專利名稱：含有外源性內(nèi)表位的病毒顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽在病毒粒子上的表達，尤其是肽在病毒衣殼內(nèi)的表達。
盡管取得了這些成功，但是就世界范圍來說，每年還有超過500萬的嬰兒死于可用現(xiàn)有疫苗預(yù)防的疾病。然而，許多現(xiàn)有疫苗必須冷藏保存，這就使得它們在發(fā)展中國家的分發(fā)較為困難。而且，還有針對具有顯著發(fā)病率或死亡率疾病的疫苗尚未發(fā)明或是不能得到的情況。舉例而言，每年有超過2.5億人慢性感染乙肝病毒，瘧疾導致100-200萬人喪生；估計腹瀉疾病(例如，由rotovirus、sp.志賀氏桿菌、霍亂弧菌和毒素產(chǎn)生型大腸桿菌引起的感染) 每年奪去超過估計的400-500萬人的生命。
疾病控制中心已經(jīng)識別了幾個用于獲得全部可能的疫苗的因素。(www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/00056803.htm)。這些建議包括尋找疫苗釋放和使用的新方法。一種方法是開發(fā)刺激兩種免疫反應(yīng)B細胞介導的體液免疫反應(yīng)和輔助T細胞介導的細胞免疫反應(yīng)的疫苗。
但是，嘗試產(chǎn)生同時刺激體液和細胞免疫反應(yīng)或優(yōu)先誘導細胞免疫反應(yīng)疫苗的努力遇到了困難。例如，合成肽疫苗和重組蛋白質(zhì)疫苗通常免疫源性差，易于誘導體液免疫反應(yīng)，不能誘導細胞免疫反應(yīng)。DNA疫苗可以同時誘導體液和細胞免疫反應(yīng)。但是，問題是長期的抗原表達將導致何種后果。
因此，本領(lǐng)域需要改善疫苗的釋放機制。特別是，釋放機制應(yīng)該有助于誘導細胞和體液免疫反應(yīng)。
在其它實施方案中，外源肽編碼一個能被動物免疫系統(tǒng)識別的表位。在一些優(yōu)選實施方案中，外源表位是細胞毒性的T型淋巴細胞表位。在特別優(yōu)選實施方案中，外源表位包括具有來自自然產(chǎn)生表位源的側(cè)面氨基酸的細胞毒性的T型淋巴細胞表位。在一些實施方案中，外源肽是T型輔助細胞的表位。在一些優(yōu)選實施方案中，外源表位包括具有來自自然產(chǎn)生表位源的側(cè)面氨基酸序列的T型輔助細胞的表位。在其它更多實施方案中，外源表位是B細胞表位。在更多的實施方案中，外源肽包括具有來自自然產(chǎn)生的表位源的側(cè)面氨基酸序列的T型輔助細胞的表位。
在一些實施方案中，嵌合病毒粒子包含表達在病毒外殼的外表面的第二個外源肽。在優(yōu)選實施方案中，第二個外源肽表達在病毒外殼的外表面，其中所述肽是插入豇豆花葉病毒的VP-S的βC’-βC”環(huán)。在其它優(yōu)選實施方案中，第二個外源肽表達于病毒外殼的外表面，其中所述肽是插入豇豆花葉病毒的VP-S的βC-βC環(huán)中。在其它優(yōu)選實施方案中，第二個外源肽表達于病毒衣殼的外表面，其中所述肽插入豇豆花葉病毒的VP-L的βE-βA環(huán)中。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，其特征在于它包含有效量的病毒粒子，該病毒粒子包含外殼，該外殼具有內(nèi)外表面，所述的衣殼包含至少一種外源肽，其中所述的外源肽是在所述衣殼的所述內(nèi)表面上。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了一種配方，它包含一種病毒粒子作為活性成分，該病毒粒子含有外殼，該外殼具有內(nèi)表面和外表面，所述外殼包含至少一種外源肽，其中所述的外源肽是在所述衣殼的所述內(nèi)表面上，和一種佐藥。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種化合物，該化合物包含一種病毒外殼蛋白，其中所述病毒外殼蛋白包括外源肽，可以設(shè)計所述病毒外殼蛋白，以便裝配進入具有內(nèi)表面和外表面的病毒衣殼中，其中所述的外源肽是在所述病毒蛋白衣殼的所述內(nèi)表面表達的。
在更多的實施方案中，本發(fā)明提供了制備病毒粒子的方法，該方法包括提供宿主細胞和編碼病毒粒子的核酸，所述病毒粒子包括i)病毒外殼蛋白，所述的病毒外殼蛋白具有內(nèi)表面和外表面，和ii)外源肽，其中所述外源肽是插入到所述病毒外殼蛋白的所述內(nèi)表面；用所述核酸轉(zhuǎn)染所述宿主細胞，以便產(chǎn)生病毒粒子。
在另外一些實施方案中，本發(fā)明提供一種在需要該治療的動物中誘導免疫反應(yīng)的方法，所述的方法包括給動物使用一種包括一種具有內(nèi)表面和外表面衣殼的病毒微粒，所述的衣殼包含至少一種外源肽，其中所述的外源肽位于所述衣殼的所述內(nèi)表面。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過所述的生產(chǎn)方法可以獲得的產(chǎn)品，該生產(chǎn)方法包括提供宿主細胞和編碼病毒粒子的核酸，所述病毒粒子包括i)病毒衣殼蛋白，所述的病毒衣殼蛋白具有內(nèi)表面和外表面，和ii)外源肽，其中所述外源肽是插入到所述病毒外殼蛋白的所述內(nèi)表面；用所述核酸轉(zhuǎn)染所述宿主細胞，以便產(chǎn)生病毒粒子。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種含有病毒粒子的商業(yè)包裝，該病毒粒子含有具備內(nèi)表面和外表面的外殼，所述外殼含有至少一個外源肽，其中所述外源肽位于所述外殼的所述內(nèi)表面作為活性成分，及其使用說明書。在其它實施方案中，本發(fā)明化合物包括表達這里描述的任何實施例中的內(nèi)表位的嵌合病毒粒子。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼病毒粒子核酸的載體，該病毒粒子包括i)具有內(nèi)表面和外表面的病毒外殼蛋白，和ii)外源肽，其中所述的外源肽是插入到病毒外殼蛋白的內(nèi)表面。本發(fā)明不限定載體的特定類型。實際上，多種載體都可考慮，包括，但不限于RNA載體(例如，編碼(+)鏈RNA病毒的核酸)或DNA載體(例如，編碼(+)鏈RNA病毒的質(zhì)粒DNA)。同樣地，本發(fā)明不限定于任何特定病毒粒子。實際上，多種病毒粒子都可考慮，包括，但不限于，桿狀病毒粒子和二十面體病毒粒子。本發(fā)明不限于任何特定植物(+)鏈RNA病毒。實際上，多種植物(+)鏈RNA病毒都可在本發(fā)明中使用。在一些優(yōu)選實施方案中，植物(+)鏈RNA病毒是豇豆花葉病毒組。在特別優(yōu)選的實施方案中，植物(+)鏈RNA病毒是豇豆花葉病毒。
在一些實施方案中，外殼蛋白是來自(+)鏈RNA病毒。本發(fā)明不限定外殼蛋白來自何種特定的(+)鏈RNA病毒。實際上，來自多種(+)鏈RNA病毒的外殼蛋白都可考慮。在一些優(yōu)選實施方案中，外殼蛋白來自一種植物(+)鏈RNA病毒。本發(fā)明不限定外源肽插入任何特定位點。實際上，可以考慮在多種位點插入。在一些實施方案中，病毒外殼蛋白具有氨基端，外源肽插入從氨基端算起的第5到第20個氨基酸的位置，以便所述的病毒外殼蛋白的裝配可以進行。在一些優(yōu)選實施方案中，病毒外殼蛋白是豇豆花葉病毒的VP-S，并且外源肽是插入VP-S的第11位點酪氨酸殘基和基因工程改造的VP-S的第12位點的重復(fù)酪氨酸殘基。在其它優(yōu)選實施方案中，病毒外殼蛋白是豇豆花葉病毒的VP-S，外源肽插入VP-S的包括位于第10位點的纈氨酸殘基和第11位點的酪氨酸殘基的二肽和VP-S的包括基因工程改造的第12位點的纈氨酸殘基和由基因工程改造的第13位點的酪氨酸殘基的重復(fù)二肽之間。
本發(fā)明不限定外源肽的任何特定類型。實際上，多種外源肽可以在本發(fā)明的載體上表達。在一些實施方案中，外源肽是疏水的。在其它實施方案中，外源肽是細胞毒性的T淋巴細胞表位。在更多的實施方案中，外源肽是輔助T細胞表位。在其它實施方案中，外源肽是B細胞表位。
本發(fā)明不限定載體只編碼一種外源肽。實際上，本發(fā)明考慮一種以上的外源肽能夠從載體上表達。在一些實施方案中，病毒外殼蛋白進一步包含第二個外源肽。在優(yōu)選實施方案中，第二個外源肽是插入到所述病毒外殼蛋白的外表面。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，病毒外殼蛋白是具有一個βC’-βC”環(huán)的VP-S，第二個外源肽插入所述的βC’-βC”環(huán)。在其它優(yōu)選的實施方案中，病毒外殼蛋白是具有βE-βA環(huán)的VP-L，第二個外源肽插入所述的βE-βA環(huán)。
本發(fā)明的載體也包括其它成分，例如調(diào)控元件。在一些實施方案中，核酸進一步編碼可可操作連于編碼病毒粒子核酸的啟動子。本發(fā)明不限定任何特定的啟動子。實際上，多種啟動子都可考慮，包括，但是不限于組織特異性植物啟動子和組成型植物啟動子。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了幾種方法，包括提供了i)上述的載體，和ii)宿主細胞；和b)在轉(zhuǎn)染細胞表達病毒粒子的條件下，用載體轉(zhuǎn)染宿主細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)染宿主細胞。本發(fā)明不限定轉(zhuǎn)染任何特定的宿主細胞。實際上，轉(zhuǎn)染多種宿主細胞都可考慮，包括，但不限于，宿主細胞可選自植物體的細胞群、植物組織培養(yǎng)細胞、植物原生質(zhì)體、植物組織中的細胞。更在進一步的實施方案中，本發(fā)明包括用這些方法產(chǎn)生的宿主細胞。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了幾種方法，包括提供了用上面描述的載體轉(zhuǎn)染的植物以及在產(chǎn)生病毒粒子的條件下培植植物。在一些優(yōu)選實施方案中，所述的方法進一步包括從植物中純化病毒粒子的步驟。
在更多的實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼含有外源肽的病毒外殼蛋白其中的核酸的組合物，該病毒外殼蛋白被設(shè)計以便裝配進入具有內(nèi)表面和外表面的病毒外殼，其中外源肽在病毒粒子的內(nèi)表面表達。本發(fā)明不限定于任何特定類型的核酸。實際上，多種核酸都可考慮，包括，但不限于RNA，(例如，編碼(+)鏈RNA病毒的核酸)或DNA(例如，編碼(+)鏈RNA病毒的質(zhì)粒DNA)。同樣地，本發(fā)明不限定于任何特定病毒粒子。實際上，多種病毒粒子都可考慮，包括，但不限于，桿狀病毒粒子和二十面體病毒粒子。本發(fā)明不限于任何特定植物(+)鏈病毒。實際上，多種植物(+)鏈RNA病毒都可用于本發(fā)明。在一些優(yōu)選實施方案中，植物(+)鏈RNA病毒是豇豆花葉病毒組。在特別優(yōu)選的實施方案中，植物(+)鏈RNA病毒是豇豆花葉病毒。
在一些實施方案中，外殼蛋白是來自(+)鏈RNA病毒。本發(fā)明不限定外殼蛋白來自任何一種特定的(+)鏈RNA病毒。實際上，來自多種(+)鏈RNA病毒的外殼蛋白都可考慮。在一些優(yōu)選實施方案中，外殼蛋白來自一種植物(+)鏈RNA病毒。本發(fā)明不限定外源肽插入任何特定位點。實際上，在多種位點插入得以考慮。在一些實施方案中，病毒外殼蛋白具有氨基端，外源肽插入從氨基端算起的第5到第20個氨基酸的位置，以便所述的病毒外殼蛋白的裝配可以進行。在一些優(yōu)選實施方案中，病毒外殼蛋白是豇豆花葉病毒的VP-S，并且外源肽是插入VP-S的第11位點酪氨酸殘基和基因工程改造的VP-S的第12位點的重復(fù)酪氨酸殘基之間。在其它優(yōu)選實施方案中，病毒外殼蛋白是豇豆花葉病毒的VP-S，外源肽插入VP-S的包括位于第10位點的纈氨酸殘基和第11位點的酪氨酸殘基的二肽和VP-S的包括基因工程改造的第12位點的纈氨酸殘基和由基因工程改造的第13位點的酪氨酸殘基的重復(fù)二肽之間。
本發(fā)明不限定外源肽為任何特定類型。實際上，多種外源肽可以在本發(fā)明的載體上表達。在一些實施方案中，外源肽是疏水的。在其它實施方案中，外源肽是細胞毒性的T淋巴細胞表位。在更多的實施方案中，外源肽是輔助T細胞表位。在其它實施方案中，外源肽是B細胞表位。
本發(fā)明不限于只編碼一種外源肽的核酸。實際上，本發(fā)明認為核酸可以編碼一個以上的外源肽。在一些實施方案中，病毒外殼蛋白進一步包括第二個外源肽。在優(yōu)選實施方案中，第二個外源肽插入病毒外殼蛋白的外表面。在一些特別優(yōu)選實施方案中，病毒外殼蛋白是具有βC’-βC”環(huán)的VP-S，第二個外源肽插入所述的βC’-βC”環(huán)。在其它實施方案中，病毒外殼蛋白是具有βE-βA環(huán)的VP-L，第二個外源肽插入到所述的βE-βA環(huán)中。
本發(fā)明的核酸也包括其它成分，例如調(diào)控元件。在一些實施方案中，核酸進一步編碼可可操作連于編碼病毒粒子核酸的啟動子。本發(fā)明不限定任何特定的啟動子。實際上，多種啟動子都可考慮，包括，但是不限于組織特異性植物啟動子和組成型植物啟動子。
在本發(fā)明的更多實施方案中，本發(fā)明提供了包含具有內(nèi)表面和外表面外殼的病毒粒子，該衣殼包含至少一個外源肽，其中外源肽是在外殼的內(nèi)表面上。本發(fā)明不限于任何特定的病毒粒子。實際上，如上所述，本發(fā)明囊括多種病毒粒子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了表達病毒粒子的植物。在更多的實施方案中，本發(fā)明提供了從該植物分離的果實、葉子、塊莖、莖或純化的病毒粒子。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了誘導免疫反應(yīng)的方法，該方法包括提供i)病毒粒子(如上描述)，該病毒粒子包含多個具有內(nèi)表面和外表面的外殼蛋白，該外殼蛋白包含外源肽，其中外源肽是在外殼蛋白的內(nèi)表面上；和ii)被試者；b)在被試者針對外源肽產(chǎn)生免疫反應(yīng)的條件下，將被試者暴露給病毒粒子。在一些優(yōu)選實施方案中，病毒粒子是由植物源提供的。
在本發(fā)明的更多實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼具有插入的外源肽序列的病毒外殼蛋白序列的核酸的載體，該病毒外殼蛋白包括第二個點突變，從而使得病毒外殼蛋白能夠裝配進病毒外殼。本發(fā)明不限定任何特定的第二位點突變。實際上，多個第二位點點突變都可考慮，包括，但是不限于，第二位點點突變在豇豆花葉病毒的VP-S和VP-L上。在特別優(yōu)選實施方案中，第二個點突變選自VP-S中的F91S、VP-S中的F180L、VP-S中的M177V、VP-S中的I124V、VP-L中的R2102K、VP-L中的I2045M、VP-S中的M177T、VP-L中的A2092T、VP-S中的G80D。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在病毒外殼蛋白中誘導第二個點突變的方法，該方法包括提供i)包含編碼病毒粒子的核酸的載體，該病毒粒子包括病毒外殼蛋白，該病毒外殼蛋白具有內(nèi)表面和外表面，和ii)外源肽，其中外源肽是插入到病毒外殼蛋白的內(nèi)表面和ii)第一宿主植物；用載體感染第一宿主植物，以便表達病毒粒子；監(jiān)控第一宿主植物，直到在直接感染的葉片上出現(xiàn)晚期病變；接種第二宿主植物，以便獲得繼發(fā)性感染。在一些實施方案中，該方法進一步包括監(jiān)控第二宿主植物直到全身癥狀出現(xiàn)的步驟。在一些優(yōu)選實施方案中，全身癥狀的出現(xiàn)時間與用對照病毒粒子感染植物出現(xiàn)全身癥狀的時間框架一致。在其他實施方案中，該方法進一步包括權(quán)利要求84所述方法的步驟，進一步包括從全身病變中分離病毒粒子的步驟，該病毒粒子包括一個基因組；和對病毒粒子的基因組測序。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用本方法產(chǎn)生的病毒粒子。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包括含有外殼的病毒粒子的疫苗組合物，該外殼具有內(nèi)表面和外表面，包括至少一種外源肽，其中外源肽是在衣殼的內(nèi)表面上。在更多的實施方案中，本發(fā)明提供了誘導體液免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給動物使用本疫苗組合物。
在其他實施方案中，本發(fā)明提供了增強針對B細胞表位的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括提供了i)修飾的病毒粒子，它包括一個B細胞表位和一個免疫原復(fù)合物中的內(nèi)在細胞毒性T細胞(CTL)表位；和ii)一種動物；將修飾病毒粒子施用于動物。本發(fā)明不限定于任何特定的CTL表位。實際上，多種CTL表位都可考慮，包括，但不限于，乙肝病毒表面抗原“a“類決定簇的2F10肽模擬位(mimotope)。
本發(fā)明還提供了增強針對B細胞表位的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括提供了i)修飾的病毒粒子，其包括一個B細胞表位和一個抗原復(fù)合物中的內(nèi)在CTL表位；和一種動物；b)將修飾病毒粒子施用于動物。本發(fā)明不限定于特定CTL表位。實際上，多種CTL表位都可考慮，包括，但不限于，乙肝病毒表面抗原“a”類決定簇的2F10肽模擬表位(mimotope)。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了增強針對B細胞表位的免疫反應(yīng)的方法，包括提供了i)修飾的病毒粒子，包括一個B細胞表位和一個免疫原復(fù)合物中的內(nèi)在輔助T細胞表位；和ii)一種動物；以及將修飾病毒粒子施用于動物。本發(fā)明不限定于任何特定的T細胞表位。實際上，多種T細胞表位都可考慮，包括，但不限于破傷風類毒素的通用T細胞表位。
在另一些實施方案中，本發(fā)明提供了增強針對B細胞表位的免疫反應(yīng)的方法，包括提供了i)修飾的病毒粒子，包括一個B細胞表位和一個抗原復(fù)合物中的內(nèi)在輔助T細胞表位；和ii)一種動物；以及將修飾病毒粒子施用于動物。本發(fā)明不限定于任何特定的T細胞表位。實際上，多種T細胞表位都可考慮，包括，但不限于破傷風類毒素的通用T細胞表位。
圖2表示根據(jù)本發(fā)明一個實施方案(參考實施例6)用嵌合病毒粒子預(yù)防接種小鼠的CTL分析結(jié)果；使用BetaMax工作站測量含有來自LCMV靶肽的靶細胞或空載細胞的鉻的釋放量。
圖3表示使用于公開的大量遺傳構(gòu)建中的載體pCP26的限制性酶切圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及肽在病毒粒子上的表達，尤其是肽在病毒外殼或內(nèi)表面上的表達。嵌合病毒粒子(CVP)作為疫苗使用代表一項改善疫苗儲藏和釋放的富有吸引力的戰(zhàn)略。CVP的使用在美國專利5,874,087和5,958,422中有報道(將它們每個引述于此作為參考)。這些專利描述了研發(fā)編碼在其外殼蛋白中包含肽插入物的修飾的豇豆花葉病毒(CPMV)基因組的載體。這些載體用于產(chǎn)生病毒粒子，肽呈現(xiàn)在病毒粒子的表面。
在定義之后，描述病毒粒子表達系統(tǒng)，肽插入物和插入位點，以及修飾病毒粒子的用途。
定義為便于理解本發(fā)明，幾個術(shù)語定義如下。
在此所用，術(shù)語“病毒粒子”是指病毒的全部或部分裝配的衣殼。病毒衣殼可以含有或者可以不含有核酸。
在此所用，術(shù)語“病毒衣殼”是指在野生型病毒中，包裹病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼。病毒衣殼具有內(nèi)表面和外表面。病毒衣殼的內(nèi)表面是指通常暴露于病毒核酸的表面。病毒衣殼的外表面是指通常暴露于環(huán)境中的表面。
在此所用，術(shù)語“病毒外殼蛋白”是指與其它蛋白作用裝配構(gòu)成病毒衣殼部分的蛋白質(zhì)。病毒外殼蛋白的實例包括，但是不限于，豇豆花葉病毒的VP-S和VP-L外殼蛋白質(zhì)。病毒外殼蛋白的內(nèi)側(cè)面是指暴露于病毒衣殼內(nèi)表面的外殼蛋白質(zhì)部分。病毒外殼蛋白的外側(cè)面是指暴露于病毒衣殼的外表面的外殼蛋白質(zhì)部分。
在此所用，術(shù)語“(+)鏈RNA病毒”是指含有RNA基因組的病毒，其中當導入合適的宿主時，分離的RNA具有直接感染力。已知(+)鏈RNA病毒能感染多種動物、真菌和植物宿主。(+)鏈RNA病毒的實例包括，但不限于，小RNA病毒(例如polioviruses)，和來自于以下家族的病毒椰菜花葉病毒屬、雀麥花葉病毒病毒屬、豇豆花葉病毒屬、雙粒病毒屬、弧腸孤病毒屬、分病毒屬、sequivididae、煙草花葉病毒屬和番茄叢矮病毒屬。
當在植物病毒感染時使用時，術(shù)語“癥狀”是指在植物體上病毒感染指征的出現(xiàn)。這些指征包括局部病變和全身癥狀。局部病變例如壞死斑，褪綠斑和環(huán)斑發(fā)生在感染部位或其附近。全身癥狀出現(xiàn)在整個植物體，包括鑲嵌型，斑點型，矮化病，黃化和壞死。
在此所用，術(shù)語“全身感染”是指從起始部位擴散的病毒感染。對植物而言，當病毒從感染細胞移動進入植物的微管結(jié)構(gòu)(例如，韌皮部)時，就會發(fā)生全身癥狀。對許多病毒而言，該移動是受一種調(diào)節(jié)原生質(zhì)網(wǎng)(plasmadesmata)的移動蛋白調(diào)節(jié)的。
當在病毒衣殼或病毒粒子中使用時，術(shù)語“二十面體的”是指表現(xiàn)普通二十面對稱的衣殼通過12個頂點的每一頂點的5層折疊旋轉(zhuǎn)對稱，關(guān)于通過20個三角每一表面中心軸的3層折疊旋轉(zhuǎn)對稱，關(guān)于通過30個邊的每一中軸的3層折疊旋轉(zhuǎn)對稱。二十面體包括60個相同的建筑單位(可以包括一個以上的亞單位)或若干60個相同的建筑單位。整個衣殼中的單位間接觸不是完全相同的；但是，所有單位間結(jié)合涉及接觸同一總類型，所以單位間結(jié)合可以看作準相同。預(yù)期一些二十面體病毒，特別是大二十面體病毒(例如，腺病毒)可能與從較小二十面體病毒觀察所得的結(jié)構(gòu)和幾何標準不同。二十面體病毒的實例包括，但不限于，小RNA病毒，腺病毒和來自以下家族的病毒椰菜花葉病毒屬、雀麥花葉病毒病毒屬、豇豆花葉病毒屬、雙粒病毒屬、弧腸孤病毒屬、分病毒屬、sequivididae和番茄叢矮病毒屬。
在此所用，術(shù)語“表位”是指抗原決定簇，它是具有誘導產(chǎn)生特異抗體和與特異抗體(即，能夠結(jié)合到特定免疫球蛋白或T細胞受體上)結(jié)合能力或潛能的大分子的任意一個區(qū)域。
當使用于肽或表位時，術(shù)語“疏水的”是指含有20％或更多疏水性氨基酸殘基的肽或表位(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸)。
在此所用，術(shù)語“細胞毒性T淋巴細胞表位”是指能被細胞毒性T淋巴細胞識別的表位。
在此所用，術(shù)語“輔助T細胞表位”是指能被輔助T細胞識別的表位。
在此所用，術(shù)語“B細胞表位”是指能被B細胞識別的表位。
在此所用，術(shù)語“免疫反應(yīng)”是指由免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的動物對抗原或免疫源的反應(yīng)，其特征是可以產(chǎn)生抗體和/或刺激細胞介導或免疫耐受性。
在此所用，術(shù)語“抗原復(fù)合物”是指包含至少一種能與免疫球蛋白或細胞表面受體結(jié)合的表位的復(fù)合物。
在此所用，術(shù)語“免疫復(fù)合物”是指包含至少一種能夠誘導體液和/或細胞介導免疫反應(yīng)的表位的復(fù)合物。
在此所用，術(shù)語“模擬位(mimotope)”是指結(jié)構(gòu)上與表位確實相似的用于誘導針對該表位的免疫反應(yīng)的肽，即使兩者的序列在氨基酸水平上沒有同源性或相似性(在肽模擬位情況下)，或，其中在模擬位代表一個為非蛋白質(zhì)分子，例如碳水化合物，接受的結(jié)構(gòu)構(gòu)型時，模擬位具有與介導該非蛋白質(zhì)表位的免疫分子反應(yīng)的能力。
在此所用，術(shù)語“免疫球蛋白”是指漿細胞的分泌產(chǎn)物(例如，激活的B細胞)，它包括兩條重鏈和兩條輕鏈復(fù)合在一起形成一個蛋白質(zhì)結(jié)合的位點。
在此所用，術(shù)語“I類MHC-主要組織相容性基團I類蛋白”是指由主要組織相容性基因編碼的蛋白質(zhì)，它的含義是CD8+T淋巴細胞的抗原有效提呈。
在此所用，術(shù)語“II類MHC-主要組織相容性基團II類蛋白”是指由主要組織相容性基因編碼的蛋白質(zhì)，它的含義是CD4+T淋巴細胞的抗原有效提呈。
在此所用，術(shù)語“植物”是指多種植物細胞，該細胞很大程度上分化成存在于植物發(fā)育的任何階段的結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)包括，但不限于，果實、芽、莖、葉、花瓣等。術(shù)語“植物組織”包括植物的分化和未分化組織，包括，但不限于，根、芽、葉、花粉、種子、瘤組織和培植的多種細胞(例如，單細胞、原生質(zhì)體、胚芽、愈合組織等)。植物組織可以存在于植物中，存在于器官培養(yǎng)，組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)中。
在此所用，術(shù)語“原生質(zhì)體”是指去掉細胞壁的分離的植物細胞。一般而言，原生質(zhì)體根據(jù)傳統(tǒng)方法產(chǎn)生(例如，參見，美國專利4,743,548；4,677,066；5,149,645；和5,508,184；所有這些引述于此作為參考)。植物組織可以分散在適當?shù)慕橘|(zhì)中，該介質(zhì)具有合適的滲透壓(例如，3-8重量％的糖多元醇)和一種或幾種多糖水解酶(例如，果膠酶、纖維素酶等)，允許細胞壁降解進行足夠時間以便提供原生質(zhì)體。過濾后，原生質(zhì)體可以用離心方法分離，然后重新懸浮用于隨后處理或用途。持續(xù)培植的原生質(zhì)體再生成完整植物體是用本技術(shù)領(lǐng)域所知的方法進行的(例如，參見，Evans等人，植物細胞培養(yǎng)手冊，1124-176頁，Macmillan出版公司，紐約 ；結(jié)合，植物原生質(zhì)體，21-37頁，CRC出版社，Boca Raton 和Potrykus和Shillito，酶學方法，118卷，植物分子生物學，A.和H.Weissbach編輯，學術(shù)出版社(Academic Press)，Orlando )。
在此所用，術(shù)語“基因”是指含有對照和產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)前體必需的編碼序列的DNA序列。多肽可以由全長的編碼序列或任何部分的編碼序列編碼，只要期望的蛋白質(zhì)活性予以保留。
在此所用，“核苷酸”是指由共價連接到五碳糖分子上的嘌呤[鳥嘌啉(G)或腺嘌呤(A)]和嘧啶[胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)]堿基組成的化合物，而“核苷酸”通常是指在其一個五碳糖羥基基團上發(fā)生磷酸化的核苷酸分子。
在此所用，“核酸”是指核苷酸共價連接序列，其中一個核苷酸的五碳糖的3’位與下一個五碳糖的5’位通過磷酸二酯鍵相連，并且其中的核苷酸殘基(堿基)是以特定序列相連的；即，核苷酸的線性序列。在此所用，“多核苷酸”是指包含長度超過100個核苷酸序列的核酸。在此所用，“寡核苷酸”是指短多核苷酸或多核苷酸的一部分。典型的寡核苷酸包括一個約由2到100個堿基組成的序列。單詞“寡”有時代替單詞“寡核苷酸”。
之所以說核酸分子具有“5’末端”和“3’末端”，是因為核酸磷酸二酯鍵連接是發(fā)生于取代單核苷酸的五碳糖環(huán)的5’碳原子和3’碳原子上。其中新的連接將發(fā)生在5’碳原子上的核酸末端是其5’末端。其中新的連接將發(fā)生在3’碳原子上的核酸末端是其3’末端。在此所用，“末端核苷酸”是指位于5’末端和3’末端的最后一個核苷酸。之所以說DNA分子具有5’末端和3’末端，是因為單核苷酸反應(yīng)形成寡核苷酸的方式使一個單核苷酸五碳糖環(huán)的5’磷酸基通過磷酸二酯鍵按一個方向結(jié)合到相鄰的單核苷酸五碳糖環(huán)的3’氧原子上。所以，如果寡核苷酸的5’磷酸基不與單核苷酸五碳糖的3’氧原子相連，則寡核苷酸的末端稱為5’末端；如果寡核苷酸的3’氧原子不與下一個單核苷酸五碳糖的5’磷酸基相連，則寡核苷酸的末端稱為3’末端。
在此所用，“核酸序列”，即使在大的寡核苷酸或多核苷酸內(nèi)部，也可以說具有5’末端和3’末端。在線性或環(huán)狀的DNA分子中，離散元件被稱作“上游”或5’元件相對于“下游”或3’元件。這些術(shù)語反映了轉(zhuǎn)錄是沿著DNA鏈從5’向3’方向進行的事實。典型情況下，介導連接基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子元件通常位于編碼區(qū)的5’端或上游。但是，增強子元件即使位于啟動子元件和編碼區(qū)的3’端也能夠起作用。轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號位于編碼區(qū)的3’或下游。
當使用于基因時，術(shù)語“野生型”是指具有從自然存在材料中分離基因的特征的基因。當使用于基因產(chǎn)物時，術(shù)語“野生型”是指具有從自然存在材料中分離基因產(chǎn)品的特征的基因產(chǎn)品。野生型基因是指在群體中最常見，并且因此武斷地定為該基因的“正常的”或“野生型”形式。相反，當使用于基因或基因產(chǎn)品時，術(shù)語“修飾的”或“突變型”相應(yīng)是指與野生型基因或基因產(chǎn)品相比較，表現(xiàn)出序列和/或功能特性的修飾(即，改變特性)的基因或基因產(chǎn)品。應(yīng)該注意到，可以分離自發(fā)突變體；當與野生型基因或基因產(chǎn)品比較時，根據(jù)它們改變了特性的事實識別它們。
在此所用，術(shù)語“過量表達”是指在轉(zhuǎn)基因生物體某個基因產(chǎn)品的產(chǎn)量超過了正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物體的產(chǎn)量水平。在此所用，術(shù)語“共抑制”是指表達與內(nèi)源基因?qū)嵸|(zhì)上同源的外源基因，導致外源基因和內(nèi)源基因的表達都受到抑制。在此所用，術(shù)語“變化水平”是指轉(zhuǎn)基因生物的基因產(chǎn)品產(chǎn)量在數(shù)量或比例上與正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物不同。
當使用于DNA分子時，術(shù)語“重組”是指包含通過分子生物學技術(shù)連在一起的DNA片段的DNA分子。當使用于蛋白質(zhì)或多肽時，術(shù)語“重組”是指用重組DNA分子表達的蛋白質(zhì)分子。
術(shù)語“目的核苷酸序列”是指任何核苷酸序列，具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的人可以操作該序列產(chǎn)生針對某個原因的期望結(jié)果(例如，賦予質(zhì)量改善)。這樣的核苷酸序列包括，但不限于此，結(jié)構(gòu)基因的編碼序列(例如，報告基因，篩選標記基因，癌基因，抗藥性基因，生長因子等)以及不編碼mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的非編碼調(diào)控序列(例如，啟動子序列，多腺苷酸化序列，終止序列，增強子序列等)。
在此所用，當使用于結(jié)構(gòu)基因時，術(shù)語“編碼區(qū)”是指編碼作為mRNA分子翻譯結(jié)果的新生多肽的氨基酸的核苷酸序列。典型地，編碼區(qū)的5’端結(jié)合了編碼起始蛋氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”，3’端結(jié)合了終止密碼子(例如，TAA，TAG，TGA)。在一些情況下，編碼區(qū)也可用核苷酸三聯(lián)體“TTG”啟動。
在此所用，當使用于多核苷酸時，術(shù)語“互補的”“互補性”是指依靠堿基配對原則相互聯(lián)系的多核苷酸。例如，序列5’-AGT-3’互補于序列5’-ACT-3’。互補性可以是“部分互補”，其中只有核酸的一些堿基依據(jù)堿基配對原則配對?；蛘撸诤怂衢g可能存在“完全”或“全部”互補性。核酸鏈間的互補性程度對核酸鏈間雜交的效率和強度有顯著的影響。這在依賴于核酸間結(jié)合的擴增反應(yīng)和檢測方法中具有特殊意義。
在此所用，核酸序列的“互補體”是指其核酸表現(xiàn)出與含有所述核酸序列的核酸具有完全互補的核苷酸序列。
當使用于核酸時，術(shù)語“同源性”是指互補性的程度。存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)?！靶蛄型恍浴笔侵竷蓚€或更多核酸或蛋白質(zhì)間的相關(guān)性度量，是以關(guān)于總對比長度的百分比給出。同一性計算考慮了相同的，并且在其各自較長的序列中處于同一相對位置的核苷酸和氨基酸殘基。同一性計算可以用包含于計算機程序中的運算法則進行，例如“GAP”(遺傳學計算機集團(Genetics Computer Group)，Madison，威斯康星州)和“ALIGN”(DNAStar，Madison，威斯康星州)。
部分互補序列是至少部分抑制(或與之競爭)與靶核酸雜交的完全互補序列的序列，使用功能性術(shù)語“基本上同源”來定義。完全互補序列與靶序列雜交的抑制可以在低嚴緊條件下使用雜交分析進行檢驗(Southern或Northern雜交，溶液雜交和類似方法)。在低嚴緊條件下，基本同源的序列或探針將會與靶序列完全同源的序列競爭，抑制序列的結(jié)合(即，雜交)。這不是說低嚴緊條件是容許非特異性結(jié)合的條件；低嚴謹條件要求兩個序列的相互結(jié)合是特異性(即，選擇性的)相互作用。不存在非特異性結(jié)合可以通過使用甚至缺乏部分互補性(例如，同一性低于30％)的第二個靶序列測試；不存在非特異性結(jié)合時，探針將不能與第二個非互補靶序列雜交。
當使用于雙鏈核酸序列，例如cDNA或基因組克隆時，術(shù)語“基本同源”是指在如下文所述的低嚴謹條件下，任何可以與雙鏈核酸序列的任一鏈或兩條鏈雜交的探針。
當使用于核酸雜交時，低嚴緊條件包括等同于當使用約含500個核苷酸長度的探針時，在42℃的溶液中進行結(jié)合或雜交的條件。其中溶液的組成為5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/lEDTA，用NaOH將pH調(diào)至7.4)，0.1％的SDS，5X Denhardt’s試劑[每500毫升含有50X Denhardt’s5g水溶性聚蔗糖(Type 400，Pharmacia)，5g牛血清清蛋白(V級，Sigma)和100μg/ml變性鮭精DNA。結(jié)合或雜交后用包含5XSSPE，0.1％的SDS的溶液在42℃洗滌。
當使用于核酸雜交時，高嚴緊條件包括等同于當使用約含500個核苷酸長度的探針時，在42℃的溶液中進行結(jié)合或雜交的條件。其中溶液的組成為5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/lEDTA，用NaOH將pH調(diào)至7.4)，0.5％的SDS，5X Denhardt’s試劑和100ug/ml變性鮭精DNA。結(jié)合或雜交后用包含0.1X SSPE，1.0％的SDS的溶液在42℃洗滌。
當使用于核酸雜交時，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可以使用大量等同條件包括低嚴緊條件或高嚴緊條件；諸如探針長度和性質(zhì)(DNA，RNA，堿基組成)、靶性質(zhì)(DNA，RNA，堿基組成，在溶液中存在或固定化等)、鹽和其他成分(例如，存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)的濃度等因素都應(yīng)考慮，雜交溶液可以變化產(chǎn)生與上面所列條件不同的低或高嚴緊條件，但是其作用是等同的。
當使用于核酸雜交時，“嚴緊”一般發(fā)生在從約Tm-5℃(低于探針Tm溫度5℃)到比Tm低20℃-25℃的范圍內(nèi)。正如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，嚴緊雜交可以用于區(qū)分或檢測同一性多核苷酸序列或者區(qū)分或檢測相似或相關(guān)的多核苷酸序列。在“嚴緊條件”下，目的核酸序列將與其精確互補或密切相關(guān)的序列雜交。
之所以說多肽分子具有“氨基末端”(N-端)和“羧基末端”(C-端)，是因為肽鍵發(fā)生在第一個氨基酸殘基主鏈氨基基團和第二個氨基酸殘基的主鏈羧基基團之間。典型地說，其新的連接將加到生成多肽鏈的羧基末端的多肽末端和多肽序列是從氨基末端開始從左到右進行的。
在此所用，術(shù)語“外源肽”或“外來肽”是指不存在于其自然環(huán)境的肽(即，經(jīng)過了人工修改)。例如，外源肽基因含有插入另一個多肽或加入或融合到一個多肽上的肽。
當使用于氨基酸序列或蛋白質(zhì)時，術(shù)語“部分”(如在“氨基酸序列的一部分”)是指該蛋白質(zhì)的片段。該片段的大小范圍是從4個氨基酸殘基到全部氨基酸序列減去一個氨基酸。
在此所用，術(shù)語“融合蛋白”是指含有與外源蛋白片段(例如，疏水表位)相連的目的蛋白(例如，病毒外殼蛋白)的嵌合蛋白。
當使用于核酸時，如在“分離的核酸序列”中的“分離”是指從通常與其自然來源相關(guān)的至少一種含雜質(zhì)的核酸中鑒定和分離出來的核酸序列。分離核酸是以不同于其自然發(fā)現(xiàn)形式或環(huán)境中存在的核酸。相反，未分離核酸是指以其自然狀態(tài)存在的核酸例如DNA和RNA。例如，給定的DNA序列(例如，基因)被發(fā)現(xiàn)存在于其鄰近基因附近的宿主細胞染色體上；RNA序列，例如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列，與編碼多數(shù)蛋白的數(shù)量眾多的其它mRNA以混合物的形式存在于細胞中。但是，包含SEQ ID NOX的分離核酸序列包括，例如，在細胞里這類一般含有SEQ ID NOX的核酸序列，其中該核酸序列是在不同于其自然細胞的染色體或染色體外位點，或者另外側(cè)面接有不同于自然發(fā)現(xiàn)的核酸序列。分離核酸序列可以以單鏈或雙鏈形式存在。當分離的核酸序列用于表達蛋白質(zhì)時，該核酸序列將最低含有至少一部分正義或編碼鏈(即，核酸序列可以是單鏈的)?？梢赃x擇的是，它可以同時包含正義和反義鏈(即，核酸可以是雙鏈的)。
在此所用，術(shù)語“純化的”是指分子或分子集合體(例如，病毒粒子)，或者是核酸或氨基酸序列，它們是從其自然環(huán)境中被取出并分離的。所以，“分離的核酸序列”是純化的核酸序列。“基本純化的”分子是指至少含量60％，優(yōu)選地至少75％，更優(yōu)選地至少90％不含與其自然相關(guān)的其他成分的分子。
在此所用，術(shù)語“載體”和“運載體”是可互換地使用于將DNA片段從一個細胞轉(zhuǎn)移到另外一個細胞的核酸分子。載體可以包括質(zhì)粒，噬菌體，病毒，粘粒等。
在此所用，術(shù)語“表達載體”或“表達盒”是指包含期望的編碼序列和在特定宿主生物中表達可操作連接編碼序列所必須的適當核酸序列的重組DNA分子。在原核生物中表達的必須核酸序列通常包括啟動子，操縱子(選擇性的)，和核糖體結(jié)合部位，經(jīng)常還有其他序列。已知真核細胞使用啟動子，增強子和終止子和多腺苷酸化信號。
術(shù)語“靶向載體”或“靶向構(gòu)建”是指包含任何一側(cè)面都有識別序列的目的基因的寡核苷酸序列，它能同源重組定位于側(cè)面識別序列之間的DNA序列。
在此所用，術(shù)語“可操作重組”，“可操作順序”和“可操作性連接”是指核酸序列的連接方式，其中產(chǎn)生了能介導給定基因轉(zhuǎn)錄和/或期望的蛋白質(zhì)分子合成的核酸分子。本術(shù)語也指能使功能蛋白產(chǎn)生的氨基酸序列的連接形式。
真核生物的轉(zhuǎn)錄控制信號包括“啟動子”和“增強子”元件。啟動子和增強子包括與參與轉(zhuǎn)錄的細胞蛋白特異相互作用的DNA序列的短陣列(Maniatis，等人，科學(Science)，2361237，1987)。啟動子和增強子元件已經(jīng)從多種來源的真核生物中分離出來，包括酵母、昆蟲、哺乳動物和植物細胞的基因。啟動子和增強子也已從病毒中分離出來，類似控制元件，例如啟動子，也在原核生物中發(fā)現(xiàn)。特定啟動子和增強子的選擇決定于用于相關(guān)蛋白表達的細胞類型。一些真核啟動子和增強子具有較廣的宿主范圍，而其它僅在細胞類型的有限亞型中起作用(參見綜述，Voss等人，生物化學進展(Trends Biochem.Sci.)，11287，1986；和Maniatis等人，見上1987)。
在此所用，術(shù)語“啟動子元件”，“啟動子”或“啟動子序列”是指位于DNA聚合體的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的5’端(即，領(lǐng)先位置)的DNA序列。自然界所知的大多數(shù)啟動子領(lǐng)先于轉(zhuǎn)錄區(qū)。啟動子象一個開關(guān)一樣發(fā)揮作用，激活基因表達。如果基因受到激活，就說進行轉(zhuǎn)錄或參與轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄涉及mRNA從該基因中合成。所以，啟動子作為一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件發(fā)揮作用，也提供了基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的起始位點。
啟動子可以是組織特異性或細胞特異性的。當用于啟動子時，術(shù)語“組織特異”是指能介導目的核苷酸序列在特定類型的組織(例如，種子)中的選擇性表達的啟動子，而相同的目的核苷酸序列在不同的類型的組織(例如，葉子)中卻相對不表達。啟動子的組織特異性可以通過例如，將報告基因可操作連接到啟動子序列上產(chǎn)生報告子構(gòu)建物，將報告子構(gòu)建物導入植物基因組以便報告子構(gòu)建物整合進轉(zhuǎn)基因植物的每一組織，以及在轉(zhuǎn)基因植物的不同組織中檢測報告基因的表達(例如，檢測由報告基因編碼的mRNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的活性)來評價。相對于報告基因在其它組織的的表達水平，在一種或幾種組織中檢測到較高水平的報告基因的表達則表明啟動子針對檢測到的表達量較高的組織而言是特異性的。當用于啟動子時，術(shù)語“細胞類型特異”是指在特定類型的細胞中能介導目的核苷酸序列選擇性表達的啟動子，而在相同組織的不同類型的細胞中，相同的目的核苷酸序列卻相對沒有表達。當用于啟動子時，術(shù)語“細胞類型特異”也是指在某個組織的某一區(qū)域中，能促進目的核苷酸序列選擇性表達的啟動子。細胞類型特異的啟動子可以用本技術(shù)領(lǐng)域的已知方法加以評估，例如，免疫組織化學染色法。簡單來說，組織切片包埋在石蠟中，石蠟切片與第一抗體反應(yīng)，該抗體對由目的核苷酸序列編碼的多肽產(chǎn)物是特異的，而該核苷酸的表達由該啟動子控制。與第一抗體特異的標記的(例如，過氧化物酶結(jié)合)第二抗體與切片的組織結(jié)合，用顯微鏡檢測特定的結(jié)合(例如，用抗生物素/生物素)。
啟動子可以是組成性的或可調(diào)節(jié)的。當使用于啟動子時，術(shù)語“組成性”是指不存在刺激(例如，熱休克、化學性、光等)時，能夠介導可操作連接的核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。典型地，組成性啟動子能在基本上任何細胞和組織中介導轉(zhuǎn)基因表達。代表性的組成性植物啟動子包括，但不限于SD花椰菜花葉病毒(CMV SD；見例如，美國專利號5,352,605，在此加入以供參考)、甘露氨酸合酶、章魚氨酸合酶(ocs)、超級啟動子(見例如，WO01/14098)和ubi3(見例如Garbarino和Belknap，植物分子生物學(Plant.Mol.Biol.24119-127 啟動子。這些啟動子已用于在轉(zhuǎn)化植物組織中成功介導異源核酸序列的表達。
相反，“可調(diào)節(jié)的”啟動子是存在刺激(例如，熱休克、化學性、光等)時，能介導可操作連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄水平的啟動子，該轉(zhuǎn)錄水平不同于無刺激下的可操作連接核酸序列的轉(zhuǎn)錄水平。
在此所用，術(shù)語“調(diào)控元件”是指控制核酸序列表達的一些方面的遺傳元件。例如，啟動子是有助于可操作連接編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控元件。其他調(diào)控元件有拼接信號、多腺苷酸化信號、終止信號等。
增強子和/或啟動子可以是“內(nèi)源的”或“外源的”或“異源的”?！皟?nèi)源的”增強子或啟動子是與在基因組中給定基因自然連接的增強子或啟動子?！巴庠吹摹被颉爱愒吹摹眴幼踊蛟鰪娮邮怯眠z傳操作方法(即，分子生物學技術(shù))置于某個基因的毗鄰部位，以致該基因的轉(zhuǎn)錄是由連接的增強子或啟動子介導的。例如，可以分離、去除與第一個基因可操作結(jié)合的內(nèi)源啟動子，將其置于與第二個基因可操作結(jié)合的部位，從而使“異源啟動子”與第二個基因可操作性結(jié)合。多種結(jié)合得以考慮(例如，第一和第二基因可以來自同一物種，或來自不同物種。)在真核宿主細胞中，表達載體上存在“拼接信號”經(jīng)常導致重組轉(zhuǎn)錄的較高表達水平。拼接信號調(diào)節(jié)內(nèi)含子從原始RNA轉(zhuǎn)錄物上去除，由拼接供體和受體位點組成(Sambrook，等人，分子克隆實驗手冊(Molecular cloninga laboratory manual)，第二版，美國冷泉港實驗室出版社，紐約 ，16.7-16.8頁)。常用的拼接供體和受體位點是來自猿猴空泡病毒(SV40)的16S RNA的拼接結(jié)合。
在真核細胞中，重組DNA序列的有效表達需要介導最終轉(zhuǎn)錄物有效終止和多腺苷酸化的信號表達。轉(zhuǎn)錄終止信號通常發(fā)現(xiàn)存在于多腺苷酸化信號的下游，其長度為幾百個核苷酸。在此所用，術(shù)語“多腺苷酸位點”或“多腺苷酸序列”是指介導新生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的終止和多腺苷酸化的DNA序列。重組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的有效多腺苷酸化是期望的，因為缺乏多聚腺苷酸尾巴的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物則不穩(wěn)定并且很快降解。在表達載體中使用的多聚腺苷酸信號可以是“異源的”或“內(nèi)源的”。內(nèi)源多聚腺苷酸信號是指在基因組中自然存在于給定基因的編碼區(qū)的3’末端的信號。異源多聚腺苷酸信號是指從一個基因分離的，置于另一個基因的3’端的信號。常用的異源多聚腺苷酸信號是猿猴空泡病毒40(SV 40)的多聚腺苷酸信號。SV 40的多聚腺苷酸信號包括在一個237 bp的BamHI/BclI限制酶切片段，介導終止和多腺苷酸化(Sambrook，見上，16.6-16.7頁)。
術(shù)語被細菌“傳染”和“感染”是指靶生物樣品(例如，細胞、組織等)與細菌在某種條件下共培養(yǎng)，這樣細菌中含有的核酸序列樣品導入到一個或多個靶生物樣品的細胞中。
術(shù)語“轟擊(bombarding)”、“轟擊(bombardment)”和“生物學轟擊(biolistic bombardment)”是指加速粒子轟擊靶生物材料(例如，細胞，組織等)的過程，以便影響靶生物材料細胞的細胞膜損傷和/或使粒子進入靶生物材料。生物(biolistic)轟擊的辦法在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的(例如，美國專利號5,584,807，其內(nèi)容引于此作為參考)，并且是商業(yè)上可以獲得的(例如，氦氣驅(qū)動的微彈道加速器(PDS-1000/He，BioRad)。
當用于植物組織時，術(shù)語“微損傷”是指在該組織中引入顯微傷害。微損傷可以通過，例如，此處描述的粒子轟擊或磨擦組織獲得。在此所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指將外源DNA導入真核細胞。轉(zhuǎn)染可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的多種方法實現(xiàn)，包括磷酸鈣-DNA共沉淀物的轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、利用1，5二甲基-1，5二氮十一亞甲基聚甲溴化物的轉(zhuǎn)染、電穿孔法、微注射、脂質(zhì)體融合、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、反轉(zhuǎn)錄病毒感染和生物方法(biolistic)。
當用于細胞時，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指包含轉(zhuǎn)基因的細胞，或其基因組已經(jīng)受到轉(zhuǎn)基因?qū)氲男揎?。當用于組織或植物時，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”分別指組織和植物，其含有具有轉(zhuǎn)基因的一個或多個細胞，或者由于導入轉(zhuǎn)基因?qū)е缕浠蚪M的改變。轉(zhuǎn)基因細胞、組織和植物可以用幾種方法產(chǎn)生，包括將含有核酸(通常為DNA)的“轉(zhuǎn)基因”導入靶細胞或使用人工干涉的方法將轉(zhuǎn)基因整合到靶細胞的染色體組中，例如此處所述的方法。
術(shù)語“外源基因”是指通過實驗控制導入細胞的基因組的任何核酸(例如，基因序列)，可以包括該細胞里發(fā)現(xiàn)的基因序列，只要導入的基因相對于自然發(fā)生的基因存在一些改變(例如，點突變、存在選擇性標記基因等)。
在此所用，“轉(zhuǎn)化”是指將轉(zhuǎn)基因?qū)爰毎?。細胞轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定的或是暫時的。術(shù)語“暫時轉(zhuǎn)化”或“短暫轉(zhuǎn)化的”是指將一個或多個轉(zhuǎn)基因?qū)爰毎?，但是并未整合進宿主細胞基因組中。例如，暫時轉(zhuǎn)化可以用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定法檢測，該方法檢測一種或多種轉(zhuǎn)基因編碼的多肽的存在?？商娲厥?，暫時轉(zhuǎn)化可以通過檢測由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)(例如，β-葡糖苷酸酶)的活性進行。術(shù)語“暫時轉(zhuǎn)化體”是指暫時整合進一個或多個轉(zhuǎn)基因的細胞。相反，術(shù)語“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化”或“穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化”是指將一個或多個轉(zhuǎn)基因?qū)牒驼系郊毎幕蚪M中。細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以使用能與一個或幾個轉(zhuǎn)基因結(jié)合的核酸序列對細胞的基因組DNA進行Southern印跡雜交來檢測?？蛇x擇的，細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化也可以通過細胞基因組DNA的多聚酶鏈式反應(yīng)擴增轉(zhuǎn)基因序列檢測。術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體”是指已經(jīng)將一個或多個轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合進其基因組DNA的細胞。所以，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體與暫時轉(zhuǎn)化體的區(qū)別在于，來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的基因組DNA含有一個或多個轉(zhuǎn)基因，而來自暫時轉(zhuǎn)化體的基因組DNA不含有轉(zhuǎn)基因。
A.病毒粒子表達系統(tǒng)為了產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的修飾的病毒粒子，通過在編碼暴露于病毒衣殼的內(nèi)表面的外殼蛋白部分的病毒基因組所述部位導入編碼外源肽(例如，動物病毒抗原)的核苷酸序列來修飾病毒核酸，然后用修飾的病毒核酸感染宿主細胞或生物體，收獲修飾病毒的裝配粒子。對于DNA病毒，本方法最好通過直接操作病毒的DNA；或者操作與RNA病毒的RNA的相對應(yīng)的cDNA來實現(xiàn)。相應(yīng)地，在一些實施例中，本發(fā)明提供了編碼病毒粒子的載體，該病毒粒子已被修飾以便在病毒衣殼的內(nèi)表面表達外源肽。在特別優(yōu)選的實施方案中，編碼病毒外殼蛋白的核酸序列通過插入編碼外源肽的序列被修飾，以便當病毒外殼蛋白裝配進衣殼時，外源蛋白展現(xiàn)在衣殼的內(nèi)表面。在進一步的實施方案中，編碼外源肽的序列是插入病毒外殼蛋白的一部分中，以便病毒外殼蛋白裝配進衣殼時不受到實質(zhì)的干擾或破壞。
多種病毒粒子都可用于本本發(fā)明。假定DNA病毒和RNA病毒都適合用在此所述的方法修飾。在特別優(yōu)選的實施方案中，修飾病毒粒子是植物病毒。在進一步優(yōu)選的實施方案中，植物病毒優(yōu)選二十面體病毒。迄今為止，所有已經(jīng)闡明晶體結(jié)構(gòu)的具有二十面體對稱的所有植物病毒的特征是存在一個規(guī)則的8鏈β-桶構(gòu)型。所以，可能是該構(gòu)型是所有植物二十面體病毒的共性。因此，優(yōu)選的二十面體植物病毒可以選自下述病毒家族椰菜花葉病毒屬、雀麥花葉病毒病毒屬、豇豆花葉病毒屬、雙粒病毒屬、弧腸孤病毒屬、分病毒屬、sequivididae和番茄叢矮病毒屬。和下述病毒屬黃屬病毒組、玉米雷亞多非納病毒組、南方菜豆花葉病毒組、蕪菁黃花葉病毒組、enamovirus和ideavirus。
在特別優(yōu)選的實施方案中，修飾病毒粒子來自豇豆花葉病毒屬家族。豇豆花葉病毒屬家族是一組至少14個植物病毒的病毒組，它主要感染豆科植物。它們的基因組由兩個單鏈的不同大小的正義RNA分子構(gòu)成，它分別包于直徑約28nm的等容積的粒子中。以其氯化銫密度剃度離心中的行為結(jié)果劃分，兩種類型的核蛋白體被稱為中間成分(M)和底部成分(B)，粒子中的RNA相應(yīng)稱為M RNA和B RNA。兩種類型的粒子都有相同的蛋白組分，包括60個拷貝，每個拷貝含有一個大外殼蛋白(VP37；VP-L)和一個小外殼蛋白(VP23；VP-S)。除了核蛋白體粒子，豇豆花葉病毒制備物包含不同量的空衣殼(只有蛋白質(zhì))，其被稱為頂部(T)成分。
在豇豆花葉病毒家族的典型成員中，豇豆花葉病毒屬(CPMV)，已知M RNA和B RNA都是多腺苷酸化的，并具有共價連接在其5’末端的小蛋白質(zhì)(VPg)。對其他豇豆花葉病毒的有限研究暗示這些特征為本組中的RNA病毒共有特征。來自CPMV的兩種RNA已經(jīng)測序，表明由3481(M)和5889(B)個核苷酸構(gòu)成，其中不包括多聚腺苷酸尾巴(vanWezenbeek等人，EMBO J.2941-46 ；Lomonossoff和Shanks，EMBO J.22253-2258 )。兩種RNA都含有一個單一的長開放閱讀框，通過合成和隨后裂解大的前體多肽表達病毒基因產(chǎn)品。雖然兩個RNA對于感染整個植物都是必須的，但是較大的B RNA可以獨立在原生質(zhì)體中復(fù)制，但在這種情況下，沒有病毒粒子產(chǎn)生(Goldbach等人，自然286297-300 )。這些結(jié)果和較早的遺傳實驗已確定外殼蛋白是由M RNA編碼的。
CPMV的3.5埃電子密度圖表明CPMV與T＝3植物病毒如豇豆花葉病毒之間有一種清楚的關(guān)系，特別是番茄叢矮病(TBSV)和南方菜豆花葉病毒組，尤其是南方菜豆花葉病毒(SBMV)。后者病毒的衣殼由180個相同的外殼蛋白亞單位組成，每個亞單位由一個單一的β-桶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。它們在病毒粒子中可以占據(jù)三種不同的位置，即A、B和C。CPMV的兩個外殼蛋白表明它們由3個不同的β-桶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，兩個來自VP37，一個來自VP23。所以，與T＝3病毒相同，每個CPMV病毒是由180個β-桶結(jié)構(gòu)構(gòu)成的。來自VP23的單一結(jié)構(gòu)域占據(jù)了與TBSV和SBMV的A型亞單位相似的位置，而VP37的氨基端和羧基端相應(yīng)占據(jù)了C型和B型亞單位的位置。
X射線衍射分析了CPMV晶體和本組的另外一個成員，菜豆莢斑駁病病毒(BPMV)，表明BPMV和CPMV的三維結(jié)構(gòu)是十分相似的，總的來說是豇豆花葉病毒典型。在CPMV和BPMV的結(jié)構(gòu)中，每個β-桶原則上由不同長度的環(huán)連接的8條反向平行的β-片層構(gòu)成。平的β-片層命名為B、C、D、E、F、G、H和I片層，連接環(huán)被稱為βB-βC、βD-βE、βF-βG和βH-βI環(huán)。
豇豆花葉病毒在結(jié)構(gòu)上也與動物小核糖核酸病毒有關(guān)。小核糖核酸病毒的衣殼由60個拷貝構(gòu)成，其中每一個拷貝由三種不同的外殼蛋白VP1、VP2和VP3組成，每個具有一個單一的β-桶結(jié)構(gòu)域。對于豇豆花葉病毒而言，這些外殼蛋白是通過一個前體多蛋白的裂解釋放的，并以VP2-VP3-VP1的順序合成。比較CPMV和小核糖核酸病毒的三維結(jié)構(gòu)可以表明VP37的氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域相應(yīng)等同于VP2和VP3，而VP23的氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域等同于VP1。結(jié)構(gòu)位置和基因順序的等同性表明VP37相當于兩種小核糖核酸病毒的衣殼蛋白，VP2和VP3的未裂解形式。
豇豆花葉病毒和小核糖核酸病毒之間的主要差別之一是豇豆花葉病毒的蛋白亞單位缺乏在小核糖核酸病毒上發(fā)現(xiàn)的β-桶鏈間的大插入，雖然這些病毒粒子的基本結(jié)構(gòu)是非常相似的。β-折疊間的四個環(huán)(βB-βC、βD-βE、βF-βG和βH-βI)對于保持病毒粒子的結(jié)構(gòu)完整性不是關(guān)鍵的，但是，根據(jù)本發(fā)明，是外源肽序列的表達位點，例如動物病毒的抗原位點。
豇豆花葉病毒的一個優(yōu)點是衣殼包括60拷貝，每個拷貝含有兩個組成性的外殼蛋白，所以允許每個病毒粒子展現(xiàn)某個肽的60-180個拷貝，其中每個外殼蛋白結(jié)構(gòu)域已被操作以致它們表達插入的片段。在豇豆花葉病毒屬家族中，優(yōu)選豇豆花葉病毒和菜豆莢斑駁病毒，最優(yōu)選豇豆花葉病毒CPMV是一種二重基因組RNA病毒，為了便于操作任何RNA病毒來表達外源肽，適宜的是使用該RNA的cDNA克隆。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了編碼一個修飾的病毒粒子的cDNA載體，以便將外源肽表達在病毒衣殼的內(nèi)表面。CPMV的兩個RNA分子的全長cDNA克隆是可以得到的，其可以被操作插入編碼外源肽的寡核苷酸序列。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，載體是CP26。在其他實施方案中，載體包括B RNA或M RNA或者B RNA或M RNA的變體或類似物。在一些實施方案中，變體或類似物可以與B RNA或M RNA的正鏈或負鏈在從高嚴緊到低嚴緊的條件下雜交。在特別優(yōu)選的實施方案中，變體或類似物包括編碼外源蛋白的序列。
在一些實施方案中，cDNA被用于產(chǎn)生體外轉(zhuǎn)錄物，當與植物溫育時，轉(zhuǎn)錄物具有感染性。相應(yīng)地，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了編碼修飾病毒粒子的RNA載體，修飾的目的是在病毒衣殼的內(nèi)表達外源肽。但是，轉(zhuǎn)錄物的感染性顯著低于自然病毒粒子的RNA，可能在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端作為存在非病毒殘基的結(jié)果。困難也可能來自轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物暴露于溫育中的降解性試劑。對此原因，轉(zhuǎn)錄物通常通過給它們的5’端加帽來穩(wěn)定。仍在更多的優(yōu)選實施方案中，修飾的病毒粒子也包括展現(xiàn)在病毒衣殼外表面的外源肽。將外源肽展現(xiàn)在病毒衣殼的外表面的方法由美國專利5,874,087和5,958,422提供，每個專利引于此作為參考。
在進一步的實施方案中，cDNA直接用于溫育植物。在這些實施方案中，編碼修飾的病毒粒子的序列可以與在植物組織中表達的啟動子可操作連接。在本發(fā)明中有用處的啟動子包括，但不限于此，花椰菜花葉病毒(CaMV SD，見例如，美國專利5,352,605，在此引入以供參考)、甘露氨酸合酶、章魚氨酸合酶(ocs)、超級啟動子(見例如WO 95/14098)和ubi3(見例如Garbarino和Belknap，植物分子生物學，24119-127 )啟動子。這些技術(shù)克服了使用體外轉(zhuǎn)錄物所遇到的一些問題，并且適于所有植物RNA病毒。
對于DNA病毒，DNA本身被導入植物體。在這種情況下，外源肽最初作為衣殼蛋白的一部分表達，因此是以整個病毒粒子的一部分而生產(chǎn)。所以，肽可以作為打算以此為目的的連接分子而生產(chǎn)?？商娲厥牵《镜倪z傳修飾可以進行設(shè)計，以便可以通過使用適當影響病毒粒子裂解的試劑容許釋放期望的肽。
為了在商業(yè)水平上生產(chǎn)修飾的病毒，不必制備用于每批病毒生產(chǎn)的感染性接種物(DNA或RNA轉(zhuǎn)錄物)。在一些實施方案中，首次接種可以用于感染植物，獲得的修飾的病毒可以在植物體傳代，以便產(chǎn)生完整病毒或病毒RNA，用于隨后批次的接種物。
在一些實施方案中，病毒衣殼不包括核酸。本技術(shù)領(lǐng)域已知用于選擇性富集和純化“空”病毒粒子的方法(參見，例如，van Kammen和de Jaeger，豇豆花葉病毒，在植物病毒197的CBI/AAB描述，CommonwealthAgriculturalBureax ；和WO 98/56933，的公開在此引入以工參考)。
B.外源肽在病毒衣殼內(nèi)的表達以前描述的病毒表達技術(shù)的局限之一是存在帶正電荷肽或疏水性肽插入外殼蛋白的表面環(huán)之一導致病毒感染性的喪失的事實，可能原因是擾亂的蛋白折疊，粒子凝聚或擾亂的病毒運輸。這些粒子的無生存能力是表達一些表位的巨大障礙。通過表達一些附加酸性氨基酸可以補償帶正電荷的表位(例如，pIMM8、pIMM9；Bendalm-nane等人，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)290(1)9-20 。但是，在表面表達疏水性殘基至今仍十分困難。在病毒表面使用替代性插入位點沒有解決這個問題?？偟膩碚f，在VP-S的羧基端插入表位給出了相似的特性，該表位也是表達在表面上。本技術(shù)的局限使其表達多數(shù)T細胞表位存在困難。新的插入位點的發(fā)現(xiàn)描述如下。
1.插入位點總的來說，外源RNA或DNA可以以多種構(gòu)型插入植物病毒基因組中。例如，可以作為已有核酸的附加物或已有序列的部分替代物，該項選擇極大地由衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)和附加或取代的容易程度決定，前提是不干擾遺傳修飾的病毒在植物體中的裝配能力。對于適用于本發(fā)明目的附加或缺失可容許的和最合適大小的確定，可在每一特定狀況下，參考現(xiàn)有的公開技術(shù)，用實驗確定。在一些情況下，附加插入物的用途比取代插入表現(xiàn)出更多的靈活性。
本發(fā)明證實在病毒外殼蛋白上插入表位以便它們在病毒衣殼的內(nèi)表面或內(nèi)側(cè)上表達?？偟膩碚f，暴露在裝配的病毒衣殼的內(nèi)表面的病毒外殼蛋白的任何部分都是表位插入的候選位點。在本發(fā)明的一些實施方案中，那樣的位點是通過病毒衣殼的高分辨結(jié)構(gòu)分析(例如，晶體結(jié)構(gòu)分析)選擇的。在本發(fā)明的進一步實施方案中，病毒外殼蛋白通過在識別出的位點插入表位。編碼修飾病毒的載體(例如，cDNA或RNA載體)然后用于感染合適的宿主(例如，原生質(zhì)體，植物組織或整個植物)。如果感染發(fā)生了(例如，通過在植物中的局部病變的出現(xiàn)分析)，那么這個位點對于表位表達是有用的。在一些情況中，感染病毒連續(xù)選擇識別出導致更大感染性的突變體，包括能全身感染的病毒粒子(下面將詳細討論)。
本發(fā)明是以將外源基因插入CMPV的VP-S中為樣板的。在一些實施方案中，插入位點在VP-S的氨基端。在進一步的實施方案中，外源基因插入從氨基端算起第5氨基酸和第20氨基酸之間的任何一點，優(yōu)選地從氨基酸端算起的第7氨基酸和第15氨基酸之間，更優(yōu)選地從氨基酸端算起的第9氨基酸和第12氨基酸之間。在優(yōu)選的實施方案中，外源肽的插入不干擾的體內(nèi)病毒的功能(例如，裝配)。
根據(jù)高分辨結(jié)構(gòu)，氨基端是在病毒粒子的內(nèi)表面，而不是在外表面。本發(fā)明不限定于特定的作用機制。實際上，對作用機制的理解對實施本發(fā)明而言不是必須的。而且，作為將表位表達于CMPV的VP-S的氨基端的戰(zhàn)略，期望的是將表位插入Y11或V10Y11的重復(fù)中。氨基端在病毒的生存周期中起作用，因為它在多肽加工過程中被病毒蛋白酶識別。識別位點的確切大小還不知道，但是根據(jù)VP37與MP(運動蛋白)的識別位點類推，識別位點的大小可能是10-11個氨基酸(Verver等人，病毒學2422-27 )。VP-S的前十個氨基酸從VP-S的β-桶中凸出，不與其它任何殘基作用。Y11標志著VP-S的氨基端和小外殼蛋白的其余部分的界線，是由Q73、R165和H71形成的疏水口袋。在Y11處插入顯然不干擾多蛋白的加工。
其它因素也使該處成為期望的位點。CMPV內(nèi)的RNA分布不清楚。但是，菜豆莢斑駁豇豆花葉病毒的中間成分中，一些RNA是在晶體結(jié)構(gòu)中。主要的RNA-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在VP37的氨基端。對CMPV而言，這種情況同樣發(fā)生。CMPV的冷凍電子顯微技術(shù)照片顯示在其五片層幾何軸上可能存在一個小的空間，正好在蛋白質(zhì)殼的下面。而且，VP-S的氨基端包含兩個帶負電的殘基，使其與RNA的糖-磷酸主鏈的相互作用也不可能。所以，VP-S的氨基端的插入不可能干擾與RNA的相互作用，并且存在容納外源肽的空間?？商娲氖牵琕P-S的氨基端可能結(jié)構(gòu)完好，在病毒粒子中與VP23分子相關(guān)的五個幾何終點形成一個環(huán)面(Lin等人，病毒學雜志(Journal Virology)74(1)493-504 )。B因子表明第1-9個氨基酸是柔性的。這個區(qū)域的插入將可能導致破壞環(huán)面，但將不可能影響β-桶折疊。肽掃描實驗表明CMPV和許多其它二十面體植物病毒的VP-S的氨基端展現(xiàn)最強的B細胞表位之一具有相關(guān)性。這與該結(jié)構(gòu)域通過裝配病毒粒子，例如CVP，的能動行為(即，呼吸)短暫暴露的觀念一致。
相應(yīng)地，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了具有在Y11位點插入外源肽的修飾的CPMV。仍在進一步的實施方案中，外源肽是插入VP-S的Y11的重復(fù)體之間。在其他的實施方案中，本發(fā)明提供了具有在VP-S的V10Y11的重復(fù)體之間插入外源肽的修飾的CPMV。本發(fā)明不限定于任何一種特定的作用機制。實際上，對作用機制的理解對于本發(fā)明的實施并非必須。但是，推測外源肽的側(cè)面具有Y11或V10Y11的重復(fù)體保護了Y11的疏水性環(huán)境。
Y11的重復(fù)體代表病毒載體的基因工程的誘發(fā)變異，這可以有助于在CPMV的衣殼中容納外源肽?？偟貋碚f，由于許多觀察到的發(fā)生于粒子上、將肽展示在粒子外表的全程變異已經(jīng)限制在外源肽本身，CPMV的氨基酸序列的其它變化證實設(shè)計困難。
幾種表位已被成功地插入Y11位置，表現(xiàn)出在豇豆植物上的很好的感染能力。一些構(gòu)建體具有V10Y11的重復(fù)體，在兩種情況下(pNLAL7/pMAL8和pMV14/pMV15)，已證實有利于避免表位的變異或使構(gòu)建具有感染性。在一種構(gòu)建(pTr4)中，只有V10是重復(fù)的(因為表位開始、終止于纈氨酸)并且在這種情況下，構(gòu)建是感染性的。這些結(jié)果使在新的構(gòu)建體中重復(fù)至少V10，如果可能的話V10Y11是可取的在新的構(gòu)建體中。
2.肽根據(jù)本發(fā)明可以整合進植物病毒的外源肽可以是高度多樣性的，僅僅受制于外源肽性質(zhì)和大小，其在病毒粒子上或內(nèi)的插入位點不干擾修飾病毒在體外和體內(nèi)培養(yǎng)時的裝配能力。廣義概念而言，修飾病毒可以從任何生物學上有用的肽(通常是多肽)形成，其功能發(fā)揮需要特定構(gòu)型才具有活性。這可以通過將肽與較大的分子結(jié)合(例如，提高其穩(wěn)定性)或在特定生物系統(tǒng)上的提呈模式來獲得。這種肽的實例是肽激素；酶；生長因子；原生動物、病毒、細菌真菌來源的抗原；抗體包括抗獨特型抗體；免疫調(diào)節(jié)劑和細胞因子(例如，干擾素和白細胞介素)；受體；粘附素；肽的任何一種前述類型的部分或前體。該肽優(yōu)選地包含5個以上的氨基酸。
本發(fā)明允許將多種外源肽表達在病毒衣殼的內(nèi)表面上。在一些實施方案中，肽是從5到20氨基酸，優(yōu)選是從7到15個氨基酸，最優(yōu)選是從8到12個氨基酸。但是，可以推測外源肽大小的限制僅受嵌合病毒容納外源肽和在植物體內(nèi)仍具有裝配進感染病毒的能力的限制。在優(yōu)選的實施方案中，外源肽具有免疫學特性。相應(yīng)地，在一些實施方案中，外源肽是抗原或免疫原。成功插入的表位實例在下表1中予以提供。在一些實施方案中，表位是B細胞表位。在其他實施方案中，表位是T細胞表位。在一些優(yōu)選實施方案中，外源肽是細胞毒性T淋巴細胞表位，與細胞毒性T淋巴細胞反應(yīng)?？偟貋碚f，T細胞表位是疏水性的。在一些實施方案中，表位具有大于7.0的等電點(pI)(例如，pHBV16、pLCMV2和PVSVI)，是疏水性的或包含長的疏水性的伸長片段(例如，pLCMV2和pHBV16)。這些表位中的一些以前已經(jīng)插入到VP-S的βBβC-環(huán)中，產(chǎn)生良好的(短HBV表位)，中等的(LCMV表位)和無(2F10肽)癥狀。在一些優(yōu)選實施方案中，肽相當于序列號4-17。在其他實施方案中，肽是由相當于序列號18-31的核酸序列編碼。


使用VP-S的氨基端的插入位點相對于以前使用的插入位點而言具有明顯的優(yōu)點，表現(xiàn)在可能表達疏水性或堿性表位。這開創(chuàng)了在CPMV上表達外源表位的可能性上的一個全新領(lǐng)域。由于新插入位點存在于病毒粒子的內(nèi)面，對插入表位的強免疫反應(yīng)不可能。但是，許多植物病毒的內(nèi)藏的氨基端證實是居于病毒的最強免疫原性部分之中。對這一現(xiàn)象的最可能解釋是粒子的主動行為(呼吸)。由于這一原因，B細胞對BBV16中的2F10表位的反應(yīng)受到測試。缺如任何一種α-2F10抗體清楚表明本構(gòu)建中的表位是內(nèi)藏的。
3.第二位點變異令人驚奇地是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在其VP-S的氨基端的包含外源肽的嵌合病毒粒子(即，內(nèi)展示粒子)特別易于在植物體上選擇性影響除了插入位點本身而外的其他位點的外殼蛋白序列的變異。再次變異具有下述特征新的變異是自發(fā)發(fā)生，在宿主植物體內(nèi)進行選擇；大部分的變異發(fā)生在外源肽插入位點的遠端和近端部位。有趣的是，許多變異影響了位于被認為涉及衣殼亞單位之間的蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域中的外殼蛋白的氨基酸序列的變化。
通過用新的包含了內(nèi)部化的表位的嵌合病毒粒子構(gòu)建感染宿主植物體，可能選擇和分離除了插入物中的氨基酸以外的氨基酸發(fā)生變化的新病毒粒子。而且，在給定外殼蛋白的給定位置不依賴于時間獨立地發(fā)生，從而再次導致正好在組成衣殼的蛋白的同一位置分別地誘導和選擇變異。并且，給定氨基酸殘基可以變成不同的氨基酸(即，非保守性變化)的事實暗示從結(jié)構(gòu)中去除原始氨基酸產(chǎn)生的限制比建立特定的氨基酸替代更重要。并且，氨基酸替代自然限定于密碼子的非擺動區(qū)的(單點)點突變產(chǎn)生的變異體。所以，提供了區(qū)分CPMV的衣殼中的位置的方法，允許選擇補償突變(“熱點”)。該方法獨立于此種衣殼中的內(nèi)部化表達肽和其精確插入位點。
更引人注目的是，通過用內(nèi)部表達外源肽嵌合體感染宿主植物，CPMV的外殼蛋白的第二、第三或更多位點變異可以予以選擇。當所述的第三位點和更多位點變異發(fā)生時，新嵌合病毒的感染性和增殖性超過了只有一個再次變異(只有第二變異)的其對應(yīng)體的感染性和增殖性。并且，修飾病毒的基因組用于展現(xiàn)另外的肽時，病毒粒子的感染性和增殖性都大于野生型病毒表達同一肽的情況。所以，本發(fā)明提供了產(chǎn)生在植物體上比同源的野生型CPMV載體具有更高的增殖性的改良病毒載體的方法。
相應(yīng)地，在一些實施方案中，本發(fā)明也提供了包含第二位點和第三位點變異的載體，該載體增強了包含表位插入點的病毒粒子的感染性，并且提供了選擇這種突變的方法。在一些實施方案中，變異是在VP-S中，而在其他的實施方案中，變異是在VP-L中。七種第二位點變異和兩種第三位點突變在下表2中予以說明。相應(yīng)地，本發(fā)明也提供了包含多種變異病毒載體的載體庫，可以選擇用于表位表達。對這些突變的詳細的選擇和區(qū)分方法提供在實施例12中。

本發(fā)明不限定于特定的作用機制。實際上，對發(fā)明機制的理解對于使用本發(fā)明是不必要的。不過，多數(shù)的突變氨基酸可能涉及分子內(nèi)部蛋白-蛋白相互作用。Phe91位于兩個相鄰的VP23分子的界面上。F91S突變無疑削弱了這種作用。Phe180位于VP23和VP37分子的界面上，并且與Phe2045和Ala2047作用。F180L突變抑制這種相互作用。Met177與VP37的羧基端的Arg97的側(cè)鏈具有疏水性的相互作用。M177V和M177T突變都可以使這種相互作用不可能發(fā)生。Arg2102可能在空間位置上與相鄰的VP37分子的氨基端靠近。存在與E2121的分子間的相互作用，但是當R2102K的突變發(fā)生時，該作用就不可能了。但是，一些突變殘基內(nèi)藏于外殼蛋白之一中，結(jié)構(gòu)后果更難預(yù)測。對至少一些這種突變的一種可能的解釋是對降低了粒子穩(wěn)定性而言，需要這種突變確保有效的病毒脫殼作用。由于VP-S的氨基端形成了環(huán)狀面，插入的表位可以與另一個表位作用，穩(wěn)定病毒粒子。似乎是一些表位比其他的表位在此方面具有更強的趨勢。所以，第二位點突變具有明確的用途。在本發(fā)明的一些實施方案中，突變可用于就其本身而言不具有感染性的構(gòu)建中(例如，pSEN2，參考上面的表2)。推測認為這增加了新插入位點的應(yīng)用可能性的范圍。相應(yīng)地，一種有用的方法是用所有已經(jīng)觀察到的第二位點和第三位點突變產(chǎn)生載體庫，新的表位可在其中克隆。然后，在一些實施方案中，對最可行的載體的選擇可在植物體上實現(xiàn)。
4.與外部表位的聯(lián)合表達本發(fā)明也包括在病毒衣殼的內(nèi)部和外部都表達表位的病毒粒子和編碼這種病毒的載體。這些病毒粒子被稱為雙展示嵌合病毒粒子(ADCVP)。本發(fā)明不限制于任何一種特定的作用機制。實際上，對機制的理解對本發(fā)明的實施不是必要的。不過，推想在病毒粒子上的T細胞和B細胞表位共同表達可以導致對B細胞表位的免疫反應(yīng)的增強。相應(yīng)地，在一些實施方案中，本發(fā)明包含在病毒衣殼的外部表達B細胞表位和在病毒衣殼的內(nèi)部表達T細胞表位的病毒粒子(或者編碼病毒粒子的載體)。在一些優(yōu)選的實施方案中，病毒粒子是CMPV，并且T細胞表位插入到VP-S的氨基端。仍在更進一步的實施方案，T細胞表位是插入Y11或V10Y11的重復(fù)體之間，并且B細胞表位是插入VP-S的βBβC環(huán)、βB’βC”環(huán)或羧基端或者VP-L的βEβA環(huán)。ADVCP的實施例提供在實施例7中。
C.修飾病毒粒子的用途本發(fā)明中的載體和病毒粒子具有許多用途。在一些實施方案中，病毒粒子用于在動物體內(nèi)誘導免疫源性或抗原性反應(yīng)。所以，病毒粒子在保護動物，包括人，抵抗由病原引起的疾病中有用處。在其他實施方案中，發(fā)現(xiàn)粒子可用作腫瘤疫苗。在進一步的實施方案中，病毒粒子用于制作疫苗組合物。在優(yōu)選的實施方案中，疫苗組合物包括修飾病毒粒子和佐劑(例如，QS-21)。然后將疫苗如同本技術(shù)領(lǐng)域所知那樣施用于動物。
下述的所有實驗中使用的載體是pCP26。該載體是衍生自描述于(Dalsgaard等人，Nat.Biotech.15，248-252 )中的pCP7，其構(gòu)成為可購買到的載體Bluescript p BS SK+(Stratagene，CA)，其已經(jīng)克隆進一個盒式結(jié)構(gòu)，該盒式結(jié)構(gòu)包括連到一個相對于感染性CPMV的RNA2的cDNA分子上的來自CAMV 35S的組成性啟動子，該cDNA中編碼氨基端的24個氨基酸的核苷酸已被刪除，并且引入產(chǎn)生Pst I限制性內(nèi)切酶位點的突變nt3295(T→A)。在載體的主鏈序列中，設(shè)計了下面的點突變以便產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點Eco47III(在nt960位發(fā)生T→C)和Sal I(在nt1005位發(fā)生T→C)。在Sal I和Kpn I之間的多位點連接序列已被刪除。由于在本構(gòu)建體中，多位點連接序列的大部分已經(jīng)去除，所以，靠近Nhe I位點的單一EcoO 1091限制酶切位點用于在VP-S的βBβC-環(huán)中的插入位點。這一點顯示在

圖1中，該圖表明在CPMV的VP-S的Tyr11的重復(fù)體中插入表位的克隆戰(zhàn)略。這兩個限制位點用于插入編碼多種表位的寡核苷酸。
除非有其他的申明，在下面所述的實施例中，用編碼嵌合病毒粒子的cDNA接種宿主植物的過程是基本上按照(Daisgaard等人，見上，和Dessens&Lomonossoff，基因病毒學雜志(J.Gen.Virol.)74，889-892 )概要描述的方法進行。為了在CPMV的VP-S上同時結(jié)合表達氨基端+表面表位，每個在不同插入位點編碼一個表位的兩種質(zhì)粒用Nhe I和BamHI消化，導致產(chǎn)生1.3kb和5kb的片段。較小片段包括編碼VP-S的氨基端的序列，較大片段包括編碼VP-S的βBβC環(huán)、βB’βC”環(huán)或羧基端的序列。通過純化包括插入表位的片段并使用標準分子生物學技術(shù)將它們連接起來可以獲得包括多個表位的構(gòu)建(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.&Matiatis，T.分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社 )。
實施例1本實施例說明在病毒衣殼的內(nèi)表面上肽的表達。尤其是，來自乙肝病毒表面抗原的a組決定簇的模擬位的肽被插入到CPMV的VP-S中。來自針對乙肝病毒表面抗原(HbsAg)的抗獨特型單克隆抗體的序列，AVYYCTRGYHGSSLY(SEQ ID NO33)，和來自同一序列(GYHGSSLY；SEQ IDNO34)的高度疏水性的的八聚體被報道在發(fā)動用乙肝病毒表面抗原本身的一個“a”組決定簇產(chǎn)生的同類免疫反應(yīng)上是有效的(例如參見，美國專利5,531,990；5,744,135和5,856,087，在此引述它們作為參考)。相同的肽產(chǎn)生乙肝病毒特異性T輔助細胞反應(yīng)。所以，稱為2F10及其衍生物是a組決定簇的模擬位。來自2F10的十五聚體和八聚體可以表達在CPMV粒子的外表面。八聚體表達于VP-S的βBβC-環(huán)和VP-L的βEβA-環(huán)中(Brennan等人，微生物學145211-220 )，產(chǎn)生的嵌合粒子依次稱為，HBV7和HBV14。在接種時，該嵌合粒子都具有在豇豆植物中啟動感染的能力。十五聚體可被不同地表達在VP-S的βBβC-環(huán)中，以便產(chǎn)生已知的構(gòu)建HBV2；在VP-S的羧基端，以便產(chǎn)生HBV8；以及在VP-L的βEβA-環(huán)中(HBV3)。對這三種構(gòu)建，癥狀限制在接種的葉子中，即使將純化病毒傳代到其他植物。換句話來說，在具有啟動生活感染周期的群體內(nèi)，嵌合病毒對植物沒有選擇性。
為克服技術(shù)限制，兩種肽都作為在VP-S的氨基端的獨特插入物進行表達。八聚體(HBV 15)和十五聚體(HBV 16)是插入到Tyr 11和Ser 12之間。因為氨基端牽扯在病毒多蛋白蛋白水解酶的結(jié)合作用中，據(jù)認為至少需要十個氨基端的氨基酸，所以選擇了該位置。因此，將外源肽插入VP-S的氨基端的期望結(jié)果是避免去除蛋白酶的結(jié)合作用，以便執(zhí)行它的功能。假定天然氨基端結(jié)構(gòu)域在第11位存在酪氨酸殘基，似乎重要的是在相鄰的氨基酸模體中保持這種殘基的存在。由于這些肽本身是以酪氨酸殘基終止，所以在這種情況下對于內(nèi)部表達它們而言，Tyr11的重復(fù)體是不必要的(也參見下面的實施例2)。在所有用cDNA接種的植物體上，HBV 15在宿主植物上產(chǎn)生的癥狀不能與野生型CPMV感染產(chǎn)生的癥狀區(qū)分開來。按照Daisgaard等人，見上，的CPMV標準純化方法純化62g的葉子所得的粒子產(chǎn)量是64.5mg。用cDNA接種，HBV16在5個植物中的3個上產(chǎn)生癥狀。但是，在用首次感染周期純化而來的病毒對植物的隨后接種中，觀察到與野生型感染相當?shù)陌Y狀。按照CPMV標準純化方法(如上所述)，從這些植物純化病毒的產(chǎn)量是23g獲得13mg(0.57mg/g植物材料)。兩種病毒都在15％變性聚丙烯酰胺凝膠上分析。小外殼蛋白不表現(xiàn)出如同有時展示在CPMV的表面環(huán)中的內(nèi)部肽的裂解現(xiàn)象。
實施例2本實施例說明對應(yīng)于來自Plasmodium berghei的環(huán)子孢子蛋白的CTL-表位(MAL 7)的疏水性肽的表達和內(nèi)部展示。P.berghei是人類瘧疾的一種單細胞原生動物致病原因。相對于來自環(huán)子孢子蛋白的一個表位的肽，具有SYIPSAEKI的氨基酸序列，可以在VP-S的βBβC-環(huán)中表達(產(chǎn)生稱為Mal 4的嵌合病毒粒子)，和在VP-S的羧基端的兩個不同位點表達(依次產(chǎn)生Mal 5和Mal 6)。相同的肽可以表達在VP-S的氨基端，位于蛋白(Tyr11；參考實施例1)中的第11位點的酪氨酸殘基的重復(fù)體之間。該構(gòu)建被稱為MAL 7。在將編碼修飾的CPMV MAL 7的cDNA接種到宿主豇豆植物的葉子之后的起始階段，構(gòu)建體不產(chǎn)生全身癥狀。但是，21天后，五株植物的兩株的初生葉上出現(xiàn)了清晰可見的局部病變，表明通過接種的嵌合病毒粒子介導的感染已被建立。從這些局部病變純化的病毒直接轉(zhuǎn)移到兩組年輕的豇豆植物上，每組三株。局部病變五天里可以看到，一周里隨后的全身癥狀出現(xiàn)了。這種明顯改善的存活能力似乎表明從其基因組發(fā)生全程突變的群體中篩選病毒。在第二次接種兩組豇豆植物8天后，從純化的病毒中分離RNA，進行反轉(zhuǎn)錄-PCR，并且對所得的cDNA測序。分析結(jié)果表明存在一個點突變，這種情況在兩組植物中獨立發(fā)生，在每種情形中通過對反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA的正負鏈的測序予以證實。但是，逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象在分離的病毒中并非100％，因為在此位點，在來自每種分離物的自動測序器的色譜中，觀察到兩種核苷酸的混合物。但是，明顯地，在每種情況下，核苷酸的序列中的一個腺嘌呤變成了鳥嘌呤，導致在氨基酸水平上肽中的Glu變成Gly的突變。在接種3周后，分析植物的頂部葉片，病毒基因組的混合物仍然存在，但是通過分析色譜圖判斷突變的基因組存在量明顯大于原始序列。這表明突變的VL-P在宿主體內(nèi)啟動和進行病毒的全身傳播的能力上比未突變的嵌合病毒具有競爭優(yōu)勢。由于肽的突變序列，本構(gòu)建不能用于有關(guān)表位的免疫分析。但是，它例示了肽系統(tǒng)內(nèi)部化的兩個要素。首先，證實在CPMV的基因組的天然序列中酪氨酸殘基的重復(fù)體之間插入外源肽的使用。在一些情況下，這對于保持病毒多蛋白蛋白酶的推定結(jié)合位點是必須的。第二，證實了體內(nèi)選擇改變的嵌合病毒粒子的能力，該病毒粒子的特性使它們能在豇豆植物體內(nèi)感染和全身傳播。在特定情況下，重組病毒基因組的改變直接影響了插入的外源肽本身。突變影響在CPMV的外部展示的肽可在植物體內(nèi)的選擇壓力增加的實例中看到，因為肽具有的使總的衣殼蛋白殼的pI(參看定義部分)不平衡的電荷性質(zhì)。這里所述的結(jié)果并非預(yù)期結(jié)果，因為存在于內(nèi)部化肽的推理是一旦肽分布于病毒粒子的內(nèi)部，討論的肽本身的表面電荷將不是一種限制因素。下面的實施例發(fā)現(xiàn)了在CPMV嵌合粒子內(nèi)內(nèi)部化肽的完整非預(yù)期序列。
實施例3本實施例表明在嵌合病毒基因組中的全程突變的體內(nèi)產(chǎn)生和隨后的分離，這給在內(nèi)部表達MAL 7肽的CVP的感染進程和全身擴散中的同源野生型嵌合病毒基因組賦予了選擇性優(yōu)勢。另人驚奇的是，在(上面的)實施例2中描述的突變嵌合體，在重組病毒啟動和進行一個“自然的”感染周期上，包括在宿主植物體內(nèi)的全身性傳播，是可行的。但是，在期望通過選擇壓力消除任何結(jié)構(gòu)限制的努力中，可以導致在上面所述的MAL 7中報道的突變中的插入位點得以改變。檢查晶體結(jié)構(gòu)的溫度因素，發(fā)現(xiàn)Val10是處于一種相對剛性的構(gòu)型中，而殘基Asp9則是非常柔韌的。這意味著可能重復(fù)Val10Tyr11，以便在保留蛋白酶的結(jié)合位點的同時，將MAL 7肽內(nèi)的潛在去穩(wěn)定性的帶電殘基轉(zhuǎn)移到VP-S氨基端中相對于原始的Val10Tyr11朝向有更多羧基端的位置。所產(chǎn)生的嵌合體稱為MAL 8。
在一項單獨的研究中，MAL 8構(gòu)建用于感染宿主豇豆植物。首次感染的概況如同實施例2中的MAL 7一樣。詳細而言，用編碼MAL 8的cDNA接種的五株植物在21天后，有一株表現(xiàn)出一個局部病變，這就表明存在沒有明顯全身傳播病毒的局部感染。從局部病變純化的病毒用于接種新鮮豇豆植物。5天后，在植物體全身性傳播嵌合病毒的癥狀檢測到了。這是感染性提高的標志，最可能是病毒基因組突變的后果。從第二輪用MAL 8感染的感染物中分離的病毒的基因組用反轉(zhuǎn)錄-PCR譯成的cDNA，沿著兩條鏈測定編碼VP-S的基因序列。在核苷酸位點2931處的一種全程突變得以檢測，將胸腺嘧啶變成了胞嘧啶殘基，所以，產(chǎn)生了第191位苯丙氨酸變成絲氨酸的氨基酸變化。這種非保守改變是發(fā)生在小外殼蛋白，VP-S的一個位點，該位點是位于病毒粒子的相鄰VP-S蛋白之間的界面上。這種突變明顯允許內(nèi)部表達了肽的嵌合CPMV粒子的體內(nèi)裝配和全身性的擴散。這些數(shù)據(jù)表明使用內(nèi)部表達同樣肽的嵌合病毒粒子可以篩選不同的全程突變，該全程突變可以允許在植物體內(nèi)裝配的嵌合病毒粒子具備內(nèi)部表達外源肽和啟動對豇豆植物的感染和在其體內(nèi)進行全身傳播。這進一步證實在病毒粒子內(nèi)的突變定位和推想由插入肽產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)限制驅(qū)動的突變定位在一定程度上依賴于所用的精確插入位點，而不僅僅依賴于肽本身。
實施例4本實施例表明在嵌合病毒基因組中的全程突變的體內(nèi)產(chǎn)生和隨后選擇，其在感染進程和全身擴散內(nèi)部表達肽的嵌合病毒粒子方面，具有的選擇優(yōu)勢大于相同的野生型嵌合病毒基因組。為了排除實施例2和3所述的現(xiàn)象被限制于內(nèi)部表達瘧疾肽的嵌合病毒的可能性，接著使用一種方法選擇其中推想發(fā)生了第二位點突變的內(nèi)部表達肽的嵌合病毒粒子。允許生活力(意思是在植物體裝配進入重組病毒粒子)，感染性，全身傳播或增殖力提高的突變可以按照如下所述的方法篩選。為了說明本方法，富集和篩選方法參考一種肽進行描述，該肽是APGNYPAL，是指一種來自Sendai病毒的核蛋白體的一種CTL表位。簡單地說，cDNA被基因工程去編碼一種嵌合病毒粒子，其中肽(APGNYPAL，SEQ ID N010)插入到酪氨酸殘之間，依次是曾經(jīng)插入到CPMV的VP-S中的肽的氨基端第11位和羧基端的第20位。第20位的酪氨酸代表天然的VP-S的第11位酪氨酸的重復(fù)體，被用于保持推想的多蛋白蛋白酶的結(jié)合位點(如前所述)。所得構(gòu)建稱為pSEN 1。
在用SEN 1接種宿主豇豆植物后，病毒感染癥狀慢慢表現(xiàn)出來。在18天后，五株接種的植物中只有一株出現(xiàn)可見的全身感染。其它四株的癥狀限于接種葉片的局部病變。從感染限定于葉片局部病變的所有四株植物體分離病毒粒子，分離自一個單一的病變。分離到植物體外的病毒基因組RNA用反轉(zhuǎn)錄-PCR反轉(zhuǎn)錄。隨后對所產(chǎn)生的cDNA兩條鏈進行測序表明分離自所有四株植物的病毒基因組包含未經(jīng)變化的序列。再過7天后(感染25天后)，接種的5株植物中有3株觀察到全身癥狀。從發(fā)生全身癥狀的葉子上純化病毒，將其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄。所得cDNA的序列分析表明在核苷酸3199處發(fā)生了一個全程突變，將鳥嘌呤變成了野生型的胸腺嘧啶。結(jié)果，亮氨酸殘基摻入小外殼蛋白(VP-S)的180位，取代了苯丙氨酸。這種突變的基因組序列與使用內(nèi)部表達來自Sendai病毒的肽的嵌合病毒粒子對豇豆植物的成功感染有關(guān)。這將植物病毒-宿主相互作用的廣大用途例示作為一種富集和選擇編碼具有容納表達于衣殼內(nèi)部的外源肽的能力的嵌合病毒粒子的新的CPMV基因組的動態(tài)方法。與實施例2和實施例3放在一起，本實施例說明體內(nèi)選擇過程可以起作用，并用于內(nèi)部表達了多種不同肽的嵌合病毒粒子；因此允許較好感染性和嵌合病毒粒子全身傳播的突變可以在CPMV的小外殼蛋白的許多不同位點發(fā)生。
實施例5本實施例說明內(nèi)部表達來自淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)的CTL表位。上面概述的實施例說明具有對在嵌合病毒粒子外部表達不利的生理-化學特性的肽可以內(nèi)部表達。但是，可能的是對于可以插入并在CPMV病毒粒子的內(nèi)部表達的肽存在大小限制。所以，適合于內(nèi)部表達的外源肽在長度上不可能大于20個殘基(雖然實驗式實驗可以發(fā)現(xiàn)更長的具有內(nèi)部分布能力的肽并不是不可能的)。在這個尺寸范圍的肽的一類是所謂的細胞毒性T細胞淋巴細胞(CTL)表位。重要的是，CTL表位，除了在長度上為6-9個殘基，是構(gòu)型獨立的。實際上，存在有力的證據(jù)表明CTL表位以線形表位發(fā)揮作用。所以，這種表位應(yīng)該高度適合于內(nèi)部插入嵌合病毒粒子中。在淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒發(fā)現(xiàn)了一種此種表位(RPQASGVYMGNLTAQ；SEQ ID NO6)。當展示在嵌合病毒粒子的外部時，該序列由于它的高的正電荷產(chǎn)生了一些問題。所以，三個多余的氨基酸(谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)被加到其氨基端，以便努力產(chǎn)生一種當其在嵌合病毒粒子的外部表達時，具有較中性表面的肽。由于嵌合病毒粒子的內(nèi)在的不穩(wěn)定性，所以用這種特定構(gòu)建感染宿主豇豆植物所產(chǎn)生的癥狀是可變的，并是不可預(yù)測的。并且，外部展現(xiàn)的表位存在嚴重的裂解，在老鼠中，不能測量到與這種嵌合病毒粒子的T細胞特異反應(yīng)。為了證實CTL表位構(gòu)成了能在CVPS內(nèi)部表達的外源肽中的重要一類，編碼這種淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的已知CTL表位(RPQASGVYMGNLTAQ；SEQ ID NO6)的DNA被插入到VP-S的氨基端中。
同樣的表位(沒有附加的氨基酸Glu，Gly和Ala)被插入VP-S的氨基端，插入位置位于Tyr11和緊接于被稱為LCMV2的構(gòu)建中的小外殼蛋白中的外源蛋白下游的重復(fù)酪氨酸殘基之間的一個位置。DNA接種導致5個被接種植物中有3個表現(xiàn)病毒癥狀。RT-PCR分析和隨后對產(chǎn)物cDNA的測序證實嵌合構(gòu)建的序列未變，并與接種進植物體的一致。病毒產(chǎn)量是從29g葉子制備25mg病毒。用15％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析證實正如對內(nèi)部化的肽所期望的那樣，LCMV肽上沒有裂解。所以，這說明代表表位中的一類大而免疫上重要的類型的肽，細胞毒性T淋巴細胞表位(CTL)，可以在嵌合病毒粒子的內(nèi)部表達。而且，同樣的特定肽進一步證實在嵌合病毒粒子上實現(xiàn)帶正電肽的內(nèi)部化表達代表解決具有這種性質(zhì)的肽外部表達的嵌合病毒粒子的潛在的不穩(wěn)定性和行為上的不可預(yù)測性的技術(shù)方案。而且，這表明長度是15個氨基酸殘基的肽可以成功地容納在嵌合病毒粒子的內(nèi)部，而不需要第二個位點的突變。
實施例6本實施例說明內(nèi)部表達在嵌合病毒粒子上的CTL表位的免疫效率。嵌合病毒粒子構(gòu)建如上所述，LCMV2，在粒子的內(nèi)部表達了一個淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的CTL表位，被用于免疫老鼠。在0天和第14天，用200ug進行皮下注射，包含或不包含佐劑，QS-21。作為對照，野生型的CPMV也接種到實驗動物中，包含或不包含佐劑，QS-21。在第42天，取出脾臟；8天后進行CTL分析(參考免疫學最新方法，第一卷，第3.11.4部分及其后)。用QS-21中的LCMV2感染老鼠，從中純化細胞毒性T細胞，促進高達46％的靶細胞裂解(圖2)。在缺乏佐劑的情況下，沒有看到對LCMV2的CTL反應(yīng)。在用野生型CPMV接種的老鼠中，有或沒有佐劑，沒有觀察到特異性的CTL反應(yīng)。除了CTL反應(yīng)，從純化自注射了LCMV2的老鼠脾臟的細胞中，觀察到非常強的表位特異性T-輔助細胞反應(yīng)。從LCMV2構(gòu)建的免疫性能，可以清楚的知道具有在粒子的內(nèi)面展示肽的CVPC可以誘導針對特定肽的CTL反應(yīng)和強的肽-特異性T-輔助細胞反應(yīng)。但是，用MAL8、VSV1或SEN1免疫的老鼠中，沒觀察到CTL反應(yīng)。這在抗原提呈細胞中的表位加工中存在困難。
實施例7
本實施例說明雙展示嵌合病毒粒子(ADCVPs)的合成，它是在一個病毒粒子上同時在外部和內(nèi)部表達表位的單一嵌合病毒粒子。在穩(wěn)定的嵌合病毒粒子的內(nèi)部表達肽的能力和在穩(wěn)定的嵌合病毒粒子的外部表達較大的肽的能力(分別地)一起提出了在一個粒子上表達至少兩個同時展現(xiàn)的肽一個在內(nèi)部，另外一個在外部。特別是，內(nèi)部存在T輔助細胞表位可以加強在同一個病毒粒子的外部共同表達的其它表位的免疫反應(yīng)。為了檢驗這種認識，使用了主要在實體瘤細胞上發(fā)現(xiàn)的與多態(tài)上皮細胞粘蛋白的變體形式有關(guān)的表位(GVSTAPDTRPAPGSTA；SEQ IDNO35)。嵌合病毒粒子中該表位的免疫概況已被很好的總結(jié)了其特征。在動物模型中有反應(yīng)的肽的聯(lián)合體通過對CPMV基因組的分子遺傳操作插入到選定的位點。迄今為止，已經(jīng)建立了作為VP-S中可行插入點的三個外部位點以便用于在嵌合病毒粒子的外部展示肽βBβC環(huán)、βB’βC”環(huán)和羧基端；而嵌合病毒粒子的第四個外部插入位點是呈現(xiàn)在VP-L的βEβA環(huán)中。為了檢驗內(nèi)部結(jié)合表位和與外部表達在單個的嵌合病毒粒子上的表位的有效性，聯(lián)合體制備總結(jié)在下表3中。

下述的構(gòu)建誘導了好的癥狀(參考前邊)MUC39、HCG16、MUC41、MUC42和MUC47。這些結(jié)果表明在VP-S的βBβC環(huán)或βB’βC”環(huán)中插入物可以與VP-S的氨基端的小(8個氨基酸)的插入物最有效結(jié)合，該小插入物在范圍如上說明的適合于內(nèi)部嵌合病毒粒子的插入物大小。但是，在已經(jīng)建立的插入物大小的范圍內(nèi)，VP-S的羧基端的插入物明顯不如氨基端的插入物大小敏感。
實施例8本實施例說明雙嵌合病毒粒子在誘導特定的T-輔助細胞反應(yīng)上的免疫效率。一個在氨基端的T細胞輔助表位在免疫反應(yīng)上對一個插入其它地方的B細胞表位的刺激效應(yīng)可以通過免疫比較加以研究，比較對象是外部表達內(nèi)部表達相同的T輔助細胞表位的兩種不同的雙展示粒子的T輔助細胞表位的嵌合病毒粒子與不同的B細胞表位的結(jié)合。HBV15是在內(nèi)部位點表達來自2F10肽的八聚體的嵌合病毒粒子(參看上面的實施例1)；MUC39內(nèi)部表達了與實體瘤相關(guān)的來自人變體粘蛋白的肽一起表達的八聚體，MUClp(MUC14)外部表達在βBβC環(huán)中；而MUC42同時在VP-S的羧基端內(nèi)部表達了相同的2F10模擬位和外部表達了衍生自MUClp的肽(MUCL)(參看前述的實施例7)。
在0天和第21天，用5pg置于QS-21中的HBV15、MUC39或MUC42在QS-21存在的情況下免疫三組老鼠，每組5只。在第21天，28天和42天收集血清，并用ELISA檢測同時具有2F10和MUCI特異性的抗體。對粘蛋白肽的特異抗體的滴定平均值總結(jié)于表4中。

在每個時間點，用CPMV-MUC39免疫的老鼠產(chǎn)生的抗-MUC抗體滴定值(約高一個稀釋度)高于用CPMV-MUC14免疫老鼠的滴定值，這揭示出T-輔助細胞表位可能存在對抗-MUC B細胞反應(yīng)的刺激效應(yīng)。對于用CPMV-MUC42免疫的老鼠而言，五個中的一個產(chǎn)生了MUClp特異性的抗體而當2F10不與T-輔助細胞表位共表達時，沒有老鼠產(chǎn)生MUC1特異性抗體。在第28天，反應(yīng)是中等程度的；到第42天，滴度下降了。所以，T-輔助細胞表位，在2F10的存在的情況下，可以強化對B細胞表位的反應(yīng)，例示在Muclp肽中。
當檢測2F10特異性的T細胞反應(yīng)(表5)時，將用CPMV-MUC39免疫的老鼠所得的脾臟細胞進行增殖以便與2F10肽反應(yīng)。與由MUC42構(gòu)建所誘導的Muclp肽特異性抗體相對較低水平一致，在本項分析中，2F10肽對特定細胞毒性T細胞的增殖沒有明顯的刺激效應(yīng)。

這些數(shù)據(jù)表明用CTL表位對免疫反應(yīng)的共刺激作用可以用于啟動對共存在的、但是不相關(guān)的肽的增強反應(yīng)。
實施例9本實施例說明通過在插入肽位點以外的其它位點篩選進一步的再次突變表達和內(nèi)部化強有力的通用T-輔助細胞表位。從破傷風類毒素(VDDALINSTKIYSYFPSV；SEQ ID NO15)衍生而來的T-輔助表位已知與多種生物體中和相應(yīng)廣大的單模標本范圍內(nèi)具有一種強有力免疫刺激效應(yīng)。為了進一步增強CPMV作為表位提呈系統(tǒng)的免疫源特性，破傷風類毒素可以被整合進嵌合病毒粒子中。為了實現(xiàn)這個目的，VP-S的第十位纈氨酸(Val10)被表位本身所取代。由于破傷風類毒素表位是以纈氨酸開始和結(jié)束的，所以突變的病毒氨基端缺失10個“天然”氨基酸，該10個氨基酸似乎足以保持推想的多蛋白蛋白酶結(jié)合位點。這種方法產(chǎn)生的構(gòu)建稱為TT4。在將cDNA直接接種進豇豆植物后，Daisgaard等人，見上，TT4構(gòu)建從第14天起在接種的葉子上以局部病變的形式表現(xiàn)出感染的癥狀。宿主植物的全身感染不會發(fā)生。從這些局部病變中純化的病毒在第二輪感染中，直接接種到年輕的豇豆植物上。在感染的5天內(nèi)，就可看到局部病變；再過7天，全身感染清晰可見。所有時期的增殖力都提高表明在病毒基因組中的再次突變的病毒群中出現(xiàn)了選擇。在第二次接種10天后，純化病毒，分離RNA，進行反轉(zhuǎn)錄-PCR，對所得的cDNA測序。分析顯示了幾個單點突變，通過cDNA測序證實該單點突變在反義鏈上。總而言之，在不同的克隆中，觀察到六個再次突變-G2388A，其導致在VP-L蛋白中存在一個Arg2102Lys突變。(這個突變被發(fā)現(xiàn)在三個分別的克隆中出現(xiàn)。)；-A3188G，導致VP-S蛋白中一個Met177Val突變；-A3029G，導致VP-S蛋白中一個Ile124Val突變；和-G2388A，導致VP-S蛋白中一個Ile2045Met突變。
為了檢測是否這些突變是足以在首次感染中使TT4構(gòu)建失去感染性，3種新的構(gòu)建被制備出來用作載體骨架的新的嵌合病毒粒子基因組，依次包含G2388A(在VP-L中Arg2102Lys)、A3188G(在VP-S中Met177Val突變)、A3029G(Ile124Val)。接種了這些新克隆的植物在接種6天后，表現(xiàn)出感染的局部癥狀；再過4天，表現(xiàn)出全身癥狀。這是一個清楚的跡象單個第二點突變足以使修飾的TT4構(gòu)建失去感染性。
本構(gòu)建物提供了在CPMV的內(nèi)表面上表位插入物的幾種特性的演示。首先，它表明T輔助細胞和CTL表位可以作為嵌合病毒粒子的內(nèi)部分布肽展示。并且，清楚的說明為產(chǎn)生能夠在植物體啟動增殖感染嵌合病毒粒子，Tyr11不必復(fù)制。在CPMV的氨基端自然發(fā)生的10個氨基酸的存在對增殖和感染性是充分的。同樣清楚的是存在幾種不同的極大地提高在CPMV的VP-S的氨基端插入表位的構(gòu)建的增殖性的第二位點突變，這些突變可以發(fā)生在VP-S本身或VP-L中(大外殼蛋白)。特定的突變是單獨發(fā)現(xiàn)在分別的克隆中的事實強調(diào)，一定的第二個點突變比其它的突變更容易選擇。這代表了一種在病毒載體中區(qū)分突變熱點的方法，這些病毒載體在產(chǎn)生新的能產(chǎn)生新的嵌合病毒粒子以便展示多種外源肽的嵌合病毒粒子克隆載體中有用途。
實施例10本實施例闡明了來自破傷風類毒素的強有力的通用的T-輔助細胞表位與插入在CPMV外面的VP-L環(huán)中的B細胞表位的結(jié)合表達和內(nèi)部化。由于破傷風類毒素是一種通用的T-輔助細胞表位，所以值得研究如實施例9所述的在CPMV的內(nèi)部聯(lián)合展示這種肽的可能性，使得它與在嵌合病毒粒子的外部表面呈現(xiàn)表位的單個的病毒粒子上共表達。為達到這個目的，制造了一種構(gòu)建，其中兩個來自Pseudomonas aeruginosa的肽依次插入VP-L的B結(jié)構(gòu)域的βEαB環(huán)中(膜外蛋白肽9和10，TDAYNQKLSERRAGADNATAEGRAINRRVEAE；SEQ ID NO36；Brennan等人，見上)，而破傷風類毒素表位是插入到VP-S的氨基端。這種構(gòu)建稱為pPAE14。在cDNA直接接種豇豆植物后，PAE14構(gòu)建在14天后表現(xiàn)出感染癥狀(在接種葉片上出現(xiàn)局部病變)。但是，宿主植物的全身癥狀沒有出現(xiàn)。從這些局部病變純化的病毒直接轉(zhuǎn)移到年輕的豇豆植物上，以便啟動二次感染。5天內(nèi)，看到局部病變；一周內(nèi)，隨后的全身癥狀出現(xiàn)了。這表明篩選了其基因組增加了一個再次突變的新病毒。在接種第二組豇豆植物10天后純化病毒，提取RNA用于反轉(zhuǎn)錄-PCR，并對所得cDNA測序。分析顯示群體中存在幾種單點突變，并通過cDNA的相對鏈的測序予以證實。在不同克隆中觀察到的突變是-A3029G，導致VP-S蛋白中Ile124Val突變(參考，實施例9，其中在相同位點發(fā)生了不同的突變)；和-T3189C，導致Met177Thr突變(如上所述，在實施例9中報道了一種發(fā)生在相同位置的不同突變)。
這個實施例表明在嵌合植物病毒，例如CPMV的內(nèi)部表達一個表位，同時與在VP-L中的一個表位結(jié)合使其在外部提呈是可能的。觀察到的第二位點突變表明，對不同的構(gòu)建而言，相同的突變可以被發(fā)現(xiàn)(例如，在實施例9和此處的A3029G)；那樣選擇的不同突變可以在一個單一的氨基酸位點發(fā)生，導致感染性明顯增強的嵌合病毒粒子的產(chǎn)生。
實施例11本實施例闡明了來自破傷風類毒素的強有力的通用的T-輔助細胞表位與插入在CPMV外面的VP-S環(huán)中的B細胞表位的結(jié)合的表達和內(nèi)部化。由于有可能通過使用VP-L的B結(jié)構(gòu)域的βEαB環(huán)(實施例10)將在CPMV的內(nèi)表面表達通用的T-輔助表位與在病毒的外表面表達表位結(jié)合起來，所以值得探索將傷風類毒素表位的表達與在VP-S的βBβC環(huán)中的表位表達結(jié)合起來。用乙肝病毒的2F10模擬位的相似方法在實施例7中予以描述。
所以，制造了一種構(gòu)建，其中破傷風類毒素表位如實施例9所述插入到VP-S的氨基端，而粘蛋白-肽(GVTSAPDTRPAPGSTA；SEQ ID NO37)插入到VP-S的βBβC環(huán)中，位于基本上如同在Daisgaard等人，見上中所述的Ala22Pro23之間。該構(gòu)建被稱為pMUC51。在將cDNA接種到豇豆植物之后，MUC51不表現(xiàn)出任何感染癥狀，甚至在21天之后。由于這一原因，制備了一種與pMUC51相同的cDNA構(gòu)建，除了如同實施例9所報道的第二位點突變(A3188GMet177Val)被編碼進嵌合病毒載體中。新的構(gòu)建稱為pMUC53。在將cDNA接種到豇豆植物之后，MUC53直到第14天才表現(xiàn)出感染癥狀。宿主植物的全身感染沒有發(fā)生。從局部病變純化的病毒直接轉(zhuǎn)移到年輕的豇豆植物上以便啟動第二輪感染周期。這很可能表明在病毒基因組上篩選進一步的突變。從接種10天后的植物上分離病毒，用反轉(zhuǎn)錄-PCR將基因組RNA轉(zhuǎn)譯成cDNA。對互補鏈都進行序列分析證實發(fā)生了進一步的突變-G2357A，導致在VP-L中發(fā)生了Ala492Thr；和-G2898A，導致在VP-S中發(fā)生了Gly80Asp。
這些實驗表明表位內(nèi)部化的幾種有用的特征。清楚的是它可能將在VP-S的βBβC環(huán)中的表位插入物與VP-S的氨基端的表位結(jié)合起來，即使后一表位在長度上是18個氨基酸殘基。并且，它表明在一些情況下，單獨的第二位點突變不足以產(chǎn)生感染性的構(gòu)建，若非第三位點突變需要被選擇以便提供能夠啟動感染能力的嵌合病毒粒子。選擇如此高級次序的突變和第二位點突變的方法是在下面的實施例12中公開的。
實施例12下面的實施例介紹了篩選能夠?qū)崿F(xiàn)肽內(nèi)部化和雙展示的新的嵌合病毒粒子基因組的方法。參考前面的實施例給我們提示，用野生型嵌合病毒粒子作為載體，體內(nèi)篩選能內(nèi)部容納反映內(nèi)在化和雙展示肽的新的植物病毒粒子。所以，下述方法或其變體可以用于篩選新的嵌合病毒粒子載體。
1.通過連接兩個或更多的雜交寡核苷酸或外源DNA片段，一個編碼肽的序列克隆進一個編碼CPMV-RNA(例如，pCP7或pCP26)的感染性的cDNA分子中?？梢詰?yīng)用相鄰于編碼VP-S的氨基端的序列的限制酶切位點(例如，唯一的Nhe I和Eco01091位點)。肽插入的確切位置優(yōu)選在Val10和Tyr11之間，在Val10Tyr11的重復(fù)體之間，或者在Tyr11的重復(fù)體之間。也可能使用其中已經(jīng)插入肽的cDNA克隆(例如，VP-S的βBβC環(huán))，以便幾個表位可以同時在一個粒子上編碼和提呈。
2.在豇豆嵌合病毒的案例中，將步驟1所構(gòu)建的克隆和編碼CPMV-RNA1的cDNA克隆結(jié)合接種約為10-14天齡的豇豆植物(或者在植物生長、并在開花開始前的其他任一時期*)。(任何其他CPMV的易感宿主可以在開花開始前的適合時間予以感染*)。[*直到生長階段停止前，病毒能夠在適合的宿主上啟動全身感染；對于開花植物而言，是在開花開始前]。
3.對植物表現(xiàn)感染癥狀進行密切的監(jiān)測。對于一個良好的復(fù)制粒子，4-6天后，可以在接種葉上看到局部病變，雖然它們通常不明顯。在感染后的10-14天，可以看到全身癥狀。如果存在全身感染的明確指征，植物可在感染后的3-4周內(nèi)收獲，并且純化病毒(步驟5)。如果14天后或更長時間才出現(xiàn)第一個局部病變，并且在感染后直到3周也沒有或非常少的全身癥狀，那么可能在植物體內(nèi)發(fā)生了自發(fā)突變。在這種情況下，病毒需要按照步驟4轉(zhuǎn)移到新鮮植物上。如果根本沒有可檢測的癥狀，需要進行再次突變(參看步驟7和8)。
4.如果在感染后的2周或更長的時間里(在花期開始前或植物生長階段終止前)僅有明顯的局部病變而沒有全身癥狀，從葉子上將病變?nèi)∠聛聿为氜D(zhuǎn)移到一個試管中。每個試管加入一些水或適合儲存病毒粒子的任何緩沖液，壓碎葉子碎片。所得懸浮液依照步驟2所述用于接種新鮮的年輕豇豆植株(或其他適合的宿主植物)。這將在感染約5天后導致局部病變，再過3-6天出現(xiàn)全身癥狀。
收獲葉子。從葉子上純化病毒，例如使用氯仿/異戊醇提取后，用PEG沉淀，(van Kammen和de Jaeger豇豆花葉病毒，在CMI/AAB描述植物病毒197，Commonwealth Agricultural Bureaux )。從每種單獨植株上分離樣品用于序列分析(Brennan等人，見上)。用能與VP-S基因或VP-L基因特異雜交并啟動其反轉(zhuǎn)錄的引物，該病毒粒子可用于標準反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用能夠擴增VP-S基因或VP-L基因或者兩者的引物，通過PCR方法擴增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。將多聚酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物進行測序，以便VP-S、VP-L或者兩者序列可在兩條鏈上確定。如果插入表位上沒有突變，該構(gòu)建物可以和其他物質(zhì)一起用于免疫學分析。
7.如果確定了第二點突變，就可以通過區(qū)域介導的突變形成或者通過將步驟6中的cDNA中切出和粘貼片段進感染克隆中，將它們導入步驟1所述的cDNA克隆的新的衍生物中。
8.如果在步驟4中，根本沒有癥狀，在不同的構(gòu)建中確定的或者任何其他可以產(chǎn)生感染克隆的已知的第二位點突變突變可以被導入步驟1制備、步驟6修飾的cDNA克隆中。對新的構(gòu)建重復(fù)整個感染過程，按照步驟2-5的順序。如果在步驟4中存在良好的癥狀，導入的突變足以使CPV在植物體中感染和復(fù)制。如果只有局部病變，那么可能發(fā)生了第三個點突變。這可以按照步驟5和6進行研究或證實。
9.使用多種第二位點突變或第三位點突變(或更多的點突變)可以建立病毒載體文庫，該文庫可以如同上面的步驟1所述連接進表位。在這種情況下，重要的是進行步驟4中的局部病變的轉(zhuǎn)移，以便確保全身感染的植株含有一個病毒單一克隆。
實施例13本實施例表明再次應(yīng)用第二突變加強了病毒載體的感染和復(fù)制，該病毒載體表達一種外源肽而不是其體內(nèi)突變選擇壓力下產(chǎn)生的內(nèi)在表達肽。來自仙臺病毒的核衣殼蛋白的肽(氨基酸序列是，HGEFAPGNYPALWYSA；SEQ ID NO11)被插入到CPMV的VP-S的氨基端，位于復(fù)制的酪氨酸殘基(即，Tyr11在該插入肽的氨基端，而第二個酪氨酸殘基緊鄰在插入肽的羧基末端之后)之間的區(qū)域。該構(gòu)建稱為pSEN2。在將cDNA在豇豆植株上接種后，21天后，SEN2不表現(xiàn)出任何的癥狀。
由于這個原因，構(gòu)建了一個與pSEN2相似的構(gòu)建體，但是其不同在于嵌合病毒載體包含一個選自表達瘧疾表位構(gòu)建(MAL8；參見實施例3)的第二位點突變，Phe91Ser。這個構(gòu)建體稱為pSEN3。在cDNA接種到豇豆植株上后，SEN3構(gòu)建體表現(xiàn)出最早6天在接種的葉片上表現(xiàn)感染癥狀，再過4天，5株接種植物中有4株表現(xiàn)全身癥狀。感染后21天收獲植物。從接種的葉上純化病毒，觀察到從47克葉子中獲得的病毒產(chǎn)量為50毫克。將來自接種21天后純化的病毒中分離的RNA進行反轉(zhuǎn)錄-PCR，并在兩條鏈上對所得cDNA測序。測序分析表明該序列與用于接種植物的pSEN3構(gòu)建的序列相比沒有變化。
這清楚地表明可以使用選自內(nèi)部表達一個肽的構(gòu)建體的特定的第二個位點突變幫助在基本上相同的位置插入另外一個無關(guān)肽的內(nèi)部表達。這暗示著第二位點突變在肽的內(nèi)部表達中具有廣闊的用途，原則上也可根據(jù)實施例7和8用于構(gòu)建雙展示粒子。所以，可能根據(jù)實施例12和13簡要說明的方法構(gòu)建一個載體庫，該載體庫可以不經(jīng)過不適當?shù)膶嶒灆z驗肽在病毒粒子內(nèi)部的表達。
實施例14本實施例表明在植物病毒粒子的內(nèi)部表達T細胞表位可以避免該表位暴露于體液免疫反應(yīng)元件(例如，循環(huán)抗體)和免疫原或抗原提呈途徑產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)。構(gòu)成疫苗的許多肽的目的是對提呈的表位引導細胞反應(yīng)而不是體液反應(yīng)(抗體反應(yīng))。特別是，如果刺激了細胞免疫反應(yīng)，腫瘤于涉治療逐漸被認為更有效。但是，由于提呈的有關(guān)表位也可以被血清中循環(huán)的抗體識別，所以通常存在被導入用于刺激期望免疫反應(yīng)的免疫原可以誘導針對展示肽的體液免疫而不是細胞免疫反應(yīng)的機會。而且，具備與導入的免疫原或抗原性組合物的結(jié)合能力的循環(huán)抗體的偶然存在，可以通過清除復(fù)合物阻止了期望免疫反應(yīng)的適當和有效的刺激。實際上，這是任何肽展示系統(tǒng)的潛在問題，其中肽展示在大分子載體的外部，例如匙孔血藍蛋白(KLH)。另一方面，在病毒粒子的內(nèi)部表達一種肽如一種表位，，例如，在植物的嵌合病毒中，可以保護該肽不與抗體結(jié)合。這不僅阻止了對該表位的不需要的體液反應(yīng)，并且有助于肽經(jīng)受清除和蛋白水解后的存活，直到其得以提呈，并且被免疫系統(tǒng)的抗原提呈細胞加工(APCS)。由于這些原因，表位在CPMV或其他植物病毒中的內(nèi)部化對表達表位有實用性，該表位可以與循環(huán)抗體交叉反應(yīng)，因而被用以介導從體液反應(yīng)到細胞反應(yīng)的免疫反應(yīng)類型。這也可以使用于肽的模擬位的表達。
對于肽在免疫治療中的應(yīng)用，需要對特定的細胞毒性的T細胞進行誘導。為了實現(xiàn)這一點，必須使細胞釋放和提呈能誘導細胞毒性T細胞反應(yīng)的表位，以便該肽表位可被加工并被提呈在MHC11分子中。以這種途徑的提呈避免了直接的抗體反應(yīng)，取而代之的是誘導了對特定細胞毒性T淋巴細胞群的刺激。這種淋巴細胞隨后直接靶向展示議論肽的細胞，導致調(diào)理作用后細胞溶解或者靶細胞或抗原的清除。
現(xiàn)已知道來自人類乳腺癌細胞(或其他癌細胞)表面大量存在的一種蛋白，粘蛋白，的肽當與載體結(jié)合后，可以誘導小鼠CTL反應(yīng)。在癌細胞上發(fā)現(xiàn)的粘蛋白多肽與許多非癌細胞表面上的發(fā)現(xiàn)的蛋白的普遍形式的不同在于它是不同的翻譯后修飾的。在嘗試用包含粘蛋白肽的疫苗Mucl p免疫實驗動物時，發(fā)現(xiàn)在小鼠中的交叉反應(yīng)抗體可以將誘導的細胞免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)化為體液免疫反應(yīng)。當同樣的免疫原預(yù)防接種人時，引起的是抗體反應(yīng)而不是細胞反應(yīng)，因為抗原肽與針對Gal α(1，3)Gal表位的抗體交叉反應(yīng)，其中Gal α(1，3)Gal表位正常存在于人類的一些血型組的決定簇中，但是沒有在老鼠中發(fā)現(xiàn)。
一種技術(shù)方案是將同樣的肽作為插入物表達于CPMV的VP-S的氨基端，位于Tyr11的重復(fù)體之間。當這些粒子被用于免疫人時，抗體不能直接與插入的表位結(jié)合。通過Muclp肽在抗原提呈細胞(APCs)上的吸收和提呈，優(yōu)先發(fā)生了針對表位的細胞反應(yīng)。對特異于Muclp肽表位的CTL亞群的刺激導致在其細胞膜上帶有基本上相同的表位的靶細胞的裂解和清除。
實施例15本實施例表明生產(chǎn)包含來自麻疹病毒的CTL表位的CVP。從麻疹病毒獲得的帶正電的CTL表位(LDRLVRLIG；SEQ ID NO13)被插入VP-S的氨基端，位于Y11的重復(fù)體之間。該構(gòu)建被稱為pMV14。用這種構(gòu)建接種植物不顯示任何癥狀。相同的表位被插入到V10Y11(＝pMV15)的重復(fù)體之間，現(xiàn)在觀察到5個接種植株中有2個表現(xiàn)了癥狀。當純化病毒被轉(zhuǎn)染到年輕的豇豆植株上時，觀察到非常良好的癥狀。兩種外殼蛋白基因被完全測序，發(fā)現(xiàn)完全正確。
實施例16本實施例表明生產(chǎn)包含來自皰疹性口腔炎病毒的CTL表位的CVP。皰疹性口腔炎病毒(RGYWQGL；SEQ ID NO12)的CTL表位已經(jīng)成功地表達在TY粒子的表面，并且這些粒子在小鼠身上誘導了非常良好的CTL反應(yīng)(Layton等人，免疫學87171-178 )。相同的表位被插入到CPMV的VP-S的重復(fù)的Y11之間。該構(gòu)建被稱為PVSVI。在用本構(gòu)建接種的5株植物中有4株表現(xiàn)出良好的癥狀。本病毒的產(chǎn)量好(0.79毫克/克葉子)。
實施例17本實施例表明構(gòu)建CTL表位側(cè)面具有寡丙氨酸的載體。已知對于抗原提呈細胞的CTL表位的正確加工，表位側(cè)面的氨基酸殘基是關(guān)鍵因素。但是，對于哪種殘基與某種表位結(jié)合是最合適的知之甚少。已經(jīng)觀察到在表位的任一位點插入短的丙氨酸片段可以有助于提高對插入的蛋白載體的CTL表位的反應(yīng)。(Del Val等人，細胞學雜志(Cell)661145-1153 )。
制備了一種在V10Y1 1的重復(fù)體之間具有5個丙氨酸的載體，但在該插入點(＝pP35)中具有唯一的一個NotI位點。該載體本身可以感染豇豆植株，雖然病毒的癥狀相比于野生型病毒要遲一些。在這個寡丙氨酸片段中插入表位可以有助于研究，萬一表位產(chǎn)生的免疫反應(yīng)很弱時的最佳CTL表位加工過程。將瘧疾表位插入到NotI位點制備了pMAL11。該構(gòu)建在植物體上有良好的癥狀。
由于在小鼠中沒有觀察到對pMV15麻疹病毒表位的CTL反應(yīng)(參見上面所述)，制備了另外一種構(gòu)建，其中表位的兩側(cè)之一具有幾個丙氨酸。這種構(gòu)建，pMV16，對豇豆植株沒有感染性。與pSEN3相似(參見上面所述)，來自不相關(guān)構(gòu)建的第二個位點的突變被用于pMV16(來自pTT4的M177V)。這種被稱為pNW17的構(gòu)建在植物體上不表現(xiàn)任何癥狀。
依據(jù)國際承認用于專利程序和控制的微生物保藏的布達佩斯條約的條文，下述有用的植物病毒載體保藏在美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)(Rockville，Md.，美國)pTB2(ATCC編號75280)和pTBU5(ATCC編號75281)。構(gòu)建這些質(zhì)粒的詳細情況在美國專利5,589,367中予以公布，引述于此作為參考。
在上述說明書中提到的出版物和專利引述于此作為參考。在不背離本發(fā)明范圍和精神的情況下，本發(fā)明所述的組合物和方法的多種改進和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然本發(fā)明是于特別的優(yōu)選的實施方案相聯(lián)系而說明的，但是應(yīng)該理解的是本發(fā)明的權(quán)利要求不應(yīng)該限于此種特定的實施方案中。實際上，對本技術(shù)領(lǐng)域和相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，所述實施本發(fā)明的模式的多種變化也應(yīng)包含在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>K·海倫多恩<120>含有外源性內(nèi)表位的病毒顆粒<130>DOW-04661<150>GB9924352.9<151>1999-10-14<160>37<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>10<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>1Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp Val1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>2Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp Val Tyr15 10<210>3<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>3Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>4Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu15<210>5<211>14<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>5Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu15 10<210>6<211>15<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>6Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln15 10 15<210>7<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>7Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile15<210>8<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>8Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Gly Lys Ile15<210>9<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>9Ala Ala Ala Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile Ala Ala Ala Ala15 10 15<210>10<211>8<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>10Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu15<210>11<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>11His Gly Glu Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu Trp Ser Tyr Ala1 5 10 15<210>12<211>8<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>12Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>13Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Ile Gly1 5<210>14<211>15<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>14Ala Ala Ala Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Ile Gly Ala Ala Ala1 5 10 15<210>15<211>18<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>15Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro15 10 15Ser Val<210>16<211>13<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>16Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln1 5 10<210>17<211> 5<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>17Ala Ala Ala Ala Ala1 5<210>18<211>21<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>18ggttatcatg gttctagtttg 21<210>19<211>42<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>19gctgtttatt attgtactag aggttatcat ggttctagtt tg 42<210>20<211>45<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>20agacctcaag cttctggtgt ttatatgggt aatttgactg ctcaa 45<210>21<211>27<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>21tcttatattc cttctgctga aaagatt 27<210>22<211>48<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>22gcagcggcct cttatattcc ttctgctgaa aagattgcgg ccgctgct 48<210>23<211>24<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>23gctcctggta attatcctgc tttg 24<210>24<211>48<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>24catggtgaat ttgctcctgg taattatcct gctttgtggt cttatgct 48<210>25<211>23<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>25agaggttatg tttatcaagg ttg 23<210>26<211>27<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>26ttggatagat tggttagatt gattggt 27<210>27<211>45<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>27gcagcggcct tggatagatt ggttagattg attggggccg ctgct 45<210>28<211>54<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223><400>28gtggatgatg ctttgattaa ttctactaag atttatagtt attttccttc tgtt54<210>29<211>39<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>29atgcaatgga actctactac ttttcatcaa actttgcaa 39<210>30<211>15<212>DNA<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>30gcagcggccg ctgct 15<210>31<211>9<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>31Tyr Ser Pro Cys Met Ile Ala Ser Thr1 5<210>32<211>10<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>32Val Tyr Ser Pro Cys Met Ile Ala Ser Thr1 5 10<210>33<211>15<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>33Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu Tyr1 5 10 15<210>34<211>8<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>34Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu Tyr1 5<210>35<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>35Gly Val Ser Thr Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala1 5 10 15<210>36<211>32<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>36Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Gly Ala Asp1 5 10 15Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu20 25 30<210>37<211>16<212>PRT<213>人造/未知<220><221>misc_feature<222>()..()<223>合成的<400>37Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種含有具有衣殼的嵌合病毒粒子的化合物，其中所述的衣殼具有內(nèi)側(cè)面和外側(cè)面，所述的衣殼在其所述的內(nèi)側(cè)面含有至少一個外源肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合病毒粒子，它能夠在宿主細胞或組織中裝配。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒是二十面體的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒是豇豆花葉病毒屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒是豇豆花葉病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入外殼蛋白中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽含有5到20個氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到距離外殼蛋白的氨基端5-20個氨基酸的地方，這種病毒粒子的裝配在宿主細胞中未受到阻止。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到豇豆花葉病毒的VP-S中，其插入位置位于第11位的酪氨酸殘基和第12位重復(fù)酪氨酸殘基之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到豇豆花葉病毒的VP-S中，其插入位置位于包含第10位的纈氨酸殘基和第11位的酪氨酸殘基的二肽與包含位于第12位的纈氨酸殘基和第13位酪氨酸殘基的重復(fù)二肽之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽被插入到豇豆花葉病毒的VP-S中，其插入位置位于第10位的纈氨酸殘基和第11位的重復(fù)的纈氨酸殘基之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的病毒粒子不含有核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽編碼一種可以為動物免疫系統(tǒng)識別的表位。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽是細胞毒性T淋巴細胞表位。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽含有具有來自表位自然發(fā)生源的側(cè)面氨基酸的細胞毒性T淋巴細胞表位。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽是T輔助細胞表位。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-12和權(quán)利要求16中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽含有具有來自表位自然發(fā)生源的側(cè)面氨基酸序列的T輔助細胞表位。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽是B細胞表位。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-12和權(quán)利要求18中任一項所述的嵌合病毒粒子，其中所述的外源肽包括具有來自表位自然發(fā)生源的側(cè)面氨基酸序列的T輔助細胞表位。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的嵌合病毒粒子，它含有一個表達在病毒衣殼外表面上的第二個外源肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的嵌合病毒粒子，它含有一個表達在病毒衣殼外表面的第二個外源肽，其中所述的肽被插入到豇豆花葉病毒的VP-S的βC’-βC”環(huán)中。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的嵌合病毒粒子，它含有一個表達在病毒衣殼外表面的第二個外源肽，其中所述的肽被插入到豇豆花葉病毒的VP-S的βC-βC環(huán)中。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的嵌合病毒粒子，它含有一個表達在病毒衣殼外表面的第二個外源肽，其中所述的肽被插入到豇豆花葉病毒的VP-L的βE-βA環(huán)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及在病毒粒子上表達肽，尤其是在病毒衣殼的內(nèi)部表達肽。本發(fā)明描述了修飾病毒的方法，以便使外源表位可被表達在病毒衣殼的內(nèi)部?？杀恍揎椀牟《景?+)鏈RNA病毒，特別是植物(+)鏈RNA病毒，例如豇豆花葉病毒。內(nèi)部表達對表達疏水表位特別有用。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)修飾的病毒粒子有作為疫苗和作為能誘導免疫反應(yīng)的物質(zhì)的用途。
文檔編號C07K14/12GK1471580SQ00816753
公開日2004年1月28日 申請日期2000年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月14日
發(fā)明者K·海倫多恩, T·瓊斯, K 海倫多恩 申請人:陶氏化學公司