分枝桿菌感染的預(yù)防和治療的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療分枝桿菌感染(尤其但不僅是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染)之抗原(包括分枝桿菌硫酸鹽同化途徑組分，例如CysD)的鑒定；涉及表達(dá)系統(tǒng)，其包含用于表達(dá)所述用于預(yù)防和治療所述感染之抗原的活分枝桿菌；并且涉及所述抗原和表達(dá)系統(tǒng)用于預(yù)防和治療所述感染的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】分枝桿菌感染的預(yù)防和治療

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療分枝桿菌感染（尤其但不僅是結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis)感染）之抗原的鑒定；涉及表達(dá)系統(tǒng)，其包含用于表達(dá)所 述用于預(yù)防和治療所述感染之抗原的活分枝桿菌（Mycobacterium);并且涉及所述抗原和 表達(dá)系統(tǒng)用于預(yù)防和治療所述感染的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 本說(shuō)明書(shū)中參考的任何現(xiàn)有技術(shù)不是也不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或任何形式的建議該 現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成了澳大利亞或任何其他司法管轄區(qū)的公知常識(shí)，或者該現(xiàn)有技術(shù)可以由本領(lǐng) 域技術(shù)人員合理地預(yù)期為確定、理解和視為相關(guān)。
[0003] 結(jié)核?。╰uberculosis,TB)的病原體結(jié)核分枝桿菌每年奪去將近2百萬(wàn)生命 (Dye，2010)，且是全球由于單細(xì)菌病原體而死亡的首要原因。該情況在過(guò)去十年中已經(jīng)由 于與HIV的共感染以及目前的疫苗卡介苗（BacillusCalmette-Gu6rin，BCG)為成年人提 供針對(duì)TB的保護(hù)時(shí)的低效率而變得更危急（Dye，2010)。
[0004] 通過(guò)被感染個(gè)體識(shí)別新的和保護(hù)性抗原的鑒定將代表TB控制中的主要進(jìn)步，且 可形成限制疾病傳播之新療法的基礎(chǔ)。
[0005]目前臨床試驗(yàn)中的TB疫苗包括病毒載體的或基于佐劑的亞單位疫苗，以及全分 枝桿菌疫苗，其表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)免疫原性結(jié)核分枝桿菌抗原（Kaufmann，2011)。這些策 略中的多數(shù)基于結(jié)合分枝桿菌的分泌抗原，假定其被宿主免疫應(yīng)答更容易地"看到"（在 (Kaufmann，2011)中綜述）。還沒(méi)有確定這些新候選疫苗在人中的保護(hù)性效力。
[0006] 存在對(duì)用于預(yù)防和/或治療分枝桿菌感染（尤其是結(jié)核分枝桿菌感染）之其他候 選抗原和疫苗的需要。
[0007] 為進(jìn)一步鑒定抗原，通過(guò)重組疫苗載體（例如卡介苗（BCG))在抗原呈遞細(xì)胞中抗 原表達(dá)的靶向調(diào)節(jié)將顯著地輔助開(kāi)發(fā)有效的免疫治療策略。
[0008] 存在對(duì)候選表達(dá)系統(tǒng)的需要，尤其是能夠立即并持續(xù)表達(dá)保護(hù)性抗原的那些，從 而使得能夠提高對(duì)分枝桿菌（尤其是結(jié)核分枝桿菌）的抗原特異性免疫應(yīng)答。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明尋求解決一個(gè)或更多個(gè)上面提到的需要和/或提供預(yù)防和/或治療分枝桿 菌感染的改進(jìn)，并且在一個(gè)實(shí)施方案中提供了最小化在個(gè)體中發(fā)生分枝桿菌感染之可能性 的方法，其包括：
[0010] -在個(gè)體中形成對(duì)分枝桿菌硫酸鹽同化途徑（sulphateassimilationpathway, SAP)之組分（component)的免疫應(yīng)答；
[0011] 從而最小化所述個(gè)體中發(fā)生分枝桿菌感染的可能性。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于向個(gè)體提供對(duì)分枝桿菌感染之免疫的方法，其 包括：
[0013]-在個(gè)體中形成對(duì)分枝桿菌SAP之組分的免疫應(yīng)答；
[0014] 從而向所述個(gè)體提供對(duì)分枝桿菌感染的免疫。
[0015] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了預(yù)防個(gè)體中發(fā)生分枝桿菌感染的方法，其包括：
[0016]-在處于病癥中的需要所述預(yù)防的個(gè)體中提供分枝桿菌SAP的組分以使所述個(gè)體 中能夠形成對(duì)所述組分的免疫應(yīng)答；
[0017] 從而預(yù)防所述個(gè)體中發(fā)生感染。
[0018] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療具有分枝桿菌感染的個(gè)體以至少最小化所 述感染或與所述感染相關(guān)病癥之進(jìn)展的方法，其包括：
[0019]-在處于病癥中的需要所述治療的個(gè)體中提供分枝桿菌SAP的組分以使所述個(gè)體 中能夠形成對(duì)所述組分的免疫應(yīng)答；
[0020] 從而治療所述個(gè)體。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分枝桿菌SAP的組分在制造用于最小化個(gè)體中發(fā)生 分枝桿菌感染可能性的藥物中的用途。
[0022] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了分枝桿菌SAP之組分用于最小化個(gè)體中發(fā)生分枝桿 菌感染可能性的用途。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于確定個(gè)體是否對(duì)分枝桿菌免疫的方法，其包 括：
[0024]-在處于病癥中的個(gè)體中提供分枝桿菌SAP的組分以使所述個(gè)體中能夠形成對(duì)所 述組分的免疫應(yīng)答；
[0025]-確定所述個(gè)體是否發(fā)生了對(duì)所述組分的保護(hù)性免疫應(yīng)答；
[0026] 其中保護(hù)性免疫應(yīng)答的發(fā)生確定了所述個(gè)體對(duì)分枝桿菌免疫；
[0027] 從而確定所述個(gè)體是否對(duì)分枝桿菌免疫。
[0028] 分枝桿菌CsyD基因或基因產(chǎn)物是用于上述方法中的優(yōu)選組分。
[0029] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于在個(gè)體中提供對(duì)分枝桿菌之免疫應(yīng)答的疫苗或 免疫刺激組合物，其包含：
[0030]-分枝桿菌SAP的組分；
[0031] _化合物，其用于增強(qiáng)對(duì)分枝桿菌SAP之組分的免疫應(yīng)答。
[0032] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于在個(gè)體中提供對(duì)分枝桿菌之免疫應(yīng)答的疫苗或 免疫刺激組合物，其包含：
[0033]-包含重組CysD基因或蛋白質(zhì)的分枝桿菌細(xì)胞。
[0034] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適合于用在上述組合物中的重組蛋白，所述蛋白包 含具有由分枝桿菌CysD基因編碼之序列的第一區(qū)以及一個(gè)或更多個(gè)具有分枝桿菌抗原序 列的另外的區(qū)。還提供了編碼所述重組蛋白的核酸以及包含所述核酸的表達(dá)載體。
[0035] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適合于用在上述組合物中的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包 含具有由分枝桿菌CysD基因編碼之序列的第一區(qū)以及具有由分枝桿菌Agb85基因編碼之 序列的另外的區(qū)。還提供了編碼所述蛋白質(zhì)的核酸以及包含所述核酸的表達(dá)載體。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含編碼分枝桿菌CysD蛋白的核酸和啟動(dòng)子的表 達(dá)載體，其中當(dāng)將包含所述載體的分枝桿菌菌株引入APC時(shí)所述啟動(dòng)子與核酸可操作地相 連接用于表達(dá)所述核酸，所述啟動(dòng)子具有引起分枝桿菌ATP非依賴(lài)性分子伴侶之表達(dá)的分 枝桿菌啟動(dòng)子的序列。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含上述重組蛋白、核酸或表達(dá)載體的分枝桿菌。細(xì) 胞可來(lái)自結(jié)核分枝桿菌或可為結(jié)核分枝桿菌的減毒菌株。
[0038] 在一些相關(guān)的實(shí)施方案中，提供了用于提供對(duì)分枝桿菌感染之抗原特異性免疫應(yīng) 答的方法，其包括：
[0039] -將分枝桿菌菌株引入抗原呈遞細(xì)胞（antigenpresentingcell,APC);
[0040] 其中所述菌株包含：
[0041]-編碼用于提供對(duì)分枝桿菌感染的抗原特異性免疫應(yīng)答之分枝桿菌抗原的重組核 酸；
[0042]-當(dāng)將所述菌株引入APC時(shí)用于表達(dá)所述重組核酸的與所述重組核酸可操作地相 連接的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子具有引起分枝桿菌ATP非依賴(lài)性分子伴侶之表達(dá)的分枝桿菌啟 動(dòng)子的序列。
[0043] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了表達(dá)載體，其包含：
[0044]-編碼用于提供對(duì)分枝桿菌感染的抗原特異性免疫應(yīng)答之分枝桿菌抗原的核酸；
[0045] _當(dāng)將菌株引入APC時(shí)用于表達(dá)所述核酸的與所述核酸可操作地連接的啟動(dòng)子， 所述啟動(dòng)子具有引起分枝桿菌ATP非依賴(lài)性分子伴侶之表達(dá)的分枝桿菌啟動(dòng)子的序列。
[0046] 在上述的一些實(shí)施方案中，分枝桿菌HspX啟動(dòng)子是用作具有引起分枝桿菌ATP非 依賴(lài)性分子伴侶之表達(dá)的分枝桿菌啟動(dòng)子序列之啟動(dòng)子的優(yōu)選的啟動(dòng)子。
[0047] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含上述表達(dá)載體的分枝桿菌菌株。
[0048] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了表達(dá)載體，其包含：
[0049]-編碼蛋白質(zhì)的核酸，所述蛋白質(zhì)包含具有由分枝桿菌CysD基因編碼之序列的第 一區(qū)以及具有由分枝桿菌Agb85基因編碼之序列的另外的區(qū)；
[0050]-當(dāng)將所述載體引入APC時(shí)，引起所述核酸表達(dá)的分枝桿菌HspX啟動(dòng)子。
[0051] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了細(xì)胞，通常為結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞或減毒分枝桿菌細(xì) 胞（例如減毒牛分枝桿菌（M.bovis)細(xì)胞如BCG)，或減毒結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞，所述細(xì)胞包含 上述表達(dá)載體。
[0052] 在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，提供了用于最小化個(gè)體中發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染可能 性的方法，其包括：
[0053]-在個(gè)體中提供減毒結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞，在其中發(fā)生所述感染的可能性將被最小 化；
[0054] 其中所述細(xì)胞包含：
[0055] 表達(dá)載體，其包含：
[0056]-編碼蛋白質(zhì)的重組核酸，所述蛋白質(zhì)包含具有由分枝桿菌Agb85基因編碼之序 列的第一區(qū)以及具有由分枝桿菌CysD基因編碼之序列的另外的區(qū)；
[0057]-當(dāng)將所述載體引入APC時(shí)，引起所述重組核酸表達(dá)的分枝桿菌HspX啟動(dòng)子；
[0058] 其中在所述處于病癥中的個(gè)體中提供所述細(xì)胞用于形成所述個(gè)體中對(duì)所述蛋白 質(zhì)的免疫應(yīng)答；
[0059]從而最小化個(gè)體中發(fā)生分枝桿菌感染的可能性。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0060] 圖1.在宿主細(xì)胞內(nèi)和非復(fù)制持續(xù)期間結(jié)核分枝桿菌硫酸鹽活化復(fù)合物的上調(diào)。 (A) 編碼所述硫酸鹽活化復(fù)合物之cysDNC基因座的基因組構(gòu)（geneticorganisation)。在 結(jié)核分枝桿菌中，cysN(GTP酶）和cysC(激酶）活性在一條多肽中融合在一起，且cysDNC 構(gòu)成操縱子。（B)通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)量之桿菌（bacilli)cysDNC的相對(duì)表達(dá)水平，所述桿 菌在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)48小時(shí)（空柱）或在RAW細(xì)胞感染后生長(zhǎng)48小時(shí)（黑柱）。數(shù)據(jù)為以 一式三份測(cè)量的平均相對(duì)表達(dá)土S.E.M，且代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。（C)DETA-NO(Det)對(duì)經(jīng)培 養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的作用。每24小時(shí)將50yMDETA-N0添加至結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物 (實(shí)心正方形），持續(xù)7天，或者未處理（實(shí)心圓圈）。在第0、1、3和7天，取等分試樣以確 定CFU/mL。（D)在DETA-N0處理后第7天cysDNC的相對(duì)表達(dá)水平（黑柱）與未處理之結(jié) 核分枝桿菌培養(yǎng)物（空柱）的比較。
[0061] 圖2.結(jié)核分枝桿菌硫酸鹽活化復(fù)合物的宿主免疫識(shí)別。在鼻內(nèi)結(jié)核分枝桿菌攻 擊（challenge)后3周（A)和8周（B)測(cè)量小鼠之MLN中的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在對(duì) CysDNC或85B蛋白（lOiig/ml)回憶（recall)后通過(guò)ELIspot計(jì)數(shù)IFN-y分泌性細(xì)胞。 數(shù)據(jù)為4只小鼠的平均值土S.E.M，且代表兩次實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AN0VA確定蛋白質(zhì)刺激的和未 刺激的細(xì)胞間差異的顯著性；*P< 〇. 0001。（C)在結(jié)核分枝桿菌感染的患者的外周血中 (空?qǐng)A圈）（n= 15)以及TST-ve個(gè)體的外周血中（實(shí)心圓圈）（n= 11)測(cè)量抗原特異性T 細(xì)胞應(yīng)答。經(jīng)由3H-胸苷和計(jì)算的刺激指數(shù)的整合測(cè)量10yg/ml下響應(yīng)于結(jié)核分枝桿菌 CFP、CysDNC和Ag85B蛋白的T細(xì)胞增殖。水平線(xiàn)表示每組的中值。通過(guò)Mann-WhitneyU 檢驗(yàn)確定結(jié)核分枝桿菌感染的患者和TST-ve個(gè)體間差異的顯著性；*p< 0. 001。
[0062] 圖3.在結(jié)核分枝桿菌攻擊后，通過(guò)編碼硫酸鹽活化復(fù)合物成員的DNA疫苗來(lái)提供 保護(hù)。以 2 周間隔以 100iig的DCDNA3、DNA-cysD、DNA-cysNC或DNA-cysD與DNA-cysNC之 組合的每一種通過(guò)肌內(nèi)注射（i.minjection)免疫接種C57BL/6(n= 5)小鼠三次。在第 一次注射DNA疫苗時(shí)，通過(guò)皮下注射（s.cinjectiOn)5X105CFU的BCG免疫接種小鼠一次。 在第三次免疫接種后四周，用氣溶膠結(jié)核分枝桿菌攻擊小鼠。在攻擊后四周，在肺（A)和脾 (B) 中確定細(xì)菌負(fù)荷。這些數(shù)據(jù)以每個(gè)器官的平均CFU(土SEM)示出，且代表所有組之3個(gè) 單獨(dú)實(shí)驗(yàn)之一。通過(guò)AN0VA確定未接種疫苗和免疫接種組間在肺和脾中之差異的顯著性； 女p< 0. 001。
[0063] 圖4.在結(jié)核分枝桿菌硫酸鹽活化途徑中的下游酶的上調(diào)和宿主免疫識(shí)別。（A) RAW細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌SAP基因與體外培養(yǎng)之桿菌相比的相對(duì)上調(diào)。從體外培養(yǎng)的桿菌 或結(jié)核分枝桿菌感染的RAW細(xì)胞感染后48小時(shí)提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄1yg的總RNA并進(jìn)行 實(shí)時(shí)PCR以評(píng)估結(jié)核分枝桿菌cysH、sirA、cysKl和cysE的表達(dá)。數(shù)據(jù)為一式三份測(cè)量的 平均相對(duì)表達(dá)土S.E.M并代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。（B)在結(jié)核分枝桿菌攻擊8周后測(cè)量小鼠 MLN中抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在對(duì)CysH、SirA、CysKl和CysE(10iig/ml)回憶后，通過(guò) ELIspot計(jì)數(shù)IFN-y分泌細(xì)胞。數(shù)據(jù)為四只小鼠的平均土S.E.M，且代表兩次實(shí)驗(yàn)。通過(guò) AN0VA確定蛋白質(zhì)刺激的和未刺激的細(xì)胞間之差異的顯著性；*p< 0. 0001。（C)TB感染 之個(gè)體中SAP蛋白的識(shí)別。在結(jié)核分枝桿菌感染的患者（空?qǐng)A圈）（n= 15)和TST-ve個(gè) 體（實(shí)心圓圈）（n= 11)的外周血中測(cè)量抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。如圖2C所述測(cè)量響應(yīng) 于10yg/ml的結(jié)核分枝桿菌CFP(按照?qǐng)D2C)、CysH、SirA、CysKl和CysE蛋白的T細(xì)胞增 殖。通過(guò)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)確定結(jié)核分枝桿菌感染的患者和TST-ve個(gè)體間差異的顯著 性；女P< 0.001。
[0064] 圖5.編碼下游SAP酶之DNA疫苗的保護(hù)性效力。以2周間隔以100iig的p⑶NA3、 DNA-cysD與DNA-cysNC的組合或者表達(dá)cysH、sirA、cysKl或cysE之DNA疫苗的混合物的 每一種通過(guò)肌內(nèi)注射免疫接種C57BL/6小鼠（n= 5)三次。在第一次注射DNA疫苗時(shí)，通 過(guò)皮下注射5X105CFU的BCG免疫接種小鼠一次。在第三次免疫接種后四周，用氣溶膠結(jié) 核分枝桿菌攻擊小鼠。四周后，在肺（A)和脾（B)中確定細(xì)菌負(fù)荷。這些數(shù)據(jù)以每個(gè)器官 的平均CFU(土SEM)示出，且代表所有組之3個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)之一。通過(guò)AN0VA確定未接種疫苗 和免疫接種組間在肺和脾中之差異的顯著性（*P< 〇. 0001)以及BCG免疫接種的動(dòng)物和 其他免疫接種組間之差異的顯著性（+P< 〇. 0001)。
[0065] 圖6?在用CysDN蛋白加強(qiáng)（boost)后BCG的保護(hù)性效力。用5X105CFU的BCG通 過(guò)皮下注射免疫接種小鼠的組，且在24周后小鼠皮下接受MPL-DDA中之100iig的CysDNC 蛋白（以?xún)芍荛g隔進(jìn)行3次）。在6周后，用氣溶膠結(jié)核分枝桿菌攻擊小鼠。沒(méi)有免疫對(duì)照 小鼠，沒(méi)有免疫接種或者用BCG免疫接種，并僅用MPL-DDA佐劑加強(qiáng)。在攻擊后4周，確定 肺（A)和脾（B)中的細(xì)菌負(fù)荷。這些數(shù)據(jù)以對(duì)于每組6至10個(gè)小鼠之每個(gè)器官的平均細(xì) 菌數(shù)量土SEM示出。數(shù)據(jù)代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AN0VA確定未免疫小鼠和其他組間之 差異的顯著性（*P< 0. 0001)以及BCG/MPL-DDA免疫的動(dòng)物和其他組間之差異的顯著性 (* *p< 〇? 0001 ;NS_ 無(wú)顯著差異）。
[0066] 補(bǔ)充圖1.分枝桿菌中的硫酸鹽同化。一旦輸入細(xì)胞，通過(guò)由cysDNC編碼的ATP 硫酸化酶活化硫酸鹽以產(chǎn)生腺苷_5，_磷酰硫酸（APS)。在分枝桿菌中，APS位于代謝分支 點(diǎn)。其可通過(guò)由cysC編碼的APS激酶磷酸化以產(chǎn)生磷酸腺苷-5,-磷酰硫酸（PAPS)，其作 為生物分子硫酸化（sulfation)的普遍硫酸鹽供體，所述生物分子的硫酸化為分枝桿菌細(xì) 胞壁的結(jié)構(gòu)單元（buildingblock)。在APS中的硫酸鹽部分還可通過(guò)cysH編碼的APS還 原酶催化還原為亞硫酸鹽。亞硫酸鹽通過(guò)亞硫酸鹽還原酶（由sirA編碼）進(jìn)一步還原為硫 化物，且以硫的形式在該還原途徑的最后步驟中整合入半胱氨酸，所述步驟涉及兩種酶，分 別為由cysKl和cysE編碼的0-乙酰絲氨酸硫化氫解酶（〇-Acetylserinesulfhydralse， 0ASS)和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。半胱氨酸為分枝桿菌中許多重要分子的結(jié)構(gòu)單元。
[0067] 圖7.在樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)hspX啟動(dòng)子的迅速誘導(dǎo)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量由BCG Pasteur、充氣的BCG:PhspX-GFP培養(yǎng)物（滾動(dòng)）或在低氧張力下培養(yǎng)7天的BCG:PhspXGFP(靜 止）表達(dá)GFP的水平（A)。用BCG:PhspX-GFP以1 : 1的M0I感染來(lái)自C57BL/6小鼠的BMDC 培養(yǎng)物，且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在感染后〇、6和24小時(shí)確定GFP熒光（B)。數(shù)據(jù)示出平均值 土SEM(n= 3)并代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AN0VA確定相對(duì)0時(shí)間點(diǎn)之差異的顯著性（* * *p< 0. 0001)。通過(guò)共聚焦顯微術(shù)在BMDC感染后0、6和24小時(shí)可視化BCG:PhspX-GFP 的GFP表達(dá)（C)。示出的圖像是使用GFP濾光器和相差圖像的合成以可視化細(xì)胞形態(tài)。
[0068] 圖8.在宿主內(nèi)hspX啟動(dòng)子的體內(nèi)誘導(dǎo)。用IX107CFU的對(duì)照BCG或BCG:PhspX_GFP 向小鼠皮下接種疫苗，且在感染后〇、1、3和7天確定來(lái)自感染部位CD45+細(xì)胞中GFP表達(dá) 的水平（A)。將BCG:PhspX-GFP小鼠小鼠（黑點(diǎn)）的散點(diǎn)圖（scatterplot)疊加在用對(duì)照 BCG感染小鼠（灰點(diǎn)）的GFP表達(dá)水平上。來(lái)自經(jīng)注射的GFP+總數(shù)在（B)中示出。數(shù)據(jù)示 出平均值土SEM，且代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AN0VA確定第0天與其他時(shí)間點(diǎn)間之差異的 顯著性（**p<〇.〇l;***p<〇. 0001)。
[0069] 圖9.在募集至疫苗接種部位的樹(shù)突細(xì)胞中hspX啟動(dòng)子的表達(dá)。如圖2所述向小 鼠接種疫苗，且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定顯示DC表型（CDllchiCDllbhi)之細(xì)胞的數(shù)目（A)。在 ⑶45+群內(nèi)的GFP表達(dá)細(xì)胞以散點(diǎn)圖（B)與GFP+⑶llbhirailchi細(xì)胞在疫苗接種部位的總 數(shù)隨時(shí)間進(jìn)程一起示出（C)。數(shù)據(jù)示出平均值土SEM，且代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AN0VA 確定第〇天與其他時(shí)間點(diǎn)間之差異的顯著性（*P< 〇. 05;* *p< 0. 001;* * *p < 0? 0001)。
[0070] 圖10.hspX啟動(dòng)子可促進(jìn)APC內(nèi)重組抗原的改善的T細(xì)胞識(shí)別。經(jīng)培養(yǎng)的BMDC 被留下不感染（uni)或在用由p25小鼠純化之Ag85B特異性T細(xì)胞共孵育之前用對(duì)照BCG、 BCG:Phsp6(l-85B或BCG:PhspX-85B感染 4 小時(shí)。分別通過(guò)[3H]_ 胸苷吸收（uptake)或IFN-_ ELISA在第3天確定p25T細(xì)胞的增殖（A)和IFN-_釋放（B)。數(shù)據(jù)示出平均值土SEM(n= 3)，且代表至少兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AN0VA確定未感染的細(xì)胞與其他組間之差異的顯著 性（* * *p< 〇? 0001 ;ns，不顯著）。
[0071] 圖11.在用BCG:PhspX-85B接種疫苗的小鼠的DLN中Ag85B-反應(yīng)性T細(xì)胞的做好 準(zhǔn)備（prime)。用5X105CFSE標(biāo)記的p25轉(zhuǎn)基因淋巴結(jié)細(xì)胞靜脈內(nèi)注射C57BL/6小鼠，且 一天后留下作為未感染的對(duì)照（unv)或用5X105CFU的BCG、BCG:Phsp6Q-85B或BCG:PhspX-85B 皮下接種疫苗。在感染后3或7天，確定DLN中轉(zhuǎn)移的p25⑶4T細(xì)胞的CFSE和⑶62L譜 (A)。分裂狀態(tài)呈現(xiàn)為CFSEhi (高）、CFSEint (分裂1-5,中）或CFSEi。（分裂> 6,低）。確定 處于基于CFSE水平的分裂狀態(tài)之p25⑶4T細(xì)胞的比例（B)。
[0072] 圖12.在hspX啟動(dòng)子控制下通過(guò)用表達(dá)Ag85B的BCG接種疫苗誘導(dǎo)的特異性T 細(xì)胞免疫的提高。將小鼠留下不接種疫苗（unv)或用5X105CFU的對(duì)照BCG、BCG:Phs_-85B 或BCG:PhspX-85B皮下接種疫苗。在接種疫苗后3周（A)或12周⑶確定對(duì)應(yīng)于來(lái)自Ag85B 之p25肽的IFN-_分泌性脾細(xì)胞的數(shù)目。在接種疫苗后12周，還用結(jié)核分枝桿菌H37Rv霧 化（aerosolize)小鼠的組，且在攻擊后4周確定肺（C)和脾（D)中的結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷。 示出的數(shù)據(jù)為每組3只小鼠的平均值土SEM，且代表兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AN0VA確定未 接種疫苗的小鼠與BCG接種組間之差異的顯著性（*p< 0. 05 ; * *p< 0. 001 ; * * *p < 0? 0001)。
[0073] 圖13.用BCG:Ag85BCysD的疫苗接種顯示出改善的免疫原性。用5X105CFU的BCG 或表達(dá)Ag85BCysD融合蛋白的BCG免疫接種C57BL/6小鼠（n= 5)。用Ag85BCysD蛋白再 刺激的脾細(xì)胞表現(xiàn)出與僅用BCG免疫接種之小鼠的脾細(xì)胞相比提高的IFN-g-分泌性細(xì)胞 的數(shù)目。
[0074] 圖14.通過(guò)Ag85B_CysD融合蛋白誘導(dǎo)的保護(hù)。用佐劑（MPL/DDA)、Ag85B_CysD融 合蛋白（l〇mg)或Ag85B(10mg)通過(guò)皮下注射免疫接種C57BL/6小鼠（n= 5)3次。在第一 次注射蛋白質(zhì)疫苗時(shí)，通過(guò)皮下注射5X105CFU的BCG免疫接種小鼠一次。在第三次免疫 接種后四周，用具有每肺□ 100個(gè)有活力的桿菌之感染劑量的氣溶膠結(jié)核分枝桿菌攻擊小 鼠，且4周后在肺（A)和脾（B)中確定細(xì)菌負(fù)荷。數(shù)據(jù)以每器官的平均CFU(土SEM)示出。 用單因素AN0VA以及使用Bonferroni事后檢驗(yàn)完成的多組數(shù)據(jù)集的成對(duì)比較來(lái)評(píng)價(jià)組間 之差異的顯著性。

【具體實(shí)施方式】
[0075] 現(xiàn)將詳細(xì)涉及本發(fā)明的某些實(shí)施方案。雖然本發(fā)明將與這些實(shí)施方案相結(jié)合來(lái)描 述，但是應(yīng)理解目的不在于將本發(fā)明限制于那些實(shí)施方案。相反地，本發(fā)明旨在覆蓋所有替 代方案、修改和等價(jià)方案，其可包括在通過(guò)權(quán)利要求書(shū)所定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0076] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多類(lèi)似或等價(jià)于本文所描述的那些的方法和材料，其 可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。本發(fā)明不以任何方式限制所描述的方法和材料。
[0077] 應(yīng)理解，在本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的和所定義的本發(fā)明延伸至兩個(gè)或更多個(gè)提到的或 者從文字或圖明顯的單個(gè)特征的所有替代組合。所有這些不同的組合構(gòu)成本發(fā)明的多個(gè)替 代方面。
[0078] 本文提到的所有專(zhuān)利和出版物通過(guò)引用以其整體并入。
[0079] 為了說(shuō)明本說(shuō)明書(shū)，沒(méi)有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個(gè)/種或更多個(gè)/種。
[0080] 如本文所述，本發(fā)明人示出硫酸鹽同化途徑（SAP)基因和相關(guān)基因產(chǎn)物是高度免 疫反應(yīng)性的，在這個(gè)意義上，刺激來(lái)自從結(jié)核分枝桿菌感染的具有SAP蛋白之小鼠淋巴結(jié) 的淋巴細(xì)胞提供強(qiáng)Thl應(yīng)答，在感染后持續(xù)長(zhǎng)達(dá)8周。此外，在感染結(jié)核分枝桿菌的人中， 觀察到外周血淋巴細(xì)胞響應(yīng)于SAP蛋白的增殖在程度上大于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌陰性個(gè)體 的細(xì)胞。
[0081] 進(jìn)一步說(shuō)，本發(fā)明人示出可利用SAP基因和蛋白來(lái)誘導(dǎo)抗原特異性保護(hù)性免疫應(yīng) 答。更特別地，本發(fā)明人示出用SAP基因和蛋白的免疫接種對(duì)隨后感染結(jié)核分枝桿菌之小 鼠中的肺和脾提供了保護(hù)，且保護(hù)性效力接近在用BCG免疫接種中觀察到的。
[0082] 此外，本發(fā)明人示出可使用SAP基因和基因產(chǎn)物來(lái)改善通過(guò)BCG免疫接種提供的 保護(hù)免疫，如本說(shuō)明書(shū)所示，所述SAP組分改善了BCG針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)作用， 這在肺組織中最明顯。
[0083] 如本文所討論的，這些發(fā)現(xiàn)是出乎意料的，因?yàn)檎J(rèn)為SAP蛋白為細(xì)胞內(nèi)或膜相關(guān) 蛋白（鑒于其定位）與分泌性蛋白質(zhì)相比應(yīng)當(dāng)不太可能進(jìn)行免疫監(jiān)視。在這點(diǎn)上，令人吃 驚地在這些研究中觀察到免疫活化的量等效于針對(duì)細(xì)胞表面抗原或分泌性抗原Ag85B所 觀察到的量。
[0084]A.定義
[0085] 如本文使用的，除了當(dāng)上下文另有要求外，術(shù)語(yǔ)"包括/包含（comprise)"及該術(shù) 語(yǔ)的變體（比如"comprising"、"comprises"和"comprised"）不旨在排除另外的添加劑、 組分、整數(shù)或步驟。
[0086] 磷酸鹽同化途徑或SAP-般指通過(guò)其分枝桿菌還原硫的途徑，從而獲得用于生物 合成半胱氨酸和下游產(chǎn)物（包括分支硫醇（mycothiol))的底物。更詳細(xì)地說(shuō)，所述途徑包 括從硫酸鹽形成腺苷-5' -磷酰硫酸（APS)，APS還原酶（由CysH編碼）可由其產(chǎn)生亞硫 酸鹽，且亞硫酸鹽還原酶（由SirA編碼）可由其產(chǎn)生硫化物，且用0-乙酰基-L-絲氨酸、 0-乙?；?L-絲氨酸硫化氫解酶（由CysKl編碼）可由其產(chǎn)生半胱氨酸。SAP的關(guān)鍵酶包 括ATP硫酸化酶（腺苷酰轉(zhuǎn)移酶）（由CysD編碼）、GTP酶（由CysN編碼）和APS激酶。 這些酶使得能夠從硫酸鹽形成PAS，且從APS形成3'磷酸腺苷5' -磷酰硫酸（PAPS)。 [0087] SAP組分一般指根據(jù)SAP涉及分枝桿菌中硫還原的蛋白質(zhì)或酶，其的實(shí)例包括由 CysD、CysNC、CysH、SirA、CysE、CysKl基因編碼的那些。
[0088] 硫酸鹽活化復(fù)合物或SAC-般指從CysD基因產(chǎn)物與CysNC基因產(chǎn)物的組合形成 的異源二聚復(fù)合物。所述CysD和CysNC基因作為操縱子一起存在于分枝桿菌中。
[0089]CysD基因一般指編碼ATP硫酸化酶的核酸。所述核酸可具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQID NO:1所示的核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定義的限定的同源性和/或同一性。
[0090]CysD蛋白一般指ATP硫酸化酶。所述蛋白質(zhì)可具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQIDN0 :2所 示的氨基酸序列，或以其他方式具有如本文所定義的限定的同源性和/或同一性。
[0091] CysNC基因一般指編碼GTP酶和APS激酶的核酸。所述核酸可具有實(shí)質(zhì)上如本文 SEQIDN0 :3所示的核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定義的限定的同源性和/或 同一I"生。
[0092]CysNC蛋白一般指GTP酶和APS激酶。所述蛋白質(zhì)可具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQID NO:4所示的氨基酸序列，或以其他方式具有如本文所定義的限定的同源性和/或同一性。
[0093]Ag85B基因一般指這樣的核酸，所述核酸具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQIDN0 :5所示的 核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定義的限定的同源性和/或同一性。
[0094]Ag85B蛋白一般指這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQIDN0:6所 示的氨基酸序列，或以其他方式具有如本文所定義的限定的同源性和/或同一性。
[0095] HspX啟動(dòng)子一般指這樣的核酸,所述核酸具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQIDN0 :7所示的 核苷酸序列，或以其他方式具有如本文所定義的限定的同源性和/或同一性。
[0096] 85BCysD-般指具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQIDN0 :8所示之氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0097]pHspX85BCySD-般指具有實(shí)質(zhì)上如本文SEQIDN0 :9所示之核苷酸序列的核酸。
[0098] B.抗原特異件免疫的誘導(dǎo)
[0099] 如本文所討論以及在實(shí)例中所示例的，本發(fā)明人已經(jīng)示出SAP組分引起抗原特異 性保護(hù)性免疫應(yīng)答。特別地，用SAP組分免疫接種且特別是SAC組分防止稍后感染結(jié)核分 枝桿菌的小鼠中分枝桿菌感染的進(jìn)展。此外，本發(fā)明人示出所述SAP組分可用來(lái)加強(qiáng)來(lái)自 BCG免疫接種的免疫，且所述SAP組分在結(jié)核分枝桿菌感染的個(gè)體中是高度免疫反應(yīng)性的， 表明這些組分對(duì)最小化由感染造成之疾病或病癥的發(fā)生是有用的。因此，本發(fā)明提供了用 于對(duì)分枝桿菌感染進(jìn)行（i)預(yù)防、（ii)治療、和（iii)加強(qiáng)免疫的方法。在這些情形下，本 發(fā)明的方法通過(guò)防止所述感染發(fā)展成相關(guān)疾病或病理狀況或者一旦感染已經(jīng)建立通過(guò)防 止進(jìn)一步發(fā)生疾病或病理狀況使發(fā)生感染的可能性最小化。
[0100] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中提供了用于在個(gè)體中使發(fā)生分枝桿菌感染之可能性最小 化的方法，所述方法包括：
[0101]-對(duì)個(gè)體中之分枝桿菌硫酸鹽同化途徑（SAP)的組分形成免疫應(yīng)答；
[0102] 從而使個(gè)體中發(fā)生分枝桿菌感染的可能性最小化。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體可不具有可檢測(cè)的分枝桿菌感染和/或之前可沒(méi)有針對(duì) 分枝桿菌進(jìn)行免疫。這樣的個(gè)體一般可通過(guò)在本領(lǐng)域中廣泛地使用的Mantoux測(cè)試來(lái)鑒 定。
[0104] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體可以是無(wú)癥狀的或者具有感染的亞臨床癥狀。更通常 地，無(wú)癥狀對(duì)象具有一種或更多種癥狀（例如，發(fā)燒、咳嗽、體重減輕）。桿菌可存在且可培 養(yǎng)，即可生長(zhǎng)在來(lái)自以上體液的培養(yǎng)物中，且個(gè)體可具有放射顯影上的明顯的肺部損害，其 可包括浸潤(rùn)但無(wú)成腔（cavitation)。
[0105] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體可具有感染的明顯癥狀，例如肺的腔損害。桿菌可從痰 和/或其他上述體液的涂片培養(yǎng)，而且以足夠的數(shù)量存在以作為耐酸桿菌在這些流體的涂 片中可檢測(cè)。
[0106] 通常免疫應(yīng)答主要為T(mén)hl應(yīng)答。通過(guò)在疫苗施用后檢測(cè)細(xì)胞增殖來(lái)確定該應(yīng) 答，如通過(guò)3H胸苷整合或使用其中評(píng)估IFN-Y之產(chǎn)生的細(xì)胞測(cè)定（例如流式細(xì)胞術(shù)和/ 或ELISA)測(cè)量。還可通過(guò)檢測(cè)特異性抗體測(cè)量所述免疫應(yīng)答（以1至IX106的范圍、 優(yōu)選IX103、更優(yōu)選地以約IX103至約IX106的范圍以及最優(yōu)選地大于IX106的效價(jià) (titer))〇
[0107] 通過(guò)從現(xiàn)在或先前感染強(qiáng)致病性分枝桿菌的動(dòng)物或人中取出的淋巴細(xì)胞之相關(guān) 細(xì)胞因子（例如IFN-Y)的釋放，或者通過(guò)檢測(cè)這些T細(xì)胞的增殖來(lái)確定體外細(xì)胞應(yīng)答。 通過(guò)添加多肽或免疫原性部分至包含每孔1 X105個(gè)細(xì)胞至3 X105個(gè)細(xì)胞的懸液來(lái)進(jìn)行誘 導(dǎo)。所述細(xì)胞從血液、脾、肝或肺分離，且添加所述多肽或所述多肽的免疫原性部分產(chǎn)生不 大于每ml懸液20yg的濃度，且2至5天進(jìn)行所述刺激。為了監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖，所述細(xì)胞用 放射性標(biāo)記的胸苷脈沖作用，且孵育16-22小時(shí)后通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)所述增殖。陽(yáng)性 應(yīng)答為大于背景加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的應(yīng)答。可通過(guò)ELISA方法確定IFN-y的釋放，其是本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的。陽(yáng)性應(yīng)答為大于背景加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的應(yīng)答。當(dāng)監(jiān)測(cè)對(duì)所述多肽的免疫應(yīng) 答時(shí)，另一些不為IFN-y的細(xì)胞因子可相關(guān)，例如IL-12、TNF-a、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、 TGF-P。用于確定細(xì)胞因子（例如IFN-y)存在的另一種且更靈敏的方法為ELISP0T法， 其中將所述從血液、脾、肝或肺分離的細(xì)胞稀釋至優(yōu)選1至4X106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度并在 所述多肽或所述多肽的免疫原性部分存在下孵育18至22小時(shí)，產(chǎn)生不大于每ml20iig的 濃度。此后，將所述細(xì)胞懸液稀釋至1至2X106/ml并轉(zhuǎn)移至用抗IFN-Y包被的Maxisorp 板，并優(yōu)選地孵育4至16小時(shí)。通過(guò)使用經(jīng)標(biāo)記的二級(jí)抗IFN抗體和產(chǎn)生斑點(diǎn)的相關(guān)底物 來(lái)確定IFN-y產(chǎn)生細(xì)胞，其可使用解剖顯微鏡計(jì)數(shù)。還可能使用PCR技術(shù)來(lái)確定編碼相關(guān) 細(xì)胞因子之mRNA的存在。經(jīng)常利用例如PCR、ELISP0T或ELISA測(cè)量一種或更多種細(xì)胞因 子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解由特定多肽誘導(dǎo)的任何這些細(xì)胞因子量的顯著提高或降低可用 于評(píng)價(jià)所述多肽的免疫活性。
[0108] 為了能夠在個(gè)體中對(duì)組分形成免疫應(yīng)答，可通過(guò)在所述個(gè)體中提供分枝桿菌SAP 的所述組分形成所述免疫應(yīng)答。這些組分可以以如下相關(guān)的副標(biāo)題所討論的多種形式提 供。
[0109] 可皮下遞送或通過(guò)吸入遞送重組BCG和其他活分枝桿菌。還可由技術(shù)人員使用其 專(zhuān)業(yè)知識(shí)確定給藥方案（例如單次施用、重復(fù)施用（以規(guī)律或不規(guī)律間隔兩次或更多次） 等）。這還將通常取決于待治療的疾病以及正接受治療的個(gè)體（例如，在有膀胱癌的人中， 低劑量BCG方案已經(jīng)描述為75mg，而標(biāo)準(zhǔn)劑量為150mg)。然而，已經(jīng)記載了低至lmg的BCG 劑量有效地支持免疫應(yīng)答很長(zhǎng)時(shí)間（5年）。在肺結(jié)核中，典型劑量的實(shí)例低得多：0.075mg， 對(duì)應(yīng)于30-120萬(wàn)活分枝桿菌）。大致地說(shuō)，典型劑量可落至0. 01iig/kg體重至10mg/kg體 重。在肺結(jié)核的治療中，一次治療通常保護(hù)許多年。然而，也考慮給予重復(fù)劑量（如例如通 常在治療膀胱癌中的情況）。
[0110] 當(dāng)疫苗或免疫刺激組合物基于肽時(shí)，施加的方式可廣泛地變化。任何施用疫苗的 常規(guī)方法都是適用的。這包括以含有活性成分的固體形式（例如丸劑、栓劑或膠囊劑）或 者以生理可接受的分散體（例如噴霧劑、散劑或液體）經(jīng)口、經(jīng)鼻或經(jīng)粘膜施加，或者通過(guò) 注射胃腸外（例如皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)）施加或者經(jīng)皮施加。疫苗的劑量將取決于施用的途 徑且將根據(jù)待疫苗接種之人的年齡而變化，且較小的程度上，根據(jù)待疫苗接種之人身材大 小而變化。目前，多數(shù)疫苗通過(guò)針注射肌內(nèi)施用，且這可能繼續(xù)作為標(biāo)準(zhǔn)途徑。然而，已經(jīng) 開(kāi)發(fā)了誘導(dǎo)粘膜免疫的疫苗制劑，其通常通過(guò)經(jīng)口或經(jīng)鼻遞送。最廣泛研究的用于粘膜免 疫誘導(dǎo)的遞送系統(tǒng)之一包含霍亂毒素（CT)或其B亞單位。但在疫苗制劑中施用時(shí)，該蛋白 質(zhì)增強(qiáng)粘膜免疫應(yīng)答并誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生。優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)口或經(jīng)鼻遞送疫苗的簡(jiǎn)便。來(lái)自另一些微 生物物種的經(jīng)修飾的毒素（其已經(jīng)降低了毒性但保留了免疫刺激能力，例如經(jīng)修飾的來(lái)自 革蘭氏陰性細(xì)菌的不耐熱毒素或葡萄球菌腸毒素）也可用來(lái)產(chǎn)生類(lèi)似的作用。這些分子特 別適合經(jīng)粘膜施用。
[0111] 常規(guī)地，疫苗通過(guò)注射胃腸外施用，例如皮下或肌內(nèi)施用。適于施用的其他模式 的另外的制劑包括栓劑，和在一些情況下的經(jīng)口制劑。對(duì)于栓劑，傳統(tǒng)的粘合劑和載劑可 包括例如聚亞燒基乙二醇類(lèi)（polyalkaleneglycols)或甘油三酯類(lèi)；這樣的栓劑可由含 有0. 5%至10%，優(yōu)選1-2%范圍之活性成分的混合物形成。經(jīng)口制劑包括通常使用的 賦形劑，例如藥用級(jí)別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些 組合物采用溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊劑、持續(xù)釋放制劑或散劑的形式，且有利地含有 10% -95% (優(yōu)選25% -70% )的活性成分。
[0112] 當(dāng)疫苗或免疫刺激組合物為病毒載體時(shí)，載劑可以是任何自身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受 所述組合物的患者有害之抗體的物質(zhì)，且其可以以無(wú)過(guò)度毒性地施用。合適的載劑可以是 大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物 和無(wú)活性的病毒顆粒。這樣的載劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？伤幱幂d劑可包括液體，例 如水、鹽水、甘油和乙醇。輔助物質(zhì)（例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等）也可存在于這 樣的載劑中。穩(wěn)定劑（例如海藻糖或允許在環(huán)境溫度下水溶性糖玻璃形成的物質(zhì)）也可存 在。后者包括在懸浮于全氟化碳液體的小球體形式中使用混合可溶玻璃穩(wěn)定技術(shù)。脂質(zhì)體 也是合適的載劑。藥用載劑的徹底討論見(jiàn)Gennaro(2000)，Remington:TheScienceand PracticeofPharmacy. 20thed.，ISBN:0683306472。藥物組合物優(yōu)選為滅菌的。其優(yōu)選 無(wú)熱原的。優(yōu)選緩沖在例如PH6至pH8,通常大約pH7。優(yōu)選地，所述組合物與人等張。本發(fā) 明的組合物可經(jīng)通過(guò)多種不同途徑施用。對(duì)于某些組合物，某些途徑可能是有利的，因?yàn)楫a(chǎn) 生更有效的應(yīng)答，或更低的可能誘導(dǎo)副作用，或更容易地施用。例如，本發(fā)明中利用的組合 物可通過(guò)許多途徑施用，所述途徑包括但不限于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心 室內(nèi)、經(jīng)皮或經(jīng)皮膚施加、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)腸、表面、舌下、陰道內(nèi)或直腸方式。所述組 合物可制備成用于鼻內(nèi)施用，如鼻噴霧劑、滴鼻劑、凝膠劑或粉末，如可注射的液體溶液或 混懸液；也可制備在注射之前適于溶解于或混懸于液體載劑的固體形式。所述組合物的直 接遞送將一般通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)、鼻內(nèi)注射完成，或者遞送至組織的胞間隙。 劑量處理可以是單次劑量方案或多次劑量方案。
[0113]C.確定對(duì)分枝桿菌感染的免疫
[0114] 在另一個(gè)實(shí)施方案中提供了用于確定個(gè)體是否對(duì)分枝桿菌免疫的方法，所述方法 包括：
[0115]-在處于病癥中的個(gè)體中提供分枝桿菌SAP的組分以使得在所述個(gè)體中能夠形成 對(duì)所述組分的免疫應(yīng)答；
[0116] _確定所述個(gè)體是否發(fā)生對(duì)所述組分的保護(hù)性免疫應(yīng)答；
[0117] 其中保護(hù)性免疫應(yīng)答的發(fā)生確定所述個(gè)體對(duì)分枝桿菌免疫；
[0118] 從而確定所述個(gè)體是否對(duì)分枝桿菌免疫。
[0119] 所述方法特別地可用來(lái)確認(rèn)Mantoux測(cè)試或其他常規(guī)分枝桿菌測(cè)試的結(jié)果，或者 以其他方式用于進(jìn)一步描繪Mantoux測(cè)試的結(jié)果，例如來(lái)鑒定特定免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵特異 性或鑒定應(yīng)答所基于之相關(guān)免疫原的性質(zhì)。在之前副標(biāo)題提到的用于檢測(cè)免疫應(yīng)答之形成 的多種測(cè)定可在此執(zhí)行。
[0120] D.疫苗和免疫刺激纟目合物
[0121] 本發(fā)明提供了疫苗和免疫刺激組合物。在某些實(shí)施方案中，所述疫苗和免疫刺激 組合物可用于提供對(duì)分枝桿菌感染（尤其是結(jié)核分枝桿菌感染）的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
[0122] 通常，描述了如下的4種不同形式的疫苗或組合物：
[0123] (i)為非細(xì)胞的且作為用于免疫刺激之活性成分含有的那些，重組或合成的SAP 組分。
[0124] (ii)作為用于免疫刺激的活性成分含有的那些，可對(duì)于SAP組分富集的細(xì)胞提取 物。
[0125] (iii)作為用于免疫刺激的活性成分含有的那些，表達(dá)重組SAP組分的細(xì)胞。
[0126] (iv)含有編碼施用至個(gè)體之SAP組分的核酸的那些，所述核酸表達(dá)以形成用于免 疫刺激的活性成分。
[0127] (V)含有編碼形成用于免疫接種的活性成分之SAP組分的病毒載體的那些。
[0128] 在這些形式的每種中優(yōu)選的免疫原為CysD基因或基因產(chǎn)物，或者其同系物的片 段。
[0129] 這些形式在下面更詳細(xì)地描述。
[0130]D. 1含有重組或合成SAP組分的非細(xì)胞組合物
[0131] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在個(gè)體中提供非細(xì)胞組合物形式的SAP組分形成免疫應(yīng) 答，所述組合物包含分離或重組的SAP蛋白。
[0132] 一般來(lái)說(shuō)，這些組合物包含兩個(gè)關(guān)鍵的組分，第一個(gè)為重組或合成SAP組分形式 的免疫原，且第二個(gè)為用于增強(qiáng)對(duì)免疫原免疫應(yīng)答的佐劑。
[0133] 對(duì)于免疫原，其可包含本文中所述的任何一種或更多種SAP組分。優(yōu)選地，所述免 疫原包含CysD或者免疫原性或抗原性片段或其同系物。片段和同系物在下面更詳細(xì)地描 述。
[0134] 應(yīng)理解，所述免疫原還可包含其他重組或合成的分枝桿菌抗原或免疫原。這些可 以以通過(guò)共價(jià)鍵與CysD融合的形式提供，其中他們與CysD非共價(jià)結(jié)合，或其中他們完全不 與CysD結(jié)合。這些抗原和免疫原的特別實(shí)例包括Ag85B。另一些在W02009/070700中討 論。
[0135]在一個(gè)實(shí)施方案中，給定的SAP組分（例如CysD、CysNC、CysH、SirA、CysE、CysKl 蛋白及其編碼基因）可具有在硫酸鹽同化途徑活性方面保守的功能，但具有趨異序列 (divergedsequence)。將這些蛋白或核酸稱(chēng)為同系物。
[0136] 在某些實(shí)施方案中，給定的SAP組分為與給定的SAP組分具有至少75%、優(yōu)選 80 %、更優(yōu)選85 %、更優(yōu)選90 %、更優(yōu)選95 %、更優(yōu)選98 %或99 %同一性的組分。例如，CysD免疫原可以是與SEQIDNo: 2中所示CysD蛋白具有至少75 %、優(yōu)選80 %、更優(yōu)選85 %、更 優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%，更優(yōu)選98%或99%同一性的免疫原。編碼CysD免疫原的核酸序 列可以是與SEQIDNo:1中所示CysD基因具有至少75%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選 90 %、更優(yōu)選95 %，更優(yōu)選98 %或99 %同一性的序列。
[0137] 通過(guò)常規(guī)方法，通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序的手段確定序列同一性百分比，例 如在Needleman，S.B?和Wunsch，CD.，（1970)JournalofMolecularBiology，48,443-453 中公開(kāi)的GCG程序包（ProgramManualfortheWisconsinpackage，Version8,1994年8 月，GeneticsComputerGroup, 575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)中提 供的GAP，其通過(guò)引用以其整體并入此處。對(duì)于多肽序列比較在以下設(shè)定下使用GAP:3. 0的 空位生成罰分（GAPcreationpenalty)和0.1 的空位延伸罰分（GAPextensionpenalty)。 通過(guò)類(lèi)似的方法使用對(duì)于DNA序列比較之以下設(shè)定的GAP確定多核苷酸分子的序列一致 性：5. 0的空位生成罰分和0. 3的空位延伸罰分。
[0138] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，給定的SAP組分以能夠形成保護(hù)性免疫應(yīng)答之片段的形式 提供。這些片段通常有足夠的長(zhǎng)度和能夠由I類(lèi)或II類(lèi)APC呈遞的構(gòu)象（conformation)。 它們通?？梢允且韵麻L(zhǎng)度范圍：對(duì)于I類(lèi)呈遞約8至15和約8至11，且對(duì)于II類(lèi)呈遞11 至15。
[0139] 為了鑒定在免疫應(yīng)答期間被識(shí)別的相關(guān)T細(xì)胞表位，常用方法是使用用于檢測(cè)II 類(lèi)MHC表位的重疊肽，其優(yōu)選為合成的，具有例如來(lái)自多肽之20個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度。這 些肽可在生物測(cè)定中測(cè)試（例如本文中所述的IFN-y測(cè)定）且給出陽(yáng)性應(yīng)答的那些將 被分類(lèi)為免疫原性T細(xì)胞表位?？赏ㄟ^(guò)預(yù)測(cè)將與I類(lèi)結(jié)合的那些肽來(lái)鑒定I類(lèi)MHC表位 (Stryhn，A.，等1996Eur.J.Immunol. 26 :1911_1918)，且此后合成地產(chǎn)生這些肽并在相關(guān) 生物測(cè)定（例如本文中所述的IFN-y測(cè)定）中測(cè)試它們。
[0140] 所述肽優(yōu)選地具有例如來(lái)自所述多肽之8至11個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度?？赏ㄟ^(guò)例 如Harboe，M.，等1998Infect.Immun. 66 :2 ;717-723中所述的分析B細(xì)胞對(duì)覆蓋目的多肽 之重疊肽的識(shí)別來(lái)確定B細(xì)胞表位。
[0141] 可通過(guò)固相合成或重組DNA技術(shù)來(lái)制造任何CysD、CysNC、CysH、SirA、CysE、CysKl 或相關(guān)核酸的序列。
[0142] 對(duì)于佐劑，有許多本領(lǐng)域已知的佐劑的實(shí)例。還參見(jiàn)Allison(1998,Dev.Biol. Stand.，92 :3_11 ;通過(guò)引用并入本文），Unkeless等（1998，Annu.Rev.Immunol.，6 : 251-281)和Phillips等（1992，Vaccine，10 :151-158)。根據(jù)本發(fā)明可利用的示例性佐劑包 括但不限于細(xì)胞因子、鋁鹽（例如氫氧化鋁、磷酸鋁等；Baylor等，Vaccine，20 :S18, 2002)、 凝膠型佐劑（例如磷酸鈣等）；微生物佐劑（包含CpG基序的免疫調(diào)節(jié)DNA序列；內(nèi)毒素， 例如單憐脂醜脂質(zhì)A(Ribi等，1986，ImmunologyandImmunopharmacologyofbacterial endotoxins，PlenumPubl.Corp.，NY，p407,1986);內(nèi)毒素，例如霍亂毒素、大腸桿菌 (E.coli)不耐熱毒素和百日咳毒素；胞壁酰二肽等）；基于油乳膠和乳化劑的佐劑（例如 弗氏佐劑、MF59[Novartis]、SAF等）；顆粒佐劑（例如脂質(zhì)體、生物可降解的小球體等）； 合成佐劑（例如非離子型嵌段共聚物、胞壁酰肽類(lèi)似物、聚膦腈、合成的多核苷酸等）；和/ 或其組合。另一些示例性的佐劑包括一些聚合物（例如聚膦腈類(lèi)；在美國(guó)專(zhuān)利5, 500, 161 中描述）、Q57、皂苷類(lèi)（例如QS21，Ghochikyan等，Vaccine，24 :2275, 2006)、角鯊烯、四氯 十氧化物&61：四(3111〇1'0(16。3(?1(16)、0?679〇9((]〇(^61'等，\^(^；[116, 22:3136,2004)、聚[二 (羧基苯氧基）磷腈](PCCP;Payne等，Vaccine, 16 :92,1998)、干擾素(Cao等，Vaccine, 10 :238,1992)、嵌段共聚物P1205(CRL1005;Katz等，Vaccine，. 18 :2177, 2000)、白細(xì)胞 介素-2 (IL-2;Mbwuike等，Vaccine，8 :347,1990)、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA;Kreuter 等，]\卩11&1'111.3(^，70:367，1981)、二甲基十八燒基溴化銨（00六）、1(:31(珍（￥&1111〇18861， Vaccine，29 :2100,2011)等。
[0143] 這些化合物還可包含使得能夠施用所述組合物的稀釋劑、賦形劑和載劑，如本領(lǐng) 域已知的。
[0144]D. 2細(xì)胞提取物
[0145] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在個(gè)體中以細(xì)胞提取物的形式提供SAP組分來(lái)形成免 疫應(yīng)答，所述細(xì)胞提取物包含分離或重組的SAP蛋白。
[0146] 可通過(guò)已知技術(shù)獲得細(xì)胞提取物，包括例如分枝桿菌菌株的超聲、通過(guò)離心的沉 淀和收回裂解物用于免疫接種。所述裂解物還可通過(guò)例如免疫親和層析對(duì)SAP組分進(jìn)一步 富集。這最可用于當(dāng)菌株不為SAP組分重組體時(shí)，即當(dāng)所述菌株不為SAP組分的過(guò)表達(dá)子 或SAP組分富集時(shí)。當(dāng)所述菌株為具有高水平表達(dá)的SAP組分的重組菌株時(shí)，則層析富集 步驟可不是必須的。
[0147] 所述細(xì)胞提取物可特別地用作用于測(cè)試免疫接種方案之效力的體外試劑。
[0148]D. 3重組或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞
[0149] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在個(gè)體中以細(xì)胞的形式提供SAP組分來(lái)形成免 疫應(yīng)答，所述細(xì)胞包含分離或重組的SAP蛋白。
[0150] 特別優(yōu)選細(xì)胞為分枝桿菌，且特別為結(jié)核分枝桿菌菌株，尤其是能夠形成活減毒 疫苗的減毒結(jié)核分枝桿菌菌株。本文中使用的"活減毒疫苗"為含有活的或有活力的具有 降低的致病性（減毒）之微生物的疫苗；與失活疫苗相反。
[0151] 另一些類(lèi)型的分枝桿菌包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的成員（在UniProt或NCBI 分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中的分類(lèi)標(biāo)識(shí)符77643)、其包括物種結(jié)核分枝桿菌（人結(jié)核病的主要原 因）、牛分枝桿菌、年分枝桿菌BCG(最經(jīng)常用于疫苗接種目的的菌株）、非洲分枝桿菌 (M.africanum)、田鼠分枝桿菌（M.microti)、卡內(nèi)蒂分枝桿菌（M.canetti)和海豹分枝桿 菌（M.pinnipedii)〇
[0152] 優(yōu)選地，所述細(xì)胞為BCG菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到存在數(shù)種合適的BCG菌 株，其適合用在本發(fā)明的實(shí)踐中，包括但不限于以下指定atcck號(hào)的那些：
[0153] 27289 牛分枝桿菌（Mycobacteriumbovis)BCG，Chicagol[B;BCGT;tice]
[0154] 27291牛分枝桿菌
[0155] 35731 牛分枝桿菌TMC1002[BCGBirkhaug]
[0156] 35732 牛分枝桿菌TMC1009[BCGSwedish]
[0157] 35735 牛分枝桿菌TMC1012[BCGMontreal;CIP105920]
[0158] 35736 牛分枝桿菌TMC1013[BCGBrazilian]
[0159]35737 牛分枝桿菌TMC1019[BCGJapanese]
[0160] 35738牛分枝桿菌TMC1020[BCGMexican]
[0161] 35739 牛分枝桿菌TMCl〇2l[BCGAustralian]
[0162] 35741 牛分枝桿菌[BCGGlaxo]
[0163] 35742牛分枝桿菌TMC1025[BCGPrague]
[0164] 35744TMC1029[BCGPhipps]
[0165] 35745 牛分枝桿菌 TMC 1030[BCGConnaught]
[0166] 35746牛分枝桿菌 TMC 1101[BCGMontreal，SM-R]
[0167] 35747 牛分枝桿菌TMC1103[BCGMontreal，INH-R;CIP105919]
[0168] 35748牛分枝桿菌TMC1108[BCGPasteurSM-R]
[0169] 27290牛分枝桿菌[BCGCopenhagenH]
[0170] 19274牛分枝桿菌，其以zrculosis亞種牛50[BCG]保藏
[0171] 19015分枝桿菌屬d<i的牛分枝桿菌Karlson和LesselBCG
[0172] 35733 牛分枝桿菌 TMC 1010[BCGDanish，SSI1331]和
[0173] 35734 牛分枝桿菌 TMC 1011[BCGPasteur]等。
[0174] 應(yīng)理解本發(fā)明的重組分枝桿菌不一定限于BCG菌株。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到也 可使用其他分枝桿菌菌株，其實(shí)例包括但不限于：結(jié)核分枝桿菌CDC1551菌株（參見(jiàn)，例如 Griffith等，Am.J.Respir.Crit.CareMed. 8 月；152(2) :808;1995)、結(jié)核分枝桿菌北京菌 株卜&115〇〇111^611等，了0111]\^。1'〇1^〇1.12月 ：33(12):3234-8，1995)、11371^菌株（八丁0：#: 25618)、結(jié)核分枝桿菌泛酸鹽營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（Sambandamurthy等，見(jiàn)上文）；結(jié)核分枝桿 菌rpoV突變體菌株（Collins等，ProcNatlAcadSciUSA. 92(17) :8036;1995)、結(jié)核分 枝桿菌亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（Hondalus等，Infect.Immun. 68(5) :2888 ;2000)等，或者其 他來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的減毒和/或重組菌株。其他候選細(xì)菌包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的其 他成員、其他分枝桿菌（例如非洲分枝桿菌或鳥(niǎo)分枝桿菌（M.avium)復(fù)合細(xì)菌）、或者其他 分枝桿菌物種。
[0175] 在本發(fā)明的這種形式中，SAP組分可過(guò)表達(dá)，即蛋白質(zhì)可以以超過(guò)合適對(duì)照生物體 (例如同樣的沒(méi)有進(jìn)行遺傳改造的分枝桿菌）之水平的水平表達(dá)以過(guò)表達(dá)所述SAP組分。 本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉蛋白質(zhì)活性的比較測(cè)量，以及對(duì)這種測(cè)量使用的合適標(biāo)準(zhǔn)物和對(duì) 照。
[0176] 可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適方法進(jìn)行SAP組分的過(guò)表達(dá)。通常，所述方法將包 括將編碼SAP組分的核酸序列與特定啟動(dòng)子或其他調(diào)控元件相連，當(dāng)將菌株引入細(xì)胞（尤 其是APC)時(shí)所述調(diào)控元件被激活。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多這樣的表達(dá)控制序列是 已知的，且將適合用于本發(fā)明。例如，如果希望SAP組分的組成型表達(dá)，則表達(dá)控制序列（例 如啟動(dòng)子和相關(guān)序列）包括但不限于：分枝桿菌最佳啟動(dòng)子（mop,George等，1995);blaF 啟動(dòng)子（Timm等，1994) ;hsp60、ace或mspl2啟動(dòng)子；等，具有或沒(méi)有優(yōu)化的核糖體結(jié)合位 點(diǎn)。
[0177] 作為替代地，SAP的過(guò)表達(dá)可以不是組成型的，但可替代地是可響應(yīng)于環(huán)境信 號(hào)而誘導(dǎo)的。例如，所述蛋白質(zhì)的表達(dá)可通過(guò)在特定位置誘導(dǎo)的或響應(yīng)于環(huán)境刺激的 啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)，其實(shí)例包括但不限于：巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的啟動(dòng)子（其驅(qū)動(dòng)在巨噬細(xì)胞吞 噬體內(nèi)特異性上調(diào)之基因的表達(dá)，參見(jiàn)Schannapinger等JEM2003);乙酰胺酶啟動(dòng)子 (Mahenthiralingam等，J.Gen.Microbiol. 1993)和四環(huán)素可誘導(dǎo)的（Blokpoel等，Nucl.AcidsRes. 33(2) :e22, 2005)等。
[0178] 此外，可利用來(lái)自其他物種的啟動(dòng)子，其實(shí)例包括但不限于：多種病毒啟動(dòng)子，由 此在"基因治療樣"策略（例如分枝桿菌和經(jīng)改造病毒的共接種）后，Mtb抗原在由共施用 病毒感染的經(jīng)選擇的組織中表達(dá)；等。
[0179] 作為另一個(gè)替代方案，天然或自然存在的SAP啟動(dòng)子可通過(guò)突變改變以引起SAP 組分的過(guò)表達(dá)。
[0180] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多途徑可用來(lái)將與一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制序列可操 作地相連接的編碼SAP組分的核酸序列引入其中將發(fā)生過(guò)表達(dá)的分枝桿菌宿主中。例如， 可將序列包含在載體中，接下來(lái)將所述載體引入分枝桿菌。許多適用于包含并表達(dá)基因的 載體是已知的，且包括但不限于多種染色體外元件，例如質(zhì)粒，例如包含PAL500復(fù)制初始 點(diǎn)的那些，進(jìn)行修飾以提高其拷貝數(shù)量；或其他具有會(huì)或?qū)?huì)開(kāi)發(fā)之復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒； 或者不復(fù)制或不整合入分枝桿菌基因組但為發(fā)生同源重組提供自殺源（suicidalsource) 的染色體外元件；等。將這樣的載體引入分枝桿菌可通過(guò)任何許多適用于所述特定載體的 已知方法進(jìn)行，包括但不限于電穿孔和用于同源重組的分枝桿菌噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體為質(zhì)粒且所使用的方法為電穿孔。
[0181] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，SAP組分從結(jié)核分枝桿菌染色體過(guò)表達(dá)。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到存在多種分子生物學(xué)策略來(lái)產(chǎn)生具有此性質(zhì)的分枝桿菌。例如，可將多 種突變引入染色體（隨機(jī)或以定向的方式）從而導(dǎo)致細(xì)菌大量產(chǎn)生SAP組分。作為替代 地，可將包含一個(gè)或更多個(gè)與編碼所述SAP組分的核酸序列可操作地相連接之表達(dá)控制序 列的核酸序列引入細(xì)菌染色體，例如通過(guò)用有或無(wú)反向選擇手段之自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)以提供用 于同源重組的序列。
[0182] 在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了表達(dá)載體，所述載體包含：
[0183] _編碼分枝桿菌抗原以提供對(duì)于分枝桿菌感染之抗原特異性免疫應(yīng)答的核酸；
[0184] _當(dāng)將菌株引入APC后與所述核酸可操作地連接來(lái)表達(dá)所述核酸的啟動(dòng)子，所述 啟動(dòng)子具有當(dāng)將所述啟動(dòng)子引入APC后引起立即和持續(xù)分枝桿菌抗原表達(dá)之分枝桿菌啟 動(dòng)子的序列。
[0185] 在上述實(shí)施方案中，分枝桿菌HspX啟動(dòng)子是用作具有引起分枝桿菌ATP非依賴(lài) 性分子伴侶的表達(dá)之分枝桿菌啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)子的優(yōu)選啟動(dòng)子。特別地，如本文實(shí)施例 2所示例，該啟動(dòng)子能夠在BCG菌株中誘導(dǎo)高且持續(xù)的SAP組分表達(dá)。可用于本發(fā)明的啟 動(dòng)子的另一些實(shí)例包括如Fontan等2008Infect. &Immun. 76:pp717中描述的Rv0962c、 Rv0971c、Rv0983、Rv0986、Rv2428、Rvll30、Rv2626c。
[0186] 在此副標(biāo)題下的疫苗制劑涉及研究以確定最大細(xì)菌生存力和在整個(gè)制造過(guò)程中 的穩(wěn)定性。這包括在利用多種通常使用的培養(yǎng)基培養(yǎng)分枝桿菌的培養(yǎng)期間確定最大生物體 生存力（活的至死的），所述培養(yǎng)包括添加甘油、糖類(lèi)、氨基酸和去污劑或鹽。在通過(guò)離心或 切向流過(guò)濾收獲培養(yǎng)物細(xì)胞之后，將所述細(xì)胞重懸在允許在冷凍或冷凍干燥過(guò)程期間保護(hù) 細(xì)胞的穩(wěn)定化介質(zhì)中。通常使用的穩(wěn)定劑包括谷氨酸鈉、氨基酸或氨基酸衍生物、甘油、糖 類(lèi)或通常使用的鹽。最終的制劑將提供具有足以維持穩(wěn)定性的足夠有活力的將通過(guò)皮內(nèi)、 經(jīng)皮注射、灌注或經(jīng)口遞送的生物體以及用于分發(fā)和使用足夠的保質(zhì)期（shelflife)。
[0187] 在作為疫苗向人施用之前，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)試在本副標(biāo)題下的 BCG菌株。例如，在合適的動(dòng)物模型中（例如小鼠、豚鼠等中，其中一些是免疫受損的）進(jìn)行 毒性、致病性、安全性等的測(cè)試。同樣通常在合適的動(dòng)物模型（例如小鼠、豚鼠等）中測(cè)試 疫苗制劑引起免疫應(yīng)答的能力。此外，可使用合適的動(dòng)物模型（例如小鼠、豚鼠和非人靈長(zhǎng) 類(lèi)）進(jìn)行涉及疫苗接種、加強(qiáng)和接著用活Mtb攻擊的保護(hù)研究。最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉 為了測(cè)試所述疫苗制劑的效力而在同意的人中進(jìn)行臨床試驗(yàn)的安排。細(xì)節(jié)參見(jiàn)例如2006 年6月8日公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20060121054(Sun等），以及本文中引用的參考文獻(xiàn)。
[0188] D. 4核酸疫苗
[0189] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在個(gè)體中以編碼SAP蛋白的核酸的形式提供SAP組分 來(lái)形成免疫應(yīng)答。
[0190] 特別地，如實(shí)施例1所示例，本發(fā)明人已經(jīng)示出可通過(guò)在用結(jié)核分枝桿菌攻擊的 小鼠中施用含有編碼CysD之基因的DNA疫苗提供保護(hù)性免疫。
[0191] 可以以線(xiàn)性或環(huán)狀形式提供核酸用于注射。一般來(lái)說(shuō)，所述核酸將具有能夠使得 SAP組分在相關(guān)細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)向肌肉組織施用時(shí)，載體將含有能夠由肌肉 轉(zhuǎn)錄因子和增強(qiáng)子活化的啟動(dòng)子。在這些實(shí)施方案中，一般理解肌肉細(xì)胞將產(chǎn)生相應(yīng)的SAP 組分，其然后將被APC(例如樹(shù)突細(xì)胞）吞噬來(lái)呈遞至T細(xì)胞，在其上建立免疫。
[0192] D. 5病毒載體
[0193] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)以病毒載體的形式提供SAP的組分來(lái)形成免疫應(yīng)答， 所述病毒載體含有編碼所述組分或表達(dá)所述SAP的組分的核酸。
[0194] 合適載體的實(shí)例包括基于牛痘基因組的那些和基于腺病毒基因組的那些。
[0195] 在以上副標(biāo)題下描述的一些組合物可配制為液體溶液或混懸液，然而也考慮固體 形式，例如片劑、丸劑、散劑等。在施用前也可制備適用于溶解于液體或懸浮于液體的固體 形式。還可乳化制劑?；钚猿煞挚膳c可藥用的并與所述活性成分相容的賦形劑混合。合適 的賦形劑為例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，或其組合。此外，所述組合物可含有少量的 輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖劑等。如果期望施用所述組合物的經(jīng)口形式，則可 添加多種增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑等。本發(fā)明的組合物可含有任 何這些另外的成分以提供適于施用之形式的所述組合物。
[0196] 應(yīng)理解，在本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的和所定義的本發(fā)明延伸至兩個(gè)或更多個(gè)提到的或 者從文字或圖明顯的單個(gè)特征的所有替代組合。所有這些不同的組合構(gòu)成本發(fā)明的多個(gè)替 代方面。 實(shí)施例
[0197] 實(shí)施例1
[0198] 結(jié)核分枝桿菌可在廣譜環(huán)境中存活，包括高水平的氧化應(yīng)激、低pH和營(yíng)養(yǎng)剝 奪（(Nathan，2000#29)。在感染期間結(jié)核分枝桿菌對(duì)這些條件的暴露和適應(yīng)需要基因表 達(dá)的協(xié)同調(diào)節(jié)（(Timm，2003#93)。涉及硫代謝的基因已經(jīng)一致地鑒定為在模擬巨噬細(xì)胞 環(huán)境的條件中（（Pinto, 2〇04#14 ;，#35;Muttucumaru，2〇04#34 ;Manganelli，2〇〇2#75 ; Hampshire，2004#33;Betts，2002#49)和巨噬細(xì)胞感染期間（（Schnappinger，2003#31)上 調(diào)。這些基因編碼結(jié)核分枝桿菌之硫酸鹽同化途徑（SAP)的酶，所述酶是硫的還原所需的。 實(shí)際上，含有硫的化合物是廣泛生物活性的基礎(chǔ)。在其還原的形式中，硫用在氨基酸半胱氨 酸的生物合成，半胱氨酸是在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中由結(jié)核分枝桿菌遇到（encounter)的反應(yīng)性氮 中間體的主要靶標(biāo)之一（(Rhee，2005#92)。半胱氨酸接下來(lái)可整合入分支硫醇，其與谷胱 甘肽起類(lèi)似的作用（(Fan，2009#197)且在遇到由宿主細(xì)胞釋放的自由基時(shí)對(duì)肉芽腫內(nèi)結(jié) 核分枝桿菌調(diào)節(jié)氧化還原平衡是至關(guān)重要的。其中已經(jīng)去掉了分支硫醇生物合成的恥垢 分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis)的突變體展示出對(duì)異煙肼的高水平抗性且相比野 生型菌株對(duì)氧化應(yīng)激和抗生素更易感（(Rawat，2002#82 ;Buchmeier，2003#85)。因此，該結(jié) 核分枝桿菌的第一道防線(xiàn)與半胱氨酸的利用率相聯(lián)系，且因此已經(jīng)示出為生物體存活所需 的（（Sareen，2003#84;Buchmeier，2006#83 ;Newton，2002#81)。增強(qiáng)這樣對(duì)于在巨噬細(xì)胞 環(huán)境中半胱氨酸提高的需要是ATP硫酸化酶的上調(diào)，ATP硫酸化酶是當(dāng)暴露于氧化應(yīng)激時(shí) 在SAP中的第一個(gè)酶（(Pinto,2004#14 ;，#35 ;Schnappinger，2003#31)。半胱氨酸生物 合成能力的失去減弱了小鼠中感染的慢性階段期間細(xì)菌的致病性和持久性（(Senaratne， 2006#3)〇
[0199] 雖然SAP的成員似乎在推定于宿主內(nèi)遇到的條件下高度表達(dá)，但是如果這些蛋白 質(zhì)構(gòu)成結(jié)核分枝桿菌的免疫原性組分，則所述表達(dá)是不知道的。多數(shù)焦點(diǎn)已經(jīng)在分枝桿菌 的分泌性蛋白質(zhì)上了，因?yàn)轭A(yù)測(cè)這些將被早期宿主免疫應(yīng)答所識(shí)別（(Andersen，1992#202 ; Roberts，1995#203)。硫還原發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)且由于這個(gè)原因SAP酶為胞內(nèi)或膜結(jié)合組分 ((deSouza，2011#206 ;Bhave，2007#205 ;Schelle，2006#204)且將在篩選結(jié)核分枝桿菌的 免疫原性分泌抗原中不被檢測(cè)（(Andersen，1992#202)。在本報(bào)道中，我們證明了SAP的成 員是結(jié)核分枝桿菌的高度免疫原性組分，通過(guò)結(jié)核分枝桿菌感染的個(gè)體識(shí)別且賦予TB的 鼠類(lèi)模型保護(hù)性免疫。我們的結(jié)果表明SAP成員是包含入新TB疫苗的潛在候選。
[0200] 材料和方法
[0201] 細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件
[0202] 大腸桿菌（Escherichiacoli)K-12 和BL21 (DE3)培養(yǎng)于Luria-Bertani(LB) 培養(yǎng)液或瓊脂（Sigma-Aldrich)中。結(jié)核分枝桿菌H37Rv或菌株MT103 ((Jackson， 1999#208)培養(yǎng)于補(bǔ)充有0.5%甘油、0.05%Tween80和10%白蛋白-葡萄糖-過(guò)氧化 氧酶（albumin-dextrose-catalase，ADC)的Middlebrook7H9 培養(yǎng)基（Difco實(shí)驗(yàn)室） 或補(bǔ)充有油酸-ADC的Middlebrook7H11培養(yǎng)基（Difco實(shí)驗(yàn)室）中。在37°C下，所有培 養(yǎng)物在有或沒(méi)有振蕩下培養(yǎng)。當(dāng)需要時(shí)，以25yg/mL卡那霉素和100yg/mL氨芐青霉素 向培養(yǎng)基添加抗生素。使用（(Bryk，2008#36)的方法通過(guò)每日添加50iiM的一氧化氮供 體化合物2,2' -(輕基亞硝基亞肼基）雙-乙亞胺（2,2' -(Hydroxynitrosohydrazono) bis-ethanimine) (DETA-N0) (Sigma)達(dá)到體外生長(zhǎng)結(jié)核分枝桿菌的非復(fù)制持久性。在第 0、1、3和7天確定這些培養(yǎng)物的細(xì)菌計(jì)數(shù)，且在第7天，從兩種培養(yǎng)基中提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí) (RT)PCR分析。
[0203] 蛋白質(zhì)抗原和DNA疫苗
[0204] 從NIH生物防御和新興傳染病研究資源庫(kù)（BiodefenseandEmerging InfectionsResearchResourcesRepository)獲得培養(yǎng)物濾液蛋白質(zhì)（Culture Filtrateprotein，CFP)(NR_14825)。從Sigma-Aldrich購(gòu)買(mǎi)ConcavalinA(ConA)。在附 表1中描述了SAP蛋白抗原的純化和編碼SAP基因之DNA載體的構(gòu)建。
[0205] 巨噬細(xì)胞感染和實(shí)時(shí)PCR
[0206]RAW264. 7小鼠巨噬細(xì)胞系于37°C下在5%C02中于補(bǔ)充有10%胎牛血清（FCS; Gibco-BRL)和 2mML-谷氨酰胺（Invitrogen)的RPMI(Gibco-BRL)(完全RPMI)中培養(yǎng)。 用結(jié)核分枝桿菌以1 :1的感染復(fù)數(shù)感染貼壁RAW264. 7細(xì)胞。感染后4小時(shí)，用磷酸鹽緩沖 鹽水（PBS)洗滌巨噬細(xì)胞單層，將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中另外孵育48小時(shí)且提取總RNA用于 RTPCR分析。
[0207] 將來(lái)自培養(yǎng)液培養(yǎng)物或結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌沉淀重懸 在TRI試劑（Invitrogen)中，并用BioSpecProductsBeadBeater中的 0? 1-mm氧化锫 /二氧化硅珠中斷。提取RNA，用TURBODNA酶（Ambion)處理并將其如先前描述的重懸于 DPEC處理的水（Invitrogen) ((Muttucumaru，2004#34)中。通過(guò)使用SuperscriptIII反 轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen)由 1ug的總RNA合成cDNA。使用L的cDNA、SYBRgreenIPCR MasterMix(Qiagen)和5iiM的基因特異性引物對(duì)（附表1)在25iiL的反應(yīng)體積中進(jìn)行 定量RT-PCR。PCR反應(yīng)在Rotogene6000系列序列檢測(cè)器（Corbettresearch)上以每引 物對(duì)一式三份地運(yùn)行。使用Livak和Schmittgen((Livak，2001#99)的比較閾值循環(huán)方法 (comparativethresholdcyclemethod)，并使用非誘導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌 16SrRNA(由rrS 編碼）作為對(duì)照（(Banaiee，2006#101)確定相對(duì)表達(dá)水平。
[0208] 人研究
[0209]對(duì)象：從RoyalPrinceAlfredHospital，MissendenRd，NSW，Australia的TB 門(mén)診部招募15個(gè)結(jié)核分枝桿菌感染的HIV陰性患者。從活組織檢查或培養(yǎng)證實(shí)的不同年 齡和性別已經(jīng)開(kāi)始或還未開(kāi)始抗TN治療的患者獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralblood monocuclearcell，PBMC)。悉尼西南地區(qū)健康服務(wù)部門(mén)（SydneySouthWestAreaHealth. Service)給予了本研究的倫理許可（協(xié)議號(hào)：X06-0248)?；颊吲c11個(gè)健康結(jié)核菌素皮膚 測(cè)試陰性（TST-ve)個(gè)體比較。
[0210] T細(xì)胞增殖測(cè)定：來(lái)自全血的PBMC在Ficoll梯度（Histopaque-1077,Sigma Aldrich)上分離。在 37°C下 5%C02 中在有 10iig/mL的SAP蛋白、10iig/mL的CFP、Ag-85B 或3iig/mL的ConA存在下孵育每孔2. 5X105個(gè)細(xì)胞的PBMC5天。通過(guò)3H胸苷并入（MP Biomedicals，1uCi/孔）在第 5天使用液體閃爍光譜（MicrobetaLuminescenceCounter， Wallace)測(cè)定T細(xì)胞增殖。使用以下的方程計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（stimulationindex, SI):抗原存在下的平均每分鐘計(jì)數(shù)（countsperminute,cpm)/抗原不存在下的平均cpm。 認(rèn)為大于或等于3的SI為對(duì)抗原的陽(yáng)性應(yīng)答。鼠類(lèi)研究
[0211] 從動(dòng)物資源中心（Perth，Australia)獲得6至8周大的雌性C57BL/6小鼠并將其 維持在無(wú)特定病原體條件下。為確定免疫原性，通過(guò)鼻內(nèi)（i.n)途徑用5X104菌落形成單 位（CFU)的結(jié)核分枝桿菌Mtl03感染小鼠（4只/組）。在感染后3和8周，從完全RPMI培 養(yǎng)基中經(jīng)免疫小鼠的縱膈淋巴結(jié)（mediastinallymphnode,MLN)制備單細(xì)胞懸液，且通過(guò) 先前描述的ELISpot((Palendira，2002#210)使用SAP酶、CFP和濃度為 10iig/ml的Ag85B 以及以3yg/ml使用的ConA確定干擾素（IFN) -Y產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量。為了分析保護(hù)性效力， 用5X105CFU的牛分枝桿菌BCG皮下（s.c)免疫小鼠（5/組）一次，或以2周間隔用10iig 與二甲基雙十八烷基溴化銨〇)DA) (1. 25mg/ml)和單磷脂酰脂質(zhì)A(MPL) (125iig/ml)共施 用的CysDNC蛋白皮下免疫三次，或用每次注射lOOiig的DNA疫苗肌內(nèi)（i.m)免疫。在最 后的疫苗接種后8周，使用吸入暴露裝置（Glas-Col)以每肺□ 100個(gè)有活力的桿菌之感染 劑量的氣溶膠結(jié)核分枝桿菌Mtl03攻擊小鼠。在攻擊后4周通過(guò)平板接種（plate)肺和脾 的勻漿確定細(xì)菌負(fù)荷。
[0212] 統(tǒng)計(jì)分析
[0213] 為評(píng)估保護(hù)性效力，通過(guò)單因素AN0VA以及使用Bonferroni事后檢驗(yàn)完成的多 組數(shù)據(jù)集的成對(duì)比較來(lái)評(píng)價(jià)差異的顯著性。為評(píng)估由經(jīng)感染小鼠之SAP酶誘導(dǎo)的宿主免 疫應(yīng)答或者為將結(jié)核分枝桿菌感染的個(gè)體與未感染的小鼠或TST-ve個(gè)體分別比較，使用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)（*P< 0? 05)。
[0214] 結(jié)果
[0215] 在與有效抗原特異免疫相關(guān)之細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中結(jié)核分枝桿菌ATP硫酸化酶mRNA的 誘導(dǎo)。
[0216] 由CysDNC操縱子編碼的結(jié)核分枝桿菌的硫酸鹽活化復(fù)合物（SAC)是SAP的第一 步（補(bǔ)充圖1)并構(gòu)成3種催化活性，ATP硫酸化酶、GTP酶和APS激酶活性（圖1A)。結(jié)核 分枝桿菌SAC上調(diào)其在模擬細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激之培養(yǎng)條件下的表達(dá)（(Pinto, 2004#14)表明其表 達(dá)也可在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中誘導(dǎo)。為對(duì)其測(cè)試，我們檢查了結(jié)核分枝桿菌感染期間在RAW264. 7 細(xì)胞內(nèi)CysDNCmRNA水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)CysDNC的表達(dá)被顯著增強(qiáng)了，顯示出在首個(gè)48 小時(shí)期間于培養(yǎng)液培養(yǎng)的桿菌中發(fā)現(xiàn)的水平上4. 4倍的提高（圖1B)。為了模擬潛伏感染 期間遇到的條件，我們還確定了CysDNC的表達(dá)是否在非復(fù)制細(xì)菌中被誘導(dǎo)。使用一氧化氮 供體DETA-N0 ((Bryk，2008#156)，相比未處理的細(xì)菌我們能夠抑制結(jié)核分枝桿菌體外復(fù)制 (圖1C)。在非復(fù)制持續(xù)性的條件下，結(jié)核分枝桿菌CysDNC被高度上調(diào)，且證明了相比活躍 生長(zhǎng)的分枝桿菌基因表達(dá)35倍的提高（圖1D)。這意味著CysDNC可參與結(jié)核分枝桿菌適 應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中遇到的多種應(yīng)激并發(fā)展為潛伏狀態(tài)的能力。
[0217] 由于在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和非復(fù)制細(xì)菌中CysDNC以高水平誘導(dǎo)，因此我們推測(cè)在結(jié)核 分枝桿菌感染期間所述酶可由免疫應(yīng)答識(shí)別。為對(duì)其測(cè)試，我們用結(jié)核分枝桿菌鼻內(nèi)感染 小鼠并在縱膈淋巴結(jié)（MLN)中檢查IFN-y分泌性細(xì)胞的頻率。在感染后三周時(shí)，用CysDNC 離體刺激MLN細(xì)胞導(dǎo)致IFN-y分泌性細(xì)胞的強(qiáng)誘導(dǎo)，其類(lèi)似于通過(guò)結(jié)核分枝桿菌之免疫顯 性分析Ag85B蛋白所誘導(dǎo)的水平（圖2A)。感染后該強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答維持長(zhǎng)達(dá)8周（圖2B)。 在肺中觀察到響應(yīng)于CysDNC和Ag85B之抗原特異性IFN-Y分泌性細(xì)胞應(yīng)答的類(lèi)似模式 (數(shù)據(jù)未示出）。此外，人PBMC的淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定揭示在人結(jié)核分枝桿菌感染期間識(shí)別 了CysDNC(圖2C)。CysDNC應(yīng)答類(lèi)似于當(dāng)對(duì)Ag85B回憶后的應(yīng)答但低于由CFP誘導(dǎo)的應(yīng)答。 然而，相比TST-ve個(gè)體，CysDNC顯著誘導(dǎo)了來(lái)自TB患者之PBMC的增殖（圖2C)。這些結(jié) 果表明編碼ATP硫酸化酶的結(jié)核分枝桿菌CysDNC是有效的結(jié)核分枝桿菌免疫刺激抗原。
[0218] 在用編碼ATP硫酸化酶的DNA疫苗接種后針對(duì)致病性結(jié)核分枝桿菌攻擊的保護(hù)免 疫。
[0219]在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境（圖1B)、在我們的非復(fù)制持續(xù)性模型（圖1C)中編碼ATP硫酸化酶 之基因的增強(qiáng)表達(dá)以及該蛋白復(fù)合物誘導(dǎo)離體穩(wěn)?。╮obust)抗原特異性Thl型細(xì)胞因子 應(yīng)答的能力（圖2)可使得編碼的產(chǎn)物對(duì)于抗分枝桿菌保護(hù)變異性有效靶向。為對(duì)其確定， 用表達(dá)cysD和/或cysNC的DNA載體免疫小鼠，并用結(jié)核分枝桿菌氣溶膠攻擊小鼠。用表 達(dá)cysD或cysNC的所有載體免疫接種導(dǎo)致在肺（圖3A)和脾（圖3B)二者中相比用對(duì)照 載體疫苗接種小鼠顯著降低的細(xì)菌負(fù)荷（P< 〇. 01)。在所有實(shí)驗(yàn)中，在肺中DNA-cysD比DNA-cysNC提供更好之保護(hù)性效力的提高趨勢(shì)，而使用DNA-cysD和DNA-cysNC的組合等于 僅用DNA-cysD可見(jiàn)的保護(hù)。當(dāng)用這兩種質(zhì)粒的組合免疫小鼠時(shí)，在脾中的保護(hù)性效力顯著 更大，且該保護(hù)接近用BCG達(dá)到的水平（圖3B)。因此，ATP硫酸化酶是結(jié)核分枝桿菌的高 度保護(hù)性組分。
[0220] 結(jié)核分枝桿菌硫酸鹽同化途徑（SAP)的下游酶是結(jié)核分枝桿菌的免疫原組分。
[0221] 用結(jié)核分枝桿菌ATP硫酸化酶（CysDNC)獲得的滿(mǎn)意效果引導(dǎo)我們懷疑SAP的其 他成員是否為宿主免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)測(cè)試的所有SAP蛋白都在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中被顯 著上調(diào)，且CysKlmRNA顯示出大約6. 7倍的最高誘導(dǎo)（圖4A)。SirA和CysH的誘導(dǎo)水平 類(lèi)似，而CysKl和CysE還顯示出細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的類(lèi)似水平。這與SirA和CysH位于結(jié)核分枝 桿菌基因組的相同操縱子內(nèi)（(Cole，1998#225)而CysKl和CysE在基因組中臨近（(Cole， 1998#225 ;Schnell，2007#87)的事實(shí)相一致。我們還確定了在結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠中 這些蛋白質(zhì)被識(shí)別，因?yàn)樵诟腥竞?周所有蛋白質(zhì)都誘導(dǎo)了IFN-Y分泌性T細(xì)胞（圖4B)。 如CysDNC(圖2C)，在人PBMC的淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定揭示了在人結(jié)核分枝桿菌感染期間所有 研究的SAP酶都被識(shí)別（圖4C)。
[0222] 由于體內(nèi)上調(diào)了所有SAP酶的表達(dá)且在小鼠和人中識(shí)別了蛋白質(zhì)，因此我們?cè)u(píng)估 它們是否可以改善由DNA-CysDNC提供的保護(hù)性效力。當(dāng)用DNA-CysDNC與編碼cysH、sirA、 cysKl和cysE的DNA-起疫苗接種小鼠時(shí)，我們沒(méi)有觀察到在肺（圖5A)或脾（圖5B)二 者中相比僅用DNA-CysDNC保護(hù)性效力的提高。因此，雖然在結(jié)核分枝桿菌感染的人和小鼠 中通過(guò)免疫應(yīng)答識(shí)別了所有SAP成員，但是在本文中使用的小鼠模型中僅用CysDNC可提供 最大的保護(hù)性效力。
[0223] 用ATP硫酸化酶加強(qiáng)BCG疫苗接種的小鼠改善由肺中BCG提供的針對(duì)結(jié)核分枝桿 菌之攻擊的保護(hù)。
[0224] 考慮到由TB患者CATP硫酸化酶的強(qiáng)識(shí)別以及其在小鼠中的保護(hù)性作用，我們確 定了當(dāng)結(jié)核分枝桿菌攻擊時(shí)該蛋白質(zhì)復(fù)合物是否可以是用來(lái)加強(qiáng)BCG保護(hù)性作用的合適 候選物。在低劑量下，結(jié)核分枝桿菌的氣溶膠遞送之后，首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠（naivemice) 示出了檢測(cè)到在肺中大量的細(xì)菌生長(zhǎng)以及向脾的傳播（圖6A和6B)。相反地，僅用BCG的 免疫接種導(dǎo)致針對(duì)結(jié)核分枝桿菌攻擊的顯著保護(hù)，具有在肺和脾中結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷大 約1. 5-log1Q的降低（圖6A，6B)。用CysDNC蛋白的加強(qiáng)導(dǎo)致相比僅用BCG的疫苗接種之 0.5-log1(lM的進(jìn)一步顯著降低（圖6A)。雖然在加強(qiáng)的脾中降低了細(xì)菌負(fù)荷（bacterial burden)，然而該差異沒(méi)有達(dá)到顯著性（圖6B)。因此，CysDNC能夠改善針對(duì)結(jié)核分枝桿菌 感染之BCG的保護(hù)性作用，其在肺中最明顯。
[0225] 討論
[0226] 宿主免疫新靶標(biāo)的鑒定將明顯地幫助開(kāi)發(fā)更有效TB疫苗的努力。在本報(bào)道中， 我們鑒定了作為桿菌主要抗原性組分之結(jié)核分枝桿菌的硫酸鹽活化復(fù)合物（SAC)。所述 SAC是具有3種催化活性的酶復(fù)合物（(Pinto,2004#14 ;Sun，2005#13)。預(yù)計(jì)該復(fù)合物 在結(jié)核分枝桿菌對(duì)宿主細(xì)胞環(huán)境的適應(yīng)中起作用，由于在巨噬細(xì)胞內(nèi)CysDNC的上調(diào)（圖 IB) ((Schnappinger，2003#31)，并響應(yīng)于許多體外應(yīng)激條件，包括營(yíng)養(yǎng)饑餓（nutrient starvation)和氧化應(yīng)激（(Hatzios，2011#167;Pinto,2004#14)。因此，可能TB患者（圖 2C)和結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠（圖2A&B)對(duì)CysDNC的強(qiáng)識(shí)別可歸因于在宿主內(nèi)CysDNC增強(qiáng)的表達(dá)。有趣地，CysDNC還在結(jié)核分枝桿菌的非復(fù)制生長(zhǎng)模型中顯示出顯著的上調(diào) (圖1D)。此結(jié)果表明CysDNC表達(dá)可能是在慢性感染期間結(jié)核分枝桿菌對(duì)潛伏狀態(tài)適應(yīng)所 需的。這被在慢性結(jié)核分枝桿菌感染（(Senaratne，2006#3)的發(fā)作中降低的硫化合物的作 用支持，且響應(yīng)于小鼠中結(jié)核分枝桿菌感染晚期由T細(xì)胞的CysDNC的持續(xù)識(shí)別（圖2B)。 這還表明結(jié)核分枝桿菌CysDNC可有助于在通過(guò)使用半胱氨酸的持續(xù)代謝途徑的非復(fù)制持 續(xù)性的狀態(tài)中之生物體的存活。半胱氨酸整合入乙?；鵆oA，其是生物體細(xì)胞壁中脂質(zhì)的結(jié) 構(gòu)單元和乙醛酸旁路的底物，乙醛酸旁路是結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞和小鼠中持久所需的 途徑（(McKinney，2000#211)。而且，CysDNC在低氧休眠期間被上調(diào)（(Voskuil，2004#35) 且在由巨噬細(xì)胞造成的凋亡抑制中起作用（〇)anelishVili，2010#116)，表明CysDNC在宿 主免疫應(yīng)答逃避中的作用。有趣地，發(fā)現(xiàn)在暴露于殺非復(fù)制細(xì)菌的抗TB藥物后，cysD將被 上調(diào)（（Fu，2009#117 ;Heifets，2005#120 ;Tasneen，2008#121)。
[0227] 由宿主細(xì)胞應(yīng)答的分枝桿菌抗原增強(qiáng)識(shí)別不總是將針對(duì)攻擊的保護(hù)與動(dòng)物模 型中的致病性結(jié)核分枝桿菌相關(guān)聯(lián)（(Gartner，2007#215 ;Kamath，1999#143 ;Skinner， 2003#115)。因此，我們?cè)u(píng)估了CysDNC是否在我們的氣溶膠結(jié)核分枝桿菌感染的低劑量鼠 類(lèi)模型中是保護(hù)性的。當(dāng)作為DNA疫苗遞送時(shí)，CysD和CysNC在肺和脾二者中作為單獨(dú)組 分是保護(hù)性的，且所述兩個(gè)構(gòu)建體的組合達(dá)到了與由BCG誘導(dǎo)的類(lèi)似的保護(hù)水平（圖3)。 因此，編碼CysDNC基因的強(qiáng)表達(dá)與在本文所用的模型中抗原性復(fù)合物的保護(hù)性作用相關(guān)。 然而，雖然存在蛋白質(zhì)通過(guò)來(lái)自TB患者的PBMC識(shí)別，在巨噬細(xì)胞內(nèi)被上調(diào)且誘導(dǎo)來(lái)自結(jié)核 分枝桿菌感染小鼠之T細(xì)胞的強(qiáng)IFN- □應(yīng)答的事實(shí)，但是添加編碼SAP其他組分的DNA疫 苗沒(méi)有改善CysDNC的保護(hù)性效果（圖4)。不清楚為什么CysDNC在保護(hù)性效力方面是SAP 的顯性成員，但是可涉及基于該研究中使用的小鼠菌株的MHC限制性應(yīng)答。還有興趣注意 到由于SAP抗原在硫代謝中的功能，提出所述SAP抗原為細(xì)胞內(nèi)或膜聯(lián)蛋白（(deSouza， 2011#206)，且我們已經(jīng)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡對(duì)于所述成員中的一些確認(rèn)了這點(diǎn)（未示出）。然 而，臨床試驗(yàn)中的所有結(jié)核分枝桿菌抗原為分泌性蛋白質(zhì)，因?yàn)轭A(yù)計(jì)這些為宿主免疫的早 期革G標(biāo)（(Kaufmann，2011#196)。該研究表明非分泌性蛋白質(zhì)也可以是新TB疫苗構(gòu)成的合 適組分。此外，應(yīng)激誘導(dǎo)的潛伏期相關(guān)的在結(jié)核分枝桿菌感染后晚期改善保護(hù)之抗原的最 近鑒定（(Aagaard，2011#213)保證了在類(lèi)似模型中CysDNC的進(jìn)一步測(cè)試，考慮到在非復(fù)制 細(xì)菌中并響應(yīng)于體外應(yīng)激之所述蛋白質(zhì)復(fù)合物的明顯誘導(dǎo)。
[0228] 潛在亞單位疫苗的重要性質(zhì)是用現(xiàn)有的BCG免疫接種"加強(qiáng)"保護(hù)的能力，因?yàn)?這是在新TB疫苗計(jì)劃中提出的這些疫苗的作用（(Kaufmann，2011#196)。少數(shù)蛋白質(zhì)在 實(shí)驗(yàn)性結(jié)核分枝桿菌感染中已經(jīng)證明了加強(qiáng)BCG誘導(dǎo)之保護(hù)的能力（(Lu，2011#144 ;Dey， 2011#145 ;Rouanet，2009#214)?，F(xiàn)可將CysDNC添加到這個(gè)列表上，因?yàn)樗隹乖瓘?fù)合物能 夠在肺中顯著地提高僅用BCG的保護(hù)性作用，肺為所用模型中感染的主要部位（圖6)。
[0229] 除了定義所述SAP蛋白的抗原性作用之外，該研究還已經(jīng)擴(kuò)展了我們SAP基因表 達(dá)在感染期間調(diào)節(jié)的知識(shí)。所測(cè)試的SAP的所有組分顯示出在本文中使用的巨噬細(xì)胞細(xì) 胞系內(nèi)上調(diào)。這種對(duì)吞噬體環(huán)境的適應(yīng)是細(xì)菌及時(shí)向細(xì)胞供應(yīng)半胱氨酸能力的指示，其已 經(jīng)由Hatzios和Bertozzi廣泛地綜述（(Hatzios，2011#167)。有可能SAP中的酶調(diào)節(jié)彼 此的表達(dá)。例如已經(jīng)顯示絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶與途徑中上一個(gè)酶0-乙酰絲氨酸硫化氫解 酶（OASS)締合并形成復(fù)合物（(Droux，1998#218)。雖然此相互作用負(fù)調(diào)節(jié)OASS((Mino， 2000#222 ;Schnell，2007#87)，類(lèi)似于ATP-硫酸化酶，其表達(dá)和活性可取決于半胱氨酸的 需求（（Kredich，1966#219 ;Mino, 1999#220 ;Mino, 2000#221 ;Pinto, 2004#14)。而且，大 腸桿菌ATP硫酸化酶與0ASS形成緊密的復(fù)合物（(Wei，2002#96)且其是可活化硫酸鹽產(chǎn) 生APS的復(fù)合物（補(bǔ)充圖1)。已經(jīng)建議考慮到大腸桿菌與結(jié)核分枝桿菌ATP硫酸化酶 的相似性，分枝桿菌系統(tǒng)也與SAP中的其他酶催化功能連接形成更高階的復(fù)合物（(Sun， 2005#13)。雖然還沒(méi)有正式測(cè)試，然而這可能是為什么SAP的所有酶誘導(dǎo)穩(wěn)健的宿主免疫 應(yīng)答的原因（圖2、圖4B&C)。還強(qiáng)調(diào)當(dāng)暴露于多種抗生素時(shí)硫代謝基因的調(diào)節(jié)為其增強(qiáng) 的轉(zhuǎn)錄，其可影響結(jié)核分枝桿菌如何響應(yīng)于這些藥物（(Hatzios，2011#167)。假設(shè)藥物響 應(yīng)基因編碼與藥物作用模式相關(guān)的蛋白質(zhì)，且許多硫代謝酶為有希望的藥物靶標(biāo)（(Bhave， 2007#1)〇
[0230] 總的來(lái)說(shuō)，我們已經(jīng)鑒定了作為宿主細(xì)胞誘導(dǎo)之蛋白質(zhì)的SAP組分，其為結(jié)核分 枝桿菌的主要抗原性組分。
[0231]實(shí)施例2
[0232] 在致病性分枝桿菌的宿主和減毒BCG疫苗株內(nèi)優(yōu)選的小生境（niche)為巨噬細(xì)胞 的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。已經(jīng)觀察到分枝桿菌還具有在DC內(nèi)感染和持久以及刺激體內(nèi)T細(xì)胞應(yīng)答 的能力[8,9]。
[0233] 我們推測(cè)在DC內(nèi)通過(guò)重組（r)BCG的抗原靶標(biāo)表達(dá)可影響接下來(lái)抗原特異免疫的 產(chǎn)生。我們認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌hspX基因的啟動(dòng)子控制表達(dá)可以是在用BCG疫苗接種后引 導(dǎo)抗原至APC表達(dá)的合適候選物。
[0234]HspX或a-晶體蛋白是小分子量熱休克蛋白的成員，其充當(dāng)ATP非依賴(lài)性分子伴 侶[10,11]。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入經(jīng)培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞時(shí)，迅速誘導(dǎo)hspX啟動(dòng)子[12]。所述 基因還通過(guò)低氧體外上調(diào)[12]，在通氣的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)的靜止期期間[11]并 通過(guò)N0供體的添加[13]，其可全部呈現(xiàn)宿主細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌遇到的條件。重要地，在 用致病性結(jié)核分枝桿菌感染小鼠后hspX基因被上調(diào)[14]。
[0235] 在本報(bào)道中，我們證明了hspX啟動(dòng)子可用來(lái)調(diào)節(jié)由rBCG表達(dá)之抗原的表達(dá)，且在 DC內(nèi)當(dāng)rBCG進(jìn)入時(shí)迅速誘導(dǎo)抗原表達(dá)。使用hspX啟動(dòng)子來(lái)控制抗原表達(dá)導(dǎo)致抗原特異性 T細(xì)胞的加速起始以及在疫苗接種后抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的持續(xù)體內(nèi)產(chǎn)生。
[0236] 材料和方法
[0237] 細(xì)菌菌株，培養(yǎng)基和抗原
[0238] 結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATC27294)和牛分枝桿菌BCG(Pasteur菌株）在補(bǔ)充有 0.5%甘油、0.05%1￥6611-80和10%40(：的組(1(116131'〇(^7119培養(yǎng)基（01化〇,80)或補(bǔ)充有 0ADC的Middlebrook7Hll培養(yǎng)基（Difco，BD)上培養(yǎng)。當(dāng)需要時(shí)，以20iig/ml的濃度添加 抗生素卡那霉素（Km)。
[0239] 小鼠
[0240] 從動(dòng)物資源中心（Perth，WA，Australia)獲得6至8周大的C57BL/6小鼠并將其維 持在無(wú)特定病原體條件下。從K.Takatsu教授（UniversityofTokyo,Japan)和J.Ernst 教授（NewYorkUniversitySchoolofMedicine，NY) [15]獲得p25CD4+TCR轉(zhuǎn)基因（特 別對(duì)于Ag85B的殘基240-254)且回交至B6.SJL/Ptprca以獲得p25+CD45. 1+系。在悉尼大 學(xué)動(dòng)物保健和倫理委員會(huì)（UniversityofSydneyAnimalCareandEthicsCommittee) 的許可下進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
[0241] 重組（r)BCG菌株的構(gòu)建
[0242] 通過(guò)將質(zhì)粒pMV306 :GFP轉(zhuǎn)化至BCG構(gòu)建在結(jié)核分枝桿菌hspX啟動(dòng)子控制下的表 達(dá)GFP的BCG(BCG:PhspX_GFP)，其由CliffBarry教授（TuberculosisResearchSection， NIAID，NationalInstitutesofHealth，Rockville，MD)惠贈(zèng)。為開(kāi)發(fā)其中hspX啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)Ag85B蛋白表達(dá)的BCG，從結(jié)核分枝桿菌基因組DNA擴(kuò)增編碼Ag85B蛋白的fbpB基因 并用來(lái)替換PMV306 :GFP中的gfp基因，產(chǎn)生中間體載體pJEX88。通過(guò)用Xbal和Hpal消 化切除PhspX_fbpB片段并將其連接至用相同酶消化的穿梭載體pMV261 [16]。將產(chǎn)生的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化入BCG以產(chǎn)生BCG:PhspX-85B。在該研究中使用的對(duì)照BCG為BCGPasteur菌株或用 pMV261[16]轉(zhuǎn)化的BCGPasteur。先前已經(jīng)描述了在hsp60啟動(dòng)子控制下過(guò)表達(dá)結(jié)核分枝 桿菌Ag85B蛋白之rBCG(BCG:Phsp6Q-85B)的構(gòu)建[17]。
[0243] 樹(shù)突細(xì)胞感染
[0244] 如先前所述從小鼠的骨髓制備DC[18]。對(duì)于DC感染，4天大的DC培養(yǎng)物與以5 : 1 或1 : 1感染復(fù)數(shù)的rBCG菌株孵育。4小時(shí)后，通過(guò)徹底洗滌除去細(xì)胞外細(xì)菌，且在感染 后6小時(shí)和24小時(shí)，裂解DC并收集細(xì)菌進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（LSR-II，BectonDickinson，San Jose，CA，USA)。通過(guò)用起始值（第0天）除在6和24小時(shí)下的細(xì)菌群熒光確定熒光提高 的倍數(shù)。為通過(guò)共聚焦顯微術(shù)可視化，使用類(lèi)似的感染條件，除了在rBCG感染之前允許DC 粘附在約25mm的蓋玻片上（LeicaMicrosystems,Wetzlar，Germany)，然后在LP5共聚焦 顯微鏡（Leica)下觀察。
[0245] 體外免疫原性測(cè)定
[0246] 用Rbcg菌株以5: 1的M0I感染四天的DC培養(yǎng)物（1X105個(gè)細(xì)胞）通過(guò)autoMACs 分選儀（MiltenyiBiotec，BergischGladbach，Germany)從p25+CD45.1+小鼠純化CD4T 細(xì)胞，且與感染的DC培養(yǎng)5X105個(gè)經(jīng)純化的T細(xì)胞。在共孵育后3天后，如先前所述通過(guò) ELISA測(cè)定上清液的IFN-Y[19]，且通過(guò)[3H]-胸苷攝取測(cè)量T細(xì)胞增殖。
[0247] 體內(nèi)免疫應(yīng)答
[0248] 為檢測(cè)體內(nèi)GFP表達(dá)，用1X107CFU的熒光rBCG菌株在足墊中皮下接種C57BL/6 小鼠。在感染后或感染后第1、3或7天立即獲得局部炎性部位的組織。用膠原酶和DNA酶消 化組織至少1小時(shí)，然后拉緊以覆蓋細(xì)胞。用⑶45-APCCy7、⑶llb-APC和⑶llc-PE-Cy7(BD Pharmingen)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。使用LSR-II流式細(xì)胞儀（BD)分析經(jīng)染色的細(xì)胞。
[0249] 在rBCG遞送后為確定T細(xì)胞起始，制備來(lái)自P25+CD45. 1+小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞并用 羧基突光素玻拍醜亞胺基酯（carboxyfluoresceinsuccinimidylester，CFSE;Molecular Probes，Invitrogen，USA)標(biāo)記。C57BL/6 小鼠靜脈注射（i.V.)接受 5X105 個(gè)CFSE標(biāo)記 的p25淋巴結(jié)細(xì)胞且第二天用5X105CFU的rBCG菌株皮下免疫小鼠。在疫苗接種后3或7 天，處理器官并分析分裂細(xì)胞的CFSE譜。
[0250] 為確定rBCG免疫原性，用5X105CFU的rBCG菌株皮下疫苗接種小鼠。在疫苗接 種后3和12周，將脾細(xì)胞移出且2X105個(gè)脾細(xì)胞在37°C5%C02中與p25肽（3yg/ml)培 養(yǎng)。共孵育后18小時(shí)，通過(guò)先前所述的ELIspot確定IFN-Y分泌性細(xì)胞的數(shù)量[19]，且在 抗原攻擊后72小時(shí)時(shí)，通過(guò)[3H]-胸苷攝取評(píng)估T細(xì)胞增殖。
[0251] 保護(hù)性效力
[0252] 為評(píng)估保護(hù)性效力，用5X105CFU的BCG菌株免疫C57BL/6小鼠（每組5只）且 在疫苗接種后12周時(shí)使用Middlebrook空氣傳播感染裝置（Glas-Col，TerreHaute，IN， USA)以大約每肺100個(gè)有活力的桿菌之感染劑量的氣溶膠結(jié)核分枝桿菌H37Rv攻擊小鼠。 在所述攻擊后4周，在Middlebr〇〇k7HlIBacto瓊脂上計(jì)數(shù)肺和脾內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量。
[0253] 統(tǒng)計(jì)分析
[0254] 用使用Bonferroni多重比較檢驗(yàn)的方差（AN0VA)分析來(lái)確定線(xiàn)性和log轉(zhuǎn)換測(cè) 定之差異的顯著性，所述Bonferroni多重比較檢驗(yàn)用于多組數(shù)據(jù)集的成對(duì)比較。認(rèn)為具有 p< 0.05的差異是顯著的。
[0255] 結(jié)果
[0256] 在樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌hspX啟動(dòng)子的誘導(dǎo)
[0257] 我們推測(cè)在分枝桿菌感染期間靶向DC抗原表達(dá)將對(duì)引導(dǎo)向所述抗原產(chǎn)生的免疫 應(yīng)答有積極作用。為了誘導(dǎo)DC內(nèi)之外來(lái)基因的表達(dá)，我們構(gòu)建了BCG菌株，其中結(jié)核分枝 桿菌hspX啟動(dòng)子（PhspX)控制了基因表達(dá)。當(dāng)在未通氣的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)時(shí)，其中使用PhspX表 達(dá)gfp的BCG:PhspX-GFP僅顯示出明顯的GFP熒光上調(diào)，確認(rèn)了在低氧壓下hspX啟動(dòng)子的上 調(diào)（圖7A)。在用BCG:PhspX-GFP感染DC24小時(shí)后，當(dāng)與初始接種物（第0天）或感染后6 小時(shí)分離的細(xì)菌相比時(shí)分離的細(xì)菌展示出熒光明顯的提高（圖7B)。在rBCG感染的DC內(nèi) 通過(guò)共聚焦顯微術(shù)可視化GFP熒光確認(rèn)hspX控制之表達(dá)的誘導(dǎo)（圖7C)。這些結(jié)果證明 hspX啟動(dòng)子可用來(lái)驅(qū)動(dòng)DC內(nèi)迅速和顯著的由重組BCG引起之基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
[0258] 在疫苗接種后hspX誘導(dǎo)表達(dá)的早期體內(nèi)誘導(dǎo)
[0259] 為了確定hspX啟動(dòng)子是否可用來(lái)驅(qū)動(dòng)抗原體內(nèi)表達(dá)，用BCG:PhspXGFP疫苗接種小 鼠并確定GFP+宿主細(xì)胞的存在。疫苗接種后1天盡早檢測(cè)GFP+細(xì)胞，且其在疫苗接種后3 和7天明顯（圖8A)。在疫苗接種后3天GFP+細(xì)胞的比例達(dá)到峰值，然而在檢查的3個(gè)時(shí) 間點(diǎn)間無(wú)顯著差異（圖8B)。我們還檢測(cè)了⑶llchirailbhiDC內(nèi)流至rBCG疫苗接種部位， 在疫苗接種后第7天達(dá)到數(shù)量峰（圖9A)。在感染的較晚期GFP+DC明顯，在第3天和第7 天分別具有誘導(dǎo)狀態(tài)的錨定于BCG:PhspXGFP之顯著數(shù)量的DC(圖9B和C)。這些數(shù)據(jù)表明 用BCG:PhspX-GFP的疫苗接種導(dǎo)致DC的感染和hspX啟動(dòng)子的迅速細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)。
[0260] 在BCG中hspX啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外來(lái)抗原表達(dá)的用途
[0261] 為確定hspX啟動(dòng)子是否可用來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)定乂抗原的免疫，在該啟動(dòng)子的控制下我 們表達(dá)了編碼免疫顯性結(jié)核分枝桿菌Ag85B抗原的基因。雖然通過(guò)BCG表達(dá)該蛋白質(zhì)的 同系物，通過(guò)所述抗原的組成型過(guò)表達(dá)賦予BCG改善的抗Ag85B免疫[17]。BCG:PhspX-85B 菌株顯示出在有效通氣條件下培養(yǎng)的培養(yǎng)物中Ag85B表達(dá)的上調(diào)（數(shù)據(jù)未示出）。為確定 hspX介導(dǎo)的表達(dá)是否影響Ag85B被DC呈遞，用BCG:PhspX-85B、僅BCG或BCG:Phsp6Q-85B感 染來(lái)自小鼠骨髓的體外培養(yǎng)DC，其中在強(qiáng)hsp60啟動(dòng)子的控制下Ag85B組成地表達(dá)[17]。 感染的細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因Ag85B特異性CD4+T細(xì)胞（p25T細(xì)胞[15])培養(yǎng)，且檢測(cè)增殖和細(xì)胞 因子釋放。用全部3種菌株感染的DC誘導(dǎo)了p25T細(xì)胞增殖（圖10A)和IFN-Y分泌（圖 10B)，其在未感染的細(xì)胞中未觀察到。在用BCG:PhspX-85B感染的DC中應(yīng)答更明顯，且該差 異達(dá)到了T細(xì)胞增殖測(cè)定中的顯著性（圖10A)。因此，hspX啟動(dòng)子可用來(lái)驅(qū)動(dòng)BCG中外來(lái) 抗原的表達(dá)，且在DC內(nèi)的誘導(dǎo)產(chǎn)生提高的T細(xì)胞體外增殖。
[0262] 通過(guò)用BCG :PhspX_85B疫苗接種誘導(dǎo)體內(nèi)T細(xì)胞免疫增強(qiáng)
[0263] 體外免疫原性實(shí)驗(yàn)表明hspX啟動(dòng)子的使用可能能夠體內(nèi)修飾BCG誘導(dǎo)的免疫。 考慮到疫苗接種后由hspX啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)之表達(dá)的迅速誘導(dǎo)（圖8)，我們首先確定用BCG: PhspX-85B的疫苗接種是否導(dǎo)致相比僅用BCG或BCG:Phs_-85B改善的Ag85B反應(yīng)性T細(xì)胞的 早期起始。為此，將CFSE標(biāo)記的p25T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至野生型接受體，其在用BCG菌株疫苗接 種后檢查所述經(jīng)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的活化和增殖。在感染后第三天時(shí)，BCG:PhspX-85B疫苗接種已經(jīng) 誘導(dǎo)了p25T細(xì)胞增殖，具有多數(shù)顯示CFSE中等或低譜之分裂的細(xì)胞，而僅用BCG或BCG: Phsp6(l-85B的疫苗接種沒(méi)有造成可察覺(jué)的增殖（圖11A和B)。在感染后第7天時(shí)，所有BCG 菌株誘導(dǎo)了大多數(shù)經(jīng)轉(zhuǎn)移之p25T細(xì)胞的增殖，如通過(guò)p25⑶4+T細(xì)胞的CSFE譜（圖11A) 確定的大約90%的p25CD4T細(xì)胞顯示出用BCG、BCG:Phsp6(l-85B或BCG:PhspX-85B疫苗接種 后的CSFE低譜（圖11B)。一并考慮，這些結(jié)果表明BCG:PhspX-85B中Ag85B的誘導(dǎo)加速了 p25T細(xì)胞的初始起始，然而在稍后的時(shí)間點(diǎn)BCG和BCG:Phsp6(l-85B二者產(chǎn)生足夠的抗原以 引起p25T細(xì)胞的增殖。
[0264] 我們接下來(lái)評(píng)估了用所述3種BCG菌株疫苗接種的小鼠的長(zhǎng)期T細(xì)胞應(yīng)答，并檢 查了在疫苗接種后3周或12周時(shí)Ag85B特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生。在疫苗接種后3周時(shí)，BCG: Phs_-85B和BCG:PhspX-85B二者導(dǎo)致相比僅用BCGAg85B特異性IFN-Y分泌性細(xì)胞產(chǎn)生 的提高，特別是BCG:PhspX-85B相比對(duì)照BCG提高了相應(yīng)細(xì)胞數(shù)量大約5倍（圖12A)。在 疫苗接種后12周時(shí)，BCG和BCG:Phsp6(l-85B二者顯示出響應(yīng)Ag85B之IFN-Y分泌性細(xì)胞的 相等同水平，其顯著高于在未疫苗接種之小鼠中觀察到的水平（圖12B)。然而，在用BCG: PhspX-85B疫苗接種的小鼠中，抗原特異性IFN-Y分泌性細(xì)胞的數(shù)量為僅用BCG誘導(dǎo)數(shù)量的 大約6倍，且為在用BCG:Phsp6(l-85B疫苗接種后觀察到之應(yīng)答的3倍以上（圖12B)。這些 結(jié)果表明在宿主細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)Ag85B表達(dá)的能力導(dǎo)致體內(nèi)T細(xì)胞免疫提高的模式，其在疫苗 接種后延長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)最明顯。
[0265] 因?yàn)锳g85B為結(jié)核分枝桿菌的免疫顯性抗原，所以我們確定了在hspX啟動(dòng)子控制 下表達(dá)Ag85B的rBCG是否可改善針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的BCG保護(hù)性作用。疫苗接種后 12周，經(jīng)由氣溶膠途徑用低劑量的結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv攻擊小鼠。在結(jié)核分枝桿菌感 染后4周時(shí)，肺（圖12C)和脾（圖12D)二者中的細(xì)菌負(fù)荷相比未疫苗接種的小鼠在所有用 BCG菌株疫苗接種的小鼠中都顯著降低。然而，僅用BCG、用BCG:PhspX-85B、用BCG:Phs_-85B 疫苗接種之小鼠中的保護(hù)性作用是類(lèi)似的，表明在此模型中Ag85B過(guò)表達(dá)沒(méi)有改善保護(hù)性 效力。
[0266] 討論
[0267]BCG疫苗顯示出針對(duì)肺結(jié)核可變的保護(hù)性效力，然而可改造所述疫苗來(lái)以功能形 式表達(dá)外來(lái)分子，且這已經(jīng)驅(qū)動(dòng)了開(kāi)發(fā)BCG作為重組載體來(lái)針對(duì)感染性疾病和惡性疾病 (例如癌癥）提供保護(hù)[20]。對(duì)這些方法的成功至關(guān)重要的是調(diào)節(jié)BCG誘導(dǎo)的免疫以產(chǎn) 生期望之免疫應(yīng)答的能力。在本報(bào)道中，我們示出結(jié)核分枝桿菌hspX啟動(dòng)子可用來(lái)調(diào)節(jié)在 BCG中產(chǎn)生之重組抗原的表達(dá)。我們示出了在DC內(nèi)hspX啟動(dòng)子被體外迅速誘導(dǎo)（圖6)，其 補(bǔ)充了在巨噬細(xì)胞內(nèi)hspX表達(dá)[21]和在小鼠感染后DC的BCG攝取[8]的已有文獻(xiàn)。這 種在DC內(nèi)hspX啟動(dòng)子迅速和明確的體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)于抗原載體系統(tǒng)的使用是重要的，這是由 于DC在分枝桿菌免疫應(yīng)答初始中的關(guān)鍵作用[8,22,23]。我們還示出了hspX啟動(dòng)子活性 在rBCG疫苗接種的小鼠的DC內(nèi)于感染后早在24小時(shí)明顯（圖8)。該迅速的啟動(dòng)子誘導(dǎo) 似乎同低劑量氣溶膠結(jié)核分枝桿菌感染小鼠后的hspX轉(zhuǎn)錄水平相矛盾，僅在感染后大約 15天且更普遍的在較晚階段檢測(cè)到hspXmRNA[14]。這表明在結(jié)核分枝桿菌中的體內(nèi)hspX 積聚可以是緩慢的過(guò)程，或者還可涉及在目前研究中使用的高rBCG劑量的遞送，且敏感性 GFP報(bào)道系統(tǒng)促進(jìn)了hspX啟動(dòng)子活性的檢測(cè)。
[0268] 為了確定Phspx驅(qū)動(dòng)表達(dá)的抗原特異性作用，我們利用hspX啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)核分 枝桿菌Ag85B的表達(dá)，Ag85B為分泌性分枝桿菌蛋白質(zhì)，其為許多候選肺結(jié)核疫苗的組分 [24]。我們觀察到在用BCG:PhspX-85B疫苗接種后與Ag85B反應(yīng)性T細(xì)胞起始和活化增強(qiáng) (圖10和11)相關(guān)的DC早期募集至感染部位和BCG的迅速吞噬細(xì)胞裂解（圖9)。而且， 改善的T細(xì)胞起始導(dǎo)致持續(xù)產(chǎn)生的IFN-Y分泌性細(xì)胞識(shí)別Ag85B長(zhǎng)達(dá)疫苗接種后3個(gè)月。 有趣地，編碼Ag85B之基因的表達(dá)在小鼠中的慢性結(jié)核分枝桿菌感染期間被下調(diào)[14]，且 將有興趣確認(rèn)在BCG中使用天然Ag85B啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)抗原表達(dá)的疫苗是否可以在人中保持 長(zhǎng)期的保護(hù)性免疫[25]。我們還使用氣溶膠結(jié)核分枝桿菌感染的鼠類(lèi)模型來(lái)確定Ag85B的 體內(nèi)誘導(dǎo)是否可改善BCG疫苗的保護(hù)性作用。然而，相比僅用BCG我們沒(méi)有觀察到改善的 保護(hù)性作用（圖12)。在先前的研究中，類(lèi)似地我們觀察到在BCG中Ag85B的過(guò)表達(dá)沒(méi)有 改善BCG的保護(hù)性作用，盡管在經(jīng)疫苗接種的小鼠中提高了抗Ag85B免疫[17]。這表明可 需要評(píng)估在該系統(tǒng)中的其他抗原來(lái)確定BCG中Phspx驅(qū)動(dòng)表達(dá)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染提供保 護(hù)的作用，或作為替代地，應(yīng)當(dāng)在肺結(jié)核的其他臨床前模型中評(píng)估BCG:PhspX-85B，其中當(dāng)在 rBCG中表達(dá)時(shí)確實(shí)給予保護(hù)性效力一些水平的改善[25]。
[0269] 由于經(jīng)hspX啟動(dòng)子上調(diào)的抗原而改善和持續(xù)之免疫的機(jī)理是不清楚的。使用分 枝桿菌hsp60啟動(dòng)子的Ag85B組成型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致在rBCG中非常強(qiáng)的表達(dá)水平，如通過(guò)蛋 白質(zhì)印跡所檢測(cè)的[17]且在疫苗接種后早期在刺激抗原特異性T細(xì)胞免疫上比僅用BCG 更好，然而，該作用不能長(zhǎng)期保持（圖12A和12B)?？赡躊hs_轉(zhuǎn)錄在BCG感染的較晚期被 下調(diào)，因此導(dǎo)致在延長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)降低的抗原水平或者啟動(dòng)子的體內(nèi)不穩(wěn)定性降低免疫原性 [26]。相反地，Phspx活性看來(lái)在感染后較長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)最大[14]，表明該方法可導(dǎo)致由BCG: PhspX-85B表達(dá)的抗原之升高和持續(xù)的水平。先前已經(jīng)報(bào)道了BCG中Ag85B的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致 提高的自體吞噬和rBCG菌株刺激抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答之能力的改善[27]。當(dāng)我們使用 3_甲基腺嘌呤抑制rBCG感染之DC中的自體吞噬并確定Ag85B特異性T細(xì)胞活化的程度 時(shí)，我們觀察到在用BCG:PhspX-85B感染的經(jīng)處理DC中T細(xì)胞活化降低的趨勢(shì)，然而該作用 在所有實(shí)驗(yàn)中都未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性（數(shù)據(jù)未示出）。
[0270] 在目前研究中呈現(xiàn)的結(jié)果證明使用rBCG作為載體誘導(dǎo)抗原表達(dá)的能力導(dǎo)致顯著 和持續(xù)之細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，這對(duì)于需要"Thl"樣應(yīng)答對(duì)其進(jìn)行控制的疾?。ɡ绶谓Y(jié) 核）具有清楚的意義。
[0271] 實(shí)施例3
[0272] 方法
[0273] 通過(guò)皮下注射佐劑（MPL/DDA)、Ag85B-CysD融合蛋白（10mg)或Ag85B(10mg)免疫 C57BL/6小鼠（n= 5)3次。在蛋白質(zhì)疫苗第一次注射時(shí)，通過(guò)皮下注射5X105CFU的BCG 免疫小鼠一次。在第三次免疫接種后四周，用具有每肺?100個(gè)有活力的桿菌之感染劑量 的氣溶膠結(jié)核分枝桿菌攻擊小鼠。
[0274] 結(jié)果
[0275] 在用氣溶膠結(jié)核分枝桿菌攻擊經(jīng)免疫的小鼠后4周，在肺（圖14A)和脾（圖 14B)中確定細(xì)菌負(fù)荷。數(shù)據(jù)以每器官的平均CFU(土SEM)示出。用單因素AN0VA以及使用 Bonfeironi事后檢驗(yàn)完成的多組數(shù)據(jù)集的成對(duì)比較來(lái)評(píng)價(jià)組間之差異的顯著性。
[0276] 用Ag85B-CysD的疫苗接種導(dǎo)致的保護(hù)等同于存在的BCG疫苗?？紤]到BCG表達(dá)大 量的抗原性靶標(biāo)，這是引人注目的結(jié)果，而我們兩個(gè)抗原的融合為同等保護(hù)性的（圖14)。
[0277] 參考文獻(xiàn)
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[0359] 附表1:在本研究中使用的用于蛋白質(zhì)純化的引物和克隆
[0360]

【權(quán)利要求】
1. 重組或合成的蛋白質(zhì)，其包含： -第一區(qū)，其具有由編碼分枝桿菌硫酸鹽同化途徑（SAP)組分之基因編碼的序列； -另外的區(qū)，其具有分枝桿菌蛋白質(zhì)的序列。
2. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述第一區(qū)具有由CysD基因編碼的序列。
3. 權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其中所述另外的區(qū)具有Ag85B蛋白的序列。
4. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有如SEQ ID No :2所示序 列。
5. 核酸，其編碼前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
6. 權(quán)利要求5所述的核酸，其中所述核酸具有如SEQ ID No: 1所示序列。
6. 權(quán)利要求5或6所述的核酸，其中所述核酸包含分枝桿菌HspX啟動(dòng)子。
7. 疫苗或免疫刺激組合物，其用于在個(gè)體中提供針對(duì)分枝桿菌的免疫應(yīng)答，所述疫苗 或免疫刺激組合物包含： -重組或合成的蛋白質(zhì)，其具有由編碼分枝桿菌SAP組分之基因編碼的序列； -化合物，其用于增強(qiáng)針對(duì)所述重組或合成的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
8. 權(quán)利要求7所述的疫苗或組合物，其中所述重組或合成的蛋白質(zhì)具有由CysD基因編 碼的序列。
9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗或組合物，其中所述重組或合成的蛋白質(zhì)為權(quán)利 要求1至3中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。
10. 權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的疫苗或組合物，其中所述用于增強(qiáng)針對(duì)所述分枝桿 菌SAP組分之免疫應(yīng)答的化合物包括MLP和/或DDA形式的佐劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗或組合物，其中所述重組或合成的蛋白質(zhì)以重組細(xì)菌 細(xì)胞的形式在所述疫苗或組合物中提供，所述重組細(xì)菌細(xì)胞具有在所述細(xì)胞中表達(dá)的所述 重組或合成的蛋白質(zhì)。
12. 用于使個(gè)體中發(fā)生分枝桿菌感染之可能性最小化的方法，其包括： -利用前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、疫苗或組合物以在個(gè)體中形成針對(duì)分枝 桿菌SAP組分的免疫應(yīng)答； 從而使所述個(gè)體中發(fā)生分枝桿菌感染的可能性最小化。
13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述個(gè)體不具有可檢測(cè)的分枝桿菌感染。
14. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述個(gè)體具有分枝桿菌感染的一種或更多種癥狀。
【文檔編號(hào)】C07K14/35GK104271744SQ201280070011
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】詹姆斯·安東尼·特里卡斯, 拉謝爾·平托-納達(dá)納占德蘭, 瓦威克·約翰·布里頓 申請(qǐng)人:悉尼大學(xué), 百年癌癥藥物與細(xì)胞生物學(xué)研究所