四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針在檢測(cè)鋅離子方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針?lè)肿油ㄟ^(guò)熒光特性高選擇性地識(shí)別檢測(cè)鋅離子，并且進(jìn)一步可以用于細(xì)胞中鋅離子濃度變化的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]鋅是人體必需微量元素之一，也是生物體中繼鐵之后第二富集的過(guò)渡金屬。大量的鋅離子都集中在神經(jīng)組織中，如在腦組織中的濃度是0.1-0.5mM。鋅離子具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，鋅離子能夠能夠從突觸囊中釋放出來(lái)通過(guò)電位調(diào)控型離子通道進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)金屬蛋白(鋅指蛋白)來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象或阻斷DNA的合成從而影響基因表達(dá)。生物體中大部分的鋅離子都與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，其在金屬蛋白中作為一種輔助因子調(diào)控蛋白質(zhì)或酶的活性。在某些細(xì)胞中存在著“游離鋅池”，游離鋅的濃度在各種哺乳細(xì)胞內(nèi)低至納摩爾級(jí)。鋅是人體內(nèi)200多種酶和蛋白質(zhì)的重要組成成分，也是許多酶的催化劑，廣泛參與生命活動(dòng)的各個(gè)方面。其中最重要的含鋅的酶和蛋白質(zhì)有DNA聚合酶、RNA聚合酶、蛋白轉(zhuǎn)錄因子、堿性磷酸酶、味覺(jué)蛋白、消化酶等。鋅是這些重要生命大分子的活性結(jié)構(gòu)成分。DNA聚合酶是DNA復(fù)制的關(guān)鍵物質(zhì)之一，缺乏鋅元素時(shí)DNA聚合酶數(shù)量減少，活性降低，導(dǎo)致DNA復(fù)制速度減慢，結(jié)果使細(xì)胞的分裂速度降低甚至停滯。鋅缺乏還使RNA聚合酶的數(shù)量和質(zhì)量降低，直接影響基因的表達(dá)，從而使上述含鋅蛋白質(zhì)和酶的合成受到阻礙。所以說(shuō)鋅直接參與核酸蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分化和增殖以及許多代謝，人體內(nèi)還有一些酶需要鋅的激活，而發(fā)揮其活性作用。迄今為止，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到鋅在生命過(guò)程中起著許多不同的作用。鋅能提高人體的免疫功能，并達(dá)到抗衰老的作用；微量鋅可強(qiáng)化記憶力，延緩腦的衰老；鋅可以加速創(chuàng)傷愈合；鋅能保護(hù)心肌免遭損害；鋅與利尿劑合用能加強(qiáng)降壓作用，有利于控制高血壓、冠心病的發(fā)生。對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育中的嬰兒、兒童和青少年具有更重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
[0003]對(duì)金屬離子的分析測(cè)定已經(jīng)存在很多方法，比如原子吸收光譜法，電化學(xué)、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、催化動(dòng)力學(xué)方法等，但是這些方法不能夠?qū)ι矬w內(nèi)離子進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，且這些方法測(cè)定時(shí)樣品的預(yù)處理比較復(fù)雜，使得其應(yīng)用受到了一定的限制。由于熒光探針?lè)ň哂徐`敏度高、選擇性好、反應(yīng)時(shí)間快、能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)區(qū)域離子測(cè)試而受到普遍的重視。理想的鋅離子熒光分子探針應(yīng)具有化學(xué)、光穩(wěn)定性高，激發(fā)波長(zhǎng)在可見(jiàn)光區(qū)(> 400nm)、對(duì)鋅離子熒光有選擇性和敏感性、快速響應(yīng)、水溶性、對(duì)細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)。
[0004]卟啉是生物體內(nèi)的一種具有大共軛環(huán)狀結(jié)構(gòu)的金屬有機(jī)化合物。卟啉及其衍生化合物廣泛存在于生物體內(nèi)和量轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要細(xì)胞器內(nèi)。卟啉在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，如血紅素是含鐵卟啉的化合物，葉綠素是含鎂的卟啉化合物，維生素B12是含鈷的卟啉化合物。早期的卟啉是從含有卟啉化合物的天然產(chǎn)物中通過(guò)提取、分離、純化等方法得到的，如血紅素、葉綠素等。目前有兩種途徑得到目標(biāo)卟啉分子:天然卟啉的結(jié)構(gòu)修飾和卟啉化合物的全合成。天然卟啉的結(jié)構(gòu)修飾雖然能很方便地進(jìn)行結(jié)構(gòu)的改造，但是受到結(jié)構(gòu)本身的限制，同時(shí)外環(huán)官能基團(tuán)的選擇上也十分有限，此外，也限制了卟啉化合物的本身生理活性。因此，通常人們需要通過(guò)全合成的辦法，來(lái)獲得具有特定生理活性和功能的卟啉分子。通過(guò)合成設(shè)計(jì)，獲取不同種類(lèi)和功能的卟啉化合物推進(jìn)了卟啉化學(xué)的發(fā)展，擴(kuò)寬了其應(yīng)用前景。卟啉化合物在高分子材料、化學(xué)催化、電致發(fā)光材料等不同領(lǐng)域的各個(gè)方面得到很大應(yīng)用。本發(fā)明充分利用卟啉與金屬離子的配合作用，結(jié)合鋅離子檢測(cè)對(duì)熒光探針的要求，對(duì)卟啉衍生物分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改良，使其具有良好的水溶性、熒光穩(wěn)定性，從而成功用于鋅離子檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是:
為改進(jìn)現(xiàn)有鋅離子檢測(cè)方法的不足，提供一種四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針?lè)肿油ㄟ^(guò)熒光特性高選擇性地應(yīng)用于檢測(cè)鋅離子，對(duì)鋅離子進(jìn)行快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)；解決了現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法對(duì)生物體內(nèi)離子進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)、測(cè)定樣品的預(yù)處理比較復(fù)雜等不足。
[0006]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
提供一種四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為熒光探針在檢測(cè)鋅離子方面的應(yīng)用，其中，四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為檢測(cè)鋅離子的熒光探針激發(fā)光的有效光波長(zhǎng)為405、430、515、550、580nm。上述激發(fā)光的作用下，可以得到發(fā)射光譜峰在640nm的近紅外光，該發(fā)射光譜峰不隨激發(fā)光的改變而改變。
[0007]此外，四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為檢測(cè)鋅離子的熒光探針對(duì)鋅離子的最低檢測(cè)限為0.8μΜ，且可以通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡測(cè)得的熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞中的鋅離子濃度變化進(jìn)行檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物作為檢測(cè)鋅離子的熒光探針與鋅離子的結(jié)合絡(luò)合能力高，絡(luò)合后熒光明顯增強(qiáng)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性，生物相容性和細(xì)胞滲透性好，可以通過(guò)細(xì)胞熒光共聚焦成像對(duì)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的濃度變化進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的方法應(yīng)用簡(jiǎn)便易行、快速，直觀，毒性低、靈敏度高、方法簡(jiǎn)單，為金屬離子的檢測(cè)提供了高效可行的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物的分子結(jié)構(gòu)示意圖。
[0010]圖2為四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物本身的激發(fā)光譜(圖2Α)和發(fā)射光譜(圖2Β)。圖2Α橫坐標(biāo)是激發(fā)波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是激發(fā)光譜的熒光強(qiáng)度，從激發(fā)光譜中看到激發(fā)峰有五個(gè)分別在405，430，515，550，580nm。圖2B橫坐標(biāo)是發(fā)射波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是發(fā)射光譜的熒光強(qiáng)度，曲線(xiàn)a，b，c，d，e分別是使用405，430，515，550，580nm激發(fā)光激發(fā)所得到的對(duì)應(yīng)發(fā)射光譜。
[0011 ]圖3是本發(fā)明的四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物熒光探針?lè)肿优c各種金屬離子作用后的熒光光譜圖(激發(fā)波長(zhǎng)515nm)，曲線(xiàn)a是卟啉衍生物分子本身的熒光光譜，曲線(xiàn)b是加入鋅離子后的熒光光譜，鈉、鉀、鈣金屬離子加入后熒光光譜沒(méi)有任何變化與曲線(xiàn)a幾乎重合，曲線(xiàn)c是加入鎂離子后的熒光光譜，曲線(xiàn)d，e是分別加入銅、鐵離子后的光譜。光譜結(jié)果明顯表明，只有鋅離子明顯增強(qiáng)卟啉衍生物熒光表現(xiàn)出良好的選擇性識(shí)別。干擾金屬離子鈉、鉀、鈣、鎂、銅和鐵對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響。
[0012]圖4是本發(fā)明的四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉衍生物熒光探針?lè)肿拥臒晒鈴?qiáng)度和鋅離子濃度的關(guān)系。橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(納米)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。箭頭表示鋅離子的濃度變化從低到高依次為 0、0.8,2.5,7.5、15、40、80、93、123、135μΜ。
[0013]圖5是本發(fā)明的卟啉衍生物熒光探針?lè)肿訉?duì)細(xì)胞的毒性。橫坐標(biāo)是加入的卟啉的濃度，縱坐標(biāo)是細(xì)胞存活率。
[0014]圖6是本發(fā)明的卟啉衍生物熒光探針?lè)肿佑糜诩?xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)。圖6a是明場(chǎng)下的Hela細(xì)胞；圖6b是在加入熒光探針?lè)肿雍弯\離子后的細(xì)胞內(nèi)熒光成像圖，細(xì)胞呈現(xiàn)出很強(qiáng)的紅色熒光。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面將結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0016]實(shí)施例1:四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉熒光探針?lè)肿颖旧淼臒晒馓匦?br> 首先，考察卟啉衍生物熒光探針?biāo)?對(duì)-磺酸基-苯基卟啉本身的熒光特性。將固體四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉化合物溶于超純水或者磷酸緩沖溶液(pH 7.2，0.02mM)配制成濃度為1.0mM的母液。取一定量的母液用相應(yīng)的溶劑如超純水或者磷酸緩沖溶液稀釋到實(shí)驗(yàn)所用的濃度6.25μΜο稀釋后的四-對(duì)-磺酸基-苯基卟啉化合物溶液加到干凈的4mL石英比色皿中，使用島津型號(hào)為RF-5301 PC的熒光儀進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A激發(fā)光譜圖所示，激發(fā)光波長(zhǎng)具有五個(gè)激發(fā)峰，分別在405，430，515，550，580nm處。用得到的五個(gè)激發(fā)峰波長(zhǎng)分別去激發(fā)得到如圖2B所示發(fā)射光譜圖，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)分別為405，430，515，550，580nm，探測(cè)樣品發(fā)射出的熒光波長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)，五個(gè)激發(fā)光所得到的發(fā)射光波