專利名稱：卟啉衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卟啉衍生物或其藥用鹽和包括它們的用于光動力療法的藥物組合物。
背景技術(shù)：
光動力療法(PDT)是通過使用對癌細胞或各種腫瘤具有選擇性和光增強活性的光敏化劑藥物治療不能治愈疾病的一種治療技術(shù)，其不需外科手術(shù)且沒有化學(xué)療法中出現(xiàn)的并發(fā)癥。
光敏化劑藥物的作用機理在于例如，將藥物在靜脈內(nèi)給予患者并將最優(yōu)數(shù)量的光對其輻射以形成光敏化劑的激發(fā)態(tài)。藥物引起活化氧分子以轉(zhuǎn)變成激發(fā)的單線態(tài)氧，新的自由基或新的化學(xué)物質(zhì)選擇性攻擊和毀壞癌細胞或各種腫瘤。
代表性的光敏化劑是從蠶絲蠕蟲糞便或桑葉或綠藻提取和具有適當?shù)姆止夤舛扔嫓y量特性以用作光敏化劑的卟啉化合物。它們的最重要特性是由于其波長為700-900nm的紅外光引起電子躍遷，允許相對大的細胞滲透活性和因此三線態(tài)氧激發(fā)態(tài)的產(chǎn)生。
作為光敏化劑的卟啉衍生物不僅僅可以選擇性滲透或積累在腫瘤部位，而且還能發(fā)射熒光或磷光，因此可以用作早期診斷工具。
在先前技術(shù)中對幾種卟啉衍生物存在大量報導(dǎo)。例如，U.S.專利5,633,275；5,654,423；5,675,001；5,703,230；5,705,622和U.S.專利4,882,234公開了幾種光卟啉II化合物。據(jù)報導(dǎo)，其中一種在市場上銷售，另外一些現(xiàn)在在進行臨床試驗，然而，那些卟啉II是幾種由血卟啉(HpD)醚連接的低聚物組成的混合物。
PCT/WO97/29915(A)公開了BPDMA(維替泊芬)，它是一種已知對皮膚癌，牛皮癬和AMD表示特異效果的苯并卟啉衍生物。公開于PCT/WO97/48393、已知用于治療氣管和肺癌的MTHPC或公開于CA注冊的No.2121716和日本專利注冊的No.09071531、已知作為一種氯衍生物用于光動力療法的單水楊酰氯(Monoaspitylchlorine)已經(jīng)與相關(guān)幾個專利，即PCT/WO97/19081，PCT/WO 97/32885；EP 569113；U.S.Pat.Nos.5,587,394；5,648,485和5,693,632一起報導(dǎo)，所有的文獻在此引入作為參考。
然而，那些卟啉組化合物的大多數(shù)是內(nèi)消旋-四苯基卟啉衍生物，氯組，葉綠素組，荔枝螺毒素組(purpurin)，涅丁(nerdine)，狄氏(Diels-Elder)反應(yīng)加合物等和5-氨基戊酮酸，酞菁以及非卟啉組化合物的。
由于產(chǎn)生單線態(tài)氧分子的收率與細胞毒素活性直接相關(guān)，收率與細胞毒素活性成比例，在人體的光動力療法中，它與保留時間一起作為最重要的因素，現(xiàn)在仍然需要改進。然而，上述在臨床上使用卟啉化合物作為光敏化劑藥物據(jù)報導(dǎo)具有幾個缺點如在人體中保留的時間太長以致釋放不利的光毒性，現(xiàn)在仍然需要改進。
因此，本發(fā)明者致力于發(fā)現(xiàn)新穎的卟啉衍生物或它們的藥用鹽，這些衍生物或其藥用鹽是新改進的氯組，改進常規(guī)光敏化劑藥物的缺點即相對于常規(guī)卟啉衍生物的物理穩(wěn)定性，較高產(chǎn)量的再生產(chǎn)單線態(tài)氧自由基和較高的細胞毒素活性，最終完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供在光動力療法中用作光敏化劑的新的卟啉化合物及其藥用鹽。
本發(fā)明也提供包括上述卟啉化合物的藥物組合物，其作為活性成分以其有效劑量與藥用載體一起，治療或預(yù)防癌癥疾病。
本發(fā)明也提供上述卟啉化合物在制備用于治療或預(yù)防人類或哺乳動物中的各種癌癥的藥物中的用途。
本發(fā)明也提供治療或預(yù)防哺乳動物中癌癥的方法，其方法包括給予治療有效量的上述化合物或其藥用鹽。
因此，本發(fā)明的目的在于提供由如下通式(I)表示的新的化合物，及其藥用鹽
其中R1，R2分別是具有1-6個碳原子的直鏈或支化低級烷基或烷氧基、聚乙二醇基團或磺?；?；R3是氫原子、具有1-6個碳原子的烷氧基或聚乙二醇基團；R4是氫原子、羥基或具有1-6個碳原子的烷氧基，A與氧原子直接連接或橋接，能與包括Ni金屬離子的過渡金屬離子螯合。
優(yōu)選的實施方案包括通式(I)的化合物，其中R1，R2選自乙基、丙基、乙二醇基團、二甘醇基團、三甘醇基團、四甘醇基團、六甘醇基團、七甘醇基團或甲氧基乙二醇基團；R3選自氫原子、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、乙二醇基團、三甘醇基團、六亞乙基；R4是氫原子、羥基或甲氧基；和A直接連接，條件是R1和R2是相同的基團，而R2不同于R1或R3。
本發(fā)明的優(yōu)選的例示化合物包括由通式(II)-(VII)表示的如下化合物。
因此，本發(fā)明進一步的目的在于提供由如下通式(II)表示的新的化合物，及其藥用鹽
其中R1，R2分別是具有1-6個碳原子的直鏈或支化低級烷基或烷氧基、聚乙二醇基團或磺?；?，它能夠與包括Ni金屬離子的過渡金屬離子螯合。
因此，仍然本發(fā)明進一步的目的在于提供由如下通式(III)表示的新的化合物，及其藥用鹽 基中R1是聚乙二醇基團；R4是氫原子或羥基。
因此，仍然本發(fā)明進一步的目的在于提供由如下通式(IV)表示的新的化合物，及其藥用鹽
其中R2是溴丙基、或聚乙二醇基團；R4是氫原子或羥基。
因此，仍然本發(fā)明進一步的目的在于提供由如下通式(V)表示的新的化合物，及其藥用鹽 其中R1是甲基、乙基、或乙二醇基團。
仍然，本發(fā)明進一步的目的在于提供由如下通式(VI)表示的新的化合物，及其藥用鹽
其中R1，R2分別是聚乙二醇基團。
仍然，本發(fā)明進一步的目的在于提供由如下通式(VII)表示的新的化合物，及其藥用鹽 其中R1是聚乙二醇基團。
由通式(I)-(VII)表示的本發(fā)明化合物可以用本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法轉(zhuǎn)變成它們的藥用鹽。例如，由其藥用游離酸形成的酸加成鹽是有用的且可以由常規(guī)方法制備，例如，在過量酸溶液中溶解化合物之后，將鹽由水互混有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈沉淀以制備酸加成鹽，進一步可以將等量的化合物與水或醇如二醇單甲基醚稀釋的酸的混合物加熱和隨后由蒸發(fā)而干燥或在減壓下過濾以獲得干燥的鹽。
作為上述方法的游離酸，可以使用有機酸或無機酸。例如，在此可以使用有機酸如甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、乳酸、乙醇酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、葡萄糖醛酸、門冬氨酸、抗壞血酸、羰基酸、香草酸、氫碘酸等，和無機酸如鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、酒石酸等。
此外，可以通過使用堿制備本發(fā)明化合物的藥用金屬鹽形式。其堿金屬或堿土金屬鹽可以由常規(guī)方法制備，例如，在將化合物溶于過量堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物溶液之后，過濾不溶性鹽并將剩余的濾液進行蒸發(fā)和干燥獲得。作為本發(fā)明的金屬鹽，鈉、鉀或鈣鹽是制藥合適的，其相應(yīng)的銀鹽可以通過使堿金屬鹽或堿土金屬鹽與合適的銀鹽如硝酸銀反應(yīng)來制備。
如果沒有在此具體指出，由通式(I)-(VII)表示的化合物的藥用鹽可以包括能在化合物中存在的所有酸性鹽或堿性鹽。例如，本發(fā)明的藥用鹽包括羥基鹽如其鈉、鈣和鉀鹽；氨基鹽如氫溴酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、二氫磷酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、苦杏仁酸鹽、甲磺酸鹽(甲磺酸鹽)和對甲苯磺酸鹽(甲苯磺酸鹽)等，它們可以由本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法制備。
由于通式(I)-(VII)表示的化合物含有不對稱中心，可以采用光學(xué)不同的非對映體形式存在，因此，本發(fā)明的化合物包括所有的旋光異構(gòu)體，R或S立體異構(gòu)體及其混合物。本發(fā)明也包括外消旋混合物，多于一種旋光異構(gòu)體或其混合物的所有應(yīng)用以及本領(lǐng)域公知的非對映體所有制備或分離方法。
本發(fā)明的化合物可以由以下反應(yīng)方案中的方法化學(xué)合成，該方法僅是例示且決不限制本發(fā)明。反應(yīng)方案表示制備本發(fā)明代表性化合物的步驟，也可以遵循如下步驟通過適當改進試劑和初始材料來生產(chǎn)其它化合物，這些被本領(lǐng)域技術(shù)人員所正視。
通用合成過程例如，由通式(I)表示的卟啉化合物其藥用鹽可以由如下步驟制備脫鎂葉綠素α或10-羥基脫鎂葉綠素α由如下方式獲得將干燥的蠶蠕蟲糞便或綠藻采用水或有機溶劑如醇、丙酮或氯仿等萃取以獲得含卟啉的提取物；將提取物進行重復(fù)的柱色譜和薄層色譜以分離脫鎂葉綠素α(1)或10-羥基脫鎂葉綠素α；然后將分離的化合物與醇(R1OH)在酸或堿存在下在室溫或回流條件下反應(yīng)以獲得脫鎂葉綠甲酯酸α烷基酯(2)或10-羥基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯，它們用作由通式(II)-(VII)表示的化合物制備的開始材料。
方案1 如以上方案1所示，將脫鎂葉綠素α(1)與常規(guī)醇(R1OH)如3-溴-1-丙醇或PEG如乙二醇、三甘醇在酸，優(yōu)選硫酸存在下在氮氣下，在溶劑如甲苯、噁嗪、二氯甲烷中反應(yīng)1小時到3天，優(yōu)選24小時，采用適當?shù)南礈烊芤合礈欤缓髮⑹Ｓ嗟娜軇┯烧舭l(fā)器在真空中除去以獲得最終產(chǎn)物，脫鎂葉綠甲酯酸α酯(2)，并將其采用本領(lǐng)域公知的柱色譜或TLC進一步精制和分離。
方案1中所述的詳細過程在本文實施例1-3中解釋。
方案2
(3) (4)如以上方案2所示，將甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(3)與醇(R2OH)如3-溴-1-丙醇或PEG如乙二醇、三甘醇在酸，優(yōu)選硫酸或堿，優(yōu)選吡啶存在下，在氮氣下，在惰性溶劑如甲苯、噁嗪、二氯甲烷中反應(yīng)1小時到3天，優(yōu)選24小時，采用適當?shù)南礈烊芤合礈?，將剩余的溶劑由蒸發(fā)器在真空中除去以獲得最終產(chǎn)物脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(4)，將它采用本領(lǐng)域公知的柱色譜或TLC進一步精制和分離。
方案2中所述的詳細過程在本文實施例4-5中解釋。
方案3 如以上方案3所示，將甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(5)與噁嗪在堿，優(yōu)選吡啶存在下，在氮氣下，在惰性溶劑如甲苯、噁嗪、二氯甲烷中反應(yīng)1小時到3天，優(yōu)選24小時，采用適當?shù)南礈烊芤喝缌蛩徜@洗滌，然后將剩余的溶劑由蒸發(fā)器在真空中除去以獲得最終產(chǎn)物噁嗪類脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(6)，將其采用本領(lǐng)域公知的柱色譜或TLC進一步精制和分離。
方案3中所述的詳細過程在本文實施例6中解釋。
方案4
如以上方案4所示，將甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(7)與三甘醇在酸，優(yōu)選硫酸存在下，在氮氣下，在惰性溶劑如甲苯、噁嗪、二氯甲烷中反應(yīng)1小時到3天，優(yōu)選24小時，采用適當?shù)南礈烊芤喝缣妓釟溻c洗滌，將剩余的溶劑由蒸發(fā)器在真空中除去以獲得最終產(chǎn)物脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(8)，將其采用本領(lǐng)域公知的柱色譜或TLC進一步精制和分離。
方案4中所述的詳細過程在本文實施例7和8中解釋。
方案5 如以上方案5所示，將脫鎂葉綠素α(9)與常規(guī)醇(R1OH)如3-溴-1-丙醇或PEG如乙二醇、三甘醇在酸，優(yōu)選硫酸存在下在氮氣下在溶劑如甲苯、噁嗪、二氯甲烷中反應(yīng)1小時到3天，優(yōu)選24小時，采用適當?shù)南礈烊芤合礈旌蛯⑹Ｓ嗟娜軇┯烧舭l(fā)器在真空中除去。進一步將化合物采用氧化劑如KMnO4、NaIO4在堿性條件下在氮氣中，在質(zhì)子溶劑如水中進行氧化以獲得最終產(chǎn)物脫鎂葉綠甲酯酸α醇(10)，將其采用本領(lǐng)域公知的柱色譜或TLC進一步精制和分離。
方案5中所述的詳細過程在本文實施例9中解釋。
本發(fā)明也提供包括通式為(I)-(VII)的化合物或其藥用鹽作為活性成分用于預(yù)防或治療各種癌癥如人類或哺乳動物中的胃癌、肝癌、肺癌、子宮頸癌和乳腺癌的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的通式為(I)-(VII)的化合物可以被提供作為包含藥用載體，佐劑或稀釋劑的藥物組合物。例如，可以將本發(fā)明的化合物溶于油、丙二醇或常用的其它溶劑用于生產(chǎn)注射液。載體的合適例子包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、十四烷酸異丙酯等，但不限于它們。對于局部給藥，本發(fā)明的化合物中以采用軟膏和乳劑的形式配制。
本發(fā)明的化合物具有有效的抗癌活性，因此，本發(fā)明的藥物組合物可通過再產(chǎn)生單線態(tài)氧自由基和優(yōu)異細胞毒素活性來用于治療或預(yù)防各種癌癥。
本發(fā)明也提供選自通式為(I)-(VII)的化合物或其藥用鹽的化合物作為光動力療法中光敏化劑的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，也提供化合物(I)-(VII)在制造用于治療或預(yù)防各種癌癥如人類或哺乳動物中的胃癌、肝癌、肺癌、子宮頸癌和乳腺癌的藥物中的用途，。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，也提供治療或預(yù)防各種癌癥如人類或哺乳動物中胃癌、肝癌、肺癌、子宮頸癌和乳腺癌的方法，其包括給予治療有效量的通式為(I)-(VII)的化合物或其藥用鹽。
以下的配制方法和賦形劑僅是例示，決不限制本發(fā)明。
本發(fā)明的化合物在藥物劑型上可以采用它們藥用鹽的形式使用，也可以單獨使用或適當?shù)慕Y(jié)合使用，以及與其它藥用活性化合物結(jié)合使用。
通過在水溶劑如生理鹽水、5％葡萄糖，或非水溶劑如植物油、合成脂族酸甘油酯、高級脂族酸酯或丙二醇中溶解、懸浮或乳化，本發(fā)明的化合物可配制成注射用制劑。配制劑可包括常規(guī)添加劑如增溶劑，等滲劑，懸浮劑，乳化劑，穩(wěn)定劑和防腐劑。
本發(fā)明化合物的所需劑量依賴對象的條件和重量，嚴重度，藥物形式，給藥途徑和周期而變化，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。然而，為獲得所需的效果，本發(fā)明的化合物的一般推薦給藥量是0.0001-100mg/kg，優(yōu)選的為0.001-100mg/kg/天。每天的劑量可以一次或分幾次給與。在組成方面，化合物的量應(yīng)為組合物的總重量的0.0001-10％，優(yōu)選0.0001-1％。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過各種途徑給予到對象動物如哺乳動物(大鼠，小鼠，家庭動物或人類)。設(shè)想所有的給藥模式例如，給藥可以口服、經(jīng)直腸或由靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、鞘內(nèi)注射、硬膜外注射或腦室內(nèi)注射進行。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然可以對本發(fā)明的組合物，用途和制備進行各種改進和變化而不背離本發(fā)明的精神或范圍。
本發(fā)明將由如下實施例更具體地解釋。然而，應(yīng)當理解本發(fā)明不以任何方式限于這些實施例。


從如下詳細描述結(jié)合附圖更清楚地理解本發(fā)明的以上和其它目的，特征和其它優(yōu)點，其中圖1表示本光敏化物質(zhì)(DH-1-180-3)的UV光譜；圖2表示在508nm下氧單線態(tài)的測定結(jié)果(λ激發(fā))；圖3表示由MTT測定測量小鼠EMT6細胞系的細胞毒性結(jié)果，其中各自表示對照組(對照)，僅光輻射組(光)，溶劑處理組(DMF)，沒有光的光敏化劑樣品處理組(僅Ps(2))和由本光敏化物質(zhì)處理組(DH-1-180-3)；圖4表示為研究細胞凋亡機理以AnnexinV/PI染色的染色結(jié)果；圖5表示通過FACS分析測定不同PDT濃度在細胞中PDT攝取量；圖6表示通過FACS分析測定根據(jù)持續(xù)時間在細胞中PDT累積比例；圖7表示根據(jù)照射光的強度測定細胞毒性程度；
圖8表示由FACS分析在PDT處理和JC-1染料染色之后測定在EMT6細胞中MMP(線粒體膜電勢)；圖9表示由DH-1-180-3處理的EMT6細胞引起的BALB/c小鼠的腫瘤抑制；圖10表示由圖9的結(jié)果獲得的存活曲線。
實施本發(fā)明的最佳方式由如下實施例更具體地解釋本發(fā)明。然而，應(yīng)當理解本發(fā)明不以任何方式限于這些實施例。
實施例實施例1(13-二甘醇-氧羰基)-脫鎂葉綠甲酯酸α，甲基酯(2)的制備將含有脫鎂葉綠素α(60mg)的二氯甲烷(3ml)溶液傾入50ml燒瓶，用二甘醇(20ml)處理并攪拌。向其中加入1ml硫酸，攪拌3小時，然后向其中加入碳酸氫鈉水溶液。將溶液采用氯仿萃取，收集的氯仿層通過除去有機溶劑而濃縮。將剩余物由柱色譜精制以分離出39mg的(13-二甘醇-氧羰基)-脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(2)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.51(s，1H，meso-H)，9.37(s，1H，meso-H)，8.56(s，1H，meso-H)，7.99(dd，1H，J＝6.2，11.6Hz，CH2＝CH)，6.29(d，1H，J＝17.8Hz，CH2＝CH)，6.28(s.1H，CH)，6.18(d，1H，J＝11.6HzCH2＝CH)，4.48-4.41(m，1H，CH)，4.24-4.22(m.1H.CH)，4.19-4.04(m，2H，OCH2)，3.87(s，3H，OCH3)，3.71-3.66(m，2H，CH2)，3.68(s，3H，CH3)，3.64-3.42(m，6H，CH2OCH2CH2)，3.40(s，3H，CH3)，3.22(s，3H，CH3)，2.68-2.15(m，4H，CH2CH2)，1.82(d，3H，J＝7.3Hz，CH3)，1.69(t，3H，J＝7.6Hz，CH3)，0.56(br.S.，1H，N-H)，-1.61(br.s.，1H，N-H).
實施例2(13-甲氧基三甘醇-氧羰基)脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(3)的制備將29mg(13-甲氧基三甘醇-氧羰基)脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(3)由以上實施例1中所述的相同過程制備，區(qū)別在于使用脫鎂葉綠素(60mg)和甲氧基三甘醇(30ml)
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.45(s，1H，meso-H)，9.30(s，1H，meso-H)，8.55(s，1H，meso-H)，7.93(dd，1H，J＝6.2，11.5Hz，CH2＝CH)，6.26(s.1H，CH)，6.25(d，1H，J＝17.8Hz CH＝CH2)，6.14(d，1H，J＝11.3HzCH＝CH2)，4.49-4.44(m，1H，CH)，4.22-4.20(m.1H.CH)，4.15-4.02(m，2H，OCH2)，3.88(s，3H，OCH3)，3.67(s，3H，CH3)，3.60(q，2H，CH3-CH2)，3.51-3.45(m，8H，CH2OCH2CH2OCH2)，3.41-3.37(m，2H，CH2)，3.38(s，3H，CH3)，3.25(s，3H，OCH3)，3.16(s，3H，CH3)，2.65-2.18(m，4H，CH2CH2)，1.82(d，3H，J＝7.2Hz，CH3)，1.68-1.64(m，，3H，CH3)，0.51(br.s.，1H，N-H)，-1.61(br.s.，1H，N-H).
實施例313-羥基-(13-甲氧基三甘醇氧羰基)脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(4)的制備使用與實施例1相同的步驟制備22mg的13-羥基-(13-甲氧基三甘醇氧羰基)脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(4)，不同的是使用10-羥基脫鎂葉綠素α(60mg)和甲氧基三甘醇(20ml)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.62(s，1H，meso-H)，9.49(s，1H，meso-H)，8.65(s，1H，meso-H)，8.03(dd，1H，J＝6.3，11.4Hz，CH2＝CH)，6.31(d，1H，J＝17.8Hz，CH＝CH2)，6.20(d，1H，J＝11.6Hz，CH＝CH2)，5.78(s，1H，OH)，4.52-4.47(m，1H，CH)，4.30-4.14(m，3H，CH and OCH2)，3.74(s，3H，OCH3)，3.74-3.70(m，2H，CH2)，3.63-3.57(m，8H，CH2OCH2CH2OCH2)，3.60(s，3H，CH3)，3.47-3.46(m，2H，CH2)，3.43(s，3H，CH3)，3.29(s，3H，CH3)，3.27(s，3H，OCH3)，3.02-2.95，2.64-2.57and2.35-2.21(m，4H，CH2CH2)，1.71(t，3H，J＝7.5Hz，CH3)，1.60(d，3H，J＝7.1Hz，CH3)，0.30(br.s.，1H，N-H)，-1.83(br.s.，1H，N-H).
實施例4[13-(3-溴-1-丙氧基羰基)]-脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(5)的制備將含有甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(4)(20mg)的吡啶(4ml)和甲苯(8ml)的溶液傾入50ml燒瓶，采用3-溴-1-丙醇(0.003ml)攪拌處理，加熱5小時。然后將溶液采用氯化銨水溶液洗滌并用二氯甲烷萃取。將收集的二氯甲烷層通過除去有機溶劑而濃縮，剩余物由柱色譜精制，分離11mg的[13-(3-溴-1-丙氧基羰基)]-脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(5)
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.52(s，1H，meso-H)，9.38(s，1H，meso-H)，8.56(s，1H，meso-H)，7.99(dd，1H，J＝6.2，11.7Hz，CH2＝CH)，6.28(d，1H，J＝19.3Hz，CH＝CH2)，6.26(d，1H，CH)，J＝11.6Hz，CH＝CH2)，6.18(d，1H，J＝11.6Hz，CH＝CH2)，4.52-4.45(m，3H，CH and OCH2)，4.24-4.22(m，1H，CH)，3.68(s，3H，CH3)，3.67(m，2H，CH2)，3.56(s，3H，OCH3)，3.47-3.34(m，2H，CH2)，3.40(s，3H，CH3)，3.23(s，3H，CH3)，2.68-2.17(m，6H，CH2CH2and CH2)，1.83(d，3H，J＝7.3Hz，CH3)，1.69(t，3H，J＝7.6Hz，CH2-CH3)，0.54(br.s.，1H，N-H)，-1.62(br.s.，1H，N-H).
實施例5(13-三甘醇氧羰基)脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(6)的制備采用實施例4中的相似方法，將含有甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(4)(100mg)的吡啶(16ml)和甲苯(15ml)中的溶液傾入50ml燒瓶，采用三甘醇(0.033m)在氮氣下處理并加熱16小時。然后將溶液采用氯化銨水溶液洗滌并用二氯甲烷萃取。將收集的二氯甲烷層通過除去有機溶劑濃縮，剩余物由柱色譜精制，分離73mg的(13-三甘醇氧羰基)脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(6)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.53(s，1H，meso-H)，9.40(s，1H，meso-H)，8.57(s，1H，meso-H)，8.00(dd，1H，J＝6.3，11.5Hz，CH2＝CH)，6.30(d，1H，J＝18.1Hz，CH＝CH2)，6.27(s，1H，CH)，6.19(d，1H，J＝6.3，12.8Hz，CH＝CH2)，4.49-4.45(m，3H，CH and OCH2)，4.26-4.24(m，1H，CH)，3.72-3.66(m，4H，CH2and OCH2)，3.69(s，3H，CH3)，3.55(s，3H，OCH3)，3.49-3.39(m，4H，CH2OCH2)，3.41(s，3H，CH3)，3.31(t，2H，J＝4.6Hz，CH2)，3.26-3.23(m，5H，CH2and CH3)，2.66-2.21(m，5H，CH2CH2and OH)，1.82(d，3H，J＝7.3Hz，CH3)，1.70(t，3H，J＝7.6Hz，CH3)，0.54(br.s.，1H，N-H)，-1.62(br.s.，1H，N-H).
實施例6[13-羥基-(13-三甘醇氧羰基)]脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(7)的制備將含有甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(4)(50mg)的吡啶(8ml)和噁嗪(23ml)溶液溶于10ml甲苯，加熱5小時。然后將溶液采用氯化銨水溶液洗滌并用二氯甲烷萃取。將收集的二氯甲烷層通過除去有機溶劑濃縮，剩余物由柱色譜精制，分離21mg的[13-羥基-(13-三甘醇氧羰基)]-脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(7)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.76(s，1H，meso-H)，9.54(s，1H，meso-H)，8.71(s，1H，meso-H)，8.01(dd，1H，J＝6.2，11.6Hz，CH2＝CH)，6.34(d，1H，J＝17.9Hz，CH＝CH2)，6.18(d，1H，J＝11.6Hz，CH＝CH2)，6.09(s，1H，OH)，4.47-4.42(m，1H，CH)，4.07-4.05(m，1H，CH)，3.90(s，3H，OCH3)，3.77(s，3H，CH3)，3.74(q，2H，CH3-CH2)，3.54(s，3H，OCH3)，3.44(s，3H，CH3)，3.26(s，3H，CH3)，2.61-1.78(m，4H，CH2CH2)，1.71(t，3H，J＝7.6Hz，CH2-CH3)，1.60(d，3H，J＝7.1Hz，CH3)，-1.09(br.s.，1H，N-H)，-1.41(br.s.，1H，N-H).
實施例7脫鎂葉綠甲酯酸α三甘醇甲基酯(8)的制備將含有甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(30mg)的溶液溶于20ml三甘醇，攪拌并加入1ml硫酸。然后將溶液用碳酸氫鈉水溶液洗滌并用乙酸乙酯萃取。將收集的乙酸乙酯層通過除去有機溶劑而濃縮，將剩余物由柱色譜精制，分離32mg的脫鎂葉綠甲酯酸α三甘醇甲基酯(8)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.53(s，1H，meso-H)，9.40(s，1H，meso-H)，8.57(s，1H，meso-H)，8.00(dd，1H，J＝6.4，11.5Hz，CH2＝CH)，6.30(d，1H，J＝17.9Hz，CH＝CH2)，6.29(d，1H，CH)，6.19(d，1H，J＝12.5Hz，CH＝CH2)，4.49-4.44(m，3H，CH and OCH2)，4.26-4.24(m，1H，CH)，4.15-4.07(m，2H，OCH2)，3.74-3.65(m，4H，CH2and OCH2)，3.69(s，3H，OCH3)，3.58-3.43(m，14H，OCH2)，3.41(s，3H，CH3)，3.35(t，2H，J＝4.5Hz，CH2)，3.30-3.28(m，2H，CH2)，3.24(s，3H，CH3)，2.66-2.02(m，6H，CH2CH2and OH)，1.82(d，3H，J＝7.3Hz，CH3)，1.70(t，3H，J＝7.6Hz，CH3)，0.55(br.s.，1H，N-H)，-1.62(br.s.，1H，N-H).
實施例8甲基脫鎂葉綠甲酯酸α二甘醇酯(9)的制備將含有脫鎂葉綠素α(60mg)的溶液溶于少量二氯甲烷。將20ml二甘醇和1L硫酸加入到其中并攪拌23小時。然后將溶液采用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌并用氯仿萃取。將收集的氯仿層通過除去有機溶劑而濃縮，剩余物由柱色譜精制，分離2mg甲基脫鎂葉綠甲酯酸α二甘醇酯(9)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.26(s，1H，meso-H)，8.34(s，1H，meso-H)，7.92(dd，1H，J＝6.0，11.8Hz，CH2＝CH)，6.33(s，1H，OH)，6.25(d，1H，J＝17.8Hz，CH＝CH2)，6.17(d，1H，J＝11.6Hz，CH＝CH2)，4.88(br.s，2H.OH)，4.76-4.60(m，4H，CH2CH2)，4.41-4.33(m，3H，CH and CH2)，4.27-4.23(m，2H，CH and OCH2)，3.96-3.94(m，2H，CH2)，3.88-3.80(m，6H，CH2)，3.75(s，3H，OCH3)，3.75-3.69(m，2H，CH2)，3.58(s，3H，CH3)，3.31(s，3H，CH3)，3.18(s，3H，CH3)，2.75-2.00(m，4H，CH2CH2)，2.03(d，3H，J＝7.0Hz，CH3)，1.64(t，3H，J＝7.3Hz，CH3)，0.87(br.s.，1H，N-H)，-1.85(br.s.，1H，N-H).
實施例9甲基脫鎂葉綠甲酯酸α三甘醇酯(10)的制備將溶于16ml吡啶的甲基脫鎂葉綠甲酯酸α甲基酯(100mg)溶液加入到15ml甲苯中。將0.033ml三甘醇加入到其中，在氮氣下加熱16小時。然后將溶液采用二氯甲烷萃取。將收集的二氯甲烷層通過除去有機溶劑而濃縮，剩余物由柱色譜精制，分離73mg以下命名為DH-1-180-3的甲基脫鎂葉綠甲酯酸α三甘醇酯(10)UV光譜參見圖11H-NMR(500MHz，CDCl3)δ9.53(s，1H，meso-H)，9.40(s，1H，meso-H)，8.57(s，1H，meso-H)，8.00(dd，1H，J＝6.3，11.5Hz，CH2＝CH)，6.30(d，1H，J＝18.1Hz，CH＝CH2)，6.27(s，1H.CH)，6.19(d，1H，J＝12.8Hz，CH＝CH2)，4.49-4.45(m，3H，CH and OCH2)，4.26-4.24(m，1H，CH)，3.72-3.66(m，4H，CH2and CH2)，3.69(s，3H，OCH3)，3.55(s，3H，OCH3)，3.49-3.39(m，4H，CH2OCH2)，3.41(s，3H，CH3)，3.31(t，2H，，J＝4.6Hz，CH2)，3.26-3.23(m，5H，CH2and CH3)，2.66-2.21(m，5H，CH2CH2andOH)，1.82(d，3H，J＝7.3Hz，CH3)，1.70(t，3H，J＝7.6Hz，CH3)，0.54(br.s.，1H，N-H)，-1.62(br.s.，1H，N-H).
試驗例1本發(fā)明化合物到氧單線態(tài)的轉(zhuǎn)變活性的測定目標化合物到氧單線態(tài)的轉(zhuǎn)變活性由如下方法測量。
方法在空氣飽和條件(99.999％超純氣體)下使用甲苯(MerckCo.HPLC級)作為溶劑，溶液氧濃度為2.1×10-3M時在21℃下進行試驗測定。
結(jié)果在508nm下(λ激發(fā))氧單線態(tài)的測定結(jié)果，如圖2所示，轉(zhuǎn)變的光子產(chǎn)額是0.60(5％)。因此，確認DH-1-180-3到氧單線態(tài)的轉(zhuǎn)變活性優(yōu)異，其物理穩(wěn)定性也良好。
試驗例2本發(fā)明化合物抗癌活性的測定目標化合物的抗癌活性由如下試驗測定。
體內(nèi)測定作為本發(fā)明試驗樣品的DH-1-180-3和作為對照組的光卟啉(photogem)用于試驗。
乳腺癌細胞系(EMT6；1×106個細胞/小鼠)移植到BALB/c小鼠(每組12只)，7到10天之后，將用1％吐溫80稀釋的試驗樣品和用注射水稀釋的對照藥物分別在試驗樣品組0.4和0.8mg/kg/小鼠和在對照組2mg/kg/小鼠的劑量下給予每只小鼠。
三個小時之后，將小鼠麻醉，在1.2J的強度下由鹵素燈對其進行照射。由測徑器在2或3天的間隔下測定每個小鼠的腫瘤尺寸，也測定小鼠根據(jù)腫瘤的存活率。
體外測定將乳腺癌細胞系(EMT6；1×106個細胞/小鼠)在培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS+100單位青霉素+100μg鏈霉素)中培養(yǎng)，采用0.25％胰蛋白酶-EDTA處理以收集細胞，由Trypan藍色染色劑染色計數(shù)細胞的數(shù)目。
將每3ml細胞以2×105個細胞/ml的濃度加入到35mm的培養(yǎng)皿，在有5％CO2的培養(yǎng)箱中孵化24小時使得細胞排列成單層。
將溶于DMF的各種濃度的DH-1-180-3加入到35mm的培養(yǎng)皿中，調(diào)節(jié)DMF溶劑的濃度不超過0.5％以排除DMF的影響。將光敏化物質(zhì)加入到其中和在1.2J的強度下由鹵素燈對其進行照射。將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中孵化。
由PDT引起的細胞毒性由MTT測定分析，細胞的形態(tài)由顯微鏡觀察。
常規(guī)光敏化劑，即photogem用作對比對照組，在本試驗中調(diào)整幾種因素如樣品的濃度，光的照射強度和樣品的吸收時間等。
結(jié)果圖3表示由MTT測定的在小鼠EMT6細胞系上的細胞毒性結(jié)果。
如在圖3中看出的那樣，僅光照射組(光)、僅由DMF處理組(DMF)及由光敏化劑樣品處理而沒有光的組(僅PS(2))不顯示細胞毒性，光敏化劑處理組，特別是由0.2μg本發(fā)明的光敏化劑處理的組顯示顯著的細胞毒性，試驗組的100％致死發(fā)生在0.4μg光敏化劑處理組，它是最有效的濃度。
圖4表示為了研究細胞凋亡的作用機理采用Annexin V/PI染色的染色結(jié)果。
如可以在圖4看出的那樣，在對照組中大于90％的細胞存活，而在PDT處理組(0.2μg/小時)中大于50到60％的細胞死亡，這些EMT6細胞死于細胞凋亡。
圖5表示通過FACS分析測定不同PDT濃度在細胞中PDT攝取量。
如可以在圖5中看出的那樣，在細胞中PDT的攝取量以劑量依賴性的方式隨PDT的濃度而增加且與細胞毒性密切相關(guān)。確認了最強的細胞毒性在MFI(平均熒光強度)的數(shù)值是208.92，DH-I-180-3的濃度是至少0.4μg處顯現(xiàn)。
圖6表示通過FACS分析測定根據(jù)持續(xù)時間在細胞中PDT累積比例。
如圖6中可以看出的那樣，在細胞中PDT的累積比例隨持續(xù)時間而增加且與細胞毒性密切相關(guān)。確認了最強的細胞毒性在MFI(平均熒光強度)的數(shù)值達到208.92，持續(xù)時間是至少60分鐘處顯現(xiàn)。
圖7表示根據(jù)照射光的強度測定細胞毒性程度。
如可以在圖7中看出的那樣，照射光的強度達到1.2J時呈現(xiàn)最強的細胞毒性，但超過強度效果不增加。
圖8表示在PDT和JC-1染料染色之后，由FACS分析測定在EMT6細胞中MMP(線粒體膜電勢)。
如可以在圖8中看出的那樣，MMP隨PDT顯著降低，這與采用熒光顯微鏡的觀察結(jié)果一致。
圖9表示由DH-1-180-3處理的EMT6細胞引起的BALB/c小鼠的腫瘤抑制。
如可以在圖9中看出的那樣，與對照組和光卟啉(photogem)處理組相比，在PDT處理組中腫瘤的生長比例隨處理時間而顯著降低。
圖10表示由圖9的結(jié)果得出的存活曲線。
如可以在圖10中看出的那樣，與對照組相比PDT處理組中的存活比率增大。
根據(jù)上述試驗結(jié)果，處理本發(fā)明的DH-1-180-3的最優(yōu)條件是用于PDT的光敏化劑濃度是0.4μg/ml，最優(yōu)吸收時間是1小時，照射強度是1.2J和測定它活性的分析時間是24小時。然而，光卟啉(photogem)在50-100μg/ml的濃度下在24小時內(nèi)不是有效的，其滿足相同效果的照射光強度大于DH-1-180-3的10到100倍。
試驗3毒性試驗方法使用化合物1和10在ICR小鼠(平均體重25±5g)和Sprague-Dawley大鼠(235±10g)上進行急性毒性試驗。將由3只小鼠或大鼠組成的每組分別用試驗化合物20mg/kg，10mg/kg和1mg/kg或溶劑(0.2ml，腹膜內(nèi))腹腔給藥，觀察24小時。
結(jié)果總體的方面在任何組或任一性別中都沒有與治療相關(guān)的死亡，臨床體征，體重變化的出現(xiàn)。這些結(jié)果提示本發(fā)明中制備的化合物是有效的和安全的。
下面描述配制方法和賦形劑的種類，但本發(fā)明不限于它們。代表性制備實施例描述如下。
粉末制劑化合物10 500mg玉米淀粉 100mg乳糖 100mg滑石 10mg通過混合以上組分和填充密封的包裝制備粉末制劑。
片劑制劑化合物10100mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg通過混合以上組分和壓片制備片劑制劑。
膠囊制劑化合物1 50mg乳糖50mg硬脂酸鎂1mg通過混合以上組分和由常規(guī)明膠制備方法填充明膠膠囊制備片劑制劑。
注射制劑化合物1 100mg注射用蒸餾水最優(yōu)數(shù)量PH控制劑最優(yōu)數(shù)量通過溶解活性組分，控制pH到約7.5和然后在2ml樣品中填充所有組分并由常規(guī)注射制劑方法消毒而制備注射制劑。
這樣描述了本發(fā)明，顯然可以采用許多方式變化本發(fā)明。不能認為這樣的變化背離本發(fā)明的精神和范圍，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯然所有這樣改進都包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明的化合物可用于各種癌癥疾病的預(yù)防或治療并具有優(yōu)于常規(guī)光敏化劑的優(yōu)點，如生產(chǎn)單線態(tài)氧的優(yōu)異光子產(chǎn)額，良好的物理穩(wěn)定性和有效的細胞毒性。
權(quán)利要求
1.由如下通式(I)表示的化合物，及其藥用鹽 其中R1，R2分別是具有1-6個碳原子的直鏈或支化低級烷基或烷氧基、聚乙二醇基團或磺?；?；R3是氫原子、具有1-6個碳原子的烷氧基或聚乙二醇基團；R4是氫原子、羥基或具有1-6個碳原子的烷氧基，A與氧原子直接連接或橋接，能與包括Ni金屬離子的過渡金屬離子螯合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1，R2選自乙基、丙基、乙二醇基團、二甘醇基團、三甘醇基團、四甘醇基團、六甘醇基團、七甘醇基團或甲氧基乙二醇基團；R3選自氫原子、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、乙二醇基團、三甘醇基團、六亞乙基；R4是氫原子、羥基或甲氧基；A是直接連接，條件是R1和R2是相同的基團而R2不同于R1或R3。
3.由如下通式(II)表示的化合物，及其藥用鹽 其中R1，R2分別是具有1-6個碳原子的直鏈或支化低級烷基或烷氧基、聚乙二醇基團或磺?；?，能與包括Ni金屬離子的過渡金屬離子螯合；其中X是氧原子；A是-CH2-；R1是氫原子或氨基乙基；R2是氫或鹵素原子或具有1-6個碳原子的烷基。
4.由如下通式(III)表示的化合物，及其藥用鹽 基中R1是聚乙二醇基團；R4是氫原子或羥基。
5.由如下通式(IV)表示的化合物，及其藥用鹽 其中R2是溴丙基、或聚乙二醇基團；R4是氫原子或羥基。
6.由如下通式(V)表示的化合物，及其藥用鹽 其中R1是甲基、乙基、或乙二醇基團。
7.由如下通式(VI)表示的化合物，及其藥用鹽 其中R1，R2分別是聚乙二醇基團。
8.由如下通式(VII)表示的化合物，及其藥用鹽 其中R1是聚乙二醇基團。
9.一種藥物組合物，其包括作為活性成分的由權(quán)利要求1-8所述的通式為(I)-(VII)的化合物或其藥用鹽及藥用載體，通過再產(chǎn)生單線態(tài)氧自由基和優(yōu)異細胞毒素活性來治療或預(yù)防各種癌癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述的癌癥包括人類或哺乳動物中的胃癌、肝癌、肺癌、子宮頸癌和乳腺癌。
11.一種光動力診斷和治療劑，其包括作為活性成分的由權(quán)利要求1-8所述的通式(I)-(VII)的化合物或其藥用鹽及藥用載體，通過再生產(chǎn)單線態(tài)氧自由基和優(yōu)異細胞毒素活性治療或預(yù)防各種癌癥。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的通式為(I)-(VII)的化合物或其藥用鹽，在光動力療法中作為光敏化劑的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的通式為(I)-(VII)的化合物在制備用于治療或預(yù)防各種癌癥如人類或哺乳動物中的胃癌、肝癌、肺癌、子宮頸癌和乳腺癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過再生產(chǎn)單線態(tài)氧自由基用作抗癌或光動力診斷劑的新的光卟啉化合物及其藥用鹽，本發(fā)明的化合物具有很大的優(yōu)點，如相對常規(guī)光敏化劑而言，有優(yōu)異的光子產(chǎn)額以產(chǎn)生單線態(tài)氧，良好的物理穩(wěn)定性和有效的細胞毒性。本發(fā)明也提供藥物組合物，該組合物包括作為活性成分用于預(yù)防或治療各種癌癥如人類或哺乳動物中的胃癌、肝癌、肺癌、子宮頸癌和乳腺癌的通式為(I)－(VII)的新的光卟啉化合物或其藥用鹽以及其藥用載體。
文檔編號C07D487/00GK1738823SQ200380108782
公開日2006年2月22日 申請日期2003年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月16日
發(fā)明者禹南臺, 姜旼錫, 李元營, 李昌凞, 金容祿, 李大云, 元東勳, 高時奐 申請人:科技城股份有限公司