專利名稱：胃泌素組合物和制劑及其使用和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明以多種實(shí)施方案提供了具有比胃泌素肽更長的體內(nèi)活性機(jī)能的胃泌素組合物、制備方法以及使用胃泌素組合物治療糖尿病的方法。
背景技術(shù)：
治療劑，例如疾病治療中用到的肽和低分子蛋白質(zhì)，受到很多的限制。這些治療劑通常在短時(shí)間內(nèi)通過腎臟得到排除，或通過蛋白酶得到降解，因此限制了它們的生物利用度，導(dǎo)致短的血漿半衰期和比療效所需更低的藥物濃度。就需要維持長時(shí)間的高血清水平以獲得最大療效而言，治療藥物的高清除率不是最理想的。增加劑量或提高給藥頻率通常帶來更高療效，但也帶來更高的副作用風(fēng)險(xiǎn)，因此限制了投放劑量或投放頻率。
一些肽激素在血流中的半衰期極短，導(dǎo)致給藥后不久就喪失了生物活性。已證實(shí)胃泌素是聯(lián)合其他生長因子來有效地治療糖尿病的肽激素。然而，單獨(dú)投放胃泌素時(shí)，療效受到限制。此外，已發(fā)現(xiàn)胃泌素具有比較短的半衰期。例如胃泌素-17具有約5-9分鐘的循環(huán)半衰期，而胃泌素-34具有約35分鐘的循環(huán)半衰期。
因此需要含有具有延長或長效的作用的胃泌素化合物的組合物。
簡述本發(fā)明的特征實(shí)施例提供了包含胃泌素化合物的藥物組合物，該胃泌素化合物與天然胃泌素相比，在給藥給患者后具有延長的活性。該實(shí)施方案中的胃泌素成分含有至少選自于下列的氨基酸SEQ IDNO1中的29-34位、SEQ ID NO2中的29-34位、SEQ ID NO3中的12-17位、和SEQ ID NO4中的12-17位，并且胃泌素進(jìn)一步與蛋白質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)或碳水化合物締合。
選擇性的特征實(shí)施方案提供了包含Z-Ym-Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6的胃泌素化合物，其中AA1是Tyr或Phe，AA2是Gly、Ala或Ser，AA3是Trp、Val或Ile，AA4是Met或Leu，AA5是Asp或Glu，以及AA6是Phe或Tyr，AA6被酰胺化；其中Z是聚合物，當(dāng)該聚合物是蛋白質(zhì)時(shí)，Z是該蛋白質(zhì)的氨基酸序列；Ym是任選的間隔區(qū)，包括m個(gè)小分子中性氨基酸的氨基酸殘基，并且X選自于下列任意的連續(xù)部分SEQ ID NO1的1-28位殘基，SEQ ID NO2的1-28位殘基，SEQ ID NO3的1-11位殘基，和SEQ ID NO4的1-11位殘基，條件是該胃泌素化合物結(jié)合胃泌素/CCK受體。例如AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6是Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe?；蛘逜A1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6是Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe。在此通式中，Z是蛋白質(zhì)，例如，Z是人血清清蛋白。
Y是包含m個(gè)堿基的氨基酸序列，其具有交替的甘氨酸和丙氨酸，例如[Gly-Ala]5，或者具有甘氨酸和丙氨酸的隨機(jī)序列。當(dāng)m大于1時(shí)，在Y氨基酸末端，或當(dāng)m為0時(shí)，在X氨基酸末端，該胃泌素化合物還具有半胱氨酸殘基。胃泌素化合物還包括用于鍵合Z的雙功能交聯(lián)劑。一般地，m是0至約20個(gè)殘基。在某個(gè)實(shí)施方案中，如果m是0，其中Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6還包括用于鍵合Z的雙功能交聯(lián)劑。
在某個(gè)實(shí)施方案中，X選自于下列序列SEQ ID NO3的1位至11位；SEQ ID NO4的1位至11位；SEQ ID NO3的2位至11位；以及SEQ ID NO4的2位至11位。其中Z是蛋白質(zhì)的胃泌素化合物可以以重組方式產(chǎn)生。
本申請?zhí)峁┑牧硪粋€(gè)實(shí)施方案是編碼其中Z是蛋白質(zhì)的胃泌素化合物的核酸序列。還提供攜帶該核酸序列的細(xì)胞。該細(xì)胞是細(xì)菌或酵母細(xì)胞。當(dāng)該細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，它可以是，例如，埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬的種的細(xì)胞。當(dāng)該細(xì)胞是酵母細(xì)胞時(shí)，它可以是酵母屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬或畢赤酵母種的細(xì)胞。
胃泌素化合物通常含有最小胃泌素成分，該成分至少是SEQ IDNO2的29-34位氨基酸或SEQ ID NO4的12-17位氨基酸。它們位于循環(huán)中出現(xiàn)的胃泌素的羧基末端，在多種實(shí)施方案中，可以存在例如來自胃泌素的附加氨基酸。
聚合物成分不必限于蛋白質(zhì)，還可以是例如聚乙二醇(PEG)或葡聚糖的化學(xué)合成聚合物。當(dāng)聚合物是蛋白質(zhì)時(shí)，在多種實(shí)施方案中，其是血清蛋白，例如血清清蛋白，例如人血清清蛋白。
本申請?zhí)峁┑奈该谒鼗衔锏牧硪粋€(gè)實(shí)施方案具有C-Ym-X結(jié)構(gòu)，其中C是Cys或Lys，Ym是任選的包含m個(gè)中性小氨基酸的氨基酸殘基的間隔區(qū)，X是至少六個(gè)氨基酸殘基，其包含選自于胃泌素-17(SEQ ID NO3和4)的至少位點(diǎn)12-17的序列以及胃泌素-34(SEQID NO1和2)的至少29-34位點(diǎn)的序列。胃泌素化合物還與聚合物進(jìn)行偶合，例如，與聚乙二醇(PEG)或葡聚糖進(jìn)行偶合。胃泌素化合物還選擇性地與蛋白質(zhì)偶合。在某個(gè)實(shí)施方案中，胃泌素化合物還包括雙功能交聯(lián)劑，其中交聯(lián)劑的第一個(gè)反應(yīng)末端與C共價(jià)結(jié)合。交聯(lián)劑的第二個(gè)反應(yīng)末端與聚合物或蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。C-Ym-X可以以重組方式生產(chǎn)，或通過肽合成法得以合成。
在某個(gè)實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┑娜我馕该谒鼗衔锸且杂行┝康靡蕴峁┑?。本申請?zhí)峁┑奈该谒鼗衔镞€包括免疫抑制劑。本申請?zhí)峁┑奈该谒鼗衔镞€包括降血糖劑。本申請?zhí)峁┑奈该谒鼗衔镞€包括藥學(xué)上可接受的載體。本申請?zhí)峁┑奈该谒鼗衔镞€包括生長因子。例如，在某個(gè)實(shí)施方案中，生長因子是胰高血糖素樣肽1受體配體?；蛘?，在某個(gè)實(shí)施方案中，生長因子是EGF受體配體。
本申請還提供本發(fā)明的實(shí)施方案，其包括用于治療患有糖尿病的患者的藥物的制備方法，包括配制根據(jù)說明書描述的任一胃泌素化合物，以及將胃泌素化合物給藥于患者。在該方法的某個(gè)實(shí)施方案中，胃泌素化合物的給藥頻率少于天然胃泌素的給藥頻率。該方法還包括測量胰島再生的生理指示劑，例如，測量空腹血糖(FBG)。該方法包括降低胰島素的依賴性。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還提供胃泌素化合物的制備方法，該方法為將胃泌素的氨基酸序列與一種載體成分組合物締合。相應(yīng)地，在胃泌素與載體締合前，修飾胃泌素使其包含半胱氨酸替換或附加的半胱氨酸殘基。半胱氨酸替換是焦谷氨酸替換。胃泌素氨基酸序列包括至少選自于氨基酸序列SEQ ID NO1中29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO2中的29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO3中的12-17殘基；以及氨基酸序列SEQ ID NO4的12-17殘基。在某個(gè)實(shí)施方案中，半胱氨酸是在胃泌素的氨基酸末端；或者，在胃泌素與載體締合前，該方法包括修飾胃泌素使其進(jìn)一步包括雙功能交聯(lián)劑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還提供了用于治療糖尿病病人的藥物的制備方法，該方法包括配制能與血清蛋白共價(jià)反應(yīng)的修飾的胃泌素化合物，以及給病人給藥修飾的胃泌素。修飾的胃泌素包括能結(jié)合胃泌素/CCK受體以及半胱氨酸或賴氨酸的氨基酸末端的天然胃泌素序列。相應(yīng)地，天然胃泌素序列選自于氨基酸序列SEQ ID NO1中的29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO2中的29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO3中的12-17位殘基；以及氨基酸序列SEQ ID NO4中的12-17位殘基。
本申請還提供了與具有胃泌素的氨基酸序列的肽的血清水平相比，用于長時(shí)間地維持增長的胃泌素血清水平的藥物的制備方法，該方法包括配制定義如上所述的胃泌素化合物，以及給藥該胃泌素化合物。
本申請還提供包含如本申請描述的、至少一種有效劑量的胃泌素化合物的試劑盒。
附圖簡介

圖1顯示在14天處理后，未修飾的胃泌素對最近糖尿病發(fā)作的NOD小鼠的空腹血糖水平的影響。
圖2顯示在14天處理后，未修飾的胃泌素對最近糖尿病發(fā)作的NOD小鼠的胰腺胰島素水平的影響。
發(fā)明詳敘使用長效作用的胃泌素化合物，能導(dǎo)致通過酶降低胃泌素的清除率或減少胃泌素的降解，從而長期維持高濃度的血漿胃泌素和/或提高胃泌素的半衰期，因此導(dǎo)致療效得以提高。通過使用較低劑量和/或降低對糖尿病病人給藥胃泌素的頻率而改進(jìn)劑量方案。此外，當(dāng)胃泌素與載體軛合時(shí)，有可能一些載體也能屏蔽胃泌素而不被免疫系統(tǒng)識別，因此減少或抑制胃泌素激發(fā)免疫反應(yīng)，以及提高血清胃泌素的半衰期和/或維持高濃度的血清胃泌素。
本發(fā)明的常規(guī)實(shí)施方案提供了具有胃泌素樣活性的組合物，本文中是指胃泌素化合物。如此處所用的術(shù)語“胃泌素化合物”，意指結(jié)合、刺激或與胃泌素/CCK受體相互作用的制劑。胃泌素化合物包括能與胃泌素/CCK受體相互作用的胃泌素衍生物和偶合物以及肽同系物。此處所用的術(shù)語“衍生物”和“偶合物”是等效的，其用于指示化學(xué)性質(zhì)關(guān)聯(lián)的組合物，并且其通過合成的、生物的、重組的或化學(xué)的方法得以制備。
在多個(gè)實(shí)施方案中，制備“修飾的”胃泌素并用于治療患有糖尿病的病人。如此處所用的術(shù)語“糖尿病”，是指胰島素缺乏、抗胰島素抗體的生成、或血糖過量的任何生理跡象，或者包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的任何哺乳動(dòng)物、以及包括例如I型和II型糖尿病的人模式的任何明顯糖尿病癥狀，早期糖尿病和糖尿病的前期癥狀以溫和減少胰島素或溫和提高血糖水平為特征。如此處所用的，術(shù)語“哺乳動(dòng)物”具有哺乳類的任何一員，并且包括人的普通含義。
修飾的胃泌素可以是胃泌素衍生物或類似物，包括6個(gè)氨基酸(來自C-末端)的最小序列，以及還可添加例如能經(jīng)受加成反應(yīng)的半胱氨酸殘基(涉及SEQ ID 1-4)的反應(yīng)性基團(tuán)。在多個(gè)實(shí)施方案中，胃泌素可延伸至34個(gè)氨基酸(“大”胃泌素或胃泌素-34)，其中至少1個(gè)反應(yīng)性氨基酸，例如半胱氨酸殘基或賴氨酸殘基，在N-末端被添加或替換。例如半胱氨酸的反應(yīng)性氨基酸的添加可以在末端區(qū)，并且在有關(guān)的實(shí)施方案中，間隔區(qū)可以任選地位于添加的反應(yīng)性氨基酸之前。例如，間隔區(qū)可以作為胃泌素氨基酸序列的一部分被生物合成或可以化學(xué)結(jié)合于胃泌素的氨基酸序列上，形成具有胃泌素序列-間隔區(qū)-半胱氨酸的結(jié)構(gòu)。例如，間隔區(qū)是由幾個(gè)例如丙氨酸或甘氨酸組成的氨基酸序列。氨基酸序列可以是交替的氨基酸(如甘氨酸/丙氨酸)或是非交替的，即可以是隨機(jī)序列或特定的序列。序列至少由一個(gè)氨基酸組成。
在選擇性的實(shí)施方案中，將作為反應(yīng)性成分的雙功能交聯(lián)劑添加到修飾的胃泌素，特別是添加到在氨基酸末端具有添加的反應(yīng)性基團(tuán)(如，半胱氨酸)，或添加到具有間隔區(qū)的修飾胃泌素中，通過交聯(lián)劑的同雙功能或異雙功能部分而在一個(gè)末端上生成具有例如硫醇或氨基的反應(yīng)性基團(tuán)的修飾的胃泌素(例如，以形成如下列羧基末端所列出的，具有暴露的反應(yīng)性基團(tuán)的胃泌素-間隔區(qū)-cys-交聯(lián)劑-載體、胃泌素-cys-交聯(lián)劑-載體、胃泌素-間隔區(qū)-cys/-交聯(lián)劑，以及具有暴露的反應(yīng)性基團(tuán)的胃泌素-cys-交聯(lián)劑)。
然后在這種情形下將修飾的胃泌素注射到病人中，或者在注射前，在體外將其偶合到例如從病人中獲得的全血漿或分餾的血清的一種或多種血漿成分，或結(jié)合例如清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或免疫球蛋白的一種或多種純化的血清蛋白(質(zhì))，或結(jié)合脂質(zhì)/親脂性部分/疏水性部分、或結(jié)合例如葡聚糖或PEG的聚合物載體。如此處所用的和權(quán)利要求中的術(shù)語聚合物，包括氨基酸、糖、核苷的聚合物、合成聚合物(例如PEG)及其混合物。例如在結(jié)合之前，可通過雙功能交聯(lián)劑或通過其他化學(xué)方法活化聚合物。與給藥天然胃泌素相比，給藥活化的胃泌素化合物或胃泌素偶合物導(dǎo)致提高血清的半衰期和/或長期維持胃泌素的高血藥濃度。
本發(fā)明的一般性實(shí)施方案提供具有部分的胃泌素組合物，所述部分是胃泌素化合物，并與大分子例如聚合物或融合蛋白以非共價(jià)方式或以共價(jià)軛合物形式締合或以與具有氨基酸序列的其他肽化合物的融合蛋白的形式締合。與天然胃泌素形式相比，本文中提及的胃泌素化合物在患病動(dòng)物或病人中具有更長的循環(huán)半衰期，和/或維持更高的胃泌素化合物體內(nèi)濃度。此外，本發(fā)明在其他實(shí)施方案中提供了組合物和制備及實(shí)驗(yàn)胃泌素化合物的方法，既可單獨(dú)提供給病人或者聯(lián)合至少一種生長因子、聯(lián)合降血糖劑、或聯(lián)合免疫抑制劑來治療糖尿病。生長因子的實(shí)例包括但不限于例如EGF的EGF受體配體、例如GLP-1的GLP-1受體配體，例如促乳泌素的促乳泌素受體配體和例如生長激素的生長激素受體配體。免疫抑制劑的實(shí)例包括但不限于環(huán)孢霉素、FK506、雷帕霉素和daclizumab。降血糖劑的非限制型實(shí)例包括磺胺尿素、meglitinide、雙胍、噻唑烷二酮和α-葡糖苷酶抑制劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，胃泌素化合物可在血液中結(jié)合比較大的結(jié)構(gòu)或多個(gè)結(jié)構(gòu)，并且依然保持結(jié)合靶蛋白的能力，例如胃泌素/CCK受體。通常，胃泌素，其在體內(nèi)以別的方式快速降解，結(jié)合于載體蛋白；使用該組合物，可獲得更長期的藥效。或者胃泌素化合物可以偶合到聚合物載體例如聚乙二醇(PEG)或葡聚糖上，可達(dá)到相似的目的。
在某個(gè)實(shí)施方案中，對胃泌素的化學(xué)修飾用于提供能在體外或體內(nèi)與載體蛋白或聚合物載體共價(jià)或非共價(jià)反應(yīng)的化合物。在相關(guān)的實(shí)施方案中，非共價(jià)相互作用是靜電的或疏水的。在其他的實(shí)施方案中，以所述的方式修飾胃泌素，使得當(dāng)注射它時(shí)具有在血流中對載體的增強(qiáng)的親和力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，無需載體蛋白，在體內(nèi)或體外通過化學(xué)修飾來制備長效的胃泌素化合物。
在某個(gè)實(shí)施方案中，載體蛋白是血漿蛋白。在相關(guān)的實(shí)施方案中，血漿蛋白是清蛋白或免疫球蛋白或免疫球蛋白的成分。在結(jié)合之前，可修飾或部分缺失免疫球蛋白或免疫球蛋白的成分。在某個(gè)實(shí)施方案中，聚合物載體是聚乙二醇或葡聚糖。例如，通過胃泌素化合物中的氨基，將活化的PEG結(jié)合于胃泌素化合物(Vernonese，F(xiàn)M.Biomaterials 22(2001)-405-417)。
在其他實(shí)施方案中，在注射前，使用標(biāo)準(zhǔn)的重組遺傳技術(shù)，將作為氨基酸序列的胃泌素化合物與載體蛋白進(jìn)行遺傳工程融合，其中所述蛋白也作為氨基酸序列。將胃泌素與具有或不具有交聯(lián)劑/間隔區(qū)的載體蛋白，例如包括小分子中性不帶電的氨基酸重組融合。編碼胃泌素的核酸可與全部或部分的載體蛋白進(jìn)行重組融合或直接合成，并且該核酸構(gòu)建體或融合蛋白，可編碼或插入許多作為兩個(gè)蛋白之間的間隔區(qū)的附加氨基酸。重組的融合蛋白可在酵母(酵母屬、畢赤酵母)或標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)，或者可使用哺乳類或昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)。在表達(dá)和/或純化的標(biāo)準(zhǔn)程序之后，融合蛋白可用于治療上。在融合蛋白的構(gòu)建中，如果需要，可引入對胃泌素化合物的多肽序列的修飾。
在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾胃泌素化合物，以引入例如那些存在于氨基酸例如賴氨酸或半胱氨酸上的的反應(yīng)性基團(tuán)，以致于還與例如載體蛋白或載體非蛋白質(zhì)的聚合物的其他化合物相接觸的反應(yīng)性基團(tuán)，能與載體蛋白或聚合物形成共價(jià)相互作用。例如，使用琥珀酰亞氨基丙酸-3-2-吡啶二硫基酯(SPDP)，通過在賴氨酸的氨基添加反應(yīng)硫醇基至胃泌素分子上，隨后用DTT還原以釋放活性硫醇基((″Proteinthiolation and reversible protein-protein conjugation.N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate，a new heterobifunctional reagent.″Carlsson J，Drevin H，Axen R.Biochem J 173，723-737(1978))。此外，在添加了半胱氨酸或賴氨酸后，還可添加雙功能基團(tuán)，以致于交聯(lián)劑的一個(gè)反應(yīng)性末端與半胱氨酸/賴氨酸進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)在另一末端的另一個(gè)反應(yīng)性末端保持暴露或與載體偶合。
通過EDAC介導(dǎo)的與胱胺的反應(yīng)，隨后使用DTT還原二硫化物，也可在羧基插入硫醇(″Introduction of sulffiydryl groups into proteinsat carboxyl sites.″Lin CM，Mihal KA，Krueger RJ.Biochim BiophysActa 1038，382-385(1990)。在非限制性的實(shí)施例中，通過使反式-4-(馬來酰亞胺甲基)環(huán)己胺-1-羧酸琥珀酰亞胺基酯(″Conjugation ofglucose oxidase from Aspergillus niger and rabbit antibodies using N-hydroxysuccinimide ester of N-(4-carboxycyclohexylmethyl)-maleimide.″Yoshitake S，Yamada Y，Ishikawa E，Masseyeff R.Eur JBiochem 101，395-399(1979))，與胃泌素中的賴氨酸殘基上的氨基反應(yīng)，在胃泌素的氨基酸位點(diǎn)引入硫醇反應(yīng)性基團(tuán)，所述胃泌素隨后與載體蛋白或無硫醇基的活化聚合物的半胱氨酸殘基反應(yīng)。
胃泌素化合物-載體復(fù)合物包括附加的模式成分，其含有容易制備或分離胃泌素化合物-載體復(fù)合物的、或增強(qiáng)或維持胃泌素化合物的功能活性的間隔臂或元件或其他成分。間隔臂可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸、肽、多肽模擬物、或有機(jī)小分子，以及可以包括同雙功能或異雙功能交聯(lián)劑或幾丁質(zhì)寡居物或聚乙二醇或相關(guān)的聚合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體和胃泌素化合物可以與或不與間隔臂進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。非間隔臂(零長度的交聯(lián)劑)的實(shí)例包括EDC。例如，生成間隔臂的同雙功能交聯(lián)劑是辛二酸二琥珀酰亞胺基酯，生成間隔臂的異雙功能交聯(lián)劑是2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷、6-琥珀酰亞氨基[3-(2-吡啶二硫基)丙酰氨基]己酸(LC-SPDP)和4-(N-甲基馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)。
在多個(gè)實(shí)施方案中，胃泌素化合物可與更大的載體部分如聚合物，例如蛋白質(zhì)締合。由于締合可以是共價(jià)或非共價(jià)的，蛋白質(zhì)可以被認(rèn)為是載體蛋白。載體蛋白的種類可以具有非抗原的性質(zhì)，即，是天然的人蛋白，以及能在循環(huán)中維持保養(yǎng)。理想的載體蛋白是一種通常在人循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的普通物質(zhì)。
如此處所用的，術(shù)語“胃泌素/CCK受體配體”包括結(jié)合、刺激或與胃泌素CCK受體相互反應(yīng)的任何化合物。美國專利6,288,301(2001年9月11日公開)給出了所述胃泌素/CCK受體配體的實(shí)例，該實(shí)例包括多種形態(tài)的胃泌素，例如胃泌素34(大胃泌素)、胃泌素17(小胃泌素或短胃泌素)、胃泌素14、胃泌素13、胃泌素10、和胃泌素8、五肽胃泌素、四肽胃泌素；多種形態(tài)的縮膽囊素，如CCK58、CCK33、CCK22、CCK12和CCK8；以及其他胃泌素/CCK受體配體。通常，胃泌素/CCK配體共有羧基末端氨基酸序列Trp-Met-Asp-Phe-酰胺。前述的甲硫氨酸(Met)可被亮氨酸取代。預(yù)期還可以是活化的類似物、片段和其他以上的修飾物，包括肽和非肽激動(dòng)劑、或胃泌素/CCK受體的局部激動(dòng)劑，例如A71378(Lin等，Am.J.Physiol.258(4Pt 1)G648，1990)。
通過肽合成，可經(jīng)濟(jì)地制備小的胃泌素形式例如胃泌素17，并且合成肽是商業(yè)上可利用的。合成的人胃泌素17，例如在位點(diǎn)15具有甲硫氨酸或亮氨酸的人胃泌素17，也可從Bachem AG，Bubendorf，瑞士和從Researchplus中獲得。自然界中發(fā)現(xiàn)的胃泌素肽是羧基末端酰胺化的肽，并且羧基末端的氨基酸的酰胺化在本文中胃泌素化合物的范圍內(nèi)。
胃泌素/CCK受體配體還包括有活性的類似物、片段和其他以上配體的修飾物，其共有內(nèi)源哺乳動(dòng)物胃泌素的氨基酸序列，例如，共有60％的序列同一性，或70％的同一性，或80％的同一性。所述的配體也包括可促進(jìn)內(nèi)源胃泌素分泌的化合物、來自組織儲藏位點(diǎn)的縮膽囊素或類似的活化肽。這些實(shí)例是胃泌素釋放肽、抑制胃泌素酸分泌的奧美拉唑和促進(jìn)CCK刺激的大豆胰蛋白酶。
此處顯示了大的胃泌素34和小的胃泌素17的序列。大胃泌素-34基本上是在N末端具有附加的氨基酸序列的小胃泌素-17的延伸形態(tài)。大胃泌素在體內(nèi)被清除以釋放胃泌素-17。在N末端的符號“Glp”是焦谷氨酸殘基，其是谷氨酸的天然環(huán)化形態(tài)。在多個(gè)實(shí)施方案中，通過使用谷氨酸或谷氨酰胺替換焦谷氨酸，或缺失焦谷氨酸，來修飾具有N末端焦谷氨酸殘基的胃泌素，以含有N末端半胱氨酸或賴氨酸殘基。此外，各個(gè)胃泌素34和胃泌素-17以分別如此處SEQ ID No1-2所示的位點(diǎn)32、或分別如SEQ ID No3-4所示的位點(diǎn)15具有甲硫氨酸或亮氨酸的修飾形態(tài)得以使用。
N末端Glp-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-His-Leu-Val-Ala-Asp-Pro-Ser-Lys-Lys- Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(SEQ ID NO1)。
N末端Glp-Leu-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-His-Leu-Val-Ala-Asp-Pro-Ser-Lys-Lys-Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-TrD-Leu-Asp-Phe-NH2(SEQ ID NO2)。
N末端Glp-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-′Trp-Met-Asp-Phe-NH2(SEQ ID NO3)。
N末端Glp-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe-NH2(SEQ ID NO4)。
在某個(gè)實(shí)施方案中，作為胃泌素氨基酸序列與在胃泌素序列的氨基末端的任選氨基酸間隔區(qū)的融合蛋白、并具有蛋白載體的胃泌素化合物，可以被轉(zhuǎn)基因施用于患者。在用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)所述融合蛋白的核酸構(gòu)建體的實(shí)施方案中，通過類似于美國專利號5,885,956所公開的技術(shù)，將人胃泌素原的肽前體基因融合于具有或不具有間隔區(qū)的編碼載體蛋白的基因。
治療需要治療的糖尿病個(gè)體的方法包括給藥個(gè)體組合物，該組合物提供了胃泌素化合物和例如EGF、GLP-1、泌乳刺激素和生長激素的FACGINT。還包括這些FACGINT的衍生物、類似物和偶合物。如此處所用的，術(shù)語“FACGINT”是指補(bǔ)充胃泌素用于胰島素再生療法的因子。如此處所用的詞語“FACGINT”也指“一個(gè)或多個(gè)FACGINT”或“至少一個(gè)FACGINT”。
術(shù)語“FACGINT”包括大量的生長因子和生長激素的變體、調(diào)節(jié)一種或多種激素因子的制劑、一種或多種受體的配體和效應(yīng)物，所述受體涉及與這些生長激素和生長因子的結(jié)合，通常可以理解、舉例說明這些術(shù)語，但其不限于EGF受體配體；例如PTHrP(PTHrP；Garcia-Ocana，A.等，2001，J.clin.Endocrin.Metab.86984-988)的PTH相關(guān)蛋白(PTHrP)受體配體；例如HGF(HGF；Nielsen，J.等，1999，J Mol Med 7762-66)的肝細(xì)胞生長因子(HGF)受體配體；例如FGF的纖維原細(xì)胞生長因子，例如KGF的角化細(xì)胞生長因子(KGF)受體配體；例如NGF的神經(jīng)生長因子(NGF)受體配體；例如GIP的抑胃肽(GIP)受體；例如TGFss(美國申請專利2002/0072115，2002年6月13日公開)的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFss)受體配體；例如昆布氨酸的昆布氨酸受體配體；例如INGAP的胰島再生相關(guān)蛋白(INGAP)受體配體；例如BMP-2的骨形態(tài)發(fā)生因子(BMP)受體配體；例如VIP的血管活性腸肽(VIP)受體配體；例如GLP-1和毒蜥外泌肽-4的胰高血糖素樣肽-1受體配體；例如GLP-2的胰高血糖素樣肽2(GLP-2)受體配體；二肽酰肽酶IV抑制物，其通過抑制與其完整性相關(guān)的酶來間接影響GLP-1水平(Hughes，T.等，2002，Am Diabetes Assoc Abstract 272-或)；例如REG蛋白的REG受體配體；例如GH的生長激素(GH)受體配體，例如PRL和胎盤催乳質(zhì)(PL)的促乳泌素(PRL)受體配體；例如IGF1和IGF2的胰島素樣生長因子(1型和2型)受體配體；例如EPO(http//www.drinet.ort/html/august_2002_.htm)的促紅細(xì)胞生成素(EPO)受體配體；betacellunin(也認(rèn)為其是EGF家族的成員)；例如活化素A的活化素A受體配體；例如VEGF的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體配體；例如BMP-2的骨形態(tài)發(fā)生因子(BMP)受體配體；例如VIP的血管活性腸肽(VIP)受體配體；例如VEGF的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體配體；例如PACAP的垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽(PACAP)受體配體；例如G-CSF的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)受體配體；例如GM-CSH的粒細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)受體配體；例如PDGF的血小板源生長因子(PDGF)受體配體；和例如胰泌素的胰泌素受體配體。
對于本文中任何表現(xiàn)出典型的FACGINT的生長因子、酶、酶抑制物、肽、蛋白質(zhì)和激素化合物，及其所有已知的類似物和衍生物，無論是天然存在或通過誘變制備或設(shè)計(jì)合成的，都應(yīng)該視為FACGINT的等價(jià)物。這些等價(jià)物也可視為是偶合物，即，通過添加一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)衍生的組合物，及其混合物?？勺兓幋a基因，例如通過指導(dǎo)突變發(fā)生的寡核苷酸來生成FACGINT類似物，如人重組類似物。此外，通過靶突變發(fā)生，可改變一個(gè)以上的氨基酸殘基的身份或位置。蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列可通過偶合得以增加，如通過糖基化、酰基化、或添加任何其他的互補(bǔ)分子，例如一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)、磷酸、硫酸和/或乙酰基。此外，鏈中的單個(gè)氨基酸殘基可通過氧化作用、還原作用或其他衍生作用得以修飾。可剪切FACGINT以獲得保持活性的任意片段。FACGINT的前體藥物或代謝物等價(jià)于FACGINT。完整的多肽或蛋白質(zhì)或任何片段可與任何的其他肽或蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白和其他細(xì)胞因子融合。偶合物包括，例如，含有偶合非天然存在的聚合物的FACGINT的組合物，所述聚合物含有聚乙二醇部分。術(shù)語也包括通過化學(xué)修飾親本肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而制備的衍生物，所述化學(xué)修飾例如是烷基化、?；?、酯形成作用或酰胺形成作用?；蛘撸煽紤]將誘導(dǎo)FACGINT的形成或模擬FACGINT的作用的制劑作為等效化合物。單一形式的“FACGINT”，意指任何一個(gè)或多個(gè)如此處所示的典型的FACGINT的化合物。如此處所用的術(shù)語“衍生物”和“偶合物”是等效的，并用于表示化學(xué)上相關(guān)的，并通過人工合成、生物、或重組或化學(xué)方法制備的組合物。
如此處所用的術(shù)語“受體配體”，其與具體配體的受體有關(guān)，意指與受體結(jié)合、刺激或相互作用的任意組合物。
受體胚胎包括受體激動(dòng)劑的定義范圍，對于任意具體的FACGINT的受體，無論激動(dòng)劑是否與FACGINT的結(jié)構(gòu)有關(guān)。
如此處所用的術(shù)語“泌乳刺激素”，意指共有相似于內(nèi)源性哺乳類泌乳刺激素的基本序列的任意肽，該術(shù)語是本領(lǐng)域公知的具有泌乳刺激素活性的蛋白因子，例如，人泌乳刺激素。內(nèi)源性人泌乳刺激素是由垂體產(chǎn)生的199個(gè)氨基酸的多肽。該術(shù)語包括內(nèi)源性泌乳刺激素發(fā)生缺失、插入、或替換突變并保持活性的泌乳刺激素類似物，并且包括來自其他物種和天然存在的變體的泌乳刺激素。功能性泌乳刺激素包括，如美國專利號6,333,031(活化氨基酸序列)和6,413,952(金屬復(fù)合物受體配體激動(dòng)劑)公開的對泌乳刺激素受體具有激動(dòng)劑活性的組合物，作為泌乳刺激素激動(dòng)劑的人生長激素的類似物的G120RhGH(Mode等，1966，Endocrinol.137(2)447-454)，和如美國專利5,506,107和5,837,460公開的泌乳刺激素的配體。
PRL、GH和PL都是多肽激素家族的成員，其共有相同的結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)和生物學(xué)功能(參見″Pancreatic Growth and Regeneration″，Ed.N.Sarvetnick，Ch.1.Brejie，T.等，1997)，因此這里指的是PRL/GH/PL家族。PRL和GH通過脊椎動(dòng)物的垂體前葉得以分泌。PRL與廣范的生物學(xué)功能有關(guān)，包括滲透調(diào)節(jié)、生殖、泌乳和免疫調(diào)節(jié)。GH與涉及生長和形態(tài)發(fā)生的生理過程有關(guān)。有關(guān)的受體配體指″PRL/GH/PL″受體配體?；陔暮偷鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)相似性、關(guān)于胃泌素互補(bǔ)作用的功能相似性、關(guān)于結(jié)合一個(gè)或多個(gè)受體的功能相似性，可將FACGINTs分為多組，并且這些組分別在本發(fā)明的多種實(shí)施方案的范圍內(nèi)。
胰高血糖樣肽-1以GLP-1分子形式(具有常規(guī)指定位點(diǎn)7-36的殘基)在小腸內(nèi)的分泌細(xì)胞中合成，該GLP-1是相似于GLP-1(7-37)的酰胺。GLP-1生物學(xué)活性的最初研究，發(fā)現(xiàn)GLP-1的全長N末端的擴(kuò)展形式的用途(1-37和1-36，后者是酰胺)。較大GLP-1分子通常缺乏生物活性。后來發(fā)現(xiàn)在除去前6氨基酸后，將帶來具有充分增強(qiáng)的生物活性的較短形式的GLP-1分子。
具有循環(huán)生物活性的GLP-1中的多數(shù)是以GLP-1(7-36)酰胺形式得以發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)也有較少量的生物活性GLP-1(7-37)形式。參見Orskov，C.等，Diabetes 1994，43335-339。兩種肽都表現(xiàn)了同樣的生物學(xué)功能。GLP-1在消化道內(nèi)分泌細(xì)胞中得以分泌，所述細(xì)胞響應(yīng)于營養(yǎng)攝取，并在營養(yǎng)吸收后的代謝動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮多重作用。通過二肽基肽酶(DPP-IV)介導(dǎo)的在丙氨酸殘基的位點(diǎn)2的剪切，來降解肽的N末端，實(shí)現(xiàn)GLP-1的調(diào)節(jié)。總的概括，可參見DPP-IV。GLP-1的生物學(xué)活性包括刺激葡萄糖依賴型胰島素分泌和胰島素的生物合成，抑制胰高血糖素分泌和胃排空，以及抑制食物攝取。GLP-1在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈現(xiàn)許多附加的效果，參見Drucker，D.，Endocrin 142521-527，2001。典型的GLP-1組合物包括BIM 51077(抗DPP-IV消化的GLP-1類似物，購自于Beaufour Ipsen)、AC2592(GLP-1，購自于Amylin，San Diego CA)、ThGLP-1(GLP-1，修飾氨基酸和脂肪酸附屬物，購自于Theratechnologies，Saint-Laurent，Quebec，Canada)、DACGLP-1(Conjuchem，Montreal，Quebec，Canada)、CJC-1131或DACTMGLP-l(用于共價(jià)偶合清蛋白的GLP-1遺傳工程類似物，Conjuchem)，LY315902和持續(xù)釋放LY315902(DDP-IV抗性的GLP-1類似物，購自于Eli Lilly，Indianapolis，IN)、低分子量的GLP-1模擬物、Albugon(清蛋白GLP-1融合肽，購自于Human Genome Sciences，Rockville，MD)、Liraglutide或NN2211(通過GLP-1分子的?；饔弥苽涞拈L效GLP-1衍生物，進(jìn)入血流后，廣泛結(jié)合清蛋白，所述清蛋白可保護(hù)其不受DPPIV降解，并降低其腎清除率；Elbrond等，Diabetes Care 2002 Aug 25(8)1398-404)。
毒蜥外泌肽-4是來自Heloderma suspectum(希拉毒蜥)毒液的新肽，與GLP-1(7-36)酰胺具有53％的同源性。由于它抗DDP-IV的降解，因此它起胰高血糖素樣肽1(GLP-1)受體的長效蛋白的作用。毒蜥外泌肽-4具有類似于GLP-1的性質(zhì)，并調(diào)節(jié)胃排空、胰島素分泌、食物攝取和slucagon分泌。毒蜥外泌肽-4的實(shí)例包括exenatide(被稱為AC2993的合成形式，Amylin)、exenatide LAR(長效作用形式)、ZP10(修飾的毒蜥外泌肽-4，其具有附加的六個(gè)賴氨酸殘基，Aventis/ZealandPharma)、和AP10(長效作用配制劑，Alkermes，Cambridge MA)。生理學(xué)研究顯示毒蜥外泌肽-4在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中的持續(xù)表達(dá)不會干擾葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡、細(xì)胞團(tuán)塊或食物攝取(Biaggio，L.等，J Biol Chem 27534472-34477，2000)，以致于沒有完全明白毒蜥外泌肽-4的生理學(xué)作用。
二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制物，是指抑制DPP-IV和766個(gè)氨基酸的與膜相關(guān)的肽酶的活性的化合物，所述氨基酸包括其底物GLP-1、GLP-2和GIP。DPP-IV介導(dǎo)GLP-1的失活是體內(nèi)GLP-1生物活性的決定因素。DPP-IV抑制物的實(shí)例包括異亮氨酸噻唑酰胺、纈氨酸purrolidide、NVP-DPP738(Novartis，Cambridge，MA)、LAF237(Novartis)、P32/98(Probiodrug AG，Halle，Germany)、和P93/01(Probiodrug)。
如此處所用的，術(shù)語“EGF受體配體”包括刺激EGF受體的化合物，因此當(dāng)胃泌素/CCK受體在同一或相鄰組織或相同個(gè)體中受到刺激時(shí)，產(chǎn)生胰島素的胰島細(xì)胞將受到誘導(dǎo)。所述EGF受體配體的實(shí)例包括是EGF1-53D的全長EGF，以及還包括EGF1-48、EGF1-49、EGF1-52，及其片段和活性類似物。EGF受體配體的其他實(shí)例是TGF形式，包括1-48、1-47、1-51、雙調(diào)蛋白和痘病毒生長因子，以及任何表現(xiàn)與胃泌素/CCK受體配體相同的協(xié)同活性的EGF受體配體。這些包括以上的活化類似物、片段和變體。也可參見Carpenter和Wahl，Chapter 4，in Peptide Growth Factors(Eds.Sporn andRoberts)，Springer Verlag，1990。
該組化合物包括EGF受體配體，進(jìn)一步包括“修飾的EGF”，其包括普通或野生型EGF的變體。變體顯示出可影響一種或多種生物學(xué)活性，例如EGF的清除率。該術(shù)語包括具有基本相似于人EGF的氨基酸序列的肽，例如，在多個(gè)殘基位點(diǎn)替換了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的肽。
已經(jīng)通過基因工程構(gòu)建了重組EGF形式，來改變結(jié)構(gòu)和活性，例如，已經(jīng)描述了用亮氨酸殘基替換了位點(diǎn)21處的甲硫氨酸(美國專利號4,760,023)的EGF。具有51個(gè)殘基的重組人EGF(hEGF)，即，缺少在hEGF位點(diǎn)52和53處的兩個(gè)C末端殘基、和具有在位點(diǎn)51中性氨基酸的替換，在生產(chǎn)微生物的過程中以及在給藥患者后，保持EGF活性并抗蛋白酶降解。許多核酸分子被描述為編碼非常相似于EGF和TGFα(WO 00/29438)的蛋白家族。也描述了在位點(diǎn)16發(fā)生中性或酸性氨基酸取代組氨酸的EGF突變蛋白(突變的EGF)(WO 93/03757)，所述形式在低pH時(shí)保持活性。EGF和TGFα的化學(xué)類似物和片段，保持了結(jié)合EGF受體家族的多種成員的能力(美國專利號4,686,283)。EGF或TGFα的多種變體可賦予影響一種或多種重組蛋白生產(chǎn)的有利性質(zhì)、體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性、以及體內(nèi)的活性。如實(shí)施例中所用的，典型的重組修飾的EGF受體配體是長度為51氨基酸的人EGF的C端缺失形式并具有位點(diǎn)51的天冬酰胺(本文中稱為EGF51N)，其基本保持了全長I.N.T.TM的活性，并具有體內(nèi)和/或體外穩(wěn)定性，即穩(wěn)定性至少大于普通或野生型hEGF(S.Magil等，PCT/US02/33907，2003年5月15日公開，此處全部引入作為參考)。
如此處所用的術(shù)語“生長因子”，包括共有與內(nèi)源性哺乳類生長激素相同的基本氨基酸序列和具有哺乳類生長激素的生物學(xué)活性的任意肽。人生長激素是單鏈中含有191氨基酸的多肽，分子量約為22千道爾頓(Goeddel等，1979，Nature 281544-548；Gray等，1985，Gene 39247-254)。該術(shù)語包括具有缺失、插入或替換的類似物，和來自其他物種及天然存在的變體的生長激素。參見Cunningham等，1989，Science 2431330-1336，和1989，Science 2441081-1085；和WO 90/05185，和美國專利號5,506,107。
如此處所用的術(shù)語“治療”或“改進(jìn)”，意指減輕或消除糖尿病的一種或多種癥狀。如此處所用的術(shù)語“糖尿病”，指胰島素缺乏、抗胰島素抗體的生成、或血糖過量的任何生理跡象，或者包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的任何哺乳動(dòng)物、以及包括例如I型和II型糖尿病的人模式的任何明顯的糖尿病癥狀，早期糖尿病和糖尿病的前期癥狀以溫和減少胰島素或溫和提高血糖水平為特征?！疤悄虿〉那捌诎Y狀”被描述為懷疑患有糖尿病或相關(guān)癥狀的哺乳動(dòng)物，例如，沒有確診為糖尿病，但表現(xiàn)出胰島素或葡萄糖水平的相應(yīng)癥狀，并且由于家族史或遺傳傾向性容易患上糖尿病或相關(guān)的病癥、或關(guān)于II型糖尿病的肥胖癥、或以前患上糖尿病或相關(guān)病癥而現(xiàn)在有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。
如此處所用的，術(shù)語“免疫抑制劑”或“用于免疫抑制的制劑”意指抑制免疫應(yīng)答的任何制劑。表1顯示典型的免疫抑制劑，并且認(rèn)為這些制劑或功能等價(jià)物的任何衍生物可適用于此處描述的本發(fā)明和權(quán)利要求書中的實(shí)施方案。將生產(chǎn)商提供的表1中的免疫抑制劑或其他等效制劑，按照藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的患者體重標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行給藥。例如，Tacrolimus通常通過注射或口服進(jìn)行給藥，而Sirolimus通常是口服給藥。
表1.用于免疫抑制的實(shí)例性的制劑以及商業(yè)來源
降血糖劑或藥是胰島素應(yīng)答的增強(qiáng)因子，通常用于糖尿病病人的糖血控制。這些制劑包括但不限于磺酰脲類(如乙酰苯磺酰環(huán)己脲、氯磺丙脲、甲磺氮草脲、甲苯磺丁脲、優(yōu)降糖、格列甲嗪、谷胱苷肽)，meglitinide類(如瑞格列奈、那格列奈)，雙胍(如甲福明二甲雙胍)，噻唑烷二酮(如匹格列酮、羅格列酮)，α-葡糖苷酶抑制物(如米格列醇)，胰高血糖素拮抗劑，鉀離子通道開放劑，胰島素增敏劑，肝酶抑制物，葡萄糖攝取調(diào)劑物，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的化合物和降低食物攝取的化合物。本文中提及的這些制劑以與胃泌素化合物組合的方式來使用。
如此處所用的，術(shù)語“哺乳動(dòng)物”應(yīng)包括不受任何限制的哺乳類，例如人、猿、嚙齒動(dòng)物如小鼠或大鼠、狗、貓、農(nóng)業(yè)上重要的動(dòng)物或肉豬、山羊、綿羊、馬，或猿如大猩猩或黑猩猩。如此處詳細(xì)說明的，個(gè)別哺乳動(dòng)物是非糖尿病患者、前期糖尿病患者或糖尿病患者。
全身給藥模式包括，但不限于透皮、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜、靜脈、皮下、鼻內(nèi)和口服途徑。以任何方便的途徑對化合物進(jìn)行給藥，例如，通過灌輸或彈丸注射、通過上皮或粘膜與皮膚的襯里(如口腔粘膜、直腸粘膜、陰道粘膜、鼻粘膜、腸粘膜，等)的吸收，并且可聯(lián)合其他生物活性制劑進(jìn)行給藥。典型的給藥途徑是全身的，例如，通過皮下注射。如果聯(lián)合FACGINT或免疫抑制劑或降血糖劑給藥，則胃泌素化合物可以以單一的組合劑量進(jìn)行給藥，或者這些成分可以以任何順序進(jìn)行單獨(dú)給藥。
組合物的制備方法胃泌素肽的合成通過任何合適的方法來生產(chǎn)胃泌素肽，例如在重組的宿主細(xì)胞中表達(dá)或通過化學(xué)合成生產(chǎn)。對于后者，例如胃泌素肽，通過在聚二甲基丙稀酰胺凝膠樹脂上使用固相Fomc(芴甲氧羰基)肽合成而得以合成。然后通過標(biāo)準(zhǔn)方法純化多肽。
偶合配對物/載體偶合配對物/載體包括血漿成分例如獲得于病人的血清、純化的血清蛋白(質(zhì))如清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或免疫球蛋白、紅血球蛋白例如血型糖蛋白A和AE-1、糖結(jié)合蛋白例如血凝素、鈍化的酶、磷酸鹽和硫酸鹽結(jié)合蛋白、膽酸、脂質(zhì)結(jié)合蛋白、脂質(zhì)/親脂性部分；聚合物載體例如葡聚糖或聚乙二醇。當(dāng)胃泌素偶合于脂質(zhì)/親脂性部分時(shí)，一旦被注射，有可能這些偶合物與血清蛋白發(fā)生非共價(jià)作用或共價(jià)的相互作用，所述血清蛋白例如是以結(jié)合脂肪酸而為人所知的清蛋白，或例如血清中的脂質(zhì)結(jié)合蛋白。對于此處的組合物和方法的目的，可習(xí)慣性地將血清和血漿進(jìn)行互換使用。為了將胃泌素偶合于載體，首先需要通過引入反應(yīng)性基團(tuán)將載體活化。在一些情況中，載體已經(jīng)包含至少一個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)，例如清蛋白的半胱氨酸34。在活化載體后(如果需要)，將載體與胃泌素化合物進(jìn)行偶合。通常，通過蛋白鏈中的反應(yīng)性基團(tuán)，例如硫醇基、α-和ε-氨基、羧基或芳香環(huán)，載體可與蛋白共價(jià)結(jié)合，其中所有的反應(yīng)性基團(tuán)都已經(jīng)存在，或使用已知的分子生物學(xué)方法通過蛋白的預(yù)先化學(xué)修飾而得以加入，即在化學(xué)合成中得以加入，或通過化學(xué)修飾已有的胃泌素肽或通過修飾蛋白的氨基酸序列而得以加入。例如，載體可結(jié)合蛋白質(zhì)的位于N末端的賴氨酸殘基或半胱氨酸殘基的硫醇基的ε-氨基?；蛘?，通過異雙功能或同雙功能交聯(lián)劑使載體與蛋白質(zhì)結(jié)合。
血漿蛋白血漿蛋白結(jié)合是提高其他短壽命分子如胃泌素的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的有效方法。血漿蛋白的一方面是大于腎過濾界限(45kDa)的天然分子量，因此在血漿中有延長的滯留時(shí)間。血漿蛋白包括但不限于清蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-抗血纖維蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、α-2-巨球蛋白、血管緊張素原、抗凝血酶III、阿樸脂蛋白AI(HDL)、阿樸脂蛋白All(HDL)、阿樸脂蛋白B(LDL)、阿樸脂蛋白CI(VLDL)、阿樸脂蛋白CII(VLDL)、阿樸脂蛋白CIII(VLDL)、阿樸脂蛋白E(VLDL)、脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、Cl酯酶抑制物、血漿銅鐵蛋白、鐵蛋白、纖維蛋白原、GC球蛋白、結(jié)合珠蛋白(混合型)、血色素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白Al、免疫球蛋白Al、免疫球蛋白A2、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E、免疫球蛋白G、Fab片段、免疫球蛋白G、Fc片段、免疫球蛋白G、免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2、免疫球蛋白G3、免疫球蛋白G4、免疫球蛋白M、μ鏈、免疫球蛋白M、FC5μ、免疫球蛋白M、免疫球蛋白重鏈(H)、免疫球蛋白輕鏈(L)-K-輕鏈、γ-輕鏈、免疫球蛋白Fab片段、免疫球蛋白Fc片段、乳鐵傳遞蛋白、脂蛋白a、[Lp(a)]、脂蛋白(高密度)、脂蛋白(低密度)、脂蛋白(極低密度)、前清蛋白、凝血素、胸腺素原-α、類風(fēng)濕因子、類固醇結(jié)合蛋白、皮質(zhì)素傳遞蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鐵傳遞蛋白和α-胎蛋白。血漿蛋白的列表可參見Anderson and Anderson，Molecular and CellularProteomics 2002，1.11845。
人血清清蛋白的分子量為67kDa，在循環(huán)中的半衰期為19天，是人血漿中最豐富的蛋白。清蛋白由形成單多肽鏈的585個(gè)氨基酸組成。清蛋白與大量的化合物相互作用，包括例如長鏈脂肪酸的生理學(xué)配體、某種治療劑例如丙酮芐羥香豆素和2-丙基戊酸鈉和無機(jī)配體例如鈣。
抗體/免疫球蛋白包括完全免疫球蛋白或其片段，其中免疫球蛋白包括多種型和同種型，例如IgA、IgD、IgE、IgGI、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段包括Fab、Fv和F(ab′)2、Fab′和類似物。此外，合適時(shí)可使用片段、凝集物、聚合物、或免疫球蛋白偶合物。抗體是單克隆或多克隆抗體，通過常規(guī)使用的技術(shù)如宿主免疫法和血清收集法(多克隆)、或通過制備連續(xù)的雜交細(xì)胞系和收集分泌蛋白(單克隆)、或可通過克隆和表達(dá)核酸序列或其編碼至少特異地結(jié)合天然抗體所需的氨基酸序列的突變型序列來制備抗體。
聚合物載體偶合配對體可包括聚合物，其在多個(gè)實(shí)施方案中是天然存在的或人工合成的。聚合物的實(shí)例包括蛋白質(zhì)、糖肽、多糖例如葡聚糖，例如氨基葡聚糖或羧基甲基葡聚糖，和葡聚糖的生物聚合物衍生物例如硫酸葡聚糖、羥乙基淀粉、纖維素纖維素原，包括甲基纖維素和羧甲基、淀粉和淀粉衍生物菊粉、肝磷脂、肝磷脂片段；合成聚合物例如烷基二醇(PAG)，例如PEG及其衍生物、聚氧乙烯多元醇(POP)例如聚氧乙烯甘油(POG)、聚三亞甲基二醇(PTG)、聚丙二醇(PPG)、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙稀酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氨基酸、聚氨酯和聚磷腈、聚(乳酸-共-乙二醇)PLA-PEG、聚(D、L-乳酸-共-乙醇酸)PLGA、聚(原酸酯)、聚(乳酸-共-乙交酯)-嵌段-聚(乙二醇)、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、和聚氨酯醇)-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA-PEG-PLGA)、聚(N-異丙基丙烯酰胺、聚氧乙烯多元醇、聚甲基丙烯酸羥乙酯、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)；腙、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚馬來酸酐、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺、聚丙二醇、聚烷二醇及其衍生物的合成共聚物；聚烷二醇及其衍生物的共聚物，聚乙烯基乙基醚和α，β-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬酰氨，聚(N-丙烯酰嗎啉)(PacM)。通常，合成的聚合物可以是線性的或分支的、取代的或未取代的、兩個(gè)或多個(gè)不同的合成單體的均聚物或共聚物。
肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化可導(dǎo)致在保留生物學(xué)功能的同時(shí)，療效得以增強(qiáng)。通過增加分子的大小和通過蛋白水解酶的降解，與PEG偶合(或與其他聚合物，如葡聚糖)，可降低腎過濾或免疫應(yīng)答的過程，所有這些可增強(qiáng)在體內(nèi)的穩(wěn)定性。PEG(聚乙二醇)是標(biāo)準(zhǔn)線性的重復(fù)單體，可以在游離的羥基末端上對其進(jìn)行化學(xué)活化。所述活化可帶來與大量功能基團(tuán)的反應(yīng)，包括巰基和氨基。為了抑制交聯(lián)劑，兩個(gè)末端羥基中的一個(gè)可用甲氧基(mPEG)加帽。為了允許在單個(gè)PEG分子有多個(gè)結(jié)合肽的位點(diǎn)，也可合成具有多個(gè)叉或分支的PEG。
通過用馬來酰亞胺修飾至少一個(gè)mPEG，含游離巰基的肽(如半胱氨酸，使用3字母氨基酸符號的縮寫Cys)將很容易發(fā)生烷基化反應(yīng)，而形成穩(wěn)定的硫酯鍵。就胃泌素來說，可使用具有將半胱苷肽引入不是其生物學(xué)活性必需的肽區(qū)域(例如，在其N端)的合成胃泌素化合物。
含游離胺的肽(如賴氨酸或N末端氨基)可與被琥珀酰亞氨酯修飾的PEG反應(yīng)，以生產(chǎn)穩(wěn)定的酰胺鍵。由于缺乏化學(xué)反應(yīng)的特異性，如就含有3賴氨酸殘基的胃泌素-34來說，任一個(gè)或更多的賴氨酸殘基可與修飾的PEG反應(yīng)，導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)或者功能性質(zhì)的偶合肽的不均勻混合物，因此其純化并非不重要。在肽合成中，通過引入其中PEG已經(jīng)鏈接于ε-氨基酸側(cè)鏈上的賴氨酸殘基(如Felix(1997)描述)，容易實(shí)現(xiàn)特殊賴氨酸殘基的位點(diǎn)特異的聚乙二醇化。Felix，A.M.(1997)Site-Specific Poly(ethylene glycol)ylation of Peptides.In″Poly(ethylene glycol).Chemistry and Biological Applications.″Harris，J.M.& Zalipsky S.Eds.
“活化的PEG”(或“聚乙二醇化制劑”)是任何的PEG衍生物，其可用作蛋白調(diào)節(jié)物，因?yàn)樗心芘c蛋白質(zhì)/肽中的一些官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的官能團(tuán)，以生產(chǎn)PEG-蛋白質(zhì)/肽偶合物。活化的PEG包括烷基化的PEG、酰化的PEG和具有氨基酸臂的PEG。通過使用PEG馬來酰亞胺(如mPEG-馬來酰亞胺-20000，來自于ShearwaterCorporation，Huntsville，AL)可在半胱氨酸殘基上進(jìn)行聚乙二醇化。氨基PEG可用于將羧基聚乙二醇化?；罨腜EG的實(shí)例包括甲氧基聚乙二醇、二氨基甲氧基-聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-對-硝基-苯基碳酸鹽、甲氧基聚乙二醇琥珀亞酰胺琥珀酸鹽、甲氧基聚乙二醇tresylate、甲氧基-聚氧乙烯胺(氨基PEG)、甲氧基聚氧乙烯-羧酸、單甲氧基-PEG對-硝基苯碳酸酯、N-N′-羰二咪唑-活化的PEG和甲氧基聚氧乙烯咪唑-羰基。不同分子量的PEG可從商業(yè)上獲得。反應(yīng)物PEG的平均分子量的范圍介于約5,000到約100,000道爾頓之間。連接方法不是決定性的，但優(yōu)選不改變，或僅僅最低限度地改變生物學(xué)活性分子的活性。優(yōu)選連接方法是通過N末端鏈接于多肽。參見Veronese，Biomaterials 22(5)405(2001)，其綜述了對PEG的不同活化策略?；蛘撸ㄟ^在偶合前先用糖分子將胃泌素與衍化而發(fā)生糖聚乙二醇化，可將PEG偶合于肽/蛋白質(zhì)(即，糖基聚乙二醇化方法，如，使用Neose′s Glyco聚乙二醇化技術(shù))。
葡聚糖是天然存在的聚合物，其主要由彼此以糖苷鍵鏈接的D-葡萄糖的重復(fù)單位的線性多糖組成。在葡聚糖聚合物中存在分支點(diǎn)，分支類型和分支程度根據(jù)物種而不同。葡聚糖可用于偶合胃泌素化合物。可溶性葡聚糖的平均分子量范圍介于約10,000至500,000道爾頓之間。葡聚糖聚合物在各個(gè)葡萄糖單體上含有相鄰的羥基，所述單體通過高碘酸鈉而氧化來釋放能與氨基反應(yīng)的官能團(tuán)醛基。通過席夫堿形成隨后發(fā)生還原胺化作用以構(gòu)建穩(wěn)定的結(jié)合，可將聚乙醛葡聚糖偶合于氨基上，例如賴氨酸殘基上的ε氨基上。通過與一氯乙酸反應(yīng)以產(chǎn)生羧甲氧基葡聚糖，使葡聚糖得以羧甲氧基化，其在與酰肼縮合中可形成葡聚糖-酰肼，該酰肼可與羰基或醛基反應(yīng)。巰基反應(yīng)性葡聚糖衍生物可以通過使用異雙功能交聯(lián)劑來制備，所述交聯(lián)劑在一末端含有例如吡啶基二硫化物、馬來酰亞胺或碘乙酰基以將偶合反應(yīng)定向于巰基上。
與親脂性部分的偶聯(lián)親脂性取代基可在胃泌素化合物的N末端結(jié)合于氨基酸的反應(yīng)性基團(tuán)，或任選地結(jié)合于通過異雙功能或同雙功能交聯(lián)劑基團(tuán)生成的反應(yīng)性基團(tuán)。例如，親脂性取代基的羧基可與賴氨酸上的氨基反應(yīng)。例如，親脂性取代基具體是含有如8-40個(gè)碳原子的長鏈基團(tuán)。例如，親脂性取代基可以是直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈脂肪酸的?；⒅辨溁蛑ф溚闊Nα，ω-二羧酸的酰基。例如，胃泌素的親脂性衍生物可通過與氨基化學(xué)結(jié)合而得以合成，例如使用多種脂肪酸與N末端的氨基進(jìn)行連接所述脂肪酸包括月桂酸(正-十二烷酸)、肉豆蔻酸(正-十四烷酸)、棕櫚酸(正-十六烷酸)、棕櫚油酸(正-十六烯酸)、硬脂酸(正-十八烷酸)、油酸(正-十八烯酸)、乙酸、亞油酸和花生四烯酸。
或者，剛性構(gòu)象的疏水性部分(即存在雙鍵、三鍵、或飽和或不飽和環(huán))可結(jié)合于胃泌素肽。例如，包含羧基的長鏈脂肪酸可結(jié)合于例如存在于賴氨酸殘基上的氨基。
雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)劑的實(shí)例包括但不限于下列氨基定向的同功能交聯(lián)劑包括二酰亞胺酯(二亞胺酸酯)，例如，乙酰亞胺酸甲酯-HCl、辛二酰亞胺酸二甲酯-2HCl；二-N-琥珀酰亞胺基衍生物，例如，二(硫代琥珀酰亞胺基-辛二酸鹽)(BSSS)、琥珀酸二-(N-羥基-琥珀酰亞胺)酯；雙功能芳基鹵，例如，1，5，-二氯-2，4-二硝基苯；雙功能?；瘎?，例如，二異氰酸酯和二異硫氰酸酯，如，1，6，-亞己基二異氰酸酯；雙功能磺酰鹵，例如，苯酚-2，4，-二磺酰氯；二硝基苯酚酯，例如，羧酸二-(對-硝基苯)酯；和雙功能酰疊氮，例如，酒石酰二疊氮；二醛，例如，戊二醛；二酮，例如，2，5-己二酮；和其他例如苯醌、2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷、季戊四醇二碳酸酯、粘溴酸、粘氯酸、氯代甲酸乙酯、氯代甲酸對硝基苯基酯、6-肼基煙酸琥珀酰亞胺基酯、丙酮腙和4-甲?；郊姿徵牾啺孵?例如首先用肼接頭修飾胺，其次將胺修飾到乙醛接頭上，然后彼此交聯(lián)在一起)。
另一組雙功能交聯(lián)劑是硫氫基定向的同雙功能交聯(lián)劑，其包括汞試劑，例如，1，4，-二(溴代汞基)丁烷；二硫化物形成劑，例如，聚亞甲基二(甲硫基磺酸鹽)；雙馬來酰亞胺，例如，N，N’-亞甲基雙馬來酰亞胺、二(N-馬來酰亞胺甲基)酯、雙-馬來酰亞胺乙烷，1，4-雙-馬來酰亞胺基丁烷、1，4-二-馬來酰亞胺基-2，3，-二羥基丁烷、二-馬來酰亞胺基己烷、1，8-二-馬來酰亞胺三亞乙基二醇。還有另一組是烷基化劑，例如二-乙酰鹵，如1，3-二溴丙酮；二(烷基鹵)，例如，二(2-氯乙基)硫化物；均-三嗪，例如，2，4，-二氯-6-甲氧基-均三嗪；氮丙啶，例如，2，3，4，-三(亞乙基亞氨基)-均三嗪；和二-環(huán)氧化物，例如，1，2，3，4-二環(huán)氧丁烷；以及其他，如乙烯砜。
其他基團(tuán)定向的同雙功能交聯(lián)劑是化學(xué)交聯(lián)劑領(lǐng)域公知的，例如羧基定向試劑，如，雙偶氮己烷；酚鹽和咪唑基定向試劑，例如二聯(lián)苯胺；精氨酸試劑，例如，對-亞苯基雙乙二醛；和其他試劑，如順式-二氯二氨合鉑(II)(用于將α2-巨球蛋白與在識別位點(diǎn)或鄰近識別位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基交聯(lián)，可交聯(lián)DNA的己二酸二酰肼的互補(bǔ)鏈，以及交聯(lián)糖蛋白、酸式磷酸酶和蔗糖酶)、N，N’-二(b-氨基乙酸)-酒石酰胺。
基團(tuán)選擇性的異雙功能交聯(lián)劑也是本領(lǐng)域公知的，其包括氨基和巰基定向的雙功能劑，例如，3-(2-吡啶二硫基丙酸)-N-琥珀酰亞胺基酯(SPDP)及其類似物(LC-SPDP，硫代-LC-SPDP)、琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯(SMPT)及其類似物硫代琥珀酰亞胺-6-{α-甲基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯甲酰胺基}己酸酯(硫代-LC-SMPT)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)及其類似物、硫代琥珀酰二亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(硫代MCC)、間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基-琥珀酰亞胺酯(MBS)及其類似物間-馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基-硫代琥珀酰亞胺酯(硫代-MBS)、N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲酸酯(SIAB)及其類似物硫代琥珀酰亞胺基(4-碘代乙?；?氨基苯甲酸酯(硫代-SIAB)、琥珀酰亞胺基-4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(SMBP)及其類似物、硫代琥珀酰亞胺基-4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸鹽(硫代SMBP)、N-γ-馬來酰亞胺基丁酰-氧基琥珀酰亞胺酯(GMBS)及其類似物(硫代-GMBS)、琥珀酰亞胺基-6-[(碘代乙?；?-氨基]己酸酯(SIAX)及其類似物琥珀酰亞胺基-6-[6-((碘代乙酰基)氨基)-己?；鵠氨基]己酸鹽(SIAXX)、琥珀酰亞胺基-4-(((碘代乙?；?氨基)甲基)-環(huán)己烷-1-羧基酯(SIAC)及其類似物琥珀酰亞胺基-6-((((4-(碘代乙?；?氨基)甲基)-環(huán)己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(SIACX)、N-琥珀酰亞胺基-4-馬來酰亞胺基丁酸酯；羧基以及巰基或氨基定向的雙功能試劑，例如，重氮乙酸對-硝基苯基酯；羰基和巰基定向的雙功能試劑，例如，1-(氨基氧基)-4-[(3-硝基-2-吡啶基)二硫基)]丁烷；4-(-4-N-馬來酰亞胺基苯基)丁酸肼鹽酸鹽(MPBH)、4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧基-肼(M2C2H)、3-(2-吡啶二硫基)丙?；?PDPH)和其他例如2-甲基-N′-苯磺酰基-N4-溴代乙?；嗸０贰-羥基琥珀酰亞胺基-對甲?；?苯甲酸酯、甲基-4-(6-甲?；?3-疊氮基-苯氧基)丁酰亞胺酸酯HCl、丙烯醛。
此外包含在實(shí)施方案中的合適的交聯(lián)劑還有零長度的交聯(lián)劑的基團(tuán)，其包括羧基活化劑，例如碳化二亞胺，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙烷)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)(活化可以與NH2基團(tuán)交聯(lián)的羧基)；噁唑鎓衍生物；氯代甲酸酯；羰基二咪唑；和N-烷酯基二氫喹啉；二硫化物形成劑，如二價(jià)銅二(1，10鄰二氮雜菲)；酶，例如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、過氧化物酶(在賴氨酸殘基間)、黃嘌呤氧化酶(形成二硫鍵)；以及其他，例如吡咯并喹啉醌(將賴氨酸轉(zhuǎn)換為可與其他賴氨酸殘基反應(yīng)的半乙醛)。
藥物組合物在多種實(shí)施方案中本發(fā)明提供藥物組合物，其包含治療有效量的單獨(dú)的胃泌素化合物或FACGINT的組合，或含有胃泌素化合物的降血糖劑。本文中描述的所有藥物組合物可以使用或不使用用于免疫抑制的制劑，使用或不使用用于持續(xù)釋放、局部或全身給藥的成分或裝置進(jìn)行配制?？商砑铀帉W(xué)上可接受的載體或賦性劑。所述載體包括但不限于鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡聚糖、水、甘油、乙醇，及其組合。劑型應(yīng)當(dāng)適合于給藥方式。在這種情況下此處所用的術(shù)語“有效量”是足以達(dá)到可治療糖尿病癥狀的可識別的醫(yī)療目的的治療劑或制劑的組合。如本文中所述，技術(shù)人員根據(jù)測量有關(guān)參數(shù)的現(xiàn)有方法，可憑經(jīng)驗(yàn)確定有效量。
本文中的組合物還包括潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳化液、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑，或粉劑。通過常規(guī)的粘合劑和載體例如甘油三酸酯，可以將組合物配制成栓劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體，例如醫(yī)藥級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，等。多種給藥系統(tǒng)是已知的，并能用于給藥本發(fā)明的組合物，例如，包裹于脂質(zhì)體、微粒、微膠囊中等。
在示范性的實(shí)施方案中，根據(jù)適合于藥物組合物的常規(guī)方法，例如用于人的皮下給藥方法，可以配制本文中的組合物。典型地，用于皮下給藥的組合物是無菌等滲的水緩沖溶液。如果需要，組合物還包括增溶劑和用于減輕注射部位疼痛的局部麻醉劑。通常，這些成分或單獨(dú)地或以一起混和在單位劑型形式提供，例如，在密封容器中的干粉末、凍干粉末或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或如指明活化劑數(shù)量的扁囊。如果通過輸液給藥組合物，則可通過含有無菌醫(yī)藥級水、緩沖液或鹽溶液配制組合物。如果通過注射給藥組合物，可提供用于注射的無菌水或鹽溶液的安培，以便給藥前混和這些成分。本文中的組合物能以多種成分被配制成栓劑，其含有按重量計(jì)算約為0.5％至10％范圍的活性成分；口服配制劑優(yōu)選含有按重量計(jì)算約為10％至95％范圍的活性成分。日劑量以單次劑量進(jìn)行給藥，或分成多個(gè)較小的分劑量來進(jìn)行每日多次的給藥。
如此處所用的，劑量時(shí)間表是指用于任何組合物的給藥方法，其中組合物包括例如本文中提供的修飾的胃泌素化合物，或聯(lián)合FACGINT或聯(lián)合降血糖劑和/或免疫抑制劑的修飾胃泌素，各組合物以有效劑量同時(shí)給藥或在各自單獨(dú)的時(shí)間間隔中給藥，所述時(shí)間間隔例如在各自的一天中，或作為組合制劑給藥或單獨(dú)給藥，該方法還包括在例如每天的每單位時(shí)間中給藥的組合物的量，以及給藥各個(gè)組合物持續(xù)的時(shí)間或周期時(shí)間。
在一個(gè)方面中，發(fā)明提供用于抑制或治療糖尿病的方法，該方法包括對需要胃泌素化合物的組合物的哺乳動(dòng)物，單獨(dú)地給藥胃泌素化合物或聯(lián)合FACGINT或聯(lián)合降血糖劑和/或聯(lián)合免疫抑制劑給藥，每次給藥量足以提高哺乳動(dòng)物中分泌胰島素β的細(xì)胞的數(shù)量；以及確定胰島再生的總數(shù)，從而治療或抑制糖尿病。確定胰島再生的總數(shù)是測量選自下列的參數(shù)血糖、血清葡萄糖、血液糖化血色素、胰島素β細(xì)胞塊、血清胰島素和胰島素的含量。與給藥組合物之前的血糖測定比較，給藥此處描述的組合物可減少血糖，例如與給藥組合物之前的血糖測定相比較，給藥這些組合物可減少血糖約50％，或70％。與哺乳動(dòng)物中在給藥組合物前測定的糖化血色素的濃度比較，糖化血色素的濃度得以降低。與哺乳動(dòng)物中在給藥組合物前測定的血清胰島素濃度比較，血清胰島素濃度得以提高。與哺乳動(dòng)物中在給藥組合物前測定的胰島素濃度比較，胰島素濃度得以提高。
可以將本發(fā)明的組合物配制成中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與游離氨基形成的鹽，例如衍生于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽，以及與游離羧基形成的鹽，例如衍生于鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。
可有效治療特殊病癥或病情的本發(fā)明的治療劑的量，取決于病癥或病情的本性，并且可通過標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)得以確定。制劑中所用的準(zhǔn)確劑量也取決于給藥途徑、疾病或病癥的嚴(yán)重程度，并根據(jù)醫(yī)師的判斷和各個(gè)病人的詳情而得以確定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定胰島素或C肽的血液水平，以及葡萄糖或葡萄糖刺激的空腹水平的常規(guī)測定。通過源自體外或動(dòng)物模型測試系統(tǒng)的劑量應(yīng)答曲線，藥學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以推斷有效劑量。使用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)包含循環(huán)、
代謝、排泄中的吸收、分布、半衰期動(dòng)力學(xué)以及本文的實(shí)施方案的受體配體的毒理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，對給藥于患者的組合物劑量，針對物種至物種的已知變化進(jìn)行調(diào)節(jié)。合適的給藥劑量范圍，通常是對各個(gè)活性化合物為每天每千克體重約0.01微克至10,000微克，例如，每天約0.01微克至1微克/kg、約0.1微克至10微克/kg、約1微克至500微克/kg、約10微克至10mg/kg。因此合適的給藥劑量范圍通常是約0.01微克/kg體重/天至10mg/kg體重/天。
在其他實(shí)施方案中本發(fā)明提供了藥品包或試劑盒，它們包含一個(gè)或多個(gè)填充有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。在所述包裹或試劑盒中，可找到含有擴(kuò)大用途的胃泌素化合物的單位劑量的容器。與這種容器相關(guān)聯(lián)的可以是多種書寫材料，如說明書，或者管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人用藥品的政府機(jī)構(gòu)的準(zhǔn)許。
除非另外限定，本文中所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，可被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員正常理解成具有相同的含義。類似于或等價(jià)于本文中描述的那些方法和材料，可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明通過多種實(shí)施方案得以充分描述，并且附加的實(shí)施方案可作為隨后的實(shí)施例和權(quán)利要求的例子進(jìn)行說明，其中它們并不意味作為進(jìn)一步限制而進(jìn)行解釋。所有引用的參考文獻(xiàn)內(nèi)容在此作為參考得以全部引用。
實(shí)施例實(shí)施例1.在通過靜脈注射對雄恒河猴給藥后，未修飾的胃泌素的藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)施例在通過單獨(dú)靜脈注射對雄恒河猴給藥后，進(jìn)行該實(shí)施例以評估未修飾的胃泌素(指文中的化合物B；參見表3)的藥物動(dòng)力學(xué)(PK)曲線圖。所用到的17個(gè)氨基酸的胃泌素類似物具有在位點(diǎn)15的單氨基酸突變，其中甲硫氨酸被替換為亮氨酸。因此雖然化合物B不同于天然存在的胃泌素，但是所有的有效證據(jù)表明它是胃泌素的功能等價(jià)物。
下列限定了與PK分析術(shù)語有關(guān)的術(shù)語Cmax-觀測到的血漿濃度的最大值。
tmax*-最大濃度對應(yīng)的時(shí)間。
AUC-曲線下方的面積，作為對一段時(shí)間內(nèi)暴露于藥物的總的量度。
血漿t1/2-測量藥物停留在血液中直至血藥濃度降至50％所需的多長時(shí)間。
胃泌素的給藥本實(shí)施例中使用雄性動(dòng)物。每只動(dòng)物通過靜脈給藥(3μg/kg、10μg/kg和30μg/kg)而接受胃泌素。用于靜脈注射的配量溶液以單團(tuán)劑量，通過隱靜脈按1ml/kg的劑量進(jìn)行給藥。在為了確保全部劑量體積的給藥的定量給藥后，施用0.2ml的鹽水洗液。給藥于每只動(dòng)物的實(shí)際體積取決于于動(dòng)物最近的體重。
血液收集通過臂靜脈或股靜脈，按下列時(shí)點(diǎn)收集連續(xù)的血樣(大約每時(shí)點(diǎn)0.5ml)0(給藥前)、1、3、5、10、15、30分鐘，1、2和4小時(shí)(給藥后)。
將每份樣品收集到含有EDTA的試管中，放置冰上直至離心。以1,500g(RCF)將樣品最少冷凍離心10分鐘，將所得血漿轉(zhuǎn)入另一個(gè)試管中并置于干冰中。將用于如下描述的PK分析的所有樣品都冷凍保藏。
分析胃泌素水平通過制定完善的、用于定量測定胃泌素的競爭放射性免疫測定法，來檢測血漿樣品中的胃泌素(Russell et al.，Postgraduate MedicalJournal 52645，1976)。檢測中所用的抗體是在兔抗合成的人胃泌素I中產(chǎn)生的，所述胃泌素I通過碳化二亞胺偶合于牛血清蛋白。用125I標(biāo)記抗原，并在該抗原的存在下，使用γ射線計(jì)數(shù)器探測抗體反應(yīng)。
藥物動(dòng)力學(xué)分析為了計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將每只動(dòng)物的各時(shí)點(diǎn)的胃泌素血液水平數(shù)據(jù)輸入Graphpad Prism 3.0(GraphPad Software，San Diego，California，USA，www.graphpad.com)。
表2靜脈注射后，靈長類的胃泌素的平均PK參數(shù)的匯總表
表2的數(shù)據(jù)表明化合物B的較短血漿t1/2，對于三個(gè)給藥組其平均約為4-5分鐘。在單團(tuán)劑量給藥后，化合物B表現(xiàn)出從靈長類血流中很快地被清除。隨著化合物B的靜脈給藥劑量的提高，可觀測到Cmax和AUC值的提高，然而提高給藥劑量對t1/2值并沒有影響。這些數(shù)據(jù)顯示加大化合物B的給藥量不能增強(qiáng)該肽在循環(huán)中的短生存期?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明胃泌素在數(shù)分鐘內(nèi)從血流中被清除。因此，由于血清中胃泌素的快速清除，限制了血清中生物活性化合物的存在。
實(shí)施例2.未修飾的胃泌素對近期發(fā)作糖尿病的NOD小鼠的空腹血糖水平和胰島素含量的影響。
根據(jù)空腹血糖(FBG)水平＞6.6mmol/l確定糖尿病的發(fā)病，從而監(jiān)控未發(fā)作糖尿病(NOD)的雌鼠。在糖尿病發(fā)作后，以(i)賦形劑(n＝4)；或(ii)胃泌素(如表3所列的化合物B)按3ug/kg/day的劑量，每天給藥一次(n＝5)共14天，來處理小鼠。小鼠未接受胰島素補(bǔ)給處理。在第0天和第35天(停止處理后的第21天)評估兩個(gè)處理組的空腹血糖水平和胰島素含量。
圖1顯示35天后賦形劑處理的對照動(dòng)物的空腹血糖水平(FBG)。相反地，胃泌素的處理可抑制一些糖尿病NOD小鼠中的血糖水平上升，然而，F(xiàn)BG剩余水平顯著地高于在普通小鼠中所觀察到的水平(約3-7mM)。這些數(shù)據(jù)表明，為了將水平降至正常水平，人們需要提高胃泌素的功效。
由于β-細(xì)胞被破壞，賦形劑處理組的胰島素水平在第35天下降，然而與預(yù)處理值相比，用胃泌素處理的動(dòng)物顯著地表現(xiàn)出胰島素水平的上升。參見圖2。然而，在以0.6μg/ml的化合物B處理后，胰島素水平的上升仍然明顯低于普通小鼠的水平(12μg/胰腺)。這些數(shù)據(jù)連同實(shí)施例1中的藥物動(dòng)力學(xué)分析一起，表明使用未修飾的胃泌素來處理糖尿病NOD小鼠的效果，受到血漿胃泌素的較短生存期的限制(5分鐘)。因此，利用長效胃泌素可更有效地刺激胰島細(xì)胞的新生，提高胰島素和抑制NOD小鼠中糖尿病的進(jìn)展。
實(shí)施例3胃泌素肽的肽合成使用固相肽的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如Steward，J.M.and Young，J.D.(1984)in″Solid Phase Peptide Synthesis″，2nded.，Pierce ChemicalCompany描述的，本領(lǐng)域中任何普通技術(shù)人員可容易地合成胃泌素肽。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如使用反向HPLC和由0.1％TFA的H2O和0.1％TFA的乙腈組成的揮發(fā)性雙元系統(tǒng)，可進(jìn)行胃泌素肽的純化。通過紫外吸收來監(jiān)測洗脫，以收集純化的肽，然后將其冷凍干燥，隨后根據(jù)需要將其溶解，用于給藥或測試，或用于進(jìn)一步的偶合反應(yīng)。
人工合成胃泌素合成肽，其含有除SEQ ID NO1或2的29-34殘基之外的1-28殘基的任何連續(xù)部分，或含有除SEQ ID NO3或4的12-17殘基之外的1-11殘基的任何連續(xù)部分。此外，人工合成具有N末端的間隔區(qū)的胃泌素肽，所述間隔區(qū)包括例如Gly和Ala的中性小氨基酸殘基。也可合成具有N末端Cys殘基的胃泌素合成肽，該肽具有或不具有間隔區(qū)。
表3列出了一些被合成用于胃泌素組合物的胃泌素肽的匯總表，并包括“大”胃泌素-34(A)、“小”或“短”胃泌素-17(B)，以及胃泌素-13(C)。
表3.胃泌素組合物及其成分的匯總表
PEG是聚(乙二醇)-20000；HAS是人血清清蛋白；(GA)5是Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala間隔區(qū)。
實(shí)施例4胃泌素與PEG-20000的偶合將N端被Cys修飾的胃泌素肽(表3中的化合物D、E、F、G和H)，在接近中性的條件下與摩爾過量的三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP；具有馬來酰亞胺部分的無活性的還原劑)一起溫育30分鐘(緩沖pH6.5-7.5)，以確保Cys殘基處于還原態(tài)，并可用于反應(yīng)。
逐步加入摩爾過量的mPEG-馬來酰亞胺-20000(平均分子量20000；從Shearwater Corporation，Huntsville AL，USA獲得)，同時(shí)混勻促進(jìn)溶解，當(dāng)充分溶解后，將溶液額外混勻1至4小時(shí)，以完成偶合反應(yīng)。使用陰離子交換劑，例如中性pH的Q-瓊脂糖，進(jìn)行偶合物的純化直到偶合物和任何未反應(yīng)的胃泌素緊密結(jié)合，由于胃泌素的理論上的等電點(diǎn)(pI)是3.4，而中性未反應(yīng)的mPEG-馬來酰亞胺不能結(jié)合。為了進(jìn)一步的純化，基于它們分子量的巨大差異，使用大小排阻層析法，例如Sephadex G-5，和適于治療用途的緩沖液，例如PBS，很容易地將偶合物從未反應(yīng)的胃泌素中分離出來。
這些反應(yīng)導(dǎo)致表3中化合物I、J、K、L和M的生成。使用針對肽含量的縮二脲反應(yīng)和針對PEG含量的比色法(Habeeb，A.E S.A.(1966)Anal.Biochem.14328-336)，以及確定偶合物總分子量的電噴霧質(zhì)譜，來檢驗(yàn)偶合反應(yīng)的成功。
實(shí)施例5與人血清清蛋白的偶合血清清蛋白含有單個(gè)可接近的半胱氨酸還原殘基(Cys-34)，所述殘基是人血清蛋白中最主要的反應(yīng)性硫醇基(Pedersen等(1980)Eur.J.Biochem.106291-295)。該性質(zhì)可允許包括肽的配體特異地偶合于血清清蛋白。
將人血清清蛋白于接近中性條件下與摩爾過量的三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP；具有馬來酰亞胺部分的無活性的還原劑)一起溫育30分鐘(緩沖pH6.5-7.5)，以確保Cys殘基處于還原態(tài)，并可用于反應(yīng)。將摩爾過量的二-馬來酰亞胺基乙烷(具有短間隔區(qū)和對巰基反應(yīng)性的同雙功能交聯(lián)劑)加入以活化Cys-34。在單獨(dú)的反應(yīng)中，加入N端被Cys修飾的胃泌素肽(表3中的化合物D、E、F、G和H)，將所得溶液額外混勻1至4小時(shí)，以完成偶合反應(yīng)?；诜肿恿康木薮蟛町?，使用大小排阻層析法，和使用治療用途的緩沖液，例如PBS，很容易地將偶合物從未反應(yīng)的胃泌素(和形成的任何胃泌素二聚物)中分離出來。從胃泌素肽偶合的HAS中無法進(jìn)一步分離未反應(yīng)的HAS。
這些反應(yīng)導(dǎo)致表3中化合物N、O、P、Q和R的生成。使用測定偶合物總分子量的電噴霧質(zhì)譜，來檢驗(yàn)偶合反應(yīng)的成功。
實(shí)施例6.通過靜脈注射對Wistar大鼠給藥后，在未修飾和修飾的胃泌素化合物之間的藥物動(dòng)力學(xué)比較引入該實(shí)施例以評估對Wistar大鼠靜脈注射后，未修飾和修飾的胃泌素衍生物/偶合物的藥物動(dòng)力學(xué)曲線圖。
胃泌素的給藥大鼠(三組)接受如實(shí)施例3中合成的多種測試化合物，將胃泌素等價(jià)物按10μg/kg的劑量水平進(jìn)行靜脈給藥。以下所用的測試化合物都是以上表3列出的化合物。詳情請參見表3。
血液收集按下列時(shí)點(diǎn)收集連續(xù)的血樣(大約每時(shí)點(diǎn)0.4ml)在注射所有動(dòng)物后的5、60、180、480分鐘。在各個(gè)時(shí)點(diǎn)，從每組的3只動(dòng)物采集血液。
將每份樣品收集到含有EDTA的試管中，放置冰上直至離心。以1,500g(RCF)將樣品最少冷凍離心10分鐘，將所得血漿轉(zhuǎn)入另一個(gè)試管中并置于干冰中。冷凍保藏所有樣品以備PK分析。
分析胃泌素水平使用來自R & D systems，catalog number DE3400的人胃泌素1(G-17)免疫測定試劑盒，通過ELISA方法，來測定血漿中化合物B水平。該測定基于競爭結(jié)合技術(shù)，其中存在于樣品中的胃泌素I與定額的堿性磷酸酶標(biāo)記的胃泌素I競爭兔多克隆抗體上的位點(diǎn)。在溫育中，抗體結(jié)合羊抗兔抗體，并包埋于微量培養(yǎng)板上。洗滌除去過量的偶合物和未結(jié)合的樣品之后，向培養(yǎng)孔中加入底物溶液以確定結(jié)合酶的活性。顏色的亮度與樣品中胃泌素I的濃度成反比例。
藥物動(dòng)力學(xué)分析使用PK Functions for Microsoft Excel(Usansky JI，Desai A，Tang-Liu D，Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism，Irvine，CA)，分析胃泌素(化合物B)及其不同的衍生物/偶合物的血藥濃度。為了評估PK曲線圖，計(jì)算多種測試化合物和下列PK值Cmax、tmax、AUC和t1/2。
由于胃泌素(如化合物B)在血液中是以可檢測水平而天然存在的，因此從給藥化合物B后獲得的血漿水平值中減去給藥前獲得的基值。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。
數(shù)據(jù)顯示與天然胃泌素相比，具有半胱氨酸(作為N末端的功能基團(tuán))的修飾的胃泌素，或在N末端偶合于PEG或HAS的修飾胃泌素化合物，具有顯著長的半衰期。與天然胃泌素17或胃泌素34相比，修飾的胃泌素化合物/偶合物以高濃度長期存在于血清中。這些數(shù)據(jù)還表明AUC也可促進(jìn)胃泌素分子的化學(xué)修飾?？梢灶A(yù)想，可最長時(shí)間地維持最大濃度的修飾的胃泌素衍生物/偶合物，對于糖尿病動(dòng)物的胰島細(xì)胞再生和葡萄糖水平的調(diào)節(jié)所要求的功效，具有最大的潛力。
實(shí)施例7.比較修飾的胃泌素化合物和未修飾的胃泌素抑制近期發(fā)作糖尿病的NOD小鼠的糖尿病進(jìn)展在該實(shí)施例中，在近期發(fā)作糖尿病的NOD小鼠中，檢查未修飾的胃泌素和修飾的胃泌素化合物/偶合物的治療效果，以確定與未修飾的胃泌素相比，多種修飾的胃泌素衍生物/偶合物是否更有效于抑制嚴(yán)重高血糖癥以及提高近期發(fā)作糖尿病的NOD小鼠的胰島素含量。以下所示用到的修飾的胃泌素化合物/偶合物(詳情參見表3)化合物B，其是被制備成具有17個(gè)氨基酸殘基同時(shí)在氨基酸位點(diǎn)15具有Leu的合成的人胃泌素I的胃泌素，和化合物E、化合物G、化合物J、化合物L(fēng)、化合物O、化合物Q。
對12-14周齡的非肥胖型糖尿病(NOD)的雌鼠，監(jiān)測其糖尿病發(fā)作的進(jìn)展(空腹血糖＞8.0至15mmol/l)，并且在出現(xiàn)癥狀的48小時(shí)內(nèi)，將不同組的小鼠各自進(jìn)行3或10μg/kg/天的胃泌素等價(jià)物的處理，通過每日腹腔注射進(jìn)行給藥處理。
治療是進(jìn)行給藥14天。每周監(jiān)測動(dòng)物的空腹血糖(FBG)水平。在停止進(jìn)食后約12小時(shí)和在最近的肽或賦形劑注射后24小時(shí)，測量FBG水平。一旦停止治療，就于下一個(gè)4周(2-6周)內(nèi)檢測所有小鼠的FBG水平，以確定終止治療處理后，是否對高血糖癥的預(yù)防得以持續(xù)。在第14天停止處理。
方法包括在第6周對這些小鼠重復(fù)取樣、采集用于分析FBG和血漿C肽的血液，并處死小鼠以測定胰島素和對胰島炎癥(胰島炎)記分。在最初處理時(shí)，小鼠既沒有接受胰島素替換療法也沒有接受免疫抑制。評估下列參數(shù)存活率、胰島素水平、胰島炎的存在和空腹血糖水平。
數(shù)據(jù)表明具有更長半衰期和AUC的修飾的胃泌素衍生物/偶合物，更有效于抑制糖尿病NOD小鼠的高血糖癥。在一些情況中，修飾的胃泌素化合物/偶合物將葡萄糖水平完全逆轉(zhuǎn)至正常水平，表明在該模型中刺激了顯著水平的胰島再生的。
實(shí)施例8.比較修飾的胃泌素化合物和未修飾的胃泌素連同GLP-1一起抑制近期發(fā)作糖尿病的NOD小鼠的糖尿病進(jìn)展在該實(shí)施例中，對近期發(fā)作糖尿病的NOD小鼠，檢測GLP-1與未修飾的胃泌素的組合以及GLP-1與修飾胃泌素化合物/偶合物的組合的治療效果，以確定GLP-1和胃泌素的給藥是否抑制嚴(yán)重的高血糖癥，以及是否提高近期發(fā)作糖尿病的小鼠中的胰島素含量。所用的GLP-1是作為人/小鼠GLP-1的生物活性片段的GLP-1(與來自由其加工該片段的前體相比，其具有位點(diǎn)7-36的殘基；獲得于BachemH6795)。以下是所用的修飾的胃泌素化合物/偶合物化合物B-化合物B-胃泌素，如具有17個(gè)氨基酸殘基同時(shí)在氨基酸位點(diǎn)15處具有Leu的合成人胃泌素I，和化合物E、化合物Q。
對12-14周齡的非肥胖型糖尿病(NOD)的雌鼠，監(jiān)測其糖尿病發(fā)作的進(jìn)展(空腹血糖＞8.0至15mmol/l)，并且在出現(xiàn)癥狀的48小時(shí)內(nèi)，將四組小鼠各自進(jìn)行如下處理一組僅用賦形劑進(jìn)行處理；其他組聯(lián)合GLP-1(100μg/kg/天)和胃泌素化合物(3μg/kg/天的胃泌素等價(jià)物)進(jìn)行處理，通過每日腹腔注射對各組進(jìn)行給藥處理。
治療是進(jìn)行給藥14天。每周監(jiān)測動(dòng)物的空腹血糖(FBG)水平。在停止進(jìn)食后約12小時(shí)和在最近的肽或賦形劑注射后24小時(shí)，測量FBG水平。一旦停止治療，就于下一個(gè)4周(2-6周)內(nèi)檢測所有小鼠的FBG水平，以確定終止治療處理后，是否高血糖癥的預(yù)防得以持續(xù)。在第14天停止處理。
方法包括在第6周對這些小鼠重復(fù)取樣、采集用于分析FBG和血漿C肽的血液，并處死小鼠以測定胰島素和對胰島炎癥(胰島炎)記分。最初處理時(shí)，小鼠既沒有接受胰島素替換療法也沒有接受免疫抑制。評估下列參數(shù)存活率、胰島素水平、胰島炎的存在和空腹血糖水平。
數(shù)據(jù)表明與結(jié)合了天然胃泌素(化合物B)的GLP-1相比，與具有更長半衰期的修飾的胃泌素化合物/偶合物(化合物E或Q)組合的GLP-1，可更有效地降低糖尿病動(dòng)物的血糖水平。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了具有更長壽命的修飾的胃泌素化合物/與GLP-1或其他生長因子的偶合物的用途。
序列表<110>WARATAH PHARMACEUTICALS，INC.
CRUZ，Antonio<120>胃泌素組合物和制劑及其使用和制備方法<130>82629-3<140>還未指定的<141>2003-11-21<150>US 60/428,100<151>2002-11-21<150>US 60/428,562<151>2002-11-22<150>US 60/530,590<151>2002-12-03<150>美國還未指定的<151>2003-11-14<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>34<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<220>
<221>混雜的特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝焦谷氨酸<220>
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<221>混雜的特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝焦谷氨酸<220>
<221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>酰胺化作用<400>4Xaa Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Leu Asp1 5 10 15Phe<210>5<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>5Tyr Gly Trp Met Asp Phe1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成肽<400>6Tyr Gly Trp Leu Asp Phe1 5<210>7
<211>4<212>PRT<213>人工的<220>
<223>普通胃泌素/CCK受體配體的羧基末端的氨基酸序列<220>
<221>MOD_RES<222>(4)..(4)<223>酰胺化作用<400>7Trp Met Asp Phe1<210>8<211>10<212>PRT<213>人工的<220>
<223>間隔臂<400>8Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala1 5 10
權(quán)利要求
1.包含胃泌素化合物的藥物組合物，所述胃泌素化合物與天然胃泌素相比，在給藥于患者后具有延長的活性。
2.包含Z-Ym-Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6的胃泌素化合物，其中AA1是Tyr或Phe，AA2是Gly、Ala或Ser，AA3是Trp、Val或Ile，AA4是Met或Leu，AA5是Asp或Glu，以及AA6是Phe或Tyr，AA6是酰胺化的；其中Z是聚合物，當(dāng)該聚合物是蛋白質(zhì)時(shí)，則Z是該蛋白質(zhì)的氨基酸序列；Ym是任選的間隔區(qū)，包括m個(gè)小分子中性氨基酸的氨基酸殘基，并且X選自于下列任意的連續(xù)部分SEQID NO1的1-28位殘基，SEQ ID NO2的1-28位殘基，SEQ ID NO3的1-11位殘基，和SEQ ID NO4的1-11位殘基，條件是胃泌素化合物結(jié)合胃泌素/CCK受體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其中AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6是Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其中AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6是Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其中Z是蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的胃泌素化合物，其中Z是人血清清蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其中Y是包含m個(gè)殘基的序列，所述殘基具有交替的甘氨酸和丙氨酸，或具有甘氨酸和丙氨酸的隨機(jī)序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其中X選自于以下序列SEQ ID NO3的1位至11位、SEQ ID NO4的1位至11位、SEQ IDNO3的2位至11位、SEQ ID NO4的2位至11位。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，當(dāng)m大于1時(shí)其進(jìn)一步地包含位于Y的氨基末端的半胱氨酸殘基，或當(dāng)m是0時(shí)其進(jìn)一步包含位于X的氨基末端的半胱氨酸殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其中m是0至約20殘基。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其中如果m是0，則Xn-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6進(jìn)一步包含用于鏈接Z的雙功能交聯(lián)劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物，其是以重組方式產(chǎn)生的。
13.編碼根據(jù)權(quán)利要求2的胃泌素化合物的核苷酸序列。
14.攜帶根據(jù)權(quán)利要求13的核苷酸序列的細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其是細(xì)菌或酵母細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)菌細(xì)胞，其選自于埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的酵母細(xì)胞，其選自于酵母屬、克魯維酵母菌屬、裂殖酵母屬和畢赤酵母。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的胃泌素化合物，其中胃泌素成分含有至少一個(gè)選自于下列的氨基酸SEQ ID NO1的29-34位、SEQ ID NO2的29-34位、SEQ ID NO3的12-17位、SEQ ID NO4的12-17位，并且該胃泌素進(jìn)一步與蛋白質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)或碳水化合物締合。
19.根據(jù)權(quán)利要求2或18的胃泌素化合物，其中該胃泌素成分至少含有SEQ ID NO2的29-34位或SEQ ID NO4的12-17位的氨基酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的胃泌素化合物，其中所述的聚合物是聚乙二醇(PEG)或葡聚糖。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的胃泌素化合物，其中所述的蛋白質(zhì)是血清清蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的胃泌素化合物，其中血清清蛋白是人血清清蛋白。
23.包含C-Ym-X結(jié)構(gòu)的胃泌素化合物，其中C是Cys或Lys，Ym是任選的包含m個(gè)中性小氨基酸的氨基酸殘基的間隔區(qū)，X是至少六個(gè)氨基酸的殘基，其包含選自于胃泌素-17(SEQ ID NO3和4)的至少12-17位，以及胃泌素-34(SEQ ID NO1和2)的至少29-34位的序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的胃泌素化合物，它進(jìn)一步與一種聚合物綴合。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的胃泌素化合物，它進(jìn)一步與聚乙二醇(PEG)或葡聚糖綴合。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的胃泌素化合物，它進(jìn)一步與一種蛋白質(zhì)綴合。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的胃泌素化合物，它進(jìn)一步包含雙功能交聯(lián)劑，其中交聯(lián)劑的第一個(gè)反應(yīng)末端與C共價(jià)結(jié)合。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的胃泌素化合物，其中交聯(lián)劑的第二個(gè)反應(yīng)末端與聚合物或蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。
29.根據(jù)權(quán)利要求23的胃泌素化合物，其中C-Ym-X是通過重組方式產(chǎn)生的或通過肽合成來合成的。
30.根據(jù)權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物，處于有效的劑量中。
31.根據(jù)權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物，它進(jìn)一步包含用于免疫抑制的制劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物，它進(jìn)一步包含生長因子。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的胃泌素，其中生長因子是胰高血糖素樣肽1受體配體。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的胃泌素化合物，其中生長因子是EGF受體配體。
35.根據(jù)權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物，它進(jìn)一步包含降血糖劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物，它進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
37.治療患有糖尿病的患者的方法，包括給藥權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中胃泌素化合物的給藥頻率低于天然胃泌素的給藥頻率。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括測量胰島新生的生理指示劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括測量空腹血糖(FBG)。
41.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括降低胰島素依賴性。
42.制備胃泌素化合物的方法，包括使胃泌素的氨基酸序列與載體組合物締合。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中在使胃泌素與載體締合前，對胃泌素進(jìn)行修飾使其包含半胱氨酸替換或附加的半胱氨酸殘基。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中半胱氨酸替換是替換焦谷氨酸。
45.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中胃泌素氨基酸序列包含至少選自于以下的位點(diǎn)氨基酸序列SEQ ID NO1的29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO2的29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO3的12-17位殘基；和氨基酸序列SEQ ID NO4的12-17位殘基。
46.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中半胱氨酸位于胃泌素的氨基末端。
47.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，進(jìn)一步包括在使胃泌素與載體締合之前，對胃泌素進(jìn)行修飾以使其進(jìn)一步包含雙功能交聯(lián)劑。
48.治療糖尿病患者的方法，包括對患者給藥能與清蛋白共價(jià)反應(yīng)的經(jīng)過修飾的胃泌素。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中經(jīng)過修飾的胃泌素包含能結(jié)合胃泌素/CCK受體的半胱氨酸或賴氨酸氨基末端的天然胃泌素序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中天然胃泌素序列選自于氨基酸序列SEQ ID NO1的29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO2的29-34位殘基；氨基酸序列SEQ ID NO3的12-17位殘基；和氨基酸序列SEQ ID NO4的12-17位殘基。
51.用于長時(shí)間地維持與具有胃泌素氨基酸序列的肽的血清水平相比時(shí)，增高的胃泌素血清水平的方法，該方法包括給藥權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物。
52.含有至少一種有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1、2和23中任一項(xiàng)的胃泌素化合物的試劑盒。
53.根據(jù)權(quán)利要求9的胃泌素化合物，它進(jìn)一步包含用于鏈接Z的雙功能交聯(lián)劑。
全文摘要
本發(fā)明提供的實(shí)施方案是包含胃泌素化合物的藥物組合物，所述胃泌素化合物與天然胃泌素相比，在給藥于患者后具有延長的活性。提供了使胃泌素的部分氨基酸序列與多種載體部分進(jìn)行偶合的方法，所述胃泌素具有結(jié)合胃泌素/CCK、受體的功能活性，該方法包括使用氨基酸間隔區(qū)和使用雙功能交聯(lián)劑。提供了使用組合物治療糖尿病患者的方法。
文檔編號C07K14/435GK1738644SQ200380108818
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月21日
發(fā)明者A·克魯茲 申請人:瓦拉塔藥品公司