專利名稱：利用定位重組系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因植物特定組織或器官中靶基因的分子方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，特別是涉及獲得轉(zhuǎn)基因植物特定組織或器官中靶基因刪除的分子方法。更具體地說，本發(fā)明涉及利用位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)將特定的靶基因在轉(zhuǎn)基因植物的特定組織或器官被刪除的分子生物學(xué)方法。
隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，人們利用基因工程手段來改造植物以提高其品質(zhì)、產(chǎn)量、和抗性水平等已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。尤其近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)突飛猛進(jìn)，轉(zhuǎn)基因作物越來越多?；蛐揎検称返陌踩詥栴}便成為公眾關(guān)注的熱點(diǎn)之一。由于某些原因，人們往往不希望在某種器官中含有外源的基因。特別是在一些可食用部分(果實(shí)，種子)若含有某種外來基因，該基因產(chǎn)物可能不利于食用器官的品質(zhì)改良，或可能不利于產(chǎn)品在市場上銷售。就有必要將這種基因在食用器官中刪除。出于基因知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，或其他目的也往往需要在局部器官中刪除某種外源基因諸如蛋白酶抑制劑。因此，如何控制轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的行為對轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化具有非常重要的意義。
隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們已經(jīng)開始利用基因工程手段來控制轉(zhuǎn)基因的行為。例如Park & Willmizter等使用馬鈴薯塊莖專一性啟動(dòng)子與uidA基因融合，所獲轉(zhuǎn)基因馬鈴薯只在塊莖組織中檢測到uidA基因的活性，而根、莖、葉中檢測不到uidA基因的活性。在我們用uidA作為報(bào)告基因研究啟動(dòng)子2a12時(shí)也證實(shí)了該啟動(dòng)子具有果實(shí)專一性表達(dá)的特性(圖2)。目前已經(jīng)有越來越多的啟動(dòng)子如葉片、根、花粉、絨氈層、胚胎、內(nèi)皮層、糊粉層、韌皮部、塊莖、果實(shí)等器官和組織特異性啟動(dòng)子被分離和鑒定(Saito T，Biosci BiotechnolBiochem，63(4)632-7(1999)；Guilfoyle TJ，Genetic Engineering 1915-47(1997)；Zhou X，Transgenic Res，2(3)141-6，(1993)；Klotz KL，PMB，36(4)509-20，(1998)；Cheung Ay，PNAS，93(9)3853-8，(1996)；Mett VL，Transgenic Res，5(2)105-113，(1996))等。上述現(xiàn)有技術(shù)中基本都是采用組織、器官專一性啟動(dòng)子連接報(bào)告基因(如uidA或gfp)或其它編碼基因表達(dá)的。但國內(nèi)至今未見有關(guān)利用定位重組系統(tǒng)介導(dǎo)的方法控制外源基因的時(shí)空分布。本發(fā)明則提供了一套在轉(zhuǎn)基因植物的當(dāng)代或后代中將外源基因在特定的組織或器官中刪除的分子生物學(xué)方法。
美國USDA和D&P公司于1998年共同申請的專利US5723765公開了一種控制植物基因表達(dá)的方法，即將三個(gè)DNA序列導(dǎo)入一種植物細(xì)胞，其中第一個(gè)重組DNA序列含有一個(gè)致死基因和一個(gè)在晚期胚胎發(fā)生中活化的啟動(dòng)子，致死基因和晚期胚胎發(fā)生中活化的啟動(dòng)子功能性相互連接，但由一個(gè)兩端具有特異切除序列的阻斷序列分隔開，阻斷序列的存在阻止了致死基因的表達(dá)。第二個(gè)DNA序列含有位于一個(gè)阻抑型啟動(dòng)子調(diào)控下的重組酶基因，該重組酶特異于第一個(gè)重組DNA序列中阻斷序列兩端的特異切除序列。第三個(gè)重組DNA序列含有編碼特異于第二個(gè)重組DNA序列的阻抑型啟動(dòng)子的阻遏物的基因。對外源基因的控制既可以通過施加外部刺激物而獲得，也可以通過雜交獲得。該專利描述了利用一種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)控制植物基因表達(dá)的分子生物學(xué)方法，但其中并沒有涉及到對轉(zhuǎn)基因作物后代中的外源基因進(jìn)行直接的刪除和控制。
來源於噬菌體P1的Cre-loxP系統(tǒng)，(Sternberg N，J．Mol．Biol，150467-486，1981)，酵母2μ質(zhì)粒的FLP-FRT系統(tǒng)，酵母PSR1質(zhì)粒的R-RS系統(tǒng)(KilbvNJ，Trends Genet，9413-421，1993)和噬菌體Mu的Gin／Gix系統(tǒng)(Plasterk RHA，Virotogy，12724-36，1983)是目前研究較清楚的四種定位重組系統(tǒng)。這些重組系統(tǒng)都是由重組酶及其特異識別的位點(diǎn)(一段核苷酸序列)組成。其中Cre，F(xiàn)LP，R編碼重組酶。Gin編碼轉(zhuǎn)化酶，這些酶的特點(diǎn)均由單個(gè)多肽組成，且作用于核酸序列時(shí)，除Gin外，其它三個(gè)重組酶均不需輔助因子。各酶之間蛋白質(zhì)序列差異較大，但C端均有一個(gè)40個(gè)氨基酸的同源區(qū)域，其中有三個(gè)保守的氨基酸序列His-Arg-Tyr，可能是這些酶的活性位點(diǎn)。四種酶所識別的特異苷酸序列分別稱為LoxP，F(xiàn)RT，RS和Gix位點(diǎn)。這些重組位點(diǎn)均含有12-13bp的反向重復(fù)序列，中間是非對稱的2-8bp的間隔區(qū)，間隔區(qū)的方向決定了重組酶介導(dǎo)重組的結(jié)果。如果重組酶識別的兩個(gè)位點(diǎn)方向相同，則兩個(gè)位點(diǎn)間的DNA序列被刪除，如果兩個(gè)識別位點(diǎn)的方向相反，則兩位點(diǎn)間的DNA序列發(fā)生倒位，如果兩個(gè)重組位點(diǎn)位于不同的DNA分子上，則會發(fā)生DNA分子的易位。目前只有Cre-loxP重組系統(tǒng)的研究最為深入，它已廣泛應(yīng)用于包括植物(Dale EC$OW，DW，Gene，9179-85，1990)(Albert H et al，plant J，7(4)649-659，1995)，動(dòng)物細(xì)胞(Saver B，Mol．Cell，Biol，72087-2096，1987)等的基因表達(dá)調(diào)控研究中。他們的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了Cre可成功介導(dǎo)生物基因組中兩個(gè)loxP兩個(gè)位點(diǎn)間的重組反應(yīng)，并且重且頻率達(dá)到近100％，尤其所年來，Cre-loxP定位重組系統(tǒng)被廣泛用于控制外源基因的表達(dá)，可以通過失活或活化外源基因，進(jìn)而影響植物的表型特征，然而，現(xiàn)有這些技術(shù)中，沒有具體描述Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在特定組織或器官中刪除不期望的外源基因，而其它器官或組織保留該外源基因方面的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明提供了用于在特定組織或器官中刪除外源基因的方法。該方法包括用第一個(gè)重組DNA序列和第二個(gè)重組DNA序列穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述的第一個(gè)重組DNA序列包含連接到組成型啟動(dòng)子下游的編碼序列，如35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼蛋白酶抑制劑的基因序列。所述的第二個(gè)重組DNA序列含有編碼一種重組酶的核苷酸序列，且處于器官或組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控之下，所述的重組酶可特異性地識別第一個(gè)重組DNA序列兩側(cè)翼的核苷酸序列并將識別位點(diǎn)之間的DNA序列刪除掉。從所述的植物細(xì)胞再生得到一個(gè)完整植株，當(dāng)由第一和第二個(gè)重組DNA序列得到的轉(zhuǎn)基因植株雜交后，或它們相互二次轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞得到轉(zhuǎn)基因植株。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的第一個(gè)重組DNA序列中的組成型啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子，其中所述的器官或組織特異性啟動(dòng)子是番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，其中所述組成型啟動(dòng)子包括但不僅限于CaMV35S啟動(dòng)子，并且所述器官或組織特異性啟動(dòng)子包括但不僅限于番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2a12。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的第一個(gè)重組DNA序列中的能改變植物表型的外源靶核苷酸序列編碼一種殺蟲蛋白，馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑(PinII)，其中所述的第二個(gè)重組DNA序列中的能識別的剪切第1個(gè)重組DNA序列的特異苷酸序列的是重組酶Cre基因，且該酶識別的特異核苷酸序列稱為loxP位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，其中所述的外源靶核苷酸序列包括但不僅限于馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑基因(PinII)，所述的重組酶基因包括但不限于Cre重組酶基因，其中所述的被重組酶識別和剪切的核苷酸序列包括但不僅限于loxP位點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，其中所述的Cre重組酶在番茄果實(shí)發(fā)育階段表達(dá)并特異性切除果實(shí)中第一個(gè)重組DNA序列中兩個(gè)loxP位點(diǎn)間外源靶核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中所說的由第一個(gè)重組DNA序列，及第二個(gè)重組DNA序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞得到再生植株為To代，To代也可是由第一個(gè)和第二個(gè)重組DNA序列共轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞得到再生植株或二次轉(zhuǎn)化后得到的再生株。由雜交得到的植株為T2代。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中所述的二次轉(zhuǎn)化是由第一或第二個(gè)重組DNA序列轉(zhuǎn)化植物得到的TO。再被第二或第一個(gè)重組DNA序列轉(zhuǎn)化，最終保證兩個(gè)DNA序列共存于一個(gè)植物細(xì)胞，由此植物細(xì)胞再生得到的植物具有組織或器官特異性刪除外源基因的能力。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，其中所述的共轉(zhuǎn)化的是由第一和第二個(gè)重組DNA序列同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)植物細(xì)胞，并且所說的具有組織和器官特異性刪除外源基因的植株，由所說的植物細(xì)胞再生后得到。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，所述的第一個(gè)重組DNA序列經(jīng)轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植株To代，第二個(gè)重組DNA序列經(jīng)轉(zhuǎn)化也得到轉(zhuǎn)基因植株To代，并且所說的具有組織和器官特異性刪除外源基因的植株，由兩個(gè)To代植株雜交產(chǎn)生的T2代植株中得到。
所說的第一個(gè)重組DNA序列包括在植物各個(gè)發(fā)育階段有活性的組成型啟動(dòng)子及其下游端的外源靶核苷酸序列所組成的嵌合基因。同時(shí)該嵌合基因兩側(cè)翼連有可被位點(diǎn)特異性重組酶識別并剪切的特異核苷酸序列，所說的第二個(gè)重組DNA序列包括組織或器官特異性啟動(dòng)子連接一個(gè)能特性識別并剪切第一個(gè)重組DNA序列中嵌合基因兩側(cè)翼特異核苷酸序列的重組酶基因。
本發(fā)明涉及一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所期望獲得的植物表型在上述實(shí)施方案中均可以控制，在一個(gè)實(shí)施方案中。所述控制通過共轉(zhuǎn)化和二次轉(zhuǎn)化等轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述控制是通過雜交實(shí)現(xiàn)。再一個(gè)實(shí)施方案中是通過將兩端連有特異識別和剪切序列的外源靶核苷酸序列與重組酶基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞獲得。本發(fā)明是通過將一些功能DNA序列引入植物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。所述DNA序列含有以下基本元件組成型表達(dá)的啟動(dòng)子序列，組織或器官特性表達(dá)的啟動(dòng)子序列，可以改變植物表型的外源核苷酸序列，一個(gè)編碼位點(diǎn)特異性重組酶的基因和該重組酶可以識別和剪切的特核苷酸序列。這些因子的排列順序可以改變，只要達(dá)到刪除外源靶基因的目的即可。
通過上述多種實(shí)施方案可以得到一種同時(shí)含有兩個(gè)DNA序列元件的植物，其中第一個(gè)重組DNA序列中的改變植物表型的外源核苷酸序列是在組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，可保證植物各部分均表現(xiàn)外源基因的性狀，此時(shí)，雖然兩種DNA序列共存于一個(gè)植物細(xì)胞中，但由于第二個(gè)重組DNA序列中識別和剪切第一個(gè)重組DNA序列中兩側(cè)翼核苷核序列的重組酶基因是在器官或組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，因此，只有在植物的特異器官或組織中該重組酶才能表達(dá)，并在表達(dá)的器官或組織中切除識別位點(diǎn)間的外源核苷酸序列，而其它器官或組織中不能刪除外源靶核苷酸序列并保證了該外源基因的性狀，從而達(dá)到本發(fā)明的目的。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以根據(jù)所需作用的目標(biāo)植物選用不同的實(shí)施方案。
在本發(fā)明中有關(guān)重組酶及其識別和剪切序列的重組系統(tǒng)可以是任何一個(gè)在植物基因組織中起刪除靶DNA序列的一種，有關(guān)幾個(gè)系統(tǒng)的描述可參考Sadowski(1993)The FASEB Journal 7760-767。本發(fā)明中優(yōu)先選擇的系統(tǒng)是來源于細(xì)菌噬菌體P1的Cre／loxP系統(tǒng)，其中Cre重組酶在loxP位點(diǎn)進(jìn)行DNA的位點(diǎn)特異性重組，其它的重組系統(tǒng)還包括FLP／FRT，R／RS，Gin／Gix等系統(tǒng)。
在本發(fā)明中所描述的將重組DNA序列，經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入目標(biāo)植物的技術(shù)不是問題的關(guān)鍵所在。關(guān)鍵在于選擇引入的靶基因在植物基因組中能穩(wěn)定存在并且也在其后代中延續(xù)在并穩(wěn)定表達(dá)的植株。現(xiàn)在可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種植物遺傳轉(zhuǎn)化手段(技術(shù))或不斷改進(jìn)的新技術(shù)來完成轉(zhuǎn)化。例如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染法，基因槍法，顯微注射法，磷酸鈣DNA共沉淀法，花粉管通道法，電擊法等，用于轉(zhuǎn)化的靶DNA可以各種形式進(jìn)入植物靶細(xì)胞，可以是質(zhì)粒中的環(huán)狀DNA或酶切后的線狀靶DNA片段?；蚴且匀斯と旧w的形式等。
可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的分子方法，諸如PCR技術(shù)，Southern印跡技術(shù)來確定重組DNA序列是否穩(wěn)定整合進(jìn)再生的被轉(zhuǎn)化植物基因組中，并可用Northern雜交以及Western印跡技術(shù)來確定重組酶表達(dá)的水平。
在本發(fā)明中，用于將轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為一個(gè)完整植株的方法并不是關(guān)鍵的，可以使用任何適用于靶植物的轉(zhuǎn)化方法。有關(guān)植物轉(zhuǎn)化的許多技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的描述，并且許多技術(shù)也在不斷涌現(xiàn)或成熟，因此在利用本發(fā)明中涉及到的轉(zhuǎn)化技術(shù)，使用者可以根據(jù)轉(zhuǎn)化物種并參考相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)選擇合適的且不需復(fù)雜和過多的實(shí)驗(yàn)以達(dá)目的的技術(shù)方案。
本發(fā)明可適用于生產(chǎn)各種轉(zhuǎn)基因植物，這些方法即適用于有性繁殖的一年生植物，它們包括但不僅限于番茄，黃瓜，西瓜，香蕉，甜瓜等，也適用于有性或無性繁殖的多年生植物，包括但不限于桃，李，葡萄，蘋果等，還適用于包括但不限于水稻，小麥和玉米等單子葉植物。
以下實(shí)例是對本發(fā)明的進(jìn)一步闡明，并不是限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。
如無特別說明，所有實(shí)施例中的細(xì)菌培養(yǎng)DNA制備和分子克隆均參考Sambrook et al，的《Molecular Cloning》和《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(顏?zhàn)臃f等，科學(xué)出版社，北京(1998)DNA操作中所用的限制性內(nèi)切酶等工具酶購自Promega(美國)，基因有限公司和華美生物工程公司(中國)


圖1番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Gus基因的植物表達(dá)載體pPRGUS圖2番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下Gus活性分析圖3果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre基因的植物表達(dá)載體pCRE2A圖4側(cè)翼含同向loxP位點(diǎn)的植物表達(dá)載體pBINPU實(shí)例1番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2a12的克隆考慮到本發(fā)明所述器官或組織特異性刪除靶基因的目的，我們在研究已證實(shí)具有果實(shí)專一性表達(dá)基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)，根據(jù)啟動(dòng)子特性，選擇性地克隆了一個(gè)851bp的啟動(dòng)子片段，作為我們研究果實(shí)專一性刪除外源基因的基礎(chǔ)。根據(jù)已發(fā)表的果實(shí)專一性基因啟動(dòng)子4kb的核苷酸序列區(qū)，設(shè)計(jì)并合成一對引物，即引物1，引物2。番茄基因組DNA的提取選取飽滿種子，用70％乙醇處理1分鐘，再用20％次氯酸鈉溶液滅菌處理20分鐘，用無菌水清洗3-5遍，播種于1／2MS固體培養(yǎng)基，10-15天后取幼葉約0．5g，置于研缽中，在液氮作用下迅速研成細(xì)粉，移入小離心管中，迅速加入550μl提取緩沖液(500mM NaCl，50mM Tris·Cl pH8．0，50mM EDTA pH8．0，1．5％(v／v)β-疏基乙醇)中加入SDS至終濃度2％，置65℃水浴中10分鐘，加入1／10體積的5MKAC溶液，置冰上20分鐘，14000g離心10分鐘取上清，加入0．6V異丙醇，冰上放置10分鐘，12500g離心5分鐘，將沉淀用600μlTE溶解，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇抽提1-2次，收集上清，加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，用無菌雙蒸水溶解備用。
取1ug總DNA為模板，在含有引物1，引物2，dNTP，緩沖液的50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR(94℃預(yù)變性10分鐘，94℃變性50秒，53℃退火50秒，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10分鐘)，在0．8％瓊脂糖凝膠中電泳，用玻璃奶回收850bp的特異條帶，Klenow大片段作用下補(bǔ)平。在T4DNA連接酶的作用下，以3∶1摩爾比與經(jīng)HinCII酶切的pUC119載體片段連接過夜，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落，進(jìn)行酶切和PCR鑒定，得到陽性克隆命名為pTM，經(jīng)核苷酸序列分析，擴(kuò)增的850bp核苷酸序列與原發(fā)表序列有99．6％的同源性。
實(shí)例2攜帶果實(shí)專一性啟動(dòng)子2a12／UidA植物表達(dá)載體pPRGUS的構(gòu)建用HindIII和XbaI酶切pTM質(zhì)粒，從中切出850bp大小的果實(shí)專一性啟動(dòng)子2a12，同時(shí)用HindIII和XbaI酶切專門用于研究啟動(dòng)子特性的雙元載體pPR97，該載體含有報(bào)告基因UidA，將850bp片段與其連接經(jīng)轉(zhuǎn)化后，挑取菌落并酶切鑒定，得到重組雙元載體pPRGUS(見
圖1)，根據(jù)UidA基因核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成一對引物，引物3引物4作為轉(zhuǎn)化后PCR鑒定用。
對pPRGUS進(jìn)一步酶切和PCR鑒定后，以凍融法將pPRGUS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，將LBA4404農(nóng)桿菌菌株接種于含100mg／L鏈霉素和50mg／L利福平的YEB(見表1)液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，分至1．5ml小離心管中，5℃，5000g離心1分鐘沉淀細(xì)菌培養(yǎng)物，用400μl預(yù)冷的50mM CaCl2重新懸浮細(xì)菌，在5℃，5000g離心1分鐘，然后用100μl預(yù)冷的CaCl2(50mM)溶液重新懸浮，4℃冰箱放置12小時(shí)。向其中加入1μg的質(zhì)粒pPRGUS，輕輕混勻后，放在液氮中凍2-5分鐘，取出后在37℃溫育3分鐘，向其中加入600μlYEB液體培養(yǎng)基，于28℃，150rpm搖床振蕩4-5小時(shí)，從該培養(yǎng)物中取100μl菌液均勻涂余于YEB平板上(Rif 25mg／L，Strr 100mg／L，Kanr 50mg／L)，28℃，倒置培養(yǎng)2天，挑取單菌落直接作PCR鑒定，鑒定后的pPRGUS保存?zhèn)溆谩?br> 表2農(nóng)桿菌YEB培養(yǎng)基(PH7．2)成分 (克／每升)牛肉膏提取物 5．0酵母提取物1．0蛋白胨5．0蔗糖 5．0七水合硫酸鎂 0．5瓊脂(固體培養(yǎng)基用) 10．0實(shí)例3攜帶2a12／Cre以卡那霉素為選擇標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒pCRE2A的構(gòu)建用XbaI和SacI消化pMM23質(zhì)粒(美國農(nóng)業(yè)部植物基因表達(dá)研究中心DavidO．W教授惠贈(zèng))，從中切出含有Cre基因及Nos終止子序列的片段(約1．8kb)并將該片段連接到經(jīng)同樣酶切的雙元載體pBINPLUS上，經(jīng)酶切和PCR鑒定篩選后，得到中間重組載體pCREH2。鑒定Cre基因的PCR引物是根據(jù)已公開的Cre基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成的，引物5，引物6，以質(zhì)粒pCREH2為模板在加有引物5、引物6、dNTP和Taq酶的50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR，條件為(94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性50秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分鐘，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘)鑒定得到攜帶Cre基因的重組載體pCREH2。
用HindIII和XbaI消化質(zhì)粒pTM，得到含有2a12果實(shí)專一性啟動(dòng)子850bp大小的片段，半其與徑同樣酶消化的pCREH2重組載體進(jìn)行連接，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，得到重組植物表達(dá)載體pCRE2A(見圖3)以凍融法將pCRE2A轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌LBA4404(Rifr，Strr)中，培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)PCR鑒定無誤后，保存菌種備用。
實(shí)例4攜帶loxP／P35S／PinII／loxP的中間載體pGLOXPIN的構(gòu)建用HindII酶消化含有35S／pinII結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒35SPin，用Klenow大片段補(bǔ)平末端，再用EcoRI消化，得到約2．0kb大小的一平一粘的核苷酸片段，同時(shí)用SmaI和EcoRI兩種酶消化含有同向loxP位點(diǎn)序列的質(zhì)粒pGGUS，得到一平一粘的載體片段，將回收的含有35S／PinII結(jié)構(gòu)的片段用T4DNA連接酶與含有同向loxP位點(diǎn)的pGGUS載體片段連接，將連接產(chǎn)物進(jìn)行酶切和PCR鑒定，得到含35S／PinII結(jié)構(gòu)并在其側(cè)翼含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的重組載體pGLOXPIN。鑒定PinII基因的引物7，引物8是根據(jù)已公開的PinII基因核苷酸序列設(shè)計(jì)合成。以質(zhì)粒pGLOXPIN為模板，在混合dNTP，Taq酶緩沖液的50μl的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件(94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性40秒，54℃退火50秒，72℃延伸50秒，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘)鑒定得到含有PinII基因約中間重組載體pGLOXPIN。
實(shí)例5，攜帶loxP／P35s／PinII／loxP的表達(dá)載體pBINPU的構(gòu)建用BstXI酶在56℃消化由實(shí)例4中得到的中間載體pGLOXPIN，末端補(bǔ)平后，再以BamHI酶消化，玻璃珠法回收含有35S／PinII側(cè)翼有l(wèi)oxP位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的片段，同時(shí)用SmaI和BamHI雙酶消化雙元表達(dá)載體pBINPLUS，將回收的片段與雙酶消化得到的載體片段進(jìn)行連接，經(jīng)酶切和PCR鑒定正確無誤后命名為pBINPU(見圖4)。用凍融法將pBINPU轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌LBA4404中，28℃培養(yǎng)36-48小時(shí)，挑取單菌落徑PCR鑒定，得到陽性克隆，保存菌種備用。
實(shí)例6攜帶2a12／Cre結(jié)構(gòu)以Bar為選擇標(biāo)記的植物將pMM23(同實(shí)例3)質(zhì)粒用表達(dá)載體的構(gòu)建HindIII和SacI雙酶切，回收3．4kb大小的片段。該片段含有35S啟動(dòng)子和Cre基因，同時(shí)將含有bar基因的雙元載體pGPTVBAR也用HindIII／SacI雙酶切，回收11．5kb大小載體片段，將兩片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒，通過酶切和PCR鑒定得到pBARCRE雙元載體，其中PCR鑒定的引物9，引物10是根據(jù)已公開的Bar基因核酸序列設(shè)計(jì)而成，PCR擴(kuò)增Bar基因的條件(94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性40秒，56℃退火50秒，72℃延伸50秒，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘)。
用HindII和XbaI酶切質(zhì)粒pTM，從中切出850bp大小的果實(shí)專一性啟動(dòng)子2a12，同時(shí)用HindIII和XbaI消化雙元載體pBARCRE，得到切除35S啟動(dòng)子的雙元載體片段，將果實(shí)專一性啟動(dòng)子2a12與該片段用T4DNA連接酶連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落進(jìn)行酶切和PCR鑒定，將連接有850bp果實(shí)專一性啟動(dòng)子2a12并含有Cre基因，以Bar為選擇標(biāo)記的植物表達(dá)載體命名為p2a12CRE。
實(shí)例7攜帶2a12／Cre和loxP／P35S／PinII／loxP兩種結(jié)構(gòu)的雙元表達(dá)載體pCRELOXPIN的構(gòu)建用BamHI單酶消化PBINPU質(zhì)粒(見實(shí)例5)用Klenow大片段補(bǔ)平末端后，再用HindIII消化該載體得到一平一粘的約14．3kb的載體片段，同時(shí)用SacI單酶消化實(shí)例3中構(gòu)建的質(zhì)粒pCRE2A，末端補(bǔ)平后，再用HindIII消化得到一平一粘的約2．5kb大小的插入片段，將插入片段與載體片段用T4DNA連接酶以3∶1摩爾比進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR檢測后得到pCRELOXPIN。
約酶切和PCR進(jìn)一步鑒定之后，用凍融法將pCRELOXPIN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌LBA4404中，挑取單菌落并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定正確后，保存菌種于-70℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)例8含pPRGUS的土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄挑取實(shí)例2中構(gòu)建的含pPRGUS并轉(zhuǎn)化土壤農(nóng)桿菌菌株的LBA4404單菌落，接種到含100mg／L鏈霉素，30mg／L利福平和100mg／L卡那霉素的20ml液體YEB培養(yǎng)基中，放在28℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)30個(gè)小時(shí)至對數(shù)生長期，取適量農(nóng)桿菌菌液用液體MS培養(yǎng)基稀釋20-30倍。
番茄轉(zhuǎn)化外殖體的準(zhǔn)備選取飽滿種子，用70％乙醇處理1分鐘，再用20％次氯酸鈉溶液滅菌處理20分鐘，以無菌水清洗3-5遍，播種于1／2MS固體培養(yǎng)基中，10-14天后取完全展開的子葉為外殖體。
剪取靠近葉柄1／3處的葉片作為外殖體浸入上述制備的土壤農(nóng)桿菌稀釋液中侵染，期間輕輕搖動(dòng)，20分鐘后，取出葉片，用無菌濾紙吸去多余菌液。轉(zhuǎn)移這些葉片于含有2．0mg／L玉米素，0．1mg／L吲哚乙酸的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)兩天后，再轉(zhuǎn)移這些葉片于含有2．0mg／L玉米素，0．1mg／L吲哚乙酸，80mg／L卡那霉素和500mg／L羧芐青霉素的固體MS培養(yǎng)基上(表2)，放置于25℃左右，16／8小時(shí)晝夜光周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。4-8周后，將生長至1厘米以上的小苗轉(zhuǎn)移到含300mg／L羧芐青霉素和80mg／L卡那霉素的固體1／2MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，約2-3周后，可見根的形成，從而得到再生的完整植株，待這些植株生長至4-5厘米大小時(shí)，從培養(yǎng)中取出，去掉根部的MS培養(yǎng)基，移栽于滅菌的土壤在溫室中繼續(xù)生長。
取上述溫室中生長的再生番茄植株葉片按實(shí)例1中所述的方法微量制備總DNA，取1ug總DNA用引物3和引物4進(jìn)行50μl體系的PCR反應(yīng)，并以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的番茄作負(fù)對照，結(jié)果特異性地?cái)U(kuò)增得到預(yù)期1．85kb大小的uidA基因片段。將初步鑒定為陽性的植株培養(yǎng)至結(jié)果期，取開花后4周的青熟果實(shí)，作徒手超薄組織切片，同時(shí)取根，莖，葉等組織也做切片，于X-Gluc染色液(0．5mgX-Gluc／ml，Triton X-100 0．1％，PH7．0的磷酸緩沖液，1mM鐵氰化鉀，1mM亞鐵氰化鉀)在37℃溫育15小時(shí)，結(jié)果見如圖2，表明了2a12果實(shí)專一性啟動(dòng)子是特異于果實(shí)組織的啟動(dòng)子。
表3番茄組織培養(yǎng)用MS培養(yǎng)基成分 每升含量(分化培養(yǎng)基)10X MS大量元素母液 100ml100X MS微量元素母液 10ml100X 鐵鹽母液10ml100X 維生素母液 10ml2．0mg／ml 玉米素2．0ml
1．0mg／ml 吲哚乙酸0．1ml瓊脂 7克PH5．6(生根培養(yǎng)基)10X MS大量元素母液100ml100X MS大量元素母液 10ml100X 鐵鹽母液 10ml100X 維生素母液 10ml瓊脂 7克PH5．6實(shí)例9含pBINPU的土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄挑取實(shí)例5中提到的pBINPU轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌菌株LBA4404的單菌落，接種于含100mg／L鏈霉素，30mg／L利福平和100mg／L卡那霉素的20ml液體YEB培養(yǎng)基中，放在28℃搖床上振蕩培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)左右至對數(shù)生長期，用此培養(yǎng)物參考Horsch等人的方法(Science，2271229-1231)進(jìn)行番茄的葉盤法轉(zhuǎn)化，取適宜土壤農(nóng)桿菌用液體MS培養(yǎng)基稀釋20倍，取無菌番茄子葉作為外殖體(制備方法見實(shí)例8)，剪取子葉浸入上述制備的農(nóng)桿菌稀釋液中，20分鐘后，取出并無菌濾紙吸去多余菌液，將這些葉片放在含2．0mg／玉米素和0．1mg／吲哚乙酸的固體MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)至含2．0mg／玉米素0．1mg／L吲哚乙酸，500mg／羧芐青霉素和100mg／L卡那霉素的固體MS培養(yǎng)基上。在25℃左右，16／8小時(shí)的光周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每隔20天繼代一次，約4-6周后，將生長至1厘米以上的小苗轉(zhuǎn)移至含300mg／L羧芐青霉素和100mg／卡那霉素的固體1／2MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，3周左右可見根的形成，從而得到再生的完整植株。待這些植株長至5厘米時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出，去除殘存于根部的MS培養(yǎng)基，移栽于滅過菌的土壤中，置于溫室中生長。
取上述溫室中生長的再生番茄葉片按實(shí)例1中提到的方法，微量制備總DNA取上述1μl總DNA用引物7，引物8進(jìn)行50μl體系的PCR反應(yīng)。結(jié)果特異性地?cái)U(kuò)增得到預(yù)期大小的750bp的片段。
取上述總DNA10μg，用PinII基因片段做探針，用Roche公司DIG-labeledPCR試劑盒和檢測試劑盒，完全按照該公司提供的操作手冊進(jìn)行Southern印跡，證明已得到含PinII基因的轉(zhuǎn)基因植株。
實(shí)例10含pCRE2A的土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄pCRE2A土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄的方法；完全同實(shí)例9中所述的，將再生的植株轉(zhuǎn)移至滅菌的土壤中，移至溫室中生長。
取上述溫室中生長的再生番茄葉片按實(shí)例1中提到的方法，微量制備基因組DNA，取上述1μl總DNA，用引物5，引物6進(jìn)行50μl體系的PCR反應(yīng)，結(jié)果特異性地?cái)U(kuò)增到1．0kb大小的片段。
用DIG Detection Kit的方法做Southern雜交，證明已得到含Cre基因的轉(zhuǎn)基因植株。
實(shí)例11．含pCRE2A和pBINPU的轉(zhuǎn)基因番茄植株的雜交及F1代的獲得選擇實(shí)例9和實(shí)例10中經(jīng)Southern雜交為陽性的植株，用Trizol試劑盒提取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因番茄植株的總RNA，取10μg經(jīng)0．8％甲醛變性凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至帶正電荷的尼龍膜上，按DIG檢測試劑盒說明進(jìn)行Northern雜交，根據(jù)雜交信號強(qiáng)弱選擇信號強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因株系作雜交的父母本，開花期，將母本去雄，用相應(yīng)父本花粉、授粉、套袋、收獲成熟果實(shí)的種子。
實(shí)例12，果實(shí)中PinII基因的特異性刪除將實(shí)例11中得到的種子，經(jīng)表面滅菌處理后(見實(shí)例1)播種到含100mg／L卡那霉素的1／2MS固體培養(yǎng)基中，篩選能在含有抗生素中生根的轉(zhuǎn)基因株系，長至5厘米大小，轉(zhuǎn)移溫室土壤中生長，按實(shí)例1中所述方法提取總DNA，用引物5，引物6進(jìn)行50μl體系的PCR反應(yīng)，用引物7、引物8也進(jìn)行50μl體系的PCR反應(yīng)。選取既能擴(kuò)增出Cre基因又能擴(kuò)增出PinII基因的轉(zhuǎn)基因株系，生長至果實(shí)青熟期時(shí)提取果實(shí)組織中的總DNA，以PinII基因標(biāo)記探針，對同一株系的根、莖、葉片、果實(shí)總DNA進(jìn)行Dot Blot證明果實(shí)中檢測不到PinII信號，根、莖、葉中均有PinII信號。用PCR方法檢測，用引物7，引物8進(jìn)行50μl體系的PCR擴(kuò)增檢測不到PinII基因，用引物11，引物12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期大小的900bp的片段，回收該片段進(jìn)行測序，證明兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的PinII基因刪除，并留下一個(gè)單個(gè)loxP位點(diǎn)，Dot Blot和PCR檢測證明運(yùn)用Cre／loxP系統(tǒng)，并在2a12果實(shí)專一性啟動(dòng)子的作用下，可以特異性地刪除番茄果實(shí)中的外源基因。
權(quán)利要求
1.組織或器官中特異刪除外源基因的方法，該方法包括將第一個(gè)重組DNA序列，第二個(gè)重組DNA序列以轉(zhuǎn)化或再轉(zhuǎn)化的方式穩(wěn)定地引入一個(gè)植物細(xì)胞、將第三個(gè)重組DNA序列也穩(wěn)定導(dǎo)入一種植物細(xì)胞，其中所述的第一個(gè)重組DNA序列含有導(dǎo)致產(chǎn)生改變植物表型的第一個(gè)基因和一個(gè)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。第一個(gè)基因與組成型啟動(dòng)子可操作地相互連接。其中在第一個(gè)基因與組成型啟動(dòng)子組成的嵌合基因的兩側(cè)翼接有能被特異性識別和剪切的核苷酸序列。所述的第二個(gè)重組DNA序列含有編碼一種重組酶的第二個(gè)基因，且可操作地與組織或器官特異性啟動(dòng)子連接。所述的重組酶可特異性識別和剪切第一個(gè)重組DNA序列兩側(cè)翼的核苷酸序列。所述的第三個(gè)重組DNA序列是第一個(gè)重組DNA序列與第二個(gè)重組DNA序列的串接。從所述的植物細(xì)胞再生得到一個(gè)完整植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第三個(gè)重組DNA序列包含第一個(gè)重組DNA序列和第二個(gè)重組DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的組成型表達(dá)啟動(dòng)子包括CaMv35S啟動(dòng)子，水稻肌動(dòng)蛋白ActI啟動(dòng)子玉米泛素Ubi等啟動(dòng)子的一組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述器官或組織特異性啟動(dòng)子包括選自于葉片、根、莖(塊莖)、果實(shí)、花、種子等組織或器官中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，所包含的植物是黃瓜、番茄、香蕉、菠蘿、西瓜、甜瓜、梨、蘋果等作物的器官或組織特異啟動(dòng)子的一組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的第一個(gè)重組DNA序列中的第一個(gè)基因包括選自于殺蟲蛋白基因、殺真菌基因、殺細(xì)菌基因、抑真菌基因，除草劑基因、抗生素選擇標(biāo)記基因或人們不希望的在特異的器官或組織中表達(dá)的基因的一組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第二個(gè)重組DNA序列中能識別和剪切第一個(gè)重組DNA序列兩側(cè)翼特異核苷酸序列的重組酶的第二個(gè)基因包括Cre，F(xiàn)LP，R，Gin編碼的整合酶和轉(zhuǎn)位酶的一組特異性重組酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所說第一個(gè)重組DNA序列中能為重組酶特異性識別和剪切的核苷酸序列包括LoxP序列的和FRT，RS，Gix等序列的一組。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的組成型啟動(dòng)子是CaMv35S啟動(dòng)子。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的器官或組織特異性啟動(dòng)子是番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述的第一個(gè)基因是馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑PinII基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求6和7所述的方法，其中能被特異識別和剪切的序列是LoxP序列，能特異識別該序列的第二個(gè)基因是Cre編碼的重組酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的組成型啟動(dòng)子是CaMv35S，第一個(gè)基因是馬鈴薯胰蛋白的酶抑制劑II基因，器官或組織特性啟動(dòng)子是番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子。第二個(gè)基因是Cre重組酶基因，Cre重組酶特異性識別和剪切的序列是10xP序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的植物細(xì)胞再的植株可以是To，T1或T2代植株。
14.番茄果實(shí)中特異性刪除馬鈴薯蛋白酶抑制劑II的方法。包括將第一個(gè)重組DNA序列和第二個(gè)重組DNA序列以及第三個(gè)重組通過遺傳轉(zhuǎn)化的方式引入植物細(xì)胞，所述的第一個(gè)重組DNA序列含有馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑II基因和組成型表達(dá)的CaMv35S啟動(dòng)子，PinII基因與35S啟動(dòng)子功能性連接，并在其側(cè)翼含有特異性識別和剪切和核苷酸序列l(wèi)oxP。所述的第二個(gè)重組DNA序列含有番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子及其驅(qū)動(dòng)的能識別和剪切l(wèi)oxP序列的Cre重組酶基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，所述的第一個(gè)重組DNA序列和第二個(gè)重組DNA序列以共轉(zhuǎn)化方式引入同一植株細(xì)胞，則由該細(xì)胞再生完整植株(To 代)得到番茄果實(shí)特異刪除PinII基因的轉(zhuǎn)基因植株。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，所述的第一個(gè)重組DNA序列和第二個(gè)重組DNA序列以二次轉(zhuǎn)化方式引入同一植株細(xì)胞，則由該細(xì)胞再生完整植株(T1 代)得到番茄果實(shí)特異刪除PinII基因的轉(zhuǎn)基因植株。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，所述的第一個(gè)重組DNA序列和第二個(gè)重組DNA序列分別引入不同的植物細(xì)胞(To 代)，則所述的番茄果實(shí)特異刪除PinII基因的轉(zhuǎn)基因植株可通過兩個(gè)To代植株間的雜交并由T2代再生植株得到。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，所述的第三個(gè)重組DNA序列直接引入植物細(xì)胞，并且所述的果實(shí)特異性刪除的植株由該細(xì)胞直接再生為完整植株得到。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到18中任何一項(xiàng)所說的方法得到的，含有第一個(gè)和第二個(gè)重組DNA序列或第三個(gè)重組DNA序列的重組載體。包括但并不僅限于實(shí)施例中提到的pBINPU(含有l(wèi)oxP／P35S／PinII／loxP結(jié)構(gòu))和pCRE2A(含有P2a12／Cre結(jié)構(gòu))以及pLPINCRE(含有l(wèi)oxP／P35S／PinII-抗生素選擇標(biāo)記P2a12／Cre／loxP的結(jié)構(gòu))。
20.攜帶權(quán)利要求21中所限定的重組載體的宿主細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到20中任何一項(xiàng)所說的方法得到的，含有第一個(gè)和第二個(gè)重組DNA序列或第三個(gè)重組DNA序列的植物細(xì)胞和由之再生得到的完整植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)的可控的遺傳操作,用于在轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)代或后代的特定組織或器官中刪除選定的無用或有害基因。在設(shè)定DNA順序的上、下游,設(shè)置可為特定重組酶識別的位點(diǎn)。通過傳粉或轉(zhuǎn)化的程序,使重組酶基因進(jìn)入受控的遺傳工程體中?；蛲ㄟ^誘導(dǎo)基因表達(dá)的方法,將原有受控于器官專一性啟動(dòng)子的重組酶基因激活。重組酶在特定時(shí)間和特定部位將選定的DNA順序刪除。此法在基因功能分析中也有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N15/11GK1292416SQ0012280
公開日2001年4月25日 申請日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月25日
發(fā)明者林忠平, 甄偉, 胡鳶雷, 高音, 陳溪 申請人:林忠平