專利名稱：修飾的血紅蛋白及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種修飾的血紅蛋白及其制備方法。
背景技術：
血紅蛋白(Hb)是紅細胞的主要組成，紅細胞攜帶氧從肺貫穿全身。當包含在紅細胞中時，Hb以兩個氧連接的αβ二聚物組成的四聚體結構存在，每個二聚物的分子量大約為32Kd。每個二聚物的每個α和β亞基都具有蛋白鏈和血紅素分子。α和β蛋白鏈的序列是已知的。Hb是一種用于輸血的可能有用的血液代用品，而且已經提出用作感染性休克中捕捉氧化亞氮，以及在癌癥的放射治療中調節(jié)組織的氧合作用的試劑。重組DNA技術能生產修飾的Hb，其具有調節(jié)用于個別治療應用的特殊需要的氧親和力。
無細胞Hb的血管活性，即小動脈和毛細血管的收縮作用，當灌輸純化的無細胞Hb溶液，或分子內交聯的Hb時，已經成為開發(fā)基于Hb的載氧體的主要障礙(Savitzsky等人1978，Sloan等人1999，Saxena等人1999)。該血管活性歸因于Hb的NO清除作用(Doharty等人1998)。兩種分子方法，二者之間截然不同，企圖用于克服Hb的NO清除活性。第一種方法是重組DNA方法，其試圖通過遠端的血紅素袋的位點特異性誘變來修飾Hb的NO結合活性，從而降低Hb的氧化亞氮清除活性(Eich et al，1996)。第二種方法是化學方法，其中通過低聚化作用來增加Hb的分子大小，低聚化作用將降低或可能完全抑制Hb從血管空間外滲到胞間隙(Hess等人1978，Thomas等人1993，Muldoon等人1996，Macdonal等人1994，Furchgott 1984，Kilbourn等人1994)。但是只有當Hb的血管活性主要作為外滲的結果而介導時，增加分子大小的方法才是成功的。雖然低聚化介導的Hb大小增加顯示出Hb血管活性有所降低，但是通過重組DNA技術，或通過包括Hb的低聚化作用使用小分子雙功能試劑來進行大小增加的方法，都沒有產生不致高血壓的Hb溶液。一個例外是Hb的低聚化產物(Matheson等人2002)，其分子大小遠遠超過300kDa，平均分子半徑為24nm，發(fā)現其是不致高血壓的而且不外滲。但是，大多數目前仍處于臨床試驗中的低聚化產物的分子量范圍為200到250kDa。
證實Enzon PEG化的Hb是不致高血壓的，其攜帶連接到Hb的α和ε-氨基上的10個拷貝的PEG-5000鏈，刺激了在血液代用品領域的研究(Rolfs等人1998)。四聚體內交聯Hb，低聚化的Hb和PEG化的Hb的NO結合活性(Winslow et al，1998，Vandegriff et al，1997)，顯示與它們的”升壓效應”沒有直接相關。因此，無細胞Hb“升壓活性”的降低似乎不與制品的NO結合活性，或者制品的分子大小直接相關。但是與低聚化的Hb相比，PEG化的Hb顯示出顯著較低水平的血管活性。Enzon的PEG-Bv-Hb，其攜帶10個拷貝的PEG-5000，幾乎沒有顯示任何”升壓效應”。Vandegriff等(1998)表示，相較于Hb低聚化樣品，PEG-Bv-Hb顯示高的粘度和膠粒滲透壓。從膠粒滲透壓計算的Enzon PEG化Bv-Hb的分子半徑比低聚化Hb的大得多(15nm)，而且計算的分子半徑與它的計算的分子量114,000道爾頓不相符(Vandegriff et.al.1998)。因此，假定Hb的大小應當增加到分子半徑為大約15nm，而且同時應伴隨粘度和膠粒滲透壓的顯著增加以產生不致高血壓的Hb溶液(Winslow 1999)。
在不致高血壓的Enzon PEG化的Hb中，PEG-5000鏈通過異肽鍵連接到牛Hb PEG-鏈的α和ε氨基上。PEG的共價連接同時伴有衍生的氨基的凈正電荷的丟失。在最近的研究中，已經證實用戊二醛進行rHb1.1的單功能修飾，能一定程度地降低Hb的血管活性，而rHbl.1的低聚化作用能更高程度地降低Hb的血管活性。因此，在理解通過PEG化作用中和Hb的血管活性的分子基礎中，需要考慮伴隨HB的PEG化的Hb表面電荷修飾的可能作用。
為了揭露由于PEG化作用而產生的Hb表面電荷微擾與產生不致高血壓的Hb之間的相關性，已經開發(fā)了新方法，其涉及Hb的保守性PEG化作用，即Hb的PEG修飾而不改變Hb的表面電荷(Acharya等人1996)。在氧條件下，PEG-馬來酰亞胺對Hb的Cys-93(β)的高反應性和選擇性，已經用于制備每個四聚體攜帶兩個拷貝PEG鏈的均一性PEG化Hb。已經生產了三種不同的PEG-HbA制品，分別攜帶兩個拷貝的PEG-5K，或PEG-10K或PEG-20K。Hb的分子體積(流體動力學體積)，分子半徑，粘度和膠粒滲透壓的改變，與共價連接到Hb上的PEG的質量相關；而且所有的這些分子特性都與升壓效應相關。盡管(PEG20K)2-Hb的粘度和膠粒滲透壓與Enzon PEG-Bv-Hb(一種不致高血壓的Hb分子)相當，這種PEG化的Hb是血管活性的。因此，血管活性問題的解決不可能通過簡單地賦予分子增加的粘度，膠粒滲透壓和分子體積(流體動力學體積)來完成。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種修飾的Hb，其具有增加的分子體積，高粘度，高膠粒滲透壓，高O2親和力，其是不致高血壓的并且還能解決血管活性問題。此外，本發(fā)明修飾的Hb可以在簡單、靈活而且高效的方法中生產，其使本發(fā)明修飾的Hb的制備有成本效益。
更特別地，本發(fā)明提供了一種具有6±1個PEG鏈的血紅蛋白分子(Hb)，其中所述PEG鏈中的兩個結合到Hb的Cys-93(β)上，而余下的PEG鏈結合到在Hb的ε-氨基上引入的巰基上。
本發(fā)明還提供了制備修飾的血紅蛋白分子(Hb)的方法，包括以下步驟(a)使Hb與8-15倍過量的亞氨基四氫噻吩反應以形成巰基化的Hb；和(b)使巰基化的Hb與16-30倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應，來形成修飾的Hb。
最后，本發(fā)明提供了根據前述方法制備的修飾的Hb分子。
附圖簡述

圖1提供了亞氨基四氫噻吩依賴的巰基化作用介導的基于馬來酰亞胺化學的Hb PEG化的示意圖。A描述了巰基化作用，簡化方式的PEG化反應的第一階段，以及馬來酰亞胺官能化的PEG鏈結合到巰基化蛋白上。連接的PEG鏈描繪為伸出中心蛋白(Hb)核心的臂。B亞氨基四氫噻吩與Hb的ε-氨基反應，產生γ-巰基丁脒基部分。
圖2描述了巰基化作用介導的基于PEG馬來酰亞胺的Hb的PEG化。A亞氨基四氫噻吩對與馬來酰亞胺(maleido)苯基PEG-5000孵育的Hb大小增加的影響。溶于PBS pH7.4中的Hb(0.5mm的四聚體)，在存在或缺乏已知濃度的亞氨基四氫噻吩時，與10mM馬來酰亞胺苯基PEG-5000于4℃孵育4小時。利用串聯連接的兩個superose柱，使用FPLC通過大小排阻色譜法對產物進行分析。柱子用PBS以每分鐘0.5ml的流速進行洗脫。標記HbA，(PEG5K)2-Hb，(PEG10K)2-Hb和(PEG20K)2-Hb的洗脫位置，作為追蹤Hb分子大小增加的指導，其伴隨著PEG鏈結合。1對照Hb。2缺乏亞氨基四氫噻吩時，與10mM馬來酰亞胺苯基PEG-5000孵育4小時的HbA。3存在1mM(2倍摩爾過量)亞氨基四氫噻吩時的PEG化。4存在2.5mM(5倍摩爾過量)亞氨基四氫噻吩時的PEG化。5存在5mM(10倍摩爾過量)亞氨基四氫噻吩時的PEG化。插圖a給出了，存在10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩時(超過Hb)，Hb的巰基化作用的動力學。插圖b顯示了Hb巰基化作用程度(孵育了4小時之后)，作為亞氨基四氫噻吩相對于Hb摩爾過量的函數。B溫度，PEG-馬來酰亞胺中PEG的分子大小和連接化學(PEG與馬來酰亞胺部分之間的連接)對Hb大小增加的影響。所有的PEG化反應，都使用10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩與20倍摩爾過量的PEG-馬來酰亞胺于室溫進行4小時，并于4℃過夜。如A所述通過大小排阻層析法檢測大小增加。aHbA，b使用Mal-Phe-PEG-5000作為PEG馬來酰亞胺于室溫進行反應。c使用Mal-Phe-PEG-10，000如b中所述的進行反應。d如b所述的進行反應，但是于4℃過夜。e如d所述的進行反應，但是使用馬來酰亞胺乙基PEG-5000作為PEG-馬來酰亞胺。
圖3描述了使用Acta探測器通過大小排阻色譜對(PEG5K)6-Hb進行純化。用180mg上樣進行了制備級實驗。如分析級實驗(圖2)那樣使用PBS進行洗脫。使用10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩與20倍摩爾過量的Mal-Phe-PEG-5000于4℃進行PEG化。插圖對純化的(PEG5K)6-Hb的分子大小與其它的PEG化Hb以及使用雙馬來酰亞胺苯基PEG-600在四聚體之間交聯的αα富馬酰Hb(一種分子內交聯的Hb)的分子大小進行了比較。該樣品有助于標記αα-富馬酰Hb的四聚體，八聚體，十二聚體和十六聚體(dohexameric)形式的位置。1四聚體間交聯的αα-富馬酰Hb。2在Superose-12制備柱上純化的(PEG5K)6-Hb。3Enzon PEG化Hb；(PEG5K)10-Hb；4APEX Biosciences的PEG化Hb樣品，(PEG3K)10-Hb。
圖4描述了(PEG5K)6-Hb的NMR光譜。
圖5描述了PEG化Hb的粘度對蛋白濃度的函數?？招膱A表示(PEG5K)6-Hb；實心菱形表示Enzon PEG化的Hb，且實心的三角形表示(PEG5K)2-Hb。
圖6描述了(PEG5K)6-Hb的膠體滲透壓對蛋白濃度的函數?？招娜切伪硎?PEG5K)2-Hb，空心圓表示(PEG5K)6-Hb；實心圓表示(PEG5K)6-Hb，其已經再透析以確保樣品中沒有任何游離的PEG試劑。實心菱形表示Enzon PEG化的Hb。注意Enzon PEG-Hb與(PEG5K)6-Hb的膠粒滲透壓相當。
圖7描述了(PEG5K)6-Hb的血管活性。A倉鼠中，動物用4gm％的(PEG5K)6-Hb的10％最大負荷進行灌輸后的平均動脈壓力。B動物用(PEG5K)2-Hb和(PEG5K)6-Hb的10％最大負荷灌輸后的小動脈直徑作為時間的函數。
圖8描述了對動物用(PEG5K)6-Hb和αα-富馬酰Hb進行50％換血后倉鼠中有功能的毛細血管密度與對照的比較。注意用(PEG5K)6-Hb換血后動物的動脈直徑與對照樣品的相當，而50％換血αα-富馬酰Hb的動物的動脈直徑比對照的狹窄。還注意到，用兩種樣品換血的毛細血管密度的差異。
發(fā)明詳述如這里所用的，除非有另外說明，“Hb”包括來自人類和哺乳動物(例如，牛Hb，豬Hb)來源的血紅蛋白，重組Hb，以及經修飾以增強或降低氧親和力和/或自動氧化的Hb(分離的或重組的Hb)。此外，Hb可包括分子內交聯橋的Hb(分離的或重組的Hb)，包括例如，利用雙馬來酰亞胺苯基PEG于Cys-93(β)處交聯的Hb(雙功能試劑的PEG鏈的MW為2000到10,000道爾頓)，αα-富馬酰Hb，或ββ-富馬酰Hb或ββsubaryl HbA。
本發(fā)明中，Hb具有或者攜帶6±1個PEG鏈，其中2個PEG鏈結合到Hb的Cys-93(β)上，剩余的PEG鏈結合到引入到Hb的ε-氨基上的巰基上。巰基優(yōu)選與Hb的γ-巰基丁脒化的ε-氨基相關聯。在優(yōu)選的實施方案中，每個PEG鏈的分子量為3000-10,000道爾頓，更優(yōu)選分子量為大約5000道爾頓。PEG鏈也優(yōu)選通過琥珀酰亞胺鍵連接到Hb上。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Hb分子也是不致高血壓的。
本發(fā)明的Hb分子可通過如下所述制備，使Hb與8-15倍過量的亞氨基四氫噻吩反應以形成巰基化的Hb；然后使巰基化的Hb與16-30倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應，來形成修飾的Hb。在優(yōu)選的實施方案中，步驟(a)中使Hb與9-12倍過量的亞氨基四氫噻吩反應，而且?guī)€基化Hb優(yōu)選與18-22倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。在更優(yōu)選的實施方案中，步驟(a)中使Hb與大約10倍過量的亞氨基四氫噻吩反應，而且步驟(b)中巰基化Hb與大約20倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。Hb的巰基化作用與巰基化Hb的PEG-修飾可以同時進行，或者在兩步法中進行，這也在本發(fā)明的范圍內。至于該方法中使用的PEG的分子量，PEG的分子量優(yōu)選3000-10,000道爾頓，更優(yōu)選分子量為大約5,000道爾頓。在最優(yōu)選的實施方案中，從該方法獲得的修飾Hb是不致高血壓的。
本發(fā)明的方法中，可以從攜帶多個氧構象特異性反應巰基的哺乳動物Hb(狗Hb，貓Hb，雞Hb，鼠Hb)，或在α和β-鏈的所需位置帶有另外的反應性半胱氨酸的重組人Hb，來直接制備修飾的Hb，其用經馬來酰亞胺部分官能化的過量PEG處理以獲得修飾的Hb。
該方法中的化學簡明地表示在圖1A和1B中。亞氨基四氫噻吩，不攜帶游離的巰基，一旦與ε-氨基反應就原位產生巰基。衍生的ε-氨基(一種脒)保持了該官能團的原始正電荷(圖1B)。因此，Hb可以與PEG-馬來酰亞胺以及巰基化試劑一起孵育，以產生PEG化的Hb，而沒有巰基化試劑消耗PEG-馬來酰亞胺試劑的危險。PEG化作用的水平可通過巰基化(亞氨基四氫噻吩與Hb反應)水平來測定。后者主要是由亞氨基四氫噻吩濃度，以及在給定構象狀態(tài)中Hb的ε-氨基對亞氨基四氫噻吩脒化作用的反應性來決定。
PEG化反應是靈活可變的，因為該反應不依賴馬來酰亞胺中PEG的分子大小，以及PEG-馬來酰亞胺中馬來酰亞胺與PEG-鏈之間的連接化學。該方法可用于增加Hb的分子體積(大小)到任何所需的水平，通過調節(jié)Hb的巰基化水平和/或PEG-馬來酰亞胺中PEG的分子量。保守的PEG化技術已優(yōu)化用于生產具有高氧親和力的多重、大小增加的PEG化Hb。本發(fā)明修飾的Hb在凈電荷和流體動力學體積方面都顯示了高度的分子均一性，其流體動力學體積相當于分子量～250,000道爾頓的球狀蛋白的流體動力學體積。相信對不致高血壓的PEG化的Hb的任何設計都應當試圖利用很多較小的PEG鏈來掩蔽保護Hb的較大分子表面。
參考下述的非限制性實施例可以更好地理解本發(fā)明。下述實施例的目的是為了更充分全面地解釋本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而絕不能解釋為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例11、材料和方法血紅蛋白.如前所述從紅細胞溶解產物純化人HbA(Acharya等人1983)。
合成馬來酰亞胺苯基聚乙二醇(MalPhePEG)試劑.根據Acharya，等人1996的程序合成PEG5000和PEG10000的單功能馬來酰亞胺苯基衍生物。馬來酰亞胺乙基PEG-5000購自Shaerwaters，Huntsville，Alabama。
HbA與MalPhe-PEG試劑反應.血紅蛋白A(0.5mM)溶于PBS，pH7.4，與10倍摩爾過量的Mal Phe PEG-5000于4℃反應。PEG對HbA的修飾可通過反相高壓液相色譜(RPHPLC)和大小排阻色譜(SEC)進行監(jiān)控。反應產物用50mM Tris-醋酸鹽緩沖液pH8.5進行透析，并通過離子交換色譜進行純化。使用AKTA Explorer 10蛋白純化系統(tǒng)，在Amer sham Biosciences Q-Sepharose高性能樹脂上，通過離子交換色譜對PEG化的Hb進行純化。Q-Sepharose高性能柱(2.6cm×62cm)用50mM Tris-醋酸鹽緩沖液，pH8.5進行平衡，蛋白用8倍柱體積的50mM Tris-醋酸鹽，pH8.5和50mM Tris-醋酸鹽，pH7.0組成的的線性降低pH梯度進行洗脫。柱流出液在240和540nm處監(jiān)控。
氧親和力測定.使用PBS pH7.4中的Hem-O-Scan(Aminco)，以血紅蛋白四聚體濃度1mM，于37℃測定氧平衡曲線。
粘度測定.在流變儀中，以蛋白濃度4g/dl，在PBS緩沖液pH7.4中并于37℃測定PEG化Hb的粘度。在測定Hb樣品的粘度之前，儀器用去離子水校準。
膠體滲透壓測定.PEG化血紅蛋白的膠體滲透壓使用Wescor 4420膠體滲壓計進行測定。所有的測定都使用溶于PBS pH7.4的2g/dl血紅蛋白樣品于室溫進行。使用30kDa的截斷膜。樣品測定之前，儀器用Osmocoll參考標準進行測試。
PEG化Hb的RPHPLC分析.各種PEG化Hb的球蛋白鏈通過RPHPLC，通過前面所述的方法進行分析。簡單而言，在Vydac C4(4.6×250mm)柱上，使用100分鐘內含有0.1％TFA的35-50％乙腈的線性梯度進行分離。柱流出液在210nm處監(jiān)控。
PEG化Hb的血管活性.在倉鼠皮褶窗微循環(huán)模型中進行研究，基本上根據先前所述的程序(Mirhashemi等人1988，Tsai等人1996)。對體重55-70g的雄性Golden Syrian倉鼠(Charles Rivers，USA)進行研究。所有的動物研究由圣地亞哥的加利福尼亞大學動物項目委員會批準，并根據用于實驗室動物的護理和使用的NIH指南來進行(NIH出版物#85-23Rev.1985)。
每只動物都用作其自己的基線。10％的超容量灌輸使用微灌輸泵(CMA 100 Microinjection PumpCMA，Sweden)，通過頸靜脈導管，以0.20ml/min的速率灌輸到動物中。灌輸后立即以及灌輸后30min測定血壓，小動脈直徑和功能性毛細血管密度。
通過亞氨基四氫噻吩進行Hb巰基化的動力學.可通過估計巰基化作用的程度來追蹤亞氨基四氫噻吩對Hb的脒化作用。與一定量的亞氨基四氫噻吩一起孵育給定長度的時間后，使用二硫代吡啶如Ampuslki(1969)所述評估Hb樣品中的巰基數。4，4′二硫代吡啶(4-PDS，MW＝220.32，Aldrich Chemical Co.)的母液，通過把該試劑溶解在PBS中達到3mM的終濃度(或者如果需要的話更高)來制備。與亞氨基四氫噻吩一起孵育的Hb的等分試樣，與二硫代吡啶一起孵育，并通過可于324nm處監(jiān)控的4-PDS轉化成4-硫代吡啶酮(4-TP)來評估蛋白上的反應性巰基數(ε324＝1.98×10-4M-1cm-1)。
亞氨基四氫噻吩依賴的巰基化作用介導的基于PEG-馬來酰亞胺的HbA的保守性PEG化作用.磷酸緩沖鹽溶液(PBs)中的HbA(0.5mM四聚體)，在存在對亞氨基四氫噻吩而言2倍摩爾過量的PEG-5000的馬來酰亞胺(馬來酰亞胺)苯基氨基甲酸酯(BioAffinity System)或馬來酰亞胺乙基PEG-5000(Shearwaters)或PEG-1000的馬來酰亞胺苯基氨基甲酸酯時，與所需水平的摩爾過量的亞氨基四氫噻吩(BioAffinitysystems)于4°(或室溫)反應所需的一段時間。在4℃反應比在室溫優(yōu)選，因為室溫時巰基化Hb的巰基發(fā)生一定量的氧化，甚至在存在PEG-馬來酰亞胺時，而這在4℃顯著降低。PEG化反應通常在蛋白濃度0.5mM時發(fā)生，但是它也可使用Hb濃度為0.25mM或者1mM Hb進行。
巰基化作用介導的PEG化作用也以兩步反應研究，首先使Hb與所需過量的亞氨基四氫噻吩一起孵育來進行Hb巰基化作用，然后添加所需摩爾過量(相對于亞氨基四氫噻吩)的PEG-馬來酰亞胺來完成巰基化Hb的PEG修飾。
為了生產不致高血壓的Hb，使用對Hb(表達為四聚體)10倍摩爾過量進行巰基化作用，以及用20倍摩爾過量的所需PEG-馬來酰亞胺進行巰基化蛋白的PEG化作用。這通常以一步反應進行，以減少巰基的氧化。如果在室溫進行反應，一般需要4到6小時的反應時間來獲得所需的分子。當在4℃進行反應時，通常進行過夜反應(～16小時)。
使用Mal-Phe-PEG-10,000，通過巰基化作用介導的基于PEG-馬來酰亞胺的PEG化作用，以0.25mM的蛋白濃度進行Hb的表面裝飾，因為以更高濃度的Hb進行反應導致不完全反應，可能是由于當使用20倍摩爾過量的Mal-PEG-2000時，反應混合物的粘度較高。
使用截斷值為12到14,000道爾頓的透析袋，對反應產物用PBS進行廣泛地透析。未反應的(過量PEG-馬來酰亞胺)透析出去；PEG化產物使用連接到Pharmacia Acta上的Superose 12柱通過大小排阻色譜進行純化。從而分離PEG化的Hb，(PEG5K)6-Hb貯存于-80°直到進一步需要。
對巰基化作用介導的基于PEG-馬來酰亞胺的PEG化作用的大小增加的測定.使用Pharmacia FPLC系統(tǒng)，分析Hb的大小增加與各種巰基化作用介導的基于PEG-馬來酰亞胺的保守性PEG化作用的關系。使用串聯連接的2個Superose柱進行大小排阻色譜。使用PBS pH7.4，以0.5ml/mi n的流速于室溫300.15MHZ于29℃，使用5mm探針對樣品進行洗脫。Hb樣品為在0.1M中4到7％濃度。
II.結果A)保守性PEG化作用技術的開發(fā)(i)HbA的流體動力學體積增加作為巰基化作用介導的基于馬來酰亞胺化學的Hb的PEG化作用的結果.缺乏和存在亞氨基四氫噻吩時，當Hb與20倍摩爾過量的Mal-Phe-PEG5K一起于室溫孵育4.5小時時，Hb的大小排阻色譜模式顯示于圖2A中。在缺乏亞氨基四氫噻吩本身時，Hb用PEG-Phe-PEG-5000進行完全修飾(圖2A，b)。未修飾的Hb于大約57分鐘洗脫(圖2A，a)，而與PEG-Phe-PEG 5K一起孵育的HbA于大約50分鐘洗脫。該產物的洗脫位置對應于在它的兩個Cys-93(β)處用Mal-Phe-PEG5K修飾的Hb。具有在Cys-93(β)處連接的各相應PEG-鏈的(SP-PEG10K)2-HbA以及(SP-PEG20K)2-HbA的洗脫位置為該柱上大約47和44分鐘，并標記作為參考。
在Hb與Mal-Phe-PEG 5K的反應混合物中包括亞氨基四氫噻吩，該修飾的Hb比(PEG5K)2-HbA的位置從大小排阻色譜柱中較早洗脫。新的PEG-馬來酰亞胺位點已經明顯產生，從而在Hb上提供了新PEG-馬來酰亞胺反應位點。以亞氨基四氫噻吩濃度依賴性方式，該修飾的Hb(PEG化的Hb)在大小排阻色譜中較早洗脫。亞氨基四氫噻吩的濃度越高，修飾的Hb洗脫的位置越早，表明Hb巰基化作用的水平增加，其作為反應混合物中亞氨基四氫噻吩濃度增加的函數，負責Hb表觀分子大小的增加。存在2.5mM的亞氨基四氫噻吩(每個四聚體5倍摩爾過量)時產生的PEG化Hb，在靠近(SP-PEG10K)2-HbA的位置洗脫(圖2A，d)。存在5mM亞氨基四氫噻吩時形成的樣品，洗脫非常接近(SP-PEG20K)2-HbA的位置，但其流體動力學體積比(SP-PEG20K)2-HbA的稍小(圖2A，e)。不過該物質在峰的上升側有小的平緩區(qū)域(shoulder)。
進一步增加亞氨基四氫噻吩的濃度到7.5mM，而不改變Mal-Phe-PEG的濃度為同樣的(10mM)，PEG化Hb峰的洗脫模式變得稍寬，但是作為平緩區(qū)域洗脫的產物產量只有較小的增加(數據未顯示)。甚至增加亞氨基四氫噻吩的濃度到10mM，洗脫模式也沒有顯著改變，除了在上升側的平緩區(qū)域物質的濃度有較小改變之外。
PEG的濃度對上升側平緩區(qū)域的影響已經研究作為PEG-馬來酰亞胺濃度增加的函數。當Mal-Phe-PEG的濃度增加到接近圖2e中使用的濃度的兩倍時，該平緩區(qū)域顯著減小(幾乎消失)，對主峰的洗脫位置的影響極小。
10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩對Hb進行巰基化作用的動力學顯示于圖2A中(插圖a)。用10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩巰基化的Hb平均每個四聚體攜帶～7個反應-SH基(針對二硫代吡啶基)，其中兩個為Cys-93(β)固有的-SH基，剩余的為通過使亞氨基四氫噻吩與Hb的反應性表面ε-氨基(Hb的γ-巰基丁脒化)反應引入的內在巰基。由于已經使用了10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩，巰基化作用的效率接近50％。PEG化Hb具有大約每個四聚體0.5摩爾的反應巰基(在非變性條件下)，其表明，平均而言，在產生該PEG化Hb中接近～6.5個拷貝的PEG鏈被引入到Hb上。
蛋白濃度為0.5mM時Hb的巰基化作用也已經作為亞氨基四氫噻吩濃度的函數研究(圖2A，插圖b)。增加亞氨基四氫噻吩的濃度，從平均每個四聚體引入5個外在巰基的10倍摩爾過量到30倍，其幾乎倍增巰基化Hb上的外在巰基數。然而，PEG化作用中看到的大小增加僅是很小的，其表明PEG化Hb不能在巰基化Hb的所有外在巰基上反應。這些結果解釋為表明在存在10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩和20倍摩爾過量的Mal-Phe-PEG5K時，Hb的PEG化顯著覆蓋了Hb分子表面，產生“擁擠狀況”，其中巰基化Hb處于通過該巰基化作用介導的PEG-5000馬來酰亞胺依賴的PEG化作用的PEG增加Hb分子大小的該階段，變得更抵抗對PEG化Hb的附加外在巰基的修飾。因此，對于所有的后續(xù)研究，利用PEG對Hb進行表面裝飾而產生的PEG化Hb，使用10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩(相對于四聚體蛋白)，存在20倍摩爾過量的Mal-Phe-5000PEG。
(ii)巰基化作用介導的基于馬來酰亞胺-pEG的Hb PEG修飾中的靈活可變性.使用10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩和20倍摩爾過量的PEG-馬來酰亞胺，在Superose 12柱上進行大小排阻色譜作為檢測系統(tǒng)，研究了溫度，pH，連接化學，以及PEG-馬來酰亞胺中PEG的分子大小對(PEG-5K)6-HbA形成的影響。當溫度降低至4℃時，PEG-鏈與巰基化蛋白連接的速度似乎減緩，但是Hb的巰基化速度在很大程度上沒有受到影響，進行該反應達9小時以確保反應完全，但是方便地通常選擇過夜反應(14到16小時)(圖2B，曲線c)。兩步法進行PEG化作用，首先巰基化，然后PEG化，也沒有表現出影響大小增加(數據未顯示)。在三種pH值，pH6.5，7.4和8.5用PEG進行表面裝飾。把使用10mM磷酸緩沖液在pH6.5，7.5和8.5時形成的PEG化產物，與在PBS中于pH7.4時形成的產物進行了比較。所有的產物在通過表面裝飾獲得的大小增加方面是相當的。
用PEG-5000進行表面裝飾時觀察到的大小增加也是獨立于連接化學的，使用馬來酰亞胺-苯基-PEG-5000獲得的反應產物具有與用PEG-乙基-PEG-5000所產生的產物基本相同的流體動力學體積(圖2B，曲線d)。在給定的巰基化作用條件下，Hb的大小增加對PEG-馬來酰亞胺中PEG的分子大小是敏感的。增加PEG-鏈的質量從5000到10,000，觀察到的大小增加高于用PEG-5000馬來酰亞胺所觀察到的(圖2B，曲線e)。
(iii)(PEG5)6-HbA的純化.為了產生達1gm的(PEG)6-HbA的物質，開發(fā)了凝膠過濾方案。常規(guī)地將HbA(0.5mm)與10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩以及20倍摩爾過量的馬來酰亞胺PEG在磷酸緩沖鹽溶液(pH7.4)中一起孵育4到6小時，然后反應混合物用100倍過量的PBS進行透析更換3次，以除去過剩的(未反應的)亞氨基四氫噻吩和馬來酰亞胺PEG。透析過的樣品濃縮到大約1mm，并利用連接到Pharmacia Acta Explorer 10上的制備Superose 12柱進行凝膠過濾。在上面所討論的條件下PEG化的HbA樣品的典型色譜模式顯示于圖6A中。于3種波長監(jiān)控洗脫，以便于監(jiān)控任何沒有與Hb反應的PEG-馬來酰亞胺的洗脫。PEG化Hb洗脫比存在于樣品中的未反應PEG-馬來酰亞胺更前得多。凝膠過濾的PEG化樣品濃縮到大約6gms/dL。在巰基化作用介導的基于馬來酰亞胺化學的PEG化反應過程中，或者在后續(xù)的純化步驟過程中，HbA不經歷任何可檢測到的自動氧化而產生met-Hb型產物。PEG化Hb樣品可貯存于-80℃長達至少1年而不經歷任何自動氧化。
(iv)對由于Hb保守性PEG化作用而致的Hb大小增加進行定量.把純化的(PEG-5K)6-Hb的洗脫模式與使用雙馬來酰亞胺苯基PEG-600在四聚體間交聯橋的αα-富馬酰Hb的洗脫模式進行了比較。(圖3，插圖，b和a)。如前面所述的，保守性PEG化Hb-(PEG-5K)6-Hb，稍小于(PEG20K)2-HbA，但高于(PEG10k)2-HbA。它的流體動力學體積對應于分子量大約250,000道爾頓的球狀蛋白的流體動力學體積。由于其上的PEG質量為～30,000，因此計算的分子量只有95,000道爾頓。但它的流體動力學體積對應于分子量為250,000的蛋白的流體動力學體積。因此，以6個拷貝的PEG-5000鏈引入30,000質量到Hb上，等同于整合近180,00質量的球狀蛋白到Hb上。從而，PEG顯示出增加Hb流體動力學體積的潛能，其大約為緊密包裝的球狀蛋白的6倍。該結論與Manjulaetal(2002)最近從他們的PEG化作用研究中得到的相似，其中PEG化作用位點限于Cys-93(β)，獲得大小增加作為使用的PEG-馬來酰亞胺中PEG分子大小的函數。從而作為PEG化作用的結果發(fā)生的大小增加顯示與連接到Hb上的總PEG-質量直接相關，而且當PEG質量以不同拷貝數呈現時是累加的。
通過新的巰基化作用介導的基于馬來酰亞胺化學的PEG化作用方案產生的(PEG5K)6-HbA的大小排阻色譜模式，與Enzon(PEG5K)10-Bv-Hb(一種非血管活性的PEG化的Hb)的大小排阻色譜模式進行了比較(圖3插圖，曲線c)。該物質在分子大小分布方面也相當均一，正如(PEG-5K)6-Hb那樣。該PEG化的Hb具有每個四聚體10個拷貝的PEG-5000(總PEG-質量為50,000)，并因此預期具有比(PEG-5K)6-Hb更高的大小增加。然而，對該Hb觀察到的大小增加不如對(PEG-5K)6-Hb觀察到的那么多。這種異常的分子基礎現階段不是很顯而易見的。另一方面，鑒于每個四聚體的PEG質量與(PEG-5K)6-Hb中的相當這一事實，PHP，每個四聚體攜帶10個拷貝的PEG-3000的另一種PEG化Hb，將期望具有與(PEG-5K)6-Hb相當的流體動力學體積。PHP是非常不均一的(圖3，插圖，曲線d)。它攜帶一些量的大小增加小于(PEG-5K)6-Hb的物質，和一些大小增加與(PEG-5K)6-Hb相當的物質，以及一些大于(PEG-5K)6-Hb的物質。雙功能PEG-3000用于表面裝飾，以及該樣品中存在四聚體內和或四聚體間的交聯，可能促成了PHP中高水平的不均勻性。
B)(PEG5)6-HbA的分子，依數和功能表征.
(i)(PEG5)6-HbA的1H-NMR光譜學.Hb的質子核磁共振光譜學是監(jiān)控HbA的三級和四級結構改變的極好的工具，其中該變化在任何給定情景中伴隨著化學修飾或突變。Cys-93(β)位于分子的構象敏感區(qū)域，Cys-93(β)對巰基特異性試劑的反應性是分子氧構象的獨特特征，在脫氧結構中它是非反應性的。圖4A對一氧化碳和脫氧形式的(PEG20)2-HbA和(PEG5)6-HbA與HbA于pH7.0，29℃在0.1M磷酸緩沖液中的質子NMR光譜進行了比較。這兩個樣品每個四聚體中幾乎相同量的PEG質量[(PEG20)2-HbA中40,000對(PEG5)6-HbA中30,000]。除了對PBG化樣品由于Hb的PEG化作用的結果而致的分子大小的增加而觀察到了較寬的共振外，在光譜范圍10到14ppm的化學位移上沒有顯著差異，表明利用PEG-20,000僅僅在Cys-93(β)處或者利用PEG-5000在Cys-93(β)和Hb的至少4個其它的ε-氨基處進行Hb的PEG化的結果，蛋白的α1β1界面沒有改變。圖4B對兩種PEG化Hb的環(huán)流-位移(ring-current-shifted)質子共振，與一氧化碳形式的HbA的環(huán)流-位移質子共振進行了比較。環(huán)流位移質子共振中有某些改變，反映了在PEG化Hb樣品的血紅素的微環(huán)境中的某些擾動。圖4C顯示了脫氧形式的PEG化Hb的α和β-鏈的近端組氨酸殘基的超精細位移的NδH1H共振。在-75ppm處的化學位移，其歸于β-鏈的近端組氨酸的NδH，向前場位移了-2到-3ppm，其反映PEG化樣品中β-血紅素環(huán)境的擾動。這種向前場位移在(PEG20)2-HbA中稍微比(PEG5)6-HbA更顯著。圖5D對兩種HbA的PEG化樣品與脫氧形式的HbA的超精細位移和可交換質子共振進行了比較。超精細位移的共振比HbA的更寬。此外，在16到24ppm的光譜范圍內有一些共振改變，其反映了作為分子PEG化作用的結果，Hb的β-血紅素的微環(huán)境的改變。14ppm處的共振，其歸于α1β2亞基界面中α-Tyr(42)與β-Asp(99)之間重要的H-鍵，在PEG化樣品中沒有改變。因此，在PEG化Hb的α1β2亞基界面沒有改變。
(ii)(PEG5)6-HbA的分子半徑.通過動態(tài)光散射測定(PEG5)6-HbA的分子半徑，并與我們前面測定的(PEG5)2-HbA和(PEG20)-HbA的分子半徑進行比較(參見表I)。(PEG5)6-HbA的分子半徑為大約6.8nm。該分子半徑稍小于(PEG20)2-HbA的，(PEG20)2-HbA的分子半徑先前估計為7.04。(PEG5)2-HbA和HbA的值分別為4.2和3.1。因此，當用大約6個拷貝的PEG-5K鏈進行表面裝飾時，HbA的分子半徑超過加倍，即使加到該蛋白上的質量為僅僅大約30,000。從而(PEG5)6-Hb顯示了增加的分子大小，其為對分子量為94,000的球狀蛋白所預期的，而且在該Hb的大小增加區(qū)域的PEG的包裝不象在蛋白核心一樣致密。Enzon PEG Bv-Hb(其分子量為114,000)的分子半徑小于(PEG5)6-Hb，為5.53nm，接近(PEG-10K)2-HbA和(PEG-5K)4-狗Hb的分子半徑。還可注意到利用Mal乙基PEG-5000產生的(PEG5)6-Hb的分子半徑差不多比利用Ma l-Phe-5000產生的小10％。(PEG-10K)6-Hb的分子半徑為大約9.8，因此需要使用更高分子大小的PEG來獲得分子半徑大于用(PEG-5K)6-HbA獲得的7nm的PEG化Hb。
(iii)通過保守和非保守PEG化作用方案產生的PEG化Hb的分子密度比較.由于通過PEG化作用獲得的大小增加(流體動力學體積增加)，幾乎比在球狀蛋白中的有效6倍(在同等質量的基礎上)，意味著在增加體積的PEG化Hb中原子的分子密度低于緊密的球狀蛋白中。在表I中也給出了增加分子體積的不同PEG化Hb中PEG的分子密度。隨著連接到Cys-93(β)上的PEG的分子量從5000增加到了20,000，增加分子體積的Hb中PEG的分子密度幾乎降低了50％。分子密度的降低意味著PEG-鏈間的相互作用降低，以及給定的PEG化Hb的PEG-殼內的溶劑分子的占據增加。當PEG殼內的PEG密度低時，可認為位于“蘑菇構象”中，而當PEG-殼中的密度高時，它可以被認為是處于“刷狀緣構象”中，而且(PEG5)6-Hb中，PEG-殼的分子密度甚至小于(PEG20)2-Hb中的分子密度。另一方面，Enzon PEG Bv-Hb的PEG-殼的分子密度很高，表明其PEG-殼內的PEG-鏈之間的相互作用比(PEG5)6-Hb的PEG-殼中的PEG-鏈之間的相互作用強。該研究清楚地反映了，Enzon PEG化Hb與通過保守的PEG化技術產生的新PEG化Hb之間在PEG-鏈的包裝上的差異。由保守的PEG化作用產生的樣品可以被認為處于“蘑菇構象”，而Enzon PEG化樣品處于“刷狀緣樣構象”。
(iv)(PEG5)6-HbA的依數性.圖5比較了(PEG5)2-HbA與(PEG5)6-HbA的粘度作為蛋白質濃度的函數，其范圍為1到10gm/dl。隨著蛋白質的濃度從1gm/dl增加到10gm/dl，(PEG5)2-HbA的粘度只顯示小的粘度增加，并且PEG化溶液的粘度顯示與蛋白質濃度成正比。另一方面，即使(PEG5)6-HbA溶液的粘度與(PEG5)2-HbA的高度稀釋溶液的粘度相當(1gm/dl)，前者的粘度隨蛋白質濃度呈指數級增加。還顯示了濃度為1到5gm/dl的攜帶10當量的PEG-5K鏈(通過異肽鍵連接到牛Hb的α和ε-氨基)的Enzon PEG牛Hb的粘度來進行比較。在所有研究的濃度，Enzon PEG牛Hb的粘度與(PEG5)6-HbA的粘度相當。該結果表明鍵的化學性質和PEG化作用的位點強烈影響PEG化作用，或者在存在每個四聚體6個拷貝的PEG-5K鏈時PEG化Hb溶液的粘度達到飽和值。
圖6顯示了PEG化Hb樣品的膠體血液滲透壓，作為蛋白質濃度的函數。樣品的膠粒滲透壓增加，作為蛋白質濃度的函數。(PEG5)2-HbA的這種增加是小的，并且看起來隨蛋白質的濃度(在1至6.8gm/dl范圍內)線性增加。另一方面，(PEG5)6-HbA溶液的膠粒滲透壓隨增加的蛋白質濃度而指數級增加。同樣，當濃度匹配時，Enzon(PEG5)10-Bv-Hb的膠粒滲透壓與(PEG5)6-HbA的膠粒滲透壓相當。該結果表明，PEG化Hb樣品的膠粒滲透壓與樣品的粘度直接相關。
(v)(PEG5)6-HbA的功能特性.表I顯示了50mM Bis-Tris/50mM Tris醋酸鹽中，pH7.4以及37℃時，(PEG5)6-HbA的氧親和力，以及在存在變構效應物時它的調節(jié)。隨著HbA的PEG化作用，Hb的P50降低(增加的氧親和力)，從對照值的8.0到6.5。存在5倍過量的DPG時，通過結合于ββ-裂縫而降低HbA的氧親和力的效應物對其氧親和力沒有顯著影響。另一方面，存在1M氯化鈉會稍微降低PEG化Hb的氧親和力(P50從6.5增加到8.5)，并與缺乏氯化物時未修飾的HbA相當。另一方面，未修飾的Hb的氧親和力，在存在1.0M的氯化物時顯著地降低。在存在L-35(通過結合于分子的αα-末端降低Hb的氧親和力的變構效應物)時，增加的(PEG5)6-HbA的P50具有一定的氧親和力降低影響，但是顯著低于對未修飾的HbA觀察到的。因此，巰基化作用介導的基于馬來酰亞胺化學的PEG化HbA幾乎完全抑制了HbA對DPG存在應答的傾向，并且強烈降低該分子對氯化物和L-35應答的傾向。
還在PBS中測定了(PEG5)6-HbA的氧親和力，因為處于循環(huán)中的樣品的值應該與在PBS中的相當。與對照HbA(P50＝15mmHg)相比，甚至在PBS中，(PEG5)6-HbA顯示較高的氧親和力(P50＝9.5mmHg)。(PEG5)6-HbA的氧親和力僅僅稍微高于(PEG5)2-HbA(P50＝11.8)的氧親和力。因為(PEG5)6-HbA具有如(PEG5)2-HbA中一樣修飾的Cys-93(β)，此外在HbA的賴氨酸殘基的ε-氨基上進行了另外的修飾，氧親和力結果表明HbA的ε-氨基的巰基化作用介導的PEG化作用本身不顯著地影響Hb的氧親和力。利用馬來酰亞胺-乙基-PEG5K對HbA進行巰基化作用介導的表面裝飾商業(yè)可獲得的馬來酰亞胺PEG-試劑在馬來酰亞胺部分與PEG-鏈之間具有烷基間隔連接。為了建立這里開發(fā)的新PEG化方法對馬來酰亞胺烷基PEG試劑的一般原則，我們在巰基化作用介導的基于馬來酰亞胺化學的反應中用Ma1-乙基-PEG5K代替Mal-Phe-PEG5K。HbA與該PEG的反應也象期望的那樣進行，除了反應效率稍微降低外。產生的并期待攜帶平均6個PEG-鏈的產物[(SE-PEG5K)6-HbA]，產生類似于(SP-PEG5K)6-HbA的凝膠過濾模式，除了在凝膠過濾上有點延遲洗脫外。此外如表2中所示，(SE-PEG5K)6-HbA的分子半徑稍微小于(SP-PEG5K)6-HbA的分子半徑。
B.(PEG5K)6-HbA的高血壓活性(i)在倉鼠中通過10％最大負荷實驗進行研究。通過在倉鼠皮褶窗模型中進行10％最大負荷實驗中，測量平均動脈壓以及測量小動脈的直徑(A2)，研究了以2個和6個拷貝的PEG5K鏈進行PEG化作用后Hb的血管收縮活性的改變。如圖7A所示，(PEG5K)2-HbA灌輸引起在幾分鐘內消退的血壓的立即增加。另一方面，(PEG5K)6-HbA的樣品在相同的期限內沒有引起血壓的改變。圖7B比較了用10％的最大負荷的(PEG5K)2-HbA與(PEG5K)6-HbA溶液灌輸倉鼠不同時間期限之后的動脈直徑。(PEG5K)6-HbA樣品保留了比(PEG5K)2-HbA樣品更接近起始值的肺泡直徑。這些分析證實了無細胞Hb PEG化到6個拷貝PEG5K鏈的水平抑制了無細胞Hb的內在血管活性至顯著水平。
(ii)用(PEG5K)6-HbA進行50％換血對倉鼠中功能性毛細血管密度的影響。圖8描繪了在用(PEG5K)6-HbA進行50％換血的倉鼠中毛細血管血流，并與用對照(無換血)以及用αα-富馬酰HbA進行50％換血的毛細血管血流進行比較。由此，顯然用(PEG5K)6-HbA進行50％換血的倉鼠保持了高的毛細血管密度，而αα-富馬酰HbA顯著地降低了功能性毛細血管密度。因此，用PEG-5000鏈對Hb進行表面裝飾可以中和無細胞Hb的內在血管收縮活性。
III.討論已經開發(fā)了一種通過PEG化作用增強Hb的分子大小而不改變該蛋白質的表面電荷的新的，簡單并靈活的方案。這包括在氧或脫氧條件下通過與亞氨基四氫噻吩反應活化Hb的一組ε-氨基作為PEG馬來酰亞胺反應性位點(巰基化作用)，然后用所需的PEG-馬來酰亞胺修飾巰基化Hb。該方法已經最佳化以產生攜帶6個拷貝的PEG-5000的PEG化Hb，而且已經發(fā)現這是不致高血壓的。
缺乏亞氨基四氫噻吩時，利用PEG-馬來酰亞胺在氧條件下進行Hb的PEG化作用限于對Cys-93(β)的修飾，也即，每個四聚體2個拷貝。該PEG化的Hb顯示與分子量為128KDa的球狀蛋白質相當的流體動力學體積。其他的4個半胱氨酸殘基被掩蓋，并且不能在使用的反應條件下與PEG馬來酰亞胺反應。Cys-93(β)也不能用于與PEG-馬來酰亞胺反應。
以亞氨基四氫噻吩濃度依賴性方式，亞氨基四氫噻吩激活Hb的一些ε-氨基作為PEG-馬來酰亞胺的反應位點。亞氨基四氫噻吩，γ-巰基butyrimidate的環(huán)化形式，不攜帶游離的巰基，并且一旦它與ε-氨基反應就原位產生巰基。經其與Hb反應，衍生一組酰胺化物反應性ε-氨基作為γ-巰基butyrimidinyl部分，在遠端具有游離的-SH基團。ε-氨基的內在正電荷在該衍生的ε-氨基中得以保存。這些新的外在巰基為官能化作為馬來酰亞胺的所需分子大小的PEG-鏈附著所靶向的位點。然而，利用PEG與馬來酰亞胺之間的烷基接頭或烷基酰胺接頭把PEG官能化作為馬來酰亞胺的其他方法是同樣有效的PEG化劑，也即，該PEG化反應是基于馬來酰亞胺化學作用的。這種PEG化作用的方法因此具有保留PEG化Hb中的Hb的凈電荷的優(yōu)點。
與10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩一起孵育的氧Hb幾乎激活Hb的5個ε-氨基作為PEG-馬來酰亞胺反應位點。當20倍摩爾過量的PEG-馬來酰亞胺與10倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩一起存在時，產生具有平均6個PEG5K-鏈的PEG化產物[(PEG5)6-Hb]。引入的6個PEG-鏈中的2個位于Cys-93(β)的巰基上，其余的位于Hb的巰基化Lys殘基上。攜帶6個PEG-5000鏈的Hb看起來產生了一定程度的對引入另外的PEG-5000鏈的抗性。是否這反映了Hb上一定程度的均一表面覆蓋，遮蔽了通過亞氨基四氫噻吩激活的Hb的其他表面α-氨基的巰基使其不能與PEG馬來酰亞胺反應，暫時還不清楚。
計算的(PEG5)6-Hb的質量為～94Kda。然而，在大小排阻色譜法中，(PEG5)6-Hb的行為如同它的分子大小為250kDa數量級，即(PEG5)6-Hb顯示了相當于分子量為～250KDa的球狀蛋白質的流體動力學體積。因此，在球狀蛋白質的分子尺度上，PEG鏈增加了Hb的流體動力學體積，分子體積幾乎為球狀蛋白質的6倍。
早先利用PEG-馬來酰亞胺產生的PEG化Hb的分子體積的增加，與在目前研究中用賦予這種大小增加的PEG質量所產生的PEG化Hb的分子體積的對比表明，在每種產物內PEG-鏈的包裝是不同的。在以前的位點特異性PEG化產物研究中，PEG-鏈的分子量增加降低了增加大小的Hb分子的PEG-殼中的PEG的分子密度。這可以解釋為PEG鏈的分子大小錨定于2個Cys-93(β)，它們之間可以彼此相互作用，從而增加其中PEG-鏈存在于分子運動中的分子體積(蛋白質周圍的PEG殼)。當由6個PEG-5000鏈產生Hb周圍的PEG-殼時(2個位于Cys-93(β)上，其它的4個位于亞氨基四氫噻吩激活的α-氨基上)，仿佛達到用于它們的分子運動的最大空間。對(PEG10)6-Hb進行初步計算，表明在其內PEG-鏈彎曲的分子空間具有與(PEG5)6-Hb的PEG-殼相當的分子密度，或可能甚至比(PEG5)6-Hb更低的密度。
一個驚奇觀察是Enzon PEG Hb的PEG-殼的分子密度顯著高于(PEG5)6-Hb的PEG-殼的分子密度的事實。這2種PEG化Hb利用兩種非常不同的化學作用組裝。本發(fā)明的PEG化作用利用保守的方案進行，因此Hb分子的凈電荷保留在PEG化產物中，即在PEG化Hb中蛋白質的水化層應當經歷有限的微擾。Enzon PEG化作用利用非保守性方法進行，其中衍生的α與a氨基的原始正電荷不保留在最終產品中。因此，該方法預期會擾亂蛋白質的水化殼。無論分子基礎是什么，這兩種方法看起來已經產生了Hb周圍的PEG-殼，其具有在禁閉Hb分子的PEG-殼內的非常不同的PEG-鏈結構(分子密度)。
利用馬來酰亞胺-乙基-PEG 5000產生的(PEG5)6-Hb的PEG-殼的分子密度高于利用馬來酰亞胺-苯基-PEG 5000產生的(PEG5)6-Hb的PEG-殼中的分子密度，但是不象Enzon PEG-Hb的PEG-殼中的分子密度一樣高。描述PEG與官能化基團之間的綴合連接與間隔鍵的錨定位點處PEG-鏈的化學作用位于三種產物中，下面用圖解法比較了琥珀酰亞胺基苯基PEG化Hb，琥珀酰亞胺基乙基PEG化Hb和乙酰氨基PEG化Hb。馬來酰亞胺苯基PEG化Hb和馬來酰亞胺乙基PEG化Hb都具有作為共同的分子實體的活化臂(γ-巰基丁酰亞胺基)，綴合基團(琥珀酰亞胺基)。Mal-Phe-PEG試劑具有作為PEG鏈與綴合臂之間的接頭的苯基乙基氨基甲酸酯，而Mal-乙基-PEG試劑具有乙基接頭。因此，在前者的情況下，利用較長的接頭鏈，而且在該接頭中存在苯基，使鏈在該錨定部分較剛性，而在后面的使PEG鏈連接到Hb上的情況中，缺乏苯基環(huán)產生更高程度的旋轉自由。另一方面，Enzon PEG-Hb沒有活化臂，由此其PEG-鏈更接近蛋白質表面。它具有作為綴合基團的乙酰胺基部分，沒有綴合單元與PEG-鏈之間的連接基團。因為綴合臂的異肽鍵期望具有部分雙鍵特性，還可以預期該PEG化作用的化學方法內在的一定程度的剛性。因此，在Enzon策略中(保守的PEG化方法)，使PEG很接近蛋白質表面(離ε-氨基的原始正電荷2到3內)，而巰基化作用介導的基于PEG馬來酰亞胺的PEG化作用使PEG-鏈位于離蛋白質表面有一段距離處(在延伸構象中遠離ε-氨基的原始正電荷大約15到21)。因此，保守的PEG化作用產生的PEG-殼可以具有蛋白質核心與PEG-殼之間有明顯邊界的Hb水合球面。這表明PEG化Hb的PEG-殼內的PEG的分子密度與連接化學作用(PEG與馬來酰亞胺之間的連接)和偶聯化學作用-PEG與Hb側鏈之間的連接均相關。
本發(fā)明重要發(fā)現是(PEG5K)6-Hb是不致高血壓的。(PEG5K)6-Hb的物理/化學特性導致中和了無細胞Hb的內在致高血壓活性。(PEG5K)6-HbA無疑是一種大小增加的Hb分子。增加Hb的分子大小是發(fā)展用于克服Hb的高血壓活性的早期設計策略之一，其基于Hb外滲到胞間隙中的觀念，并且因此將在捕獲NO方面比在血漿中循環(huán)的Hb更有效。這種觀念似乎得到250KDa范圍內的分子大小的低聚化Hb較少血管活性的觀察結果的支持。有趣的是注意到，Matheson等最近已經生產了分子大小遠遠超過300kDa，并且平均分子半徑24nm(半徑分布在12-33nm之間的不均一產品)的低聚化產物，其不出現在腎門淋巴中，指示缺乏外滲。該產物也完全抑制了升壓反應。Sakai的觀察證明分子大小與升壓效應度之間的相關性，升壓反應的程與分子大小成反比。直徑接近1000nm的包囊的Hb不產生血管收縮。然而，(PEG5K)6-Hb的分子大小僅僅為大約7nm，與處于臨床試驗的許多目前的低聚化Hb的分子大小相當。因為這些中的大多數顯示不同程度的血管收縮，大小增加本身不會是使(PEG5K)6-Hb不致高血壓的主要因素。
然而，本發(fā)明的保守PEG化Hb，攜帶平均6個拷貝的PEG-5000鏈，是不致高血壓的，并且顯示出接近Enzon PEG-Hb的粘度與膠粒滲透壓的事實，揭示了本發(fā)明的新的保守的PEG化技術的一些潛在的優(yōu)點。(i)具有每一四聚體6個拷貝的PEG-5000鏈的Hb的保守PEG化作用，產生的大小增加(增加流體動力學體積)優(yōu)于以10個拷貝的PEG-5000鏈對牛Hb的非保守PEG化作用所產生的大小增加。(ii)保守的PEG化作用增加流體動力學體積的較高效率表明，PEG-鏈在Hb的分子表面上的包裝密度較低。這與Hb分子周圍的PEG-鏈產生的新水化殼(充水的外殼)中PEG的計算分子密度一致。(iii)保守的PEG化作用技術比非保守PEG化作用更高效地增加了粘度和膠粒滲透壓；當對共價結合到Hb上的PEG-5000鏈標準化比較時這顯而易見。這表明在測定與用PEG進行表面裝飾有關的粘度變化中，在通過PEG化作用在Hb周圍產生的新PEG殼中PEG的分子密度的可能作用，以及它們產生不致高血壓的Hb分子的傾向。
基于Hb的載氧體的早期設計企圖模仿紅細胞的氧親和力，以具有低的氧親和力。Enzon選擇牛Hb產生PEG化Hb，將賦予最終產物低氧親和力。雖然牛Hb的氧親和力徑非保守性PEG化作用增加，本發(fā)明保守地PEG化Hb的氧親和力顯著高于Enzon PEG化Hb的氧親和力。自動調節(jié)理論顯示，當灌輸低氧的基于Hb的載氧體時，發(fā)生血管收縮作為循環(huán)的動脈側過量供氧的結果。預計通過增加基于Hb的載氧體的氧親和力可以減少血管收縮。(PEG5K)6-HbA的氧親和力高于EnzonPEG-Hb的氧親和力，而且本發(fā)明僅具有6個拷貝的PEG-5000鏈的保守PEG化Hb的不致高血壓的方面(與具有稍微低于本發(fā)明保守PEG化Hb的氧親和力的Enzon PEG-Hb中10個拷貝的PEG-5000相比)可能是本制品的較高的氧親和力的貢獻的反映。因此我們推測(PEG5K)6-Hb的不致高血壓的特性是多因素事件，而且要求設計多種Hb，其模仿Hb的僅僅一個物理或功能特性，并建立這些分子的血管活性。
(PEG5K)6-Hb-保守地PEG化Hb具有許多這些年來已經發(fā)展的最小化無細胞Hb的血管活性所需要的屬性(i)Hb氧親和力增加以限制無細胞Hb在血管活性小動脈中的氧卸載；(ii)保留協同結合以確保毛細血管床中的氧卸載；(iii)增加的分子大小(流體動力學體積)以減少外滲；(iv)Hb溶液的粘度增加以在小動脈壁上產生適當的剪切應力，并降低對于氧Hb，和氧，二氧化碳和/或一氧化氮的擴散常數；和(v)比傳統(tǒng)修飾的Hb增加的膠體滲透壓，其增加了血液代用品的有效性，作為一種在許多血漿擴容劑的制劑中特色設計的血漿擴容劑。因此，(PEG5K)6-Hb的觀察結果是不驚奇的。
雖然賦予(PEG5K)6-Hb的多種物理參數和功能特性的本性現階段是不明確的，該新的保守地PEG化Hb應該被認為是一類新的基于Hb的載氧體的成員，其遠離開發(fā)基于Hb的載氧體的常規(guī)設計策略。這里也應該注意，賦予一組依數性質和氧親和力本身不足以使Hb分子不致高血壓。如同Manjula等最近所示的，增加高氧親和力(其氧親和力與(PEG5k)6-Hb的氧親和力相當)PEG化Hb[在Cys-93(β)處位點特異性地PEG化]的分子體積，其粘度和膠粒滲透壓增加，但是在Hb的血管活性方面沒有任何顯著的變化。另一方面，每一四聚體低于(PEG20)2-Hb的PEG-鏈凈重的(PEG5K)6-Hb是不致高血壓的。相對于2個拷貝的PEG-20K所提供的，6個拷貝的PEG-5K鏈對Hb的分子表面的更好的保護可能是對該觀察結果最好的解釋。這提出了一個重要的問題，即PEG-5K鏈在Hb的分子表面上的位置是否在實現對Hb分子表面的保護中起任何作用，倘若如此這可能是由亞氨基四氫噻吩介導的Hb的巰基化作用提供的。鑒定通過亞氨基四氫噻吩巰基化的Hb的位點，并制備具有明確限定PEG-5000鏈拷貝數的位點特異性PEG化Hb對于洞察PEG化反應的這一方面是關鍵性的。因為Enzon PEG化Hb-不致高血壓的Hb的第一個實例屬于攜帶10個PEG-鏈的PEG化類別，當非保守性的方法用于產生PEG化Hb時，是否需要較高水平的Hb的PEG化作用來產生不致高血壓的Hb，以及產生不致高血壓的Hb所需的PEG化作用、氧親和力的最佳水平是什么，都還是不清楚的。
具有PEG-5000鏈的分子的亞氨基四氫噻吩依賴性巰基化作用介導的基于PEG-馬來酰亞胺的以PEG-5000鏈對分子進行表面裝飾克服了在發(fā)展基于Hb的載氧體方面目前主要的障礙，即無細胞Hb的致高血壓活性。這里開發(fā)的PEG化作用技術很簡單，可以在氧條件下進行，而且不包括麻煩的色譜分析提純方法來分離PEG化的Hb。在該設計中，保守的PEG化作用技術，專門考慮了用于最小化副反應的問題，尤其是與酰化反應-用于開發(fā)Enzon PEG化Hb的非保守性PEG化反應相比。亞氨基四氫噻吩對Hb的ε-氨基的脒化作用的選擇性，高效率的衍生作用，顯著高于利用活性酯或者酐對α和ε-氨基的酰化，是這種新PEG化方法的一些有利的方面。亞氨基四氫噻吩以及PEG-馬來酰亞胺的穩(wěn)定性顯著高于PEG-酸的琥珀酰亞胺基活性酯和酸酐。因此，通過亞氨基四氫噻吩介導的保守性巰基化作用引入給定數目的PEG-鏈所需的過量PEG-馬來酰亞胺，將顯著低于在用于產生早期類型的不致高血壓的PEG化Hb的非保守性PEG化方法中所需的過量PEG-馬來酰亞胺。通過該技術生產不致高血壓的Hb分子不需要復雜的脫氧作用裝置。因此，該新PEG化技術用于產生不致高血壓的Hb是很經濟合算的。
表I用Mal-Phe-PEG進行PEG化的HbA的分子大小
表II(PEG5K)6-HbA的氧親和力及其通過變構效應物的調節(jié)
樣品的氧親和力利用Hem-O-scan在50mM Bis-tris/50mM tris醋酸鹽，pH7.4中于37℃測定。蛋白質濃度保持在大約0.6mM。分析的樣品具有低于2％的met Hb。
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這里上述提到的所有出版物，無論是授權的專利，待審申請，出版論文，或者其它的，在此以其全部引入作為參考。為了清楚和理解的目的，對上述發(fā)明已經進行詳細描述，本領域的技術人員應當理解，通過閱讀公開內容，可在形式和細節(jié)上進行各種改變，而不背離所附權利要求中本發(fā)明的真實范圍。
權利要求
1.一種具有6±1個PEG鏈的血紅蛋白分子(Hb)，其中所述PEG鏈中的2個結合到Hb的Cys-93(β)上，其余PEG鏈結合到引入到Hb的ε-氨基上的巰基上。
2.權利要求1的血紅蛋白分子，其中每個PEG鏈的分子量為3000-10,000道爾頓。
3.權利要求1的血紅蛋白分子，其中每個PEG鏈的分子量為大約5000道爾頓。
4.權利要求1的血紅蛋白分子，其中每個PEG鏈通過琥珀酰亞胺基鍵連接到Hb上。
5.權利要求2的血紅蛋白分子，其中每個PEG鏈通過琥珀酰亞胺基鍵連接到Hb上。
6.權利要求3的血紅蛋白分子，其中每個PEG鏈通過琥珀酰亞胺基鍵連接到Hb上。
7.權利要求1-6中任一項的血紅蛋白分子，其是不致高血壓的。
8.一種制備修飾的血紅蛋白分子的方法，包括以下步驟(a)使Hb與8-15倍過量的亞氨基四氫噻吩反應以形成巰基化Hb；和(b)使該巰基化Hb與16-30倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應，以形成修飾的Hb。
9.權利要求8的方法，其中在步驟(a)中使Hb與9-12倍過量的亞氨基四氫噻吩反應。
10.權利要求8的方法，其中在步驟(a)中使Hb與大約10倍過量的亞氨基四氫噻吩反應。
11.權利要求8的方法，其中在步驟(b)中使巰基化Hb與18-22倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。
12.權利要求8的方法，其中在步驟(b)中使巰基化Hb與大約20倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。
13.權利要求8的方法，其中在步驟(a)中使Hb與9-12倍過量的亞氨基四氫噻吩反應，且在步驟(b)中使該巰基化Hb與18-22倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。
14.權利要求8的方法，其中在步驟(a)中使Hb與9-12倍過量的亞氨基四氫噻吩反應，且在步驟(b)中使該巰基化Hb與大約20倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。
15.權利要求8的方法，其中在步驟(a)中使Hb與大約10倍過量的亞氨基四氫噻吩反應，且在步驟(b)中使該巰基化Hb與18-22倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。
16.權利要求8的方法，其中在步驟(a)中使Hb與大約10倍過量的亞氨基四氫噻吩反應，且在步驟(b)中使該巰基化Hb與大約20倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應。
17.權利要求8-16中任一項的方法，其中PEG的分子量為3000-10,000道爾頓。
18.權利要求8-16中任一項的方法，其中PEG的分子量為大約5,000道爾頓。
19.權利要求8-16中任一項的方法，其中該修飾的Hb是不致高血壓的。
20.權利要求17的方法，其中該修飾的Hb是不致高血壓的。
21.權利要求18的方法，其中該修飾的Hb是不致高血壓的。
22.一種通過權利要求8-16中任一項的方法制備的修飾的Hb。
23.一種通過權利要求17的方法制備的修飾的Hb。
24.一種通過權利要求18的方法制備的修飾的Hb。
25.一種通過權利要求19的方法制備的修飾的Hb。
26.一種通過權利要求20的方法制備的修飾的Hb。
27.一種通過權利要求21的方法制備的修飾的Hb。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有6±1個PEG鏈的血紅蛋白分子(Hb)，其中所述PEG鏈中的2個結合到Hb的Cys－93(β)上，其余的PEG鏈結合到引入到Hb的ε－氨基上的巰基上。本發(fā)明還提供了制備修飾的血紅蛋白分子(Hb)的方法，包括以下步驟(a)使Hb與8－15倍過量的亞氨基四氫噻吩反應以形成巰基化Hb；和(b)使巰基化Hb與16－30倍過量的用馬來酰亞胺部分官能化的PEG反應，以形成修飾的Hb。
文檔編號C07K14/805GK1741812SQ200380109157
公開日2006年3月1日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權日2002年12月23日
發(fā)明者S·A·阿查里雅, B·N·曼朱拉 申請人:猶太大學阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學院