專利名稱：用于治療分枝桿菌感染的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明應(yīng)用于免疫學領(lǐng)域-具體地說應(yīng)用于控制由分枝桿菌引起的傳染病-基于使用含有抗體的制劑，通過粘膜和其它途徑施用，其具有預(yù)防和治療作用。
現(xiàn)存分枝桿菌生物中，我們發(fā)現(xiàn)證明對動物和人都危險的病原體，包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium)，其引起肺結(jié)核，麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)，引起麻風病，鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)和胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracelulare)，其在免疫缺陷患者中引起肺結(jié)核，以及在人類中引起頻率少得多的疾病的其它分枝桿菌(Sommer HM，Good RCMycobacterium.InManual of clinical Microbiology，4thEd.Washington D.CA society for Microbiology；1985.p.216-248.，Orme IM.Immunity to mycobacteria.Current Opinion inImmunology.1993；5497-502)。
在動物的情況下，鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種，其引起反芻動物的Jones病(Jones Disease)，和牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)，其引起牛肺結(jié)核，尤其值得注意(Dannenberg Am.Pathogenesis ofTuberculosisnative and acquired resistance in animals andhumans.InLeive L，Schlesinger D(eds).Microbiology.1984，p.344-354)。
在影響人的最重要分枝桿菌疾病中，肺結(jié)核(TB)感染構(gòu)成了全世界的健康關(guān)注并且是與傳染病相關(guān)的主要死亡原因，盡管使用了BCG疫苗并設(shè)計了很多藥物來控制它(Dolin PJ，Rayiglione MK，Kochi A.Global tuberculosis，incidence and mortality during 1990-2000.Bull Who.2001；72213)。
據(jù)估計世界人口的三分之一已經(jīng)感染了結(jié)核分枝桿菌。每年，全世界8百萬人發(fā)展為活動的TB和3百萬人死于它。人免疫缺陷病毒(HIV)協(xié)同感染代表了百分之3至5的病例(Dolin PJ，Raviglione MK，Kochi A.Global tuberculosis，incidence and mortality during1990-2000.Bull Who.1994；72213)。
該疾病重要的傳播迫使發(fā)展新的和更好的診斷方法，以及疫苗和治療劑的開發(fā)(Collins FM.TuberculosisThe Return of an OldEnemy.Critical Reviews in Microbiology.1993；191-16)。
關(guān)于治療，它在于以相對高劑量施用藥物和施用延長的時間的組合，其引起致使受控治療程序的實行困難的相關(guān)毒性(McCarthy M.Experts see progress in fight against tuberculosis.Lancet.2002；3592005)。在這方面，將期望縮短治療周期，和由此利于控制程序的應(yīng)用和完成，其將防止抗性菌株的出現(xiàn)。施用的藥物劑量降低也將證明對降低綜合治療的毒性有用。
對具有多藥抗性菌株和攜帶它們的很多患者的出現(xiàn)，以及不斷增長的預(yù)示將來出現(xiàn)的病例的關(guān)心在增加，這要求開發(fā)新的治療替換物(McCarthy M.Experts see progress in fight against tuberculosis.Lancet.2002；3592005；Hopwell PC.Tuberculosis ControlHowthe world has changed since 1990.Bull.World Health Org 2002，80427，F(xiàn)reire M，Rosigno G.Joining forces to develop weaponsagainst TBtogether we must.Bull.World Health Org 2002，80429)。
除此之外，存在對人引起無充分治療方法的疾病的許多種分枝桿菌。
卡介苗是用于人的唯一現(xiàn)存疫苗。在全世界，已經(jīng)施用3×1012的劑量。根據(jù)采用的菌株-其營養(yǎng)狀況、其遺傳背景、其已經(jīng)歷的老化過程和并發(fā)感染的存在，其功效變化很大。認為它僅對影響嬰兒的嚴重形式疾病(粟疹和腦膜形式)的預(yù)防有效，對肺結(jié)核的預(yù)防無效，因此急需開發(fā)新疫苗(Hirsch LS，Johnson-JL，Ellner JJ.Pulmonarytuberculosis.Curr-Opin-Pulm-Med1999；5(3)143-50；Jacobs GG，Johnson JL，Wallis RS.Tuberculosis vaccineshow close to humantesting.Tuber Lung Did 1997；78159-169；Ginsberg AM.What’snew in tuberculosis vaccines？Bull.World Health Org 2002，80483)。
基本上由THl亞群引起的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在對抗結(jié)核分枝桿菌，和抗一般的分枝桿菌中的決定性作用已經(jīng)被認可并構(gòu)成該感染不可避免具有之的國際法則(Specificity and Function of T-andB-cell Recognition in TuberculosisPathogenesis，Protectionand Control.J infect.Dis.1994；30117-135)。
按照這個理由，用于對抗肺結(jié)核和其它分枝桿菌的新疫苗開發(fā)中利用的所有接種策略旨在刺激這種免疫反應(yīng)機制(Ginsberg AM.What’s new in tuberculosis vaccines？Bull.World Health Org 2002，80483)。然而，尚未廣泛研究特異性抗體在對抗分枝桿菌中可能起的作用(Glatman A.Casadevall A.Serum therapy for tuberculosisrevisitedreappraisal of the role of antibody mediate immunityagainst Mycobacterium tuberculosis.Clin Microbiol Rev.1998；11514-532)。
分枝桿菌生物通過粘膜穿透身體；這意味著分泌物中特異性抗體的存在可能構(gòu)成這些微生物穿透的屏障，預(yù)防感染。而且，來自粘膜、血液或生物的其它部分的特異性抗體到達存在感染的部位可能具有治療作用。
迄今為止，在動物和人進行的包括使用含有多克隆抗體的血清和制劑注射施用的治療工作尚未產(chǎn)生決定性的結(jié)果(Glatman A.Casadevall A.Serum therapy for tuberculosis revisitedreappraisal of the role of antibody mediate immunity againstMycobacterium tuberculosis.Clin Microbiol Rev.1998；11514-532)。
在十九世紀末和二十世紀初對人類進行研究的情況下，采用的血清總是從其它物種獲得的，很少給出關(guān)于它們的提取形式、它們的強度等細節(jié)，并且進行的調(diào)查缺乏允許獲得有效結(jié)論的方法學和統(tǒng)計學嚴密性(Glatman A.Casadevall A.Serum therapy for tuberculosisrevisitedreappraisal of the role of antibody mediate immunityagainst Mycobacterium tuberculosis.Clin Microbiol Rev.1998；11514-532)。
與未經(jīng)處理的動物相比，給小鼠施用氣霧形式的微生物之前，結(jié)核分枝桿菌與單克隆抗體、antilipoarabinomannan預(yù)孵育延長了生存率，盡管它沒有減少研究的器官中微生物的數(shù)量(Teitelbaum R.Glatman-Freedman A，Chen B，Robbins JB，Unanue E，CasadevallA，Bloom B.A mAb recognizing a surface antigen of Mycobacteriumtuberculosis enhances host survival.Proc Natl Acad Sci USA.1998；9515688-15693；US Patent Application 20010007660)。值得注意的是，當評價“體內(nèi)”通過腹膜施用該抗體的效果時，沒有檢測到有益效果。
前述策略最主要的缺點之一是使用含有從其它物種獲得的抗體的血清和制劑，其中抗原識別不同，因為來自非人物種的抗體的類型和亞類不利用人類的所有抗體依賴性、免疫效應(yīng)機制，大大降低了它們的有效性。在伴隨施用異源蛋白中發(fā)現(xiàn)了另一個缺點，它引起血液疾病，全身消腫的嚴重并發(fā)癥，尤其是關(guān)節(jié)和腎，和由于受體產(chǎn)生的抗物種抗體的反應(yīng)造成抗體失活，導(dǎo)致采用制劑的抗微生物活性喪失。
除了這些缺點，單克隆抗體具有將它們的作用限于僅與一種微生物抗原的一個表位的缺點，它降低了它們的抗微生物潛力和采用它們抗各種類型分枝桿菌的可能性。這些要素的組合使得這些策略效率低和在實踐中危險。
本發(fā)明的目標是開發(fā)含有人抗體的制劑，單獨或與待通過粘膜以及其它途徑施用的免疫增效劑、免疫調(diào)制劑、滅活或減毒菌株、抗原、基因和/或藥物組合預(yù)防或治療由分枝桿菌引起的感染。
使用的抗體制劑由下列組成●通過任何已知、現(xiàn)有技術(shù)方法獲得的IgG人抗體，如乙醇沉淀、離子交換層析和病毒滅活階段。
●IgA分泌型和含乳鐵(lactoferrous)的人抗體，由初乳通過任何已知、現(xiàn)有技術(shù)方法獲得。
●提及的制劑的混合物所有制劑是從大量個體獲得的，并且在它們采用之前，檢測樣品中對結(jié)核分枝桿菌抗原特異性的高濃度抗體和BCG的存在。意外地，獲得了抗分枝桿菌抗原的廣泛活性，允許在預(yù)防和治療由這種類型微生物引起的廣譜感染中使用這種類型制劑，特別是細菌種類成分中抗原的廣泛交叉反應(yīng)性。
這些制劑可以用于有分枝桿菌感染風險的群體的預(yù)防，如接觸患者的群體(包括親戚、朋友、專業(yè)人員等等)，或尤其是預(yù)先有接觸這些感染傾向的那些患者，如HIV攜帶者的情況，他們更易感分枝桿菌感染，包括結(jié)核分枝桿菌引起的和特別是鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌引起的感染，這些分枝桿菌通過攝取食物經(jīng)由胃腸系統(tǒng)穿透生物，這些感染抵抗治療并且構(gòu)成這群患者的主要死亡原因之一。
另一方面，這些制劑對治療確定的感染具有治療價值，使得施用抗體制劑可能具有治療作用以及減少感染敏感菌株的患者的治療周期-這是非常重要的，因為當前的治療漫長，證明對患者有損害并妨害公眾衛(wèi)生系統(tǒng)的工作；其風險沒有正確追蹤造成治療毒性增加，可以導(dǎo)致對藥物制劑有抗性的菌株出現(xiàn)，或其在攜帶對特殊藥物具有多種抗性的菌株的患者中應(yīng)用，這是不斷增長的全球現(xiàn)象，當前沒有治療替換方法。
代表本發(fā)明的制劑在采用鼻內(nèi)模型的小鼠中引起B(yǎng)CG肺感染水平明顯減少(實施例2)。在IgG抗體制劑中，在它們通過腹膜施用后也獲得了預(yù)防和治療作用。在所有施用該抗體的方法中，已經(jīng)證明了抗體有效通過支氣管和唾液分泌物。微生物與采用的制劑預(yù)先孵育后達到肺感染的抑制(實施例2)。
從血漿或初乳獲得的人丙種球蛋白制劑顯示了靶向完全的BCG細胞和結(jié)核分枝桿菌抗原的抗體的存在(實施例1)；這暗示所產(chǎn)生的免疫作用不能與特別靶向一種抗原的抗體相聯(lián)系，很多不同抗原的同時識別是這些類型制劑的優(yōu)良品質(zhì)，它來自制劑中存在的每種類型的特異性抗體的抗菌活性。
本發(fā)明的另一個目的是所提及的制劑用于預(yù)防和治療由任何類型分枝桿菌引起的人的感染的用途，包括引起肺結(jié)核、麻風病和其它的分枝桿菌，以及它們通過粘膜施用，包括注射和鼻內(nèi)方法。
本發(fā)明也涉及另外含有任何類型天然、重組、合成等的免疫增強劑和/或免疫調(diào)制劑的制劑，以及含有減毒或滅活菌株的制劑，或含有抗原或其等同物，或已知具有抗分枝桿菌活性的藥物的制劑。
本發(fā)明提供了治療和預(yù)防由分枝桿菌引起的疾病的新方法，通過“體內(nèi)”使用含有IgG和IgA類人抗體的制劑。IgA分泌型抗體的使用特別新穎，迄今為止其它作者未曾提及。當全身和通過粘膜施用時證明所述制劑有效同樣是新的。
本發(fā)明通過得到的結(jié)果證明了人抗體如何在″體內(nèi)″預(yù)防和治療分枝桿菌感染中起作用，這是驚奇的事實，因為現(xiàn)有技術(shù)中抗體不是被描述為分枝桿菌感染的抑制劑，和認為僅僅細胞介導(dǎo)的保護機制是相關(guān)的。
將通過下列具體的實施例描述本發(fā)明實施例1.丙種球蛋白的分布動力學來自同源基因Balb/c庫，8至10周齡和體重20至22克，由國家實驗動物生產(chǎn)中心(CENPALAB)，哈瓦那，古巴供給的雄性小鼠用于實驗。給它們接種日本BCG實驗室生產(chǎn)的日本(東京)BCG菌株，和通過Cadiz和同事們所述方法(Cadiz A.Fernandez J.Joo L.Moya A.Modifications to the alcoholic fractioning method employed inCuba for the production of immunoglobulines for intravenous use.Vaccimotor 1998；72-7)獲得的人丙種球蛋白制劑。如表1所示，I和II組的動物分別通過腹膜內(nèi)和鼻內(nèi)施用人丙種球蛋白(IgG)，從屬于每組的四只不同動物中連續(xù)抽取血清、唾液和氣管支氣管分泌物樣品。對接受鼻內(nèi)IgA抗體制劑的動物進行相似的實驗。
表1.人丙種球蛋白在Balb/c小鼠中的分布動力學的實驗設(shè)計
完整細胞ELISA測試后表明每份樣品中抗牛分枝桿菌抗原的抗體的存在。人丙種球蛋白IgG制劑中檢測到抗BCG表面抗原的抗體，滴度(titer)4096。在含有IgA抗體的制劑的情況下，也檢測到特異性抗體。在I組中，第一時期(1小時)抽取的血清樣品具有滴度5120的抗體，2小時后增加到20480，3小時后減少到2560，并保持穩(wěn)定直到實驗結(jié)束(5小時)。在唾液樣品的情況下，結(jié)果相似，滴度20、1280、0和0。氣管支氣管分泌物中沒有檢測到抗體的存在，直到過去了2小時，滴度80，3小時后減少到40，實驗結(jié)尾(5小時)達到20的值。如所見到，對應(yīng)于血清、唾液和氣管支氣管分泌物樣品的抗體滴度的最大值分別是20480、1280和80。

圖1示出了這些結(jié)果。
在鼻內(nèi)接種IgG丙種球蛋白制劑的屬于II組的動物(圖2)中，在實驗不同時間，血液中沒有檢測到特異性抗體的存在，盡管在實驗第一個小時期間抽取的氣管支氣管分泌物中檢測到滴度160的抗體。比較關(guān)于接種方法的結(jié)果，觀察到僅當腹膜內(nèi)接種丙種球蛋白時，血液樣品中顯示特異性抗體的存在。在唾液樣品中，當腹膜內(nèi)進行接種時，觀察到更高滴度值，該結(jié)果與這些動物血液中存在高水平抗體有關(guān)。在氣管支氣管分泌物中，當鼻內(nèi)進行接種時獲得更高的抗體滴定度值。該研究證明兩種施用方法中，識別BCG的抗體聚集在這些動物的粘膜中。
在鼻內(nèi)施用IgA抗體制劑的情況下，其分布模式類似于用相同方法施用IgG制劑得到的模式。
實施例2.攻擊(challenge)實驗使用IgG和IgA分泌型抗體制劑，進行攻擊實驗。使用的設(shè)計在表3示出。
表3.在Balb/c小鼠中使用BCG的攻擊實驗設(shè)計
第I組動物用作陰性對照組并用0.1mL戊巴比妥鈉(IMEFA)，每公斤重量50mg通過靜脈內(nèi)麻醉。隨后給它們鼻內(nèi)接種含0.5×106個細胞的BCG的50μL Sauton溶液。根據(jù)鼻內(nèi)感染模型，使用自動微吸管(Plastomed)給它們施用25μL/鼻腔。用人丙種球蛋白腹膜內(nèi)處理屬于II組的小鼠，每克體重1mg。給III組的小鼠鼻內(nèi)接種含1mg丙種球蛋白的20μL溶液。2小時后，鼻內(nèi)施用0.5×106個細胞的BCG“攻擊”屬于II和III組的動物。給IV組的動物鼻內(nèi)接種50μL與人丙種球蛋白預(yù)孵育的BCG。為了完成這點，0.5×106個細胞的BCG與每毫克人丙種球蛋白孵育，室溫下輕輕攪拌4小時的時間?；旌衔镆?585rcf離心10分鐘，沉淀重懸于500μL PBS中并以同樣方式再次離心，最后以10×106個細胞/mL重懸。然后在感染后24小時殺死所有動物，在無菌條件下取出它們的右肺進行分枝桿菌分析，進行每毫克組織的集落形成單位數(shù)量(CFUs/毫克組織)的計算。
在含有IgA抗體的制劑的情況下，鼻內(nèi)施用給一組動物，遵循施用IgG抗體的制劑情況下采用的方法，其也在施用給一組動物前，BCG的預(yù)孵育中使用。I和III組分別采用腹膜內(nèi)和鼻內(nèi)接種含有IgG抗體的制劑(表2)。利用的丙種球蛋白劑量與動力學實驗中使用的相同。這之后，用BCG“攻擊”動物。如我們在圖3中所見，比較從I組動物(陰性對照)和其余組獲得的CFUs，存在顯著性差異(p＝0.01)。發(fā)現(xiàn)從II、III和IV組獲得的CFUs數(shù)量之間沒有顯著性差異。在鼻內(nèi)接受IgA抗體制劑的動物組和接種與這種制劑預(yù)孵育的BCG的動物組得到了相似的結(jié)果。這些結(jié)果提示在它們接種后或接種前，對BCG特異性的抗體的相互作用，通過抑制或阻斷微生物進入，通過抑制它們增殖，以及通過不同機制最終消滅它們而發(fā)揮著保護性作用。攻擊實驗證明了兩種制劑提供了相似水平的保護。
所建議溶液的優(yōu)點這些類型的制劑具有從人類獲得的優(yōu)點，為我們免去了物種間免疫不相容性相關(guān)的困難(由于物種對它的反應(yīng)等造成血液患病、制劑活性降低)和確保屬于相同物種和所有IgG和IgA亞類的抗體的存在，這些保證了將動員依賴于物種可利用的抗體的所有免疫機制(中和、調(diào)理、補體固定、ADCC等等)，產(chǎn)生最佳的抗微生物活性。
這種類型制劑的另一個優(yōu)點是它含有IgA分泌型抗體，這確保微生物的穿透遭受阻斷或抑制活動。由于分泌型成分的存在，這種類型抗體非常穩(wěn)定并且在分泌物內(nèi)具有長半衰期，使得其抗菌作用更加有效。制劑中存在人乳鐵蛋白(lactoferrin)，這與初乳中提純它之后連同IgA分泌型抗體一起出現(xiàn)，由于乳鐵蛋白對可吸收鐵作用決定的已知的廣泛抗菌作用，給該制劑賦予了另外的抗微生物活性。
另一個優(yōu)點是低水平的不良反應(yīng)，包括不存在病毒滅活特殊時期的病毒傳播。重要地，這些制劑表現(xiàn)出預(yù)防活性，通過在粘膜水平阻斷微生物穿透而發(fā)揮，和通過不同類型抗體的聯(lián)合作用而發(fā)揮的治療活性，該抗體與很多抗原反應(yīng)，發(fā)動多種多樣的抗微生物機制。
通過粘膜施用該制劑確保在微生物進入部位導(dǎo)入制劑的不復(fù)雜和通用方法，有利于感染的抑制和因此利于制劑的預(yù)防作用，以及容易接近感染組織(肺、腸等等)，也有利于對確定的感染發(fā)揮的治療作用。
考慮的另一個優(yōu)點是發(fā)揮抗不同類型分枝桿菌的廣譜活性，這由存在抗體的高滴度和這些抗體的廣泛交叉反應(yīng)性，以及它們從具有抗其生物體中分枝桿菌的高滴度抗體的供體提取做保證，這確保了高水平的特異活性。
附圖簡述圖1.腹膜內(nèi)給Balb/c小鼠施用人丙種球蛋白的分布動力學。數(shù)值代表在實驗每個時間抽取的樣品中發(fā)現(xiàn)的平均滴度值，通過完全BCG細胞的ELISA試驗確定。
圖2.鼻內(nèi)給Balb/c小鼠施用人丙種球蛋白的分布動力學。數(shù)值代表在實驗每個時間抽取的樣品中發(fā)現(xiàn)的平均滴度，通過完全BCG細胞的ELISA試驗確定。
圖3.使用鼻內(nèi)施用BCG的Balb/c小鼠的攻擊實驗結(jié)果。該值代表所研究的每個組計算的CFUs/器官的平均數(shù)量。第1組的動物(陽性對照)鼻內(nèi)接種BCG，在鼻內(nèi)施用BCG“攻擊”前，屬于第2組和第3組的動物分別鼻內(nèi)和腹膜內(nèi)接種人丙種球蛋白。第4組動物鼻內(nèi)接種與人丙種球蛋白預(yù)孵育的BCG。
權(quán)利要求
1.具有下列特征的抗分枝桿菌的組合物，(a)具有抗分枝桿菌成分活性的IgG或分泌型IgA類或二者的混合物的人多克隆抗體；(b)合適的藥物載體；以及(c)最后選自免疫調(diào)制劑、任意組合的失活或減毒菌株和乳鐵蛋白的組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗分枝桿菌的組合物，其中人多克隆抗體濃度范圍為40-160mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗分枝桿菌的組合物，其中乳鐵蛋白濃度范圍為10-20mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗分枝桿菌的組合物，具有兩種抗體比率為50∶50-80∶20的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的抗分枝桿菌的組合物，所述的免疫調(diào)制劑是免疫增效劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的抗分枝桿菌的組合物，所述的免疫調(diào)制劑是選自天然、重組、合成或基因之組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的抗分枝桿菌的組合物，其中滅活或減毒菌株的組合包括表達異源抗原和/或編碼所述抗原的基因的菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至8的組合物在預(yù)防和治療由分枝桿菌引起的疾病中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8的組合物與具有抗分枝桿菌活性的藥物組合的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學領(lǐng)域，具體地說涉及由分枝桿菌引起的傳染病的治療，其通過粘膜和其它途徑施用抗體組合物，用于預(yù)防和治療所述疾病。本發(fā)明涉及具有抗分枝桿菌抗原的特異活性的IgG類、IgA分泌型或二者的混合物的人抗體組合物的制備用于預(yù)防和治療由這種類型微生物引起的感染。本發(fā)明組合物證明了其防止“體內(nèi)”分枝桿菌感染的能力。
文檔編號C07K16/12GK1756565SQ200380109162
公開日2006年4月5日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月25日
發(fā)明者A·阿科斯塔多明格斯, M·E·薩緬托加西亞圣米格爾, Y·洛佩斯埃爾南德斯, J·F·因方特布爾扎克, A·卡迪斯拉亨斯, G·法萊羅羅德里格斯, V·G·謝拉岡薩雷斯, M·B·馬丁內(nèi)斯貝尼特斯 申請人:血清疫苗研究生產(chǎn)中心芬雷學院