-(Asp)N-Lys-連接，結(jié)構(gòu)為X-(Asp)N-Lys-KGF，其中Asp為天冬氨酸，X為GST蛋白，n為2、3或者4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中所述融合蛋白中GST蛋白和人角質(zhì)細(xì)胞生長因子之間通過凝血酶(Thrombin)酶切識別位點X-P2-P3-Pro-P1.連接，連接方式為X-P4-P3-Pro-P1-KGF，其中X為GST蛋白，P1為Arg或Lys，P2、P3為疏水性氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中所述疏水性氨基酸選自Leu、Val、ILe、Met、Ala、Cys或Trp。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，結(jié)構(gòu)式X-P4-P3-Pro-P1-KGF中，P1為Arg，P2為Val、P3為Leu，其序列表達(dá)式為X-Leu-Val-Pro-Arg-KGF，其中X為GST蛋白，KGF序列為已報道的人缺失N-端23個氨基酸殘基的含140個氨基酸的KGF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中所述GST-KGF融合蛋白的編碼DNA序列見序列表1和3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中所述GST-KGF融合蛋白的氨基酸序列見序列表2和4。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，其中所述發(fā)酵是將合格的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子基因工程菌接種到發(fā)酵罐中培養(yǎng)，其中加入IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。提取層析純化步驟包括離心收集菌體，破菌、離心收集破菌液上清的步驟，將收集的上清上Heparin親和層析柱，用平衡緩沖液洗去雜蛋白，然后用含適宜濃度的NaCl洗脫GST-KGF融合蛋白，將洗脫的GST-KGF融合蛋白上Sepharose 6B親和層析柱，用適當(dāng)濃度的GSH洗脫融合蛋白，所得融合蛋白用高純度的Enterkinase或Thrombin做酶切處理，將酶切的融合蛋白上SP Sepharose F.F.柱去掉GST蛋白，將得到的KGF上Heparin親和層析柱層析，用含適宜濃度的NaCl洗脫KGF，得到純度95％以上的純KGF。
9.用權(quán)利要求1的方法制備的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的藥物組合物，其配方組成如下人角質(zhì)細(xì)胞生長因子0.5mg甘露醇5～20mg檸檬酸(一水) 2.1mg檸檬鈉(二水) 2.94mg
10.用權(quán)利要求1的方法制備的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的藥物組合物，其配方組成如下人角質(zhì)細(xì)胞生長因子0.5mg甘露醇5～20mg磷酸二氫鈉0.93mg磷酸氫二鈉1.73mg氯化鈉10mg
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的生產(chǎn)方法，特別涉及一種利用基因重組技術(shù)制備人角質(zhì)細(xì)胞生長因子的生物活性多肽的方法，該方法包括以下步驟a.人工合成人角質(zhì)細(xì)胞生長因子氨基酸編碼區(qū)相對應(yīng)的基因；b.步驟a得到的基因與適宜的表達(dá)載體上的谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶蛋白基因3′端融合，該基因中間部分含凝血酶或者腸激酶識別位點；c.將含有融合蛋白編碼基因的適宜的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適宜的大腸桿菌獲得基因工程菌；d.該基因工程菌經(jīng)發(fā)酵后，經(jīng)提取層析純化步驟，制備出GST－KGF融合蛋白；e.再經(jīng)凝血酶或者腸激酶切割后，分離純化獲得重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子。
文檔編號C07K1/00GK1766107SQ20051008549
公開日2006年5月3日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者趙波 申請人:成都芝田生物工程有限公司