專利名稱：重組人角質(zhì)細胞生長因子－2生物流體膜及其制備工藝方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于治療上皮組織損傷的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜，特別涉及重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜及其制備工藝方法。
背景技術：
上皮細胞損傷體表表現(xiàn)為皮膚的燒燙傷、外傷性創(chuàng)口以及各種原因的皮膚潰瘍等，涉及面廣。目前，對燒燙傷、外傷性創(chuàng)面的處理臨床上基本包括傷口清理、敷料應用與藥物治療三個方面，其中敷料應用與藥物治療往往同時進行，在解決覆蓋創(chuàng)面問題的同時幫助創(chuàng)面愈合。
在現(xiàn)有技術中，治療上皮組織損傷的細胞因子藥物主要有人表皮細胞生長因子(EGF)。由于EGF為非特異性角質(zhì)細胞促進因子，因此在治療損傷的同時，可能留下明顯的疤痕。目前應用人角質(zhì)細胞生長因子-2治療上皮組織損傷已引起醫(yī)學界的高度重視和認同，例如，HUMAN GEMNOME SCIENCES開發(fā)重組KGF-2的商品名Inc(HGS)，曾在2000年5月23日就報道了KGF-2治療慢性靜脈潰瘍IIa臨床試驗的研究結果。HGS對94名有慢性靜脈潰瘍的患者給予KGF-2評價其安全性和初步有效性的實驗，結果顯示人體對KGF-2有良好的生物相容性和顯著的治療效果。不但可以治療如燒傷、燙傷、切口傷等損傷，還可用于治療慢性創(chuàng)傷包括靜脈潰瘍、糖尿病性潰瘍等。醫(yī)學界進而又發(fā)現(xiàn)重組人角質(zhì)細胞生長因子-2是一種對傷口愈合非常有治療潛力的蛋白質(zhì)因子，不但具有明顯促進燙傷創(chuàng)面愈合速度及愈合質(zhì)量，而且有明顯促進表皮細胞移行距離(P＜0.05)和移行面積(P＜0.01)的作用。同時能特異性刺激角質(zhì)細胞增殖，降解多余膠原，其在治療大面積皮膚損傷包括燒燙傷、外傷性創(chuàng)口、慢性潰瘍的同時因能減少疤痕的形成，應用前景十分看好。
然而，盡管重組人角質(zhì)細胞生長因子-2是一種對傷口愈合非常有治療潛力的蛋白質(zhì)因子，但是如何應用于臨床上，又如何將其制成一定劑型，是擺在當前醫(yī)學界急待解決的問題。
美國曾經(jīng)將KGF-2制成一種注射劑和粉針劑，但它僅僅是用于治療上皮組織損傷應用的一種藥物，在提取這種藥物時，采用包含體的方法提取KGF-2，其缺點是純度低，工藝復雜。而在敷料方面，在現(xiàn)有技術中雖然有以甲殼素衍生物(殼聚糖)為基質(zhì)制備的生物敷料膜用于各種創(chuàng)傷的治療上，但上市的甲殼素生物敷料膜是一種固體膜，而這種固體膜應用時不能緊密地接觸到創(chuàng)面的各個方面，易產(chǎn)生積液而引起感染；同時固體膜尺寸需要根據(jù)創(chuàng)面增減，極不方便，因而限制了固體敷料膜的廣泛使用。
為了充分利用KGF-2的優(yōu)勢又要克服固體膜的缺點，本發(fā)明就是為了提供一種利用重組人角質(zhì)細胞生長因子-2注入生物流體敷料中，制備成重組人角質(zhì)細胞生長因子生物流體膜。使重組人角質(zhì)細胞生長因子和生物流體敷料具有協(xié)同增效和緩釋作用。
因為對燒燙傷、外傷性創(chuàng)面的治療中，敷料應用與藥物治療往往同時進行，這要求敷料與藥物具有良好的相容性。本發(fā)明中生物流體敷料是以殼聚糖為主要原料，其性質(zhì)溫和，含有適用性廣泛的穩(wěn)定劑，基質(zhì)與輔料的配比合理，可以分別和多種藥物混合，長期儲存后仍穩(wěn)定，且其制劑的基質(zhì)是生物降解材料，可以作為藥物載體，使藥物具有緩釋作用。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術存在的缺點，本發(fā)明的目的之一是提供一種含有重組人角質(zhì)細胞生長因子-2的生物流體膜。
本發(fā)明的目的之二是提供重組人角質(zhì)細胞生長因子-2的生物流體膜的生產(chǎn)制備工藝方法。
本發(fā)明是通過下述技術方案予以實現(xiàn)本發(fā)明所稱的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜包含重組人角質(zhì)細胞生長因子-2純化原液，及其以殼聚糖，明膠、甘油、聚乙烯吡咯烷酮組成的生物流體輔料。
本發(fā)明第一個目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明是將重組人角質(zhì)細胞生長因子-2純化原液注入到生物流體敷料中，該生物流體敷料是以殼聚糖為主要基質(zhì)，以明膠、甘油、聚乙烯吡咯烷酮為輔料采用配比優(yōu)化制成。所述的輔料填充比例是，殼聚糖1.0-2.0％；明膠0.2-1.0％；聚乙烯吡咯烷酮0.02-0.1％；生物流體輔料PH值5.0-7.0。
所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2為凍干粉；發(fā)酵純化原液形式。
本發(fā)明第二個目的是這樣實現(xiàn)的
本發(fā)明所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜的制備工藝方法如下①純化原液的制備；②生物流體敷料的制備；③純化原液與生物流體敷料的混合，即重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜的主要制備方法。
①純化原液的制備方法包括(a)將KGF-2基因連接在表達載體pLY4上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，克隆高表達工程菌株；(b)培養(yǎng)工程菌株，通過提高溫度誘導表達rhKGF-2；(c)通過層析技術分離純化出步驟(b)中所表達的rhKGF-2；②生物流體敷料的制備方法包括將脫乙酰度大于80％的殼聚糖置于80℃的烘箱內(nèi)2小時，冷卻，按1.0-2.0％濃度稱量。用0.5-1.0％的醋酸溶液將上述的殼聚糖充分攪拌溶解，攪拌速度為65-296r/min，時間12小時，溶液的PH值為1-5；在溶解的殼聚糖溶液中，分別加入(0.2-1.0％)明膠、甘油，混勻。殼聚糖與明膠的干燥重量比為3.2∶1～5∶1。用0.5-0.7％的碳酸氫鈉溶液2500-4000ml進行中和，溶液PH5.0-7.0。加入(0.02-0.1％)聚乙烯吡咯烷酮，充分攪拌。過濾，消泡、滅菌。次日測定殼聚糖溶液的粘度為500-5000mpa.s，產(chǎn)品PH值為5-7，進行無菌試驗。
③純化原液加入生物流體敷料過程取無菌的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2純化原液水溶液，緩慢加入到生物流體敷料中，充分攪拌，過濾、消泡，灌裝于經(jīng)80℃烘烤4h的醫(yī)用鋁管中。流體膜中rhKGF-2終濃度為50-200μg/ml。
本發(fā)明所述的高表達工程菌株的制備方法包括表達質(zhì)粒為pLY4，宿主菌為大腸桿菌BL 21(D3)，(高效表達質(zhì)粒pLY4、大腸桿菌BL 21(D3)由劉新垣教授實驗室提供，這是劉新垣教授實驗室構建的一個溫度誘導型高表達載體。詳細構建資料參閱《中國科學》(B輯)，1995，25(10)1063-1070。)將KGF-2 cDNA序列合成20段互補的寡核苷酸，并在5′端、3′端分別引入特異酶切位點EcoR I、BamH I，用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30分鐘，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩爾數(shù)混合，94℃變性5分鐘，立即變至65℃退火10分鐘，然后加入T4連接酶，16℃反應過夜。
表達載體EcoRI/BamHI位點插入了人角質(zhì)細胞生長因子的編碼序列還包括SEQID NO1序列的簡并序列，該“簡并序列”是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)階段是溫度37℃；pH6.0；誘導時OD6002.0；共培養(yǎng)5小時；發(fā)酵誘導階段，溫度42℃，pH6.8，誘導時間為2小時。
本發(fā)明所述的純化階段是①、發(fā)酵液4℃以下，4500rpm離心10min，得菌體。
②、菌體高壓破菌，7000rpm離心30min，得上清。
③、層析1(親和層析)層析介質(zhì)肝素(Heparin)CL-6B緩沖液溶液ATris-HCl(PH7.4，20mM)溶液BTris-HCl(PH7.4，20mM)+1M NaCl清洗上樣后用6柱體積(CV)的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10柱體積(CV)將溶液B從0％升至100％。
④、層析2(陽離子交換層析)層析介質(zhì)SP Sepharose FF緩沖液溶液ATris-HCl(PH7.4，20mM)溶液BTris-HCl(PH7.4，20mM)+1M NaCl清洗上樣后用6柱體積(CV)的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10柱體積(CV)將溶液B從0％升至100％。]上述的層析技術還包括凝膠過濾層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、親和層析，凝膠過濾層析是指將樣品超濾濃縮后，可以用凝膠過濾層析去鹽及純化。
實施本發(fā)明可產(chǎn)生如下有益效果本發(fā)明在構建工程菌中，由于采用胞間質(zhì)提取工藝，故提取工藝簡單，rhKGF-2含量高。而以本發(fā)明工藝方法制備成的流體敷料不屬于軟膏劑、膠劑，其物理性狀為半流體，具有滲透性，能和創(chuàng)面緊密結合，涂于創(chuàng)面干燥后能形成透明薄膜，具有物理和化學雙重屏障抗感染作用，該薄膜氧通透性高，能控制和吸收滲出物，使用后創(chuàng)面收斂，滲出物顯著減少，痂面干燥、光整、不污染衣物，且該流體敷料室溫儲存穩(wěn)定。由高含量的rhKGF-2與流體敷料的結合所生產(chǎn)出的本發(fā)明，具有以下四方面優(yōu)點(1)表達工藝簡單。由于本發(fā)明選擇了適合rhKGF-2表達的載體，該載體有助于rhKGF-2以可溶性形式存在，不需要變性、復性工藝；簡便、低成本的溫度誘導方式提高了rhKGF-2的產(chǎn)業(yè)化價值；分離純化簡便。
(2)表達量高。通過控制關鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達水平高于目前報道的以包含體形式表達的水平。實驗表明，本發(fā)明制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得rhKGF-2純品150mg。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
(3)含有殼聚糖的流體敷料，對皮膚創(chuàng)面具有良好的生物相容性及天然的抗菌活性，能促進創(chuàng)面局部免疫、上皮細胞生長及加速愈合等多種生物學功效，該敷料局部使用干燥后，能形成一層透明的薄膜，具有物理和化學雙重屏障保護作用，且氧通透性高，能控制和吸收滲出物，使用后創(chuàng)面收斂，滲出物顯著減少，痂面干燥、光整不污染衣物。
(4)重組人角質(zhì)細胞生長因子-2(rhKGF-2)是一種對傷口愈合非常有治療潛力的蛋白質(zhì)因子，能特異地刺激角質(zhì)細胞增殖，降解多余膠原，其在治療大面積皮膚損傷包括燒傷、外傷性創(chuàng)面、慢性潰瘍的同時因能減少疤痕的形成，應用前景十分看好。重組人角質(zhì)細胞生長因子-2同生物流體敷料具有協(xié)同增效作用。
具體實施例方式實施例1重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜基質(zhì)的制備稱取經(jīng)80℃烘干的殼聚糖492克(終濃度為1.6％)置攪拌器中，加入25千克純化水攪勻，攪拌速度為196r/min，邊攪邊緩慢加入250ml醋酸溶液，PH值為3，過程約需12小時，畢后，趁熱加入事先溶解在1500ml水中的明膠150g，及150ml甘油，混勻，然后用0.7％碳酸氫鈉溶液3700ml緩慢調(diào)節(jié)殼聚糖溶液PH值至6.5，過程需2-3小時，再加入24.5克聚乙烯吡咯烷酮，充分攪拌，過濾，加熱、去氣泡，消毒，次日測定殼聚糖溶液的PH值及粘度，然后醫(yī)用鋁管灌封包裝。用旋轉(zhuǎn)式粘度計測得粘度為3570mpa.s，。該基質(zhì)常溫貯存穩(wěn)定，呈半流體狀，可直接涂敷皮膚創(chuàng)面。
殼聚糖原料的質(zhì)量指標醋酸溶液的澄清度和顏色1％醋酸溶解成1％的本樣品溶液，應為稍粘稠、目視無顆粒，稍有乳光，其顏色不應比參照液深。參照液稱取0.018g氯化鐵溶解成10ml溶液。
粘均分子量取殼聚糖適量，以0.1mol/L醋酸和0.2mol/L氯化鈉溶液為溶劑，用烏氏粘度計測定殼聚糖的特性粘數(shù)，并計算分子量范圍為2×105～5×105。
動力粘度取本品適量，用1％醋酸溶解成1％濃度的溶液，室溫放置20h后，用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)粘度計測定本品的粘度范圍5～100mpa.s。
脫乙酰度本品于40℃干燥24h后稱取0.5g，置于250ml錐形瓶中，加入0.1mol/LHCl標準溶液35ml，使其溶解。甲基橙為指示劑，用0.1mol/L NaOH標準液滴定至終點。另取本品一份0.5g，105℃烘至恒重，測其水分，以干燥品計其脫乙酰度不低于80％。
干燥失重稱取本品2.0g，105℃干燥至恒重，減失重量不得過10％(中國藥典二部附錄VIIIL)。
灼燒殘渣(灰分)稱取本品5.0g，緩緩熾灼至完全炭化，依法檢查(中國藥典二部附錄VIIIN)，遺留殘渣不得過2.0％。
酸不溶灰分將上述灼燒后的殘渣溶于5ml 5％鹽酸與5ml水的混合液中，煮沸、過濾，105℃干燥至恒重，酸不溶灰分不得過0.5％。
重金屬稱取本品1.0g，置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱量，緩緩熾灼至完全炭化，于550℃熾灼使完全灰化，依法檢查(中國藥典95版二部附錄VIIIH第二法)，重金屬(以Pb值計)含量不得過百萬分之十(10ppm)。
砷鹽稱取本品1.0g，加無水碳酸鈉1.0g，混合，加水攪拌均勻，干燥后，先用小火燒灼使炭化，再于550℃熾灼使完全灰化，放冷，加鹽酸5ml與水23ml，依法檢查(中國藥典95版二部附錄VIIIL第一法)，砷含量不得過百萬分之二(2mg/kg)。
實施例2重組人角質(zhì)細胞生長因子-2原液的制備表達質(zhì)粒為pLY4，宿主菌為大腸桿菌BL 21(D3)。根據(jù)基因文庫中的KGF-2的cDNA序列，合成20段互補的寡核苷酸，并在5′端、3′端分別引入特異酶切位點EcoR I、BamH I，采用分子克隆的常規(guī)方法，首先用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30分鐘。磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩爾數(shù)混合，94℃變性5分鐘，立即變至65℃退火10分鐘，然后加入T4連接酶，16℃反應過夜。
pLY4質(zhì)粒用EcoR I，BamH I雙酶解后回收大片斷，與合成的rhKGF-2 cDNA片斷連接過夜，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL 21(D3)，再用氨芐青霉素抗性篩選，得到陽性克隆菌株；小量制備質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶鑒定篩選出含rhKGF-2全長cDNA序列。
實施例3rhKGF-2生物流體膜的制備以流體敷料膜與適當濃度的重組人角質(zhì)細胞生長因子(rhKGF-2)搭配，制成rhKGF-2-流體膜新劑型，其配方設計為取無菌的0.4％重組人角質(zhì)細胞生長因子-2(rhKGF-2)水溶液1份，緩慢加入到rhKGF-2生物流體膜基質(zhì)19份中，充分攪拌，過濾、消泡，灌裝于經(jīng)80℃烘烤4h的醫(yī)用鋁管中。流體膜中rhKGF-2終濃度為200μg/ml。
實施例4rhKGF-2生物流體膜穩(wěn)定性試驗1、長期實驗(實驗進行中)在接近藥品的實際貯存條件下進行，以便制訂藥品的有效期提供依據(jù)。將3批樣品放置在6℃±2的環(huán)境中，并在第0天、第3個月、第6個月、第9個月、第12個月、一年半、二年、三年末取樣一次，按照規(guī)定的檢測指標進行監(jiān)測。檢測指標無菌試驗、性狀、色澤、pH值、活性、動力粘度、皮膚成膜性。
2、加速實驗此項試驗是在超常的條件下進行，目的是通過加速藥物制劑的化學或物理變化預測藥物制劑的穩(wěn)定性。
將3批樣品放在溫度25℃±2培養(yǎng)箱中，濕度60±5％的條件下放置6個月，并在實驗期間第1個月、第2個月、第3個月、第6個月末取樣一次，按照規(guī)定的檢測指標進行監(jiān)測。
重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜穩(wěn)定性試驗(長期)共進行021001、021002、021003三組試驗，僅列其中一組的考察數(shù)據(jù)如下表所示批號021001留樣日期2002.10.9實驗條件溫度6±2℃

經(jīng)過加速試驗中看出，三批被考察的樣品的效價在超常條件下稍有變化，但均在標示量的90％-110％內(nèi)。
通過長期穩(wěn)定性試驗推算，流體膜在6±2℃條件下有效期分別為021001批31.1個月、021002批35.9個月、021003批34.3個月。據(jù)此估計，該流體膜有效期暫定為2年。
實施例5rhKGF-2流體膜的藥效學試驗1、rhKGF-2流體膜對大鼠皮膚燙傷的治療作用實驗方法雄性SD大鼠50只，體重350～400g。大鼠背部脊柱兩側(cè)以8％硫化鈉(溶于1％CMC溶液中)脫毛，面積約6×8cm2，第2天硫苯妥納40mg/kg尾靜脈注射麻醉，將預先放入沸水中預熱的50g砝碼(直徑2cm)壓放在大鼠背部脊柱兩側(cè)脫毛區(qū)，燙8秒鐘，每側(cè)2個，共4個。第3天(燙傷后第2天)將大鼠隨機分成5組，每組10只。先用半透明稱量紙描記傷口大小，分析天平稱重，用于給藥前傷口面積計算。然后各組傷口涂抹生理鹽水100μl/傷口(對照組)，KGF-2溶液20μg/傷口(陽性組)、KGF-2流體膜20、10和5μg/傷口(以含有KGF-2量計)，給藥體積均為100μl/傷口，每天給藥1次，連續(xù)16天，期間每4天描記傷口1次。計算用藥過程中傷口愈合率。
實驗結果
KGF-2流體膜能明顯加快大鼠皮膚燙傷后的愈合速度，劑量關系明確。相同劑量(20μg/傷口)比KGF-2溶液的治療效果更好，愈合更快。
表1 KGF-2流體膜對大鼠燙傷傷口面積(mg)及愈合率(％)

注n＝40，和對照組比較，**p＜0.01 *p＜0.052、對大鼠皮膚全層切除傷口愈合的影響實驗方法雌性SD大鼠50只，體重250~300g。上述同樣方法在大鼠背部脫毛約6×8cm2，第2天硫苯妥納40mg/kg劑量尾靜脈注射麻醉。背部脫毛區(qū)用75％酒精消毒，每鼠用利刀在脊柱兩側(cè)做兩個1.4×5.2cm2的全層切口，并將皮膚及皮下結蒂組織剪除，直達肌肉層，但不損傷肌肉脛膜。第2天隨機分成5組，用半透明稱量紙描記傷口大小，分析天平稱重，用于給藥前傷口面積計算。分別給予生理鹽水250μl/傷口，KGF-2溶液(0.2mg/ml)250μl/傷口，KGF-2流體膜40、20和10μg/傷口(以含有KGF-2量計)，給藥體積均為250μl/傷口，每天給藥1次，期間每4天描記傷口1次。計算用藥過程中傷口愈合率。
表2 rhKGF-2流體膜對大鼠皮膚全層切除傷口愈合率的影響(％)


注n＝20，和對照組比較，**p＜0.01 *p＜0.05此實驗尚未結束，只有12天的數(shù)據(jù)。
試驗結果rhKGF-2流體膜能明顯加快大鼠皮膚全層切除傷口的愈合速度，劑量關系明確。相同劑量(40μg/傷口)比KGF-2溶液的治療效果更好，愈合更快。
和燙傷模型相比，此模型傷口的愈合率較低，可能和傷口面積較大有關(比燙傷傷口大1.32倍)。但從給藥后傷口愈合肉眼觀察看，皮膚全層切除模型中，傷口外觀狀況更好，可能和此模型中藥物能和傷口充分接觸，而在燙傷模型中，早期傷口上的死痂妨礙了藥物和具有修復功能的或組織的接觸，影響了傷口的修復。
上述所列舉的實施例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對本發(fā)明的限制，有關技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，所作出的各種變化，所有等同的技術方案也應屬于本發(fā)明保護的范疇。
權利要求
1一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜，其特征是包含重組人角質(zhì)細胞生長因子-2純化原液，及其以殼聚糖，明膠、甘油、聚乙烯吡咯烷酮組成的生物流體敷料。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜，其特征是所述的生物流體敷料填充比例是，殼聚糖1.0-2.0％；明膠0.2-1.0％；聚乙烯吡咯烷酮0.02-0.1％；生物流體敷料PH值5.0-7.0。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜，其特征是所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2為凍干粉或者發(fā)酵純化原液形式。
4.一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜制備工藝方法，其特征是將提取的純化原液加入到如權利要求1所述的生物流體敷料中；①純化原液的制備方法包括(a)把KGF-2基因連接在表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，克隆高表達工程菌株；(b)培養(yǎng)工程菌株，通過提高溫度誘導表達rhKGF-2；(c)通過層析技術分離純化出步驟(b)中表達的rhKGF-2；②生物流體敷料的制備方法包括將脫乙酰度大于80％的殼聚糖置于80℃的烘箱內(nèi)2小時，冷卻，按1.0-2.0％濃度稱量，用0.5-1.0％的醋酸溶液將上述的殼聚糖充分攪拌溶解，攪拌速度為65-296r/min，時間12小時，溶液的PH值為1-5；在溶解的殼聚糖溶液中，分別加入0.2-1.0％明膠、甘油，混勻，殼聚糖與明膠的干燥重量比為3.2∶1～5∶1，用0.5-0.7％的碳酸氫鈉溶液2500-4000ml進行中和，溶液PH5.0-7.0，加入(0.02-0.1％)聚乙烯吡咯烷酮，充分攪拌，過濾，消泡、滅菌，次日測定殼聚糖溶液的粘度為500-5000mpa.s，產(chǎn)品PH值為5-7，進行無菌試驗；③純化原液加入生物流體敷料過程取無菌的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2純化原液水溶液，緩慢加入到生物流體敷料中，充分攪拌，過濾、消泡，灌裝于經(jīng)80℃烘烤4h的醫(yī)用鋁管中。
5.根據(jù)權利要求4所述重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜制備工藝方法，其特征是所述的高表達工程菌株的制備包括表達質(zhì)粒為pLY4，宿主菌為大腸桿菌BL 21(D3)，將KGF-2 cDNA序列合成20段互補的寡核苷酸，并在5′端、3′端分別引入特異酶切位點EcoR I、BamH I，用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30分鐘，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩爾數(shù)混合，94℃變性5分鐘，立即變至65℃退火10分鐘，然后加入T4連接酶，16℃反應過夜。
6.根據(jù)權利要求5所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜制備工藝方法，其特征是所述的表達載體EcoRI/BamHI位點插入的人角質(zhì)細胞生長因子的編碼序列還包括SEQ ID NO1序列的簡并序列，該“簡并序列”是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
7.根據(jù)權利要求4所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜制備工藝方法，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)階段是，溫度37℃；pH6.0；誘導時OD6002.0；共培養(yǎng)5小時；發(fā)酵誘導階段，溫度42℃，pH6.8，誘導時間為2小時。
8.根據(jù)權利要求4所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜制備工藝方法，其特征是所述的純化階段是①、發(fā)酵液4℃下4500rpm離心10min，得菌體；②、菌體高壓破菌，7000rpm離心30min，得上清；③、層析1(親和層析)層析介質(zhì)肝素(Heparin)CL-6B緩沖液溶液ATris-HCl(PH7.4，20mM)溶液BTris-HCl(PH7.4，20mM)+1M NaCl清洗上樣后用6柱體積(CV)的溶液A清洗層析柱，梯度清洗后用10柱體積(CV)將溶液B從0％升至100％，④、層析2(陽離子交換層析)層析介質(zhì)SP Sepharose FF緩沖液溶液ATris-HCl(PH7.4，20mM)溶液BTris-HCl(PH7.4，20mM)+1M NaCl清洗上樣后用6柱體積(CV)的溶液A清洗層析柱，梯度清洗后用10柱體積(CV)將溶液B從0％升至100％，
9.根據(jù)權利要求4所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2生物流體膜制備工藝方法，其特征是所述的層析技術包括凝膠過濾層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、親和層析，凝膠過濾層析是指將樣品超濾濃縮后，可以用凝膠過濾層析去鹽及純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療上皮組織損傷的重組人角質(zhì)細胞生長因子－2，特別涉及重組人角質(zhì)細胞生長因子－2生物流體膜及其制備工藝方法。本發(fā)明所述的－2生物流體膜包含重組人角質(zhì)細胞生長因子－2純化原液，及其以殼聚糖，明膠、甘油、聚乙烯吡咯烷酮組成的生物流體敷料。所述的人角質(zhì)細胞生長因子－2流體膜純化原液的制備方法包括下述步驟(a)將KGF－2基因連接在表達質(zhì)粒pLY4上，構建表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(D3)，克隆工程菌；(b)培養(yǎng)工程菌，通過提高溫度誘導表達rhKGF－2；(c)分離純化出步驟(b)中表達的rhKGF－2。生物流體敷料的制備方法包括該生物流體敷料是以以殼聚糖為主要基質(zhì)，以明膠、甘油、聚乙烯吡咯烷酮為輔料采用配比優(yōu)化制成。流體膜用于上皮組織損傷的治療。
文檔編號A61K9/70GK1654071SQ20041003943
公開日2005年8月17日 申請日期2004年2月12日 優(yōu)先權日2004年2月12日
發(fā)明者王虎根, 蔣玉燕, 岑堅, 沈進, 畢憶群, 蔣建國 申請人:浙江省醫(yī)學科學院, 寧波人健藥業(yè)有限公司