篩選多能干細胞生長促進因子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效的無飼養(yǎng)層、無血清的細胞培養(yǎng)技術(shù)和一種基于此類培養(yǎng)技 術(shù)的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 最近對于人多能干細胞如人ES細胞（hESC)和人iPS細胞（hiPSC)的研究為再生 醫(yī)學(xué)的實際應(yīng)用提供了增加的可能性。由于此類細胞具有無限的增殖能力和分化成不同細 胞的能力，因而使用多能干細胞的再生醫(yī)學(xué)有望從根本上改變對于難治性疾病、與生活習(xí) 慣相關(guān)的疾病和其他疾病的治療方法。目前的技術(shù)已經(jīng)能夠誘導(dǎo)多能干細胞在體外分化成 不同細胞，包括神經(jīng)細胞、心肌細胞、血液細胞和視網(wǎng)膜細胞。
[0003] 已主要在使用小鼠胚胎成纖維細胞（MEF)的飼養(yǎng)細胞層上常規(guī)培養(yǎng)人多能 干細胞，如hESC和hiPSC。飼養(yǎng)細胞提供了用于維持人多能干細胞向干細胞培養(yǎng)的 生長因子。已發(fā)現(xiàn)在不同人細胞類型以及MEF中其活性能夠維持人多能干細胞的培 養(yǎng)（Hovatta0·等，Hum.Reprod·，（2003) 18,ρρ· 1404-1409;RichardsM.等，Nat. Biotechnol·，（2002) 20,ρρ· 933-936;ChengL.等，StemCells, (2003) 21，ρρ· 131-142 ;和 RichardsM.等，StemCells, (2003) 21，pp. 546-556)。然而，在常規(guī)技術(shù)中，在培養(yǎng)時飼養(yǎng) 細胞的制備是費力的，并且在干細胞中存在飼養(yǎng)細胞污染的風險。因而，需要發(fā)展替代性的 更加安全的技術(shù)。
[0004] 作為不使用MEF的多能干細胞培養(yǎng)技術(shù)，已知一種涉及使用來自添加了血清如 FBS或血清替代物的培養(yǎng)基的MEF-預(yù)制條件培養(yǎng)基（即MEF-CM)的方法和一種使用化學(xué) 固定的MEF的方法（YueX-S.等，PLoS. 0NE，（2012)7，e32707)。此外，還有一種涉及使用 不同人細胞（例如成纖維細胞、胎盤細胞、骨髓細胞和子宮內(nèi)膜細胞）作為活的飼養(yǎng)細胞而 不使用已報道的外源性細胞的方法（HayatoFukusumi和YonehiroKanemura,Development ofFeeder-freeCellCultureTechniqueofHumanES/iPSCells(人ES/iPS細胞無飼 養(yǎng)細胞培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)），JournalofClinicalandExperimentalMedicine, (2011)239 ，pp. 1338-1344)。在這些方法中，使用添加了牛血清或KNOCKOUT?SR(敲除血清替代物，其 是作為能夠培養(yǎng)ES/iPS細胞的血清替代物的添加劑）的培養(yǎng)基以培養(yǎng)人多能干細胞。然 而，很多添加劑成分包含從牛血清中提取的蛋白。因此，感染性疾病如牛海綿狀腦病（BSE) 和細胞的病毒污染成為關(guān)注的問題。盡管在一些情況下使用人血清，但是人血清不適于實 際使用，因為其使用或用量受到限制。
[0005] 此外，對用于培養(yǎng)的無MEF完全合成培養(yǎng)基（化學(xué)上確定的培養(yǎng)基）的研發(fā)已被 推進（AkopianV.等，InVitroCellDev.Biol.Anim·，（2010)46，ρρ· 247-258;和Chen G.等，Nat.Methods, (2011)8,ρρ· 424-429)。針對功能性蛋白對MEF分泌產(chǎn)物進行了分析 (ChinA.C.等，J.Biotechnol·，（2007) 130,ρρ· 320-328)。然而，在無飼養(yǎng)層、無血清培養(yǎng) 基中穩(wěn)定培養(yǎng)人多能干細胞仍是困難的，并且一直期待開發(fā)一種能夠理想生長的技術(shù)。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 發(fā)明要解決的問題
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種高效的無飼養(yǎng)層、無血清的細胞培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明的另 一個目的是提供一種基于此類培養(yǎng)技術(shù)篩選生長促進因子的方法。
[0009] 解決問題的方法
[0010] 本發(fā)明人為了達到上述目的進行了集中的研究。作為結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)預(yù)先使用飼 養(yǎng)細胞來條件化能夠用于多能干細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基能夠制備得到不需要飼養(yǎng)細胞 共培養(yǎng)就能夠穩(wěn)定培養(yǎng)多能干細胞并且改善其生長能力的培養(yǎng)基。他們還發(fā)現(xiàn)了一種能夠 通過篩選此類制備得到的培養(yǎng)基有效鑒定多能干細胞生長促進因子的技術(shù)。這導(dǎo)致完成了 本發(fā)明。
[0011] 此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)多能干細胞的生長能力能夠通過使用在含有特定成分的無血 清培養(yǎng)基中的多能干細胞的飼養(yǎng)培養(yǎng)，隨后通過無飼養(yǎng)培養(yǎng)（feeder-freeculture)得到 進一步改善。
[0012] 具體地，本發(fā)明包括下述。
[0013] [1] -種篩選多能干細胞生長促進因子的方法，包括：
[0014] a)在含有L-抗壞血酸、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和碳酸氫鈉并且不含血清或血清替 代物的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基并且回收所述條件培養(yǎng)基；和
[0015] b)在所回收的條件培養(yǎng)基中檢測多能干細胞的生長促進因子。
[0016] 在所述篩選方法的一個優(yōu)選實施方式中，所述無血清培養(yǎng)基可以是含有L-抗壞 血酸、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和碳酸氫鈉的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0017] 在所述篩選方法的一個實施方式中，所述飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)優(yōu)選地通過向所述無 血清培養(yǎng)基中加入生長因子實現(xiàn)。在所述篩選方法中加入的生長因子優(yōu)選FGF2和/或 TGF-β1。
[0018] 在所述篩選方法中，所述飼養(yǎng)細胞可以是小鼠胚胎成纖維細胞。
[0019] 在所述篩選方法中，所述多能干細胞優(yōu)選是ES細胞或iPS細胞。
[0020] [2] -種制備用于培養(yǎng)多能干細胞的培養(yǎng)基的方法，所述方法包括在含有L-抗壞 血酸、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和碳酸氫鈉并且不含血清或血清替代物的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 飼養(yǎng)細胞以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基并且回收所述條件培養(yǎng)基。
[0021] 在所述制備方法的一個優(yōu)選實施方式中，所述無血清培養(yǎng)基可以是含有L-抗壞 血酸、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和碳酸氫鈉的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0022] 在所述制備方法的一個實施方式中，所述飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)優(yōu)選地通過向所述無 血清培養(yǎng)基中加入生長因子實現(xiàn)。在所述制備方法中加入的生長因子優(yōu)選FGF2和/或 TGF-β1。
[0023] 在所述制備方法中，所述飼養(yǎng)細胞可以是小鼠胚胎成纖維細胞。
[0024] 在所述制備方法中，所述多能干細胞優(yōu)選是ES細胞或iPS細胞。
[0025] [3] -種用于培養(yǎng)多能干細胞的條件培養(yǎng)基，其通過根據(jù)上述[2]所示的方法制 備。
[0026] [4] -種多能干細胞的生長方法，所述方法包括在條件培養(yǎng)基中實現(xiàn)多能干細胞 的無飼養(yǎng)培養(yǎng)，所述條件培養(yǎng)基通過在含有L-抗壞血酸、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和碳酸氫鈉 并且不含血清或血清替代物的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞產(chǎn)生。
[0027] 在所述生長方法的一個優(yōu)選實施方式中，所述無血清培養(yǎng)基可以是含有L-抗壞 血酸、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和碳酸氫鈉的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0028] 在所述生長方法的一個實施方式中，所述飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)優(yōu)選地通過向所述無血 清培養(yǎng)基中加入生長因子實現(xiàn)。在另一個實施方式中，通過不向所述無血清培養(yǎng)基中加入 生長因子實現(xiàn)所述飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)和通過向所述條件培養(yǎng)基中加入生長因子實現(xiàn)多能干 細胞的無飼養(yǎng)培養(yǎng)是優(yōu)選的。在所述生長方法中加入的生長因子優(yōu)選FGF2和/或TGF-β1。
[0029] 在所述生長方法中，所述飼養(yǎng)細胞可以是小鼠胚胎成纖維細胞。
[0030] 在所述生長方法中，所述多能干細胞優(yōu)選是ES細胞或iPS細胞。
[0031] [5] -種生長多能干細胞的方法，所述方法包括使用含有L-抗壞血酸、胰島素、轉(zhuǎn) 鐵蛋白、硒和碳酸氫鈉并且不含血清或血清替代物的無血清培養(yǎng)基將在飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)的 多能干細胞轉(zhuǎn)變成無飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)，并且實現(xiàn)所述多能干細胞的無飼養(yǎng)培養(yǎng)。
[0032] 在這種方法的一個優(yōu)選實施方式中，所述無血清培養(yǎng)基優(yōu)選地不含白蛋白。
[0033] 本說明書包括在日本專利申請?zhí)?013-137206中公開的內(nèi)容，本申請要求了該申 請的優(yōu)先權(quán)。
[0034] 發(fā)明的效果
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，使用不含血清或血清替代物的無血清培養(yǎng)基能夠改善多能干細胞在 無飼養(yǎng)培養(yǎng)中的生長能力。此外，根據(jù)本發(fā)明，能夠制備能夠篩選促進多能干細胞在無飼養(yǎng) 培養(yǎng)中非分化生長的因子的條件培養(yǎng)基。
[0036] 附圖簡述
[0037] 圖1代表顯示在無飼養(yǎng)培養(yǎng)中無血清MEF條件培養(yǎng)基對iPS細胞生長能力影響的 照片。A:在由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基）A+ITS+FGF2+TGF-0 1制備的條件培養(yǎng)基中的生 長能力（+++) ;B:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基）A+ITS+FGF2+TGF-0 1 (未條件化）中的生 長能力（+);C:在由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基）A+ITS制備的條件培養(yǎng)基（條件化后，添 加FGF2+TGF-i3 1)中的生長能力（++) ;D:在由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基）A制備的條件 培養(yǎng)基（條件化后，添加ITS+FGF2+TGF-0 1)中的生長能力（-);E:在由基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無血 清培養(yǎng)基）B+ITS制備的條件培養(yǎng)基（條件化后，添加FGF2+TGF-0 1)中的生長能力（-);和 F:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基）B+ITS+FGF2+TGF-0 1 (未條件化）中的生長能力（-)。
[0038] 圖2代表顯示在包被了不同培養(yǎng)基質(zhì)的塑料培養(yǎng)皿中在無血清條件培養(yǎng)基中人 iPS的生長結(jié)果。使用Matrigel__ (見圖2A、B)、玻連蛋白（vitronectin)(見圖2C、D)和 PCM-DM(見圖2E、F)作為培養(yǎng)基質(zhì)。在A、C和E中，使用未條件化的無血清培養(yǎng)基。在B、D和F中，使用MEF-條件培養(yǎng)基。
[0039] 圖3代表顯示在使用MEF-條件無血清培養(yǎng)基或未條件化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)中人 iPS細胞生長能力的比較結(jié)果的表。
[0040] 圖4顯示了通過流式細胞術(shù)對在MEF-條件無血清培養(yǎng)基或未條件化無血清培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的人iPS細胞的非分化標記物進行表達分析的結(jié)果。
[0041] 圖5代表顯示在由使用含有血清替代物的培養(yǎng)基（B至E)或含有給定成分的無血 清培養(yǎng)基（G至J)進行的飼養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o飼養(yǎng)培養(yǎng)前后人iPS細胞生長能力比較結(jié)果的 照片。在圖5中，生長程度以符號（無生長）或" + "的數(shù)量表示。
[0042] 實施發(fā)明的實施方式
[0043] 以下，對本發(fā)明進行更加詳細的描述。