專利名稱：具有α－半乳糖苷酶活性的多肽及其編碼核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有α-半乳糖苷酶活性的新的多肽以及編碼該多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明也涉及包含該核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及制備該多肽的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及該多肽在B→O血型轉(zhuǎn)換中的用途。本發(fā)明還涉及一種B→O血型轉(zhuǎn)換方法。
ABO血型是臨床意義最為重要的血型系統(tǒng)，輸血時(shí)如果血型不符會(huì)引起急性溶血從而導(dǎo)致死亡。一般來說，O型血是通用型血，可以輸給任何血型的病人。如果能將其它血型的血液轉(zhuǎn)變?yōu)镺型，無疑可以充分利用血液資源，減少輸血事故，簡化輸血程序，縮短等待時(shí)間，對危急情況下的輸血急救意義更為重大。
人類A、B、O血型是由紅細(xì)胞表面作為抗原的糖鏈決定的，這些結(jié)構(gòu)相應(yīng)地稱為A、B、H抗原。B抗原與H抗原相比，內(nèi)部核心完全相同，差別僅在于前者的最末端多出的一個(gè)α-半乳糖殘基。在α-半乳糖苷酶活性的作用下，將B型紅細(xì)胞最末端的α-半乳糖殘基水解去除，就可以把B抗原改造成H抗原，從而將B型血轉(zhuǎn)變?yōu)镺型通用血(Yatziv et al，1971，Biochem.Biophys.Res.Commun，45，514-518)。
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22)是廣泛存在于人、動(dòng)物、植物、真菌以及原核生物體內(nèi)的一類外切糖苷水解酶(Corcheteet al，1987，Phytochemistry，26，927-932)，可高度特異性地水解去除各種多糖底物末端的α-半乳糖殘基，在生命代謝活動(dòng)中具有重要作用。
早在六、七十年代，人們就發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶具有水解血型抗原物質(zhì)的活性，并認(rèn)識(shí)到利用該酶的這一特性可以實(shí)現(xiàn)對人類血型的體外改造。
迄今，圍繞不同物種來源、特別是植物來源的α-半乳糖苷酶進(jìn)行了大量研究，但由于生化性質(zhì)不同，并非所有的α-半乳糖苷酶都適用于B→O血型轉(zhuǎn)變。其中，咖啡豆α-半乳糖苷酶被認(rèn)為是最佳選擇(Harpaz等人，1975，Arch.Biochem.Biophys，170，676-683)。有文獻(xiàn)報(bào)道，不同種類咖啡豆中存在多種形式的α-半乳糖苷酶的同工酶(Courtois等人，1966，Methods in Enzymol，8，565-571)。
美國專利4330619(1982年5月18日)和4427777(1984年1月24日)公開了利用從綠色Santos咖啡豆中提取的α-半乳糖苷酶將人紅細(xì)胞B型抗原轉(zhuǎn)變?yōu)镠型抗原的方法，從而證明此類酶具有B→O血型轉(zhuǎn)變的功能，但上述文獻(xiàn)未能提供可靠的、足以實(shí)用化的方法。另外，從咖啡豆等植物中提取的α-半乳糖苷酶含有丹寧、色素等成分，對α-半乳糖苷酶活性有抑制作用，更加限制了它的實(shí)際應(yīng)用(Goldsteinet al，1965，Phytochemistry，4，185-192)。
美國紐約血液中心Goldstein等利用上述Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶進(jìn)行B→O血型轉(zhuǎn)變研究，并于1996年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)開展人體臨床實(shí)驗(yàn)，但距離實(shí)際應(yīng)用尚有差距，主要原因在于，Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶的比活性較低，約為30U/mg，酶解轉(zhuǎn)變1ml B型紅細(xì)胞需要180-200U的酶，一個(gè)單位紅細(xì)胞則需約1-2g，用量大、花費(fèi)高，難以實(shí)用化(Lenny，1991，Blood，77，1383-1388)。另外，天然來源的α-半乳糖苷酶數(shù)量極其有限，從50磅Santos咖啡豆中提取的酶量僅能滿足一次血型轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)的需要。因此，在臨床中迫切需要有一種比活性較高、較易制備的α-半乳糖苷酶活性多肽。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種具有較高α-半乳糖苷酶活性的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明又一目的在于提供含有所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體，含有該核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的目的還在于提供該多肽的制備方法、用途，以及一種B→O血型轉(zhuǎn)換方法。
本發(fā)明涉及一種具有α-半乳糖苷酶活性的分離的多肽，其特征在于所述多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性更高。
本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的分離的多核苷酸，和包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及制備和應(yīng)用所述多肽的方法。


圖1顯示了中果咖啡Bourbon Santos栽培品種(Coffea canephora cv.Bourbon Santos，下文簡稱Santos)咖啡豆和小果咖啡Catimor栽培品種(Coffea arabica cv.Catimor，下文簡稱Catimor)咖啡豆的α-半乳糖苷酶基因cDNA序列的比較。其中劃線部分所示為編碼區(qū)，氨基酸順序以含信號(hào)肽的完整蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸計(jì)算。
圖2A、2B顯示了用來構(gòu)建Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶表達(dá)載體的載體pPICZαA及所構(gòu)建的表達(dá)載體pPICZ-Gal的結(jié)構(gòu)。
圖3說明在連續(xù)培養(yǎng)7天的過程中，重組菌株培養(yǎng)上清中α-半乳糖苷酶比活性的測定結(jié)果。
圖4說明用SDS-PAGE測定純化產(chǎn)物α-半乳糖苷酶的純度及蛋白質(zhì)分子量。
圖5說明B型紅細(xì)胞經(jīng)α-半乳糖苷酶酶解2小時(shí)后與各種抗體的血清學(xué)凝聚反應(yīng)情況。圖中A、B分別代表臨床上使用的標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B抗體；而1024、512、……、4、2等分別代表不同稀釋倍數(shù)的高滴度的抗B單克隆抗體。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的分離的多肽，其特征在于(1)所述多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且(2)該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性更高。
優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示序列的相同程度至少大約90％，更優(yōu)選至少是大約95％，最優(yōu)選至少大約97％(在本文中稱為“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該同源多肽具有的氨基酸序列與SEQ ID NO2氨基酸序列有5個(gè)氨基酸不同，優(yōu)選4個(gè)氨基酸不同，更優(yōu)選3個(gè)不同，還要優(yōu)選的是2個(gè)不同，最優(yōu)選1個(gè)氨基酸不同。為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)或更多氨基酸序列之間的相同程度通過BLAST2.0蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢程序(Altschul等，1997，核酸研究253389-3402)并采用以下參數(shù)確定blastall-pblastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查詢文檔]-d prot_all，其中-p指程序名稱，-a指將要用到的服務(wù)器數(shù)，-e指期望值，-E指延伸缺口的代價(jià)，-v指單線描述(one-line description)數(shù)，-b指將要顯示的比對數(shù)，-I指查詢文檔，-d指用于查詢的數(shù)據(jù)庫。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列；或其有α-半乳糖苷酶活性、且活性水平至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性更高的片段。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者其具有α-半乳糖苷酶活性、且活性水平至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性更高的片段組成。
SEQ ID NO2的片段是在該氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端缺失了一或多個(gè)氨基酸的多肽。優(yōu)選地，片段含有至少300個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少325個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選有至少350個(gè)氨基酸殘基。
同源多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2或其成熟多肽的氨基酸序列不同之處可能在于插入、添加和/或缺失1或多個(gè)氨基酸殘基和/或有1或多個(gè)氨基酸殘基被不同氨基酸殘基取代。優(yōu)選地，氨基酸改變是性質(zhì)改變較小的變化，即是不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大約30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸殘基；有多達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小連接肽；或可通過改變凈電荷或者其它功能而有助于純化的小延伸如多聚組氨酸片段、抗原表位或結(jié)合區(qū)。
保守性取代的例子是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)內(nèi)進(jìn)行的取代。通常不會(huì)改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白質(zhì)》一書，Academic Press，New York中描述過。最常見的替換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向進(jìn)行的替換。
本發(fā)明多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性水平高約25％，優(yōu)選至少高約50％，更優(yōu)選至少高約75％，最優(yōu)選至少高約99％。
本發(fā)明另外涉及一種具有α-半乳糖苷酶活性的分離的多肽，其特征在于(1)所述多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且(2)將該多肽與對-硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷1.25mmol/L，pH6.5混合，26℃溫育1小時(shí)后，測得的α-半乳糖苷酶活性至少高于30U/mg。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少約40U/mg。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少約50U/mg。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少約62U/mg。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可得自小果咖啡，尤其是小果咖啡Catimor栽培品種。
術(shù)語“可得自”在本發(fā)明上下文中指的是本發(fā)明的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽可由小果咖啡，優(yōu)選小果咖啡Catimor栽培品種產(chǎn)生，或可由插入了該來源的編碼具α-半乳糖苷酶活性之多肽的基因的細(xì)胞所產(chǎn)生。
在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
應(yīng)理解，對上述物種而言，本發(fā)明包括其它分類學(xué)等價(jià)物，而不管其已知物種名稱如何。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能輕易認(rèn)識(shí)到相應(yīng)等價(jià)名稱的一致性。
本發(fā)明之核酸序列編碼的多肽還包括在多肽或其片段的N-末端或C-末端融合了另一個(gè)多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。將編碼另一個(gè)多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合就可產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)已知，包括連接編碼多肽的編碼序列，從而使它們在同一讀框中，并且融合多肽的表達(dá)受控于相同的啟動(dòng)子和終止子。多核苷酸本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明所述多肽的核酸序列的分離多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸包含SEQ ID NO1的核苷酸序列。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含巴氏畢赤酵母CGMCC No.0479內(nèi)所含質(zhì)粒pPICZ-Gal中所具有的核苷酸序列。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的核酸序列，它與SEQ ID NO1之間因遺傳密碼的簡并性而有所不同。本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO1的亞序列的多核苷酸，所述亞序列編碼SEQ ID NO2的具有α-半乳糖苷酶活性、且活性水平至少是具有SEQ ID NO2所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性水平的75％的片段。本發(fā)明的核酸序列包括基因組序列，以及相應(yīng)的cDNA和RNA序列。此處所用術(shù)語“核酸序列”應(yīng)理解為包括合成DNA在內(nèi)的所有這類變種。
SEQ ID NO1的亞序列是SEQ ID NO1涵蓋的核酸序列，但從5’末端和/或3’末端缺失掉了1或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，亞序列含有至少900個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少975個(gè)核苷酸，最優(yōu)選至少1050個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還涉及含有在SEQ ID NO1的多肽編碼區(qū)內(nèi)至少有一個(gè)突變的突變核酸序列的分離多核苷酸，其中該突變核酸序列編碼SEQID NO2所示的多肽。
本發(fā)明還涉及編碼活性多肽、與SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列有一定同源性的核酸序列，同源程度至少約為70％、優(yōu)選約80％、更優(yōu)選約90％，還要優(yōu)選的是約95％，最優(yōu)選的是大約97％同源。就本發(fā)明目的而言，兩個(gè)核酸序列間的同源程度是通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur & Lipman，1983，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)80726-730)用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以及相同性表和以下多重對比參數(shù)缺口罰分和缺口長度罰分均為10確定的。成對對比參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，窗口(windows)＝20。
合成與本發(fā)明所述多肽基本相似的多肽時(shí)，可能有必要對編碼本發(fā)明多肽的核酸序列進(jìn)行修飾。術(shù)語與所述多肽“基本相似”是指非天然形式的多肽。這些多肽可能與從天然來源分離到的多肽在某些加工方式上不同。例如，可能希望用例如定點(diǎn)誘變來合成多肽的變體，這些變體有不同的熱穩(wěn)定性或最適pH等?？梢栽赟EQ ID NO1之多肽編碼部分的核酸序列，例如其亞序列基礎(chǔ)上構(gòu)建出類似序列；并/或通過引入核苷酸取代而構(gòu)建，所述取代不會(huì)使產(chǎn)生的氨基酸序列與原核酸序列編碼的多肽不同，但它們符合酶制備所用宿主生物對密碼子的使用習(xí)慣；或通過引入會(huì)產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構(gòu)建。關(guān)于核苷酸取代的綜述，參見例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以在分子功能關(guān)鍵區(qū)以外作這些取代，而仍可以得到活性多肽。那些為本發(fā)明所述分離核酸序列所編碼多肽的活性所必需、因此最好不進(jìn)行取代的氨基酸殘基可以依照本領(lǐng)域的已知操作，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(參見例如，Cunningham和Wells，1989，科學(xué)2441081-1085)進(jìn)行鑒定。后一種技術(shù)中，在分子中每個(gè)帶正電荷的殘基上導(dǎo)入突變，然后檢測所得突變分子的氨肽酶活性從而鑒定出對分子活性比較關(guān)鍵的氨基酸殘基。通過對用如核磁共振、晶體學(xué)或光親合標(biāo)記測定三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可以確定底物-酶相互作用的位點(diǎn)(參見例如，de Vos等，1992，科學(xué)255306-312；Smith等，1992，分子生物學(xué)雜志224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS快報(bào)(FEBS Letters)30959-64)。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸序列及與之可操作連接的1或多個(gè)調(diào)控序列的核酸構(gòu)建體，所述調(diào)控序列在其相容條件下能指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)應(yīng)理解為包括多肽生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，包括，但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
“核酸構(gòu)建體”在文中定義為單鏈或雙鏈核酸分子，它們分離自天然基因，或者經(jīng)修飾而含有以非天然方式組合和并列的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達(dá)本發(fā)明所述編碼序列必需的所有調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與表達(dá)盒同義。術(shù)語“編碼序列”在文中定義為核酸序列中直接確定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的部分。編碼序列的邊界通常是由緊鄰mRNA 5’端開放讀碼框上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(對于原核細(xì)胞)和緊鄰mRNA 3’端開放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止序列確定。編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
可以以多種方式操作編碼本發(fā)明所述多肽的分離的核酸序列，使其表達(dá)所述多肽?？赡芷谕虮仨氃诓迦胼d體之前對核酸序列進(jìn)行加工，這取決于表達(dá)載體。應(yīng)用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
本文中術(shù)語“控制序列”定義為包括表達(dá)本發(fā)明多肽所必需或有利的所有組分。每個(gè)調(diào)控序列對于編碼多肽的核酸序列可以是天然含有的或外來的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。為了導(dǎo)入特定的限制位點(diǎn)以便將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進(jìn)行連接，可以提供帶接頭的調(diào)控序列。術(shù)語“可操作連接”在文中定義為這樣一種構(gòu)象，其中調(diào)控序列位于相對DNA序列之編碼序列的適當(dāng)位置，以使調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
調(diào)控序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，即可被表達(dá)核酸序列的宿主細(xì)胞識(shí)別的核酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即能被宿主細(xì)胞識(shí)別從而終止轉(zhuǎn)錄的一段序列。終止序列可操作連接在編碼多肽的核酸序列的3’末端。在所選宿主細(xì)胞中可發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即對宿主細(xì)胞的翻譯十分重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作連接于編碼多肽的核酸序列的5’末端。在所選宿主細(xì)胞中可發(fā)揮功能的任何前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，該區(qū)編碼一段連在多肽氨基端的氨基酸序列，能引導(dǎo)編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核酸序列編碼區(qū)的5’端可能天然含有翻譯讀框一致地與分泌多肽的編碼區(qū)片段自然連接的信號(hào)肽編碼區(qū)?；蛘撸幋a區(qū)的5’端可含有對編碼序列是外來的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列在正常情況下不含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要添加外來信號(hào)肽編碼區(qū)?；蛘?，可以用外來的信號(hào)肽編碼區(qū)簡單地替換天然的信號(hào)肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽分泌。但是，任何能引導(dǎo)表達(dá)后的多肽進(jìn)入所用宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是肽原編碼區(qū)，該區(qū)編碼位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被稱為酶原或多肽原。多肽原通常沒有活性，可以通過催化或自我催化而從多肽原切割肽原而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端既有信號(hào)肽又有肽原區(qū)時(shí)，肽原區(qū)緊鄰多肽的氨基末端，而信號(hào)肽區(qū)則緊鄰肽原區(qū)的氨基末端。
添加能根據(jù)宿主細(xì)胞的生長情況來調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的調(diào)控序列可能也是需要的。調(diào)控系統(tǒng)的例子是那些能對化學(xué)或物理刺激物(包括在有調(diào)控化合物的情況下)作出反應(yīng)，從而開放或關(guān)閉基因表達(dá)的系統(tǒng)。調(diào)控序列的其他例子是那些能使基因擴(kuò)增的調(diào)控序列。在這些例子中，應(yīng)將編碼多肽的核酸序列與調(diào)控序列可操作連接在一起。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。可以將上述各種核酸和調(diào)控序列連接在一起來制備重組表達(dá)載體，該載體可以包括1或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)，以便在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘?，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達(dá)載體而表達(dá)本發(fā)明所述核酸序列。制備表達(dá)載體時(shí)，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作連接。
重組表達(dá)載體可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作并表達(dá)核酸序列的載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制型載體(即存在于染色體外的完整結(jié)構(gòu)，可獨(dú)立于染色體進(jìn)行復(fù)制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保證自我復(fù)制的任何機(jī)制?；蛘?，載體是一個(gè)當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，將整合到基因組中并與所整合到的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可應(yīng)用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或總體包含將導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體含有1或多個(gè)便于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是這樣一個(gè)基因，其產(chǎn)物賦予對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性，或賦予營養(yǎng)缺陷體原養(yǎng)型等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的抗性標(biāo)記。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體包含能使載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中，或保證載體在細(xì)胞中獨(dú)立于細(xì)胞基因組而進(jìn)行自主復(fù)制的元件。
就整合到宿主細(xì)胞基因組的情況而言，載體可以依賴于編碼多肽的核酸序列或載體的其他元件，以便載體通過同源或非同源重組穩(wěn)定地整合到基因組中?；蛘?，載體可含有用于引導(dǎo)通過同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中的附加核酸序列。附加的核酸序列能使載體整合到宿主細(xì)胞基因組中染色體上的精確位點(diǎn)。為了增加在精確位點(diǎn)整合的可能性，優(yōu)選整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如100到1500個(gè)堿基對，優(yōu)選400到1500個(gè)堿基對，最優(yōu)選800到1500個(gè)堿基對，而且與相應(yīng)靶序列高度同源，以增加同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
就進(jìn)行自主復(fù)制的情況而言，載體還可以包含復(fù)制起點(diǎn)，使載體能在目標(biāo)宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以帶有使其在宿主細(xì)胞中成為溫度敏感型的突變(參見例如，Ehrlich，1978，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)751433)。
可以向宿主細(xì)胞插入1個(gè)以上拷貝的本發(fā)明核酸序列以提高該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。該核酸序列的拷貝數(shù)增加可以通過將該序列的至少1個(gè)附加拷貝插入宿主細(xì)胞基因組中，或者與該核酸序列一起插入一個(gè)可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記，通過在有合適選擇試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞，挑選出含有擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細(xì)胞。
用于連接上述各元件來構(gòu)建本發(fā)明所述重組表達(dá)載體的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見例如，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含可用來重組生產(chǎn)多肽的本發(fā)明所述核酸序列的重組宿主細(xì)胞?？蓪景l(fā)明之核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使該載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于多肽編碼基因及其來源。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，優(yōu)選真核細(xì)胞，尤其是巴氏畢赤酵母?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
制備方法本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明多肽的方法，該方法包括從小果咖啡，尤其是小果咖啡Catimor栽培品種中純化該多肽。
本發(fā)明還涉及重組制備本發(fā)明多肽的方法，該方法包括(a)在適于產(chǎn)生該多肽的條件下，培養(yǎng)含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼該多肽的核酸序列；和(b)回收該多肽。
在本發(fā)明所述制備方法中，用本領(lǐng)域已知方法在適合多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳和氮源以及無機(jī)鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商提供或者可以參照公開的組成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)來制備。如果多肽被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以從細(xì)胞裂解物中回收。
可以用本領(lǐng)域已知針對所述多肽的特異方法檢測多肽。這些檢測方法包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以用酶法確定多肽的活性。用于測定α-半乳糖苷酶活性的步驟是本領(lǐng)域已知的。上文描述了一種測定α-半乳糖苷酶活性的方法。
可以用本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過常規(guī)操作(包括，但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收多肽。
可以通過各種本領(lǐng)域已知的操作來純化本發(fā)明所述多肽，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳(例如，制備性等電點(diǎn)聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(參見例如，蛋白質(zhì)純化，J.C.Janson和Lars Ryden 編，VCH Publishers，NewYork，1989)。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種B→O血型轉(zhuǎn)換方法，該方法包括以下步驟(1)分離B型血細(xì)胞，(2)用適當(dāng)?shù)牡葷B緩沖液洗滌B型血細(xì)胞，(3)加入權(quán)利要求1-16中任何一項(xiàng)所述的多肽，(4)在20-26℃溫育一至數(shù)小時(shí)，(5)用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述等滲緩沖液是酸性pH的PCS(60mMNaH2PO4，25mM檸檬酸鈉，75mM氯化鈉)，所述中性等滲緩沖液是PBS。
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例下述實(shí)施例中有關(guān)酵母的操作基本上按照Invitrogen公司(1600Faraday Avenue，Carlsbad，CA 92008，USA)提供的操作手冊進(jìn)行。
實(shí)施例1Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA的克隆采摘綠色新鮮的海南產(chǎn)Catimor咖啡豆，-70℃保存。取出-70℃保存的咖啡豆置于預(yù)冷的銅研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。經(jīng)丙酮溶液抽提去除丹寧和色素后，使用RNAgentsTMtotal RNA isolationsystem(Promega公司，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI53711-5399，USA)試劑盒提取細(xì)胞總RNA取抽提過的咖啡豆樣品50mg左右，加入變性液600μl，冰浴中混合均勻，立即加入60μl2MNaAc(pH4.0)溶液，充分混勻后加入600μl的酚∶氯仿∶異戊醇溶液(25∶24∶1)，放置冰上15分鐘；10,000×g 4℃離心20分鐘；水相加等體積異丙醇，-20℃沉淀30分鐘；10,000×g 4℃離心20分鐘；用冰預(yù)冷的75％乙醇充分洗滌沉淀，放置至半干燥后加適量無核酸酶的水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?長期保存則將RNA置于乙醇內(nèi)沉淀，-70℃保存)。利用紫外吸收和變性凝膠電泳檢測RNA含量、純度和完整性。
考慮到不同品種咖啡豆的α-半乳糖苷酶，其基因序列不應(yīng)有大的差別，我們參照文獻(xiàn)報(bào)道Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列(ZhuA.1994，基因，140(2)，227-231)，于編碼區(qū)外設(shè)計(jì)引物，上游引物為5’-CCGCTCGAGTTGGTGCTTCCGCT-3’、下游引物為5’-CGGAATTCTGCATTCTCCTG-3’，采用Access RT-PCR System(Promega，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI 53711-5399，USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR在50μl反應(yīng)體系中混合AMV/Tfl 5x緩沖液10μl、總RNA模板約1μg、上、下游引物各50pmol、逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶各1μl、dNTP混合物(各10mM)1μl、25mM MgSO42μl及適量水，48℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)45分鐘，94℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶2分鐘，進(jìn)入PCR循環(huán)94℃30秒、62℃1分鐘、68℃2分鐘，40個(gè)循環(huán)后68℃延伸7分鐘，以1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。經(jīng)鑒定，從Catimor咖啡豆總RNA中克隆出α-半乳糖苷酶cDNA編碼區(qū)，獲得了與預(yù)期大小一致的約1.2Kb片斷。
將PCR擴(kuò)增的cDNA片段連接到測序載體pGEMT-easy(Promega，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI 53711-5399，USA)中，按照本領(lǐng)域眾所周知的方法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)，利用質(zhì)粒純化試劑盒(Promega，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI 537u-5399，USA)按照生產(chǎn)商的操作指南提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測定。利用DNA自動(dòng)測序儀測定DNA序列，結(jié)果表明所獲得的是一種咖啡豆α-半乳糖苷酶的新的同工酶，即與Zhu A.等克隆的Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列比較，在第798位核苷酸為C，而不是T(編碼第233位氨基酸不變，均為Leu)，在第912位核苷酸為A，而不是G，從而導(dǎo)致第271位氨基酸為Thr，而不是Ala，余者同(
圖1)。分別獨(dú)立克隆兩次，重復(fù)測序結(jié)果均證明序列一致。
實(shí)施例2Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶重組表達(dá)載體pPICZ-Gal的構(gòu)建選用嗜甲醇酵母-巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)的分泌型表達(dá)載體pPICZαA(Invitrogen，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA 92008，USA)(圖2A)，該載體利用乙醇氧化酶AOX1啟動(dòng)子調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄，由釀酒酵母α交配因子的信號(hào)肽介導(dǎo)分泌表達(dá)，Zeocin抗性基因作為篩選標(biāo)志。在多克隆位點(diǎn)中，多數(shù)位點(diǎn)將使得所表達(dá)的外源基因產(chǎn)物5’端帶有載體序列編碼的若干氨基酸殘基，唯有信號(hào)肽末端的XhoI位點(diǎn)可以確保表達(dá)產(chǎn)物為天然形式，但該位點(diǎn)位于信號(hào)肽切割位點(diǎn)(Lys-Arg)的編碼序列(AAA AGA)之前，因此在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，為恢復(fù)信號(hào)肽的完整、保證閱讀框架的一致性，需要在Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶編碼序列(不包括其自身的信號(hào)肽順序)前端補(bǔ)加這兩個(gè)氨基酸的編碼序列。此外，為方便表達(dá)產(chǎn)物的純化，pPICZaA載體包含c-myc表位和多聚組氨酸金屬螯合區(qū)(6xHis)，位于外源基因插入位點(diǎn)下游，只需去掉外源基因自身的終止密碼，即可實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)，為此設(shè)計(jì)如下引物序列上游引物為5’-CCGCTCGAGAAAAGATTAGCAAATGGGCTT-3’；下游引物為5’-GCTCTAGACACTGTGGGGTTAGGAC-3’。以高保真度的Vent聚合酶(NEW ENGLAND BIOLABS，32 Tozer Road，Beverly，MA01915，USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94℃變性1分鐘，62℃退火2分鐘，72℃延伸3分鐘，35個(gè)循環(huán)后72℃繼續(xù)保溫延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI/XbaI酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收1.1kb片段，插入酵母載體pPICZaA的XhoI/XbaI位點(diǎn)，構(gòu)建的表達(dá)載體稱之為pPICZ-Gal(見圖2B)。
實(shí)施例3
獲得穩(wěn)定表達(dá)α-半乳糖苷酶的巴氏畢赤酵母重組菌株在5’AOX1區(qū)域選擇單一酶切位點(diǎn)SacI，對α-半乳糖苷酶表達(dá)載體pPICZ-Gal(10μg)進(jìn)行酶切線性化，酶切完全后(約2小時(shí))加熱或加EDTA溶液終止反應(yīng)，經(jīng)過酚/氯仿抽提、乙醇沉淀進(jìn)行滅菌處理，最后線性化的DNA溶液在10μl無菌去離子水中(約5～10μgDNA)，與按照Invitrogen公司(1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA92008，USA)提供的說明書制備的80μl巴氏畢赤酵母GS115(Invitrogen，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA 92008，USA)感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)到0.2cm冰預(yù)冷的無菌電擊杯中，冰浴5分鐘后，在1500V、25μF、200Ω條件下電擊，隨即加入1ml冰浴的1M山梨醇，轉(zhuǎn)到15ml試管中，30℃溫浴1～2小時(shí)(不要振蕩)，取100～200μl溶液涂布于含有抗生素Zeocin(200μg/ml)的YPD培養(yǎng)平板上，30℃保溫2～4天直至轉(zhuǎn)化克隆出現(xiàn)。
轉(zhuǎn)化克隆用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過觀察與生色底物反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化追蹤α-半乳糖苷酶表達(dá)情況，直接篩選陽性表達(dá)克隆將轉(zhuǎn)化子接種在硝酸纖維素膜上，鋪于YPD平板上培養(yǎng)，待克隆長成后，加入0.5％甲醇，誘導(dǎo)α-半乳糖苷酶表達(dá)，24小時(shí)后，將膜放在預(yù)先用α-半乳糖苷酶生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-α-半乳糖苷(1mg/ml，pH 6.5)浸濕的濾紙上，室溫放置15min，陽性克隆顏色將逐漸由黃變藍(lán)。挑選數(shù)十個(gè)陽性克隆，接種于5ml BMGY培養(yǎng)基中，加入0.5％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。取培養(yǎng)液樣品，5000rpm離心8min收集上清，將上清與α-半乳糖苷酶專一底物對-硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(1.25mmol/L，pH6.5)混合，26℃溫育1小時(shí)后，加硼酸鈉緩沖液(0.1mol/L，pH9.8)終止反應(yīng)，測定405nm處吸光值。一個(gè)單位(U)的α-半乳糖苷酶活性定義為在上述檢測條件下每分鐘水解1μmol底物的α-半乳糖苷酶量。酶活性(U)計(jì)算公式為[A405nmX反應(yīng)總體積(ml)]/[18.5X反應(yīng)時(shí)間(分)]
有關(guān)詳細(xì)內(nèi)容參見Kuo J-Y，Goldstein J，Enzyme MicrobiolTechnol 5285，1983。
檢測到其中編號(hào)為Zα-5的克隆可在每毫升培養(yǎng)上清中產(chǎn)生多達(dá)12U的α-半乳糖苷酶活性。
實(shí)施例4Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶的表達(dá)生產(chǎn)重組菌株在30℃富集生長，28℃誘導(dǎo)表達(dá)，有利于降低本底蛋白、提高目的蛋白的分泌表達(dá)量。將獲得的編號(hào)為Zα-5的重組菌株接種于10ml BMGY培養(yǎng)液(100mmol/L K3PO4，1.34％ YNB，0.00004％生物素，1％甘油)中，30℃搖瓶培養(yǎng)，生長至菌體密度A600nm＝10～20，室溫下以5000rpm離心8分鐘收集細(xì)胞，重懸于1/2體積BMMY(100mmol/L K3PO4，1.34％ YNB，0.00004％生物素，0.5％甲醇)中，28℃誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24小時(shí)取少量樣品，并補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5％。按照實(shí)施例3的方法對不同時(shí)間點(diǎn)的樣品測定比活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加，表達(dá)產(chǎn)物蓄積，α-半乳糖苷酶比活性逐漸升高。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，檢測到上清總蛋白濃度為1.2mg/ml，酶活性達(dá)到約18U/ml(見圖3)。
實(shí)施例5α-半乳糖苷酶表達(dá)產(chǎn)物的純化及活性測定收集重組菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)上清，利用Pharmacia KTA FPLC層析系統(tǒng)(Amersham Pharmacia，SE 751-84 Uppsala，Sweden)，以金屬螯合層析介質(zhì)Chelating Sepharose FF分離、純化α-半乳糖苷酶。純化采用的起始緩沖體系為10mM咪唑，20mM NaPO4，0.5M NaCl(pH7.4-7.6)，然后利用500mM咪唑，20mM NaPO4，0.5M NaCl(pH7.4-7.6)緩沖液洗脫目的蛋白。純化后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，呈現(xiàn)單一條帶，蛋白質(zhì)分子量約為41KD(見圖4)。純化產(chǎn)物用前述方法測定α-半乳糖苷酶比活性，達(dá)到62U/mg，遠(yuǎn)高于Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶30U/mg的水平(Zhu A.1995，Arch.Biochem.Biophys，324，65-70)。
實(shí)施例6Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶用于B→O血型轉(zhuǎn)變基本按照Goldstein J，Siviglia G，Hurst R等人，科學(xué)215168，1982和Lenny L，Hurst R，Goldstein J等人，Blood 771383-1388，1991的方法進(jìn)行。采集健康獻(xiàn)血員的B型紅細(xì)胞，于1250g離心分離4.8分鐘，用生理鹽水洗細(xì)胞3次，再用等滲的磷酸-檸檬酸-氯化鈉緩沖液(PCS60mM NaH2PO4，25mM檸檬酸鈉，75mM氯化鈉，pH5.5)洗4次，pH5.6的PCS洗2次，每毫升B型紅細(xì)胞加入50或100U上述純化獲得的α-半乳糖苷酶，使紅細(xì)胞比容保持在65-75％。在26℃緩慢振搖，進(jìn)行酶解反應(yīng)。于不同時(shí)間點(diǎn)采樣，以臨床醫(yī)院普遍使用的標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B單克隆抗體(來自安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥東南醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)的血型定型試劑)進(jìn)行血清凝集反應(yīng)測試，觀察到在酶解反應(yīng)進(jìn)行過程中，紅細(xì)胞與抗A抗體的凝聚反應(yīng)沒有任何變化，與抗B抗體的凝聚反應(yīng)則逐漸減弱，100U/ml反應(yīng)2小時(shí)后已檢測不到B型抗原；同時(shí)，選用該公司生產(chǎn)的一種供研究使用的、高滴度的抗B單克隆抗體，按2-1024不同稀釋倍數(shù)作倍比稀釋，更精細(xì)地檢測與B型紅細(xì)胞的凝聚反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，在與Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶相同的反應(yīng)條件下(Goldstein J等人，出處同前；Lenny L等人，出處同前)，使用100U/ml的高活性Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶，酶解2小時(shí)后B型紅細(xì)胞與各種抗A、抗B抗體均不發(fā)生凝聚反應(yīng)(見圖5)，呈現(xiàn)出O型通用血的特征，成功實(shí)現(xiàn)B→O血型轉(zhuǎn)變，而同樣的反應(yīng)，Santos咖啡豆α-半乳糖苷酶卻需要180-200U(GoldsteinJ等人，出處同前；Lenny L等人，出處同前)。
上述結(jié)果說明，該新型同工酶的比活性顯著提高，用于B→O血型轉(zhuǎn)變可大大降低酶的用量和成本，為B→O血型轉(zhuǎn)變的實(shí)用化奠定了基礎(chǔ)。
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保藏物 保藏號(hào)保藏日期巴氏畢赤酵母Zα-5CGMCC No.04792000年7月21日本文所描述和要求保護(hù)的發(fā)明并不限定在所公開的具體實(shí)施方案的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意在舉例說明本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何等價(jià)的實(shí)施方案均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，除了本文所示和所述，對本發(fā)明的修改方案在參照前面的描述后對本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些修改也包含在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。有沖突時(shí)，以本文公開內(nèi)容，包括定義為準(zhǔn)。
本文引用了很多文獻(xiàn)，它們均全文引入作為參考。
序列表<110>申請人中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所<120>發(fā)明名稱具有α-半乳糖苷酶活性的多肽及其編碼核酸<150>申請?zhí)柎?amp;lt;151>申請日待定<160>序列數(shù)3<210>1<211>1207<212>DNA<213>小果咖啡Catimimor栽培品種<400>11 GTTGGTGCTTCCGCT CGCCGGATGGTGAAG TCTCCAGGAACCGAG GATTACACTCGCAGGMetValLys SerProGlyThrGlu AspTyrThrArgArg15 1061 AGCCTTTTAGCAAAT GGGCTTGGTCTAACA CCTCCGATGGGGTGG AACAGCTGGAATCATSerLeuLeuAlaAsn GlyLeuGlyLeuThr ProProMetGlyTrp AsnSerTrpAsnHis15 20 25 30121 TTCCGTTGTAATCTT GATGAGAAATTGATC AGGGAAACAGCCGAT GCAATGGTATCAAAGPheArgCysAsnLeu AspGluLysLeuIle ArgGluThrAlaAsp AlaMetValSerLys35 40 45 50181 GGGCTTGCTGCACTG GGATATAAGTACATC AATCTTGATGACTGT TGGGCAGAACTTAACGlyLeuAlaAlaLeu GlyTyrLysTyrIle AsnLeuAspAspCys TrpAlaGluLeuAsn55 60 65 70241 AGAGATTCACAGGGG AATTTGGTTCCCAAA GGTTCAACATTCCCA TCAGGGATCAAAGCCArgAspSerGlnGly AsnLeuValProLys GlySerThrPhePro SerGlyIleLysAla75 80 85 90301 TTAGCAGATTATGTT CACAGCAAAGGCCTA AAGCTTGGAATTTAC TCTGATGCTGGAACTLeuAlaAspTyrVal HisSerLysGlyLeu LysLeuGlyIleTyr SerAspAlaGlyThr95 100 105 110361 CAGACATGTAGTAAA ACTATGCCAGGTTCA TTAGGACACGAAGAA CAAGATGCCAAAACCGlnThrCysSerLys ThrMetProGlySer LeuGlyHisGluGlu GlnAspAlaLysThr115 120 125 130421 TTTGCTTCATGGGGG GTAGATTACTTAAAG TATGACAACTGTAAC AACAACAACATAAGCPheAlaSerTrpGly ValAspTyrLeuLys TyrAspAsnCysAsn AsnAsnAsnIleSer135140 145 150481 CCCAAGGAAAGGTAT CCAATCATGAGTAAA GCATTGTTGAACTCT GGAAGGTCCATATTTProLysGluArgTyr ProIleMetSerLys AlaLeuLeuAsnSer GlyArgSerIlePhe155 160 165 170541 TTCTCTCTATGTGAA TGGGGAGAGGAAGAT CCAGCAACATGGGCA AAAGAAGTTGGAAACPheSerLeuCysGlu TrpGlyGluGluAsp ProAlaThrTrpAla LysGluValGlyAsn175 180 185 190601 AGTTGGAGAACCACT GGAGATATAGATGAC AGTTGGAGTAGCATG ACTTCTCGGGCAGATSerTrpArgThrThr GlyAspIleAspAsp SerTrpSerSerMet ThrSerArgAlaAsp195200 205 210661 ATGAACGACAAATGG GCATCTTATGCTGGT CCCGGTGGATGGAAT GATCCAGACATGCTGMetAsnAspLysTrp AlaSerTyrAlaGly ProGlyGlyTrpAsn AspProAspMet 215 220 225 230721 GAGGTGGGAAATGGA GGCATGACTACAACG GAATATCGATCCCAT TTCAGCATTTGGGCAGluValGlyAsnGly GlyMetThrThrThr GluTyrArgSerHis PheSerIleTrpAla235 240 245 250781 TTAGCAAAAGCACCT CTACTGATTGGCTGT GACATTCGATCCATG GACGGTACGACTTTCLeuAlaLysAlaPro LeuLeuIleGlyCys AspIleArgSerMet AspGly ThrPhe255 260 265 270841 CAACTGCTAAGCAAT GCGGAAGTTATTGCG GTTAACCAAGATAAA CTTGGCGTTCAAGGGGlnLeuLeuSerAsn AlaGluValIleAla ValAsnGlnAspLys LeuGlyValGlnGly275 280 285 290901 AACAAGGTTAAGACT TACGGAGATTTGGAG GTTTGGGCTGGACCT CTTAGTGGAAAGAGAAsnLysValLysThr TyrGlyAspLeuGlu ValTrpAlaGlyPro LeuSerGlyLysArg295 300 305 310961 GTAGCTGTCGCTTTG TGGAATAGAGGATCT TCCACGGCTACTATT ACCGCGTATTGGTCCValAlaValAlaLeu TrpAsnArgGlySer SerThrAlaThrIle ThrAlaTyrTrpSer315 320 325 3301021 GACGTAGGCCTCCCG TCCACGGCAGTGGTT AATGCACGAGACTTA TGGGCGCATTCAACCAspValGlyLeuPro SerThrAlaValVal AsnAlaArgAspLeu TrpAlaHisSerThr335 340 345 3501081 GAAAAATCAGTCAAA GGACAAATCTCAGCT GCAGTAGATGCCCAC GATTCGAAAATGTATGluLysSerValLys GlyGlnIleSerAla AlaValAspAlaHis AspSerLysMetTyr355 360 365 3701141 GTCCTAACCCCACAG TGATTAACAGGAGAA TGCAGAAValLeuThrProGln ***375 378<210>2<211>378<212>蛋白質(zhì)<213>小果咖啡Catimor栽培品種<400>2MetValLysSerPro GlyThrGluAspTyr ThrArgArgSerLeu LeuAlaAsnGlyLeu1 5 10 15 20GlyLeuThrProPro MetGlyTrpAsnSer TrpAsnHisPheArg CysAsnLeuAspGlu25 30 35 40LysLeuIleArgGlu ThrAlaAspAlaMet ValSerLysGlyLeu AlaAlaLeuGlyTyr45 50 55 60LysTyrIleAsnLeu AspAspCysTrpAla GluLeuAsnArgAsp SerGlnGlyAsnLeu65 70 75 80ValProLysGlySer ThrPheProSerGly IleLysAlaLeuAla AspTyrValHisSer85 90 95 100LysGlyLeuLysLeu GlyIleTyrSerAsp AlaGlyThrGlnThr CysSerLysThrMet105 110 115 120ProGlySerLeuGly HisGluGluGlnAsp AlaLysThrPheAla SerTrpGlyValAsp125 130 135 140TyrLeuLysTyrAsp AsnCysAsnAsnAsn AsnIleSerProLys GluArgTyrProIle145 150 155 160MetSerLysAlaLeu LeuAsnSerGlyArg SerIlePhePheSer LeuCysGluTrpGly165 170 175 180GluGluAspProAla ThrTrpAlaLysGlu ValGlyAsnSerTrp ArgThrThrGlyAsp185 190 195 200IleAspAspSerTrp SerSerMetThrSer ArgAlaAspMetAsn AspLysTrpAlaSer205 210 215 220TyrAlaGlyProGly GlyTrpAsnAspPro AspMet GluVal GlyAsnGlyGlyMet225 230 235 240ThrThrThrGluTyr ArgSerHisPheSer IleTrpAlaLeuAla LysAlaProLeuLeu245 250 255 260IleGlyCysAspIle ArgSerMetAspGly ThrPheGlnLeu LeuSerAsnAlaGlu265 270 275 280ValIleAlaValAsn GlnAspLysLeuGly ValGlnGlyAsnLys ValLysThrTyrGly285 290 295 300AspLeuGluValTrp AlaGlyProLeuSer GlyLysArgValAla ValAlaLeuTrpAsn305 310 315 320ArgGlySerSerThr AlaThrIleThrAla TyrTrpSerAspVal GlyLeuProSerThr325 330 335 340AlaValValAsnAla ArgAspLeuTrpAla HisSerThrGluLys SerValLysGlyGln345 350 355 360IleSerAlaAlaVal AspAlaHisAspSer LysMetTyrValLeu ThrProGln***365 370 375 378<210>3<211>378<212>蛋白質(zhì)<213>中果咖啡Bourbon Santos栽培品種<400>3MetValLysSerPro GlyThrGluAspTyr ThrArgArgSerLeu LeuAlaAsnGlyLeu1 5 10 15 20GlyLeuThrProPro MetGlyTrpAsnSer TrpAsnHisPheArg CysAsnLeuAspGlu25 30 35 40LysLeuIleArgGlu ThrAlaAspAlaMet ValSerLysGlyLeu AlaAlaLeuGlyTyr45 50 55 60LysTyrIleAsnLeu AspAspCysTrpAla GluLeuAsnArgAsp SerGlnGlyAsnLeu65 70 75 80ValProLysGlySer ThrPheProSerGly IleLysAlaLeuAla AspTyrValHisSer85 90 95 100LysGlyLeuLysLeu GlyIleTyrSerAsp AlaGlyThrGlnThr CysSerLysThrMet105 110 115 120ProGlySerLeuGly HisGluGluGlnAsp AlaLysThrPheAla SerTrpGlyValAsp125 130 135 140TyrLeuLysTyrAsp AsnCysAsnAsnAsn AsnIleSerProLys GluArgTyrProIle145 150 155 160MetSerLysAlaLeu LeuAsnSerGlyArg SerIlePhePheSer LeuCysGluTrpGly165 170 175 180GluGluAspProAla ThrTrpAlaLysGlu ValGlyAsnSerTrp ArgThrThrGlyAsp185 190 195 200IleAspAspSerTrp SerSerMetThrSer ArgAlaAspMetAsn AspLysTrpAlaSer205 210 215 220TyrAlaGlyProGly GlyTrpAsnAspPro AspMet GluVal GlyAsnGlyGlyMet225 230 235 240ThrThrThrGluTyr ArgSerHisPheSer IleTrpAlaLeuAla LysAlaProLeuLeu245 250 255 260IleGlyCysAspIle ArgSerMetAspGly AlaThrPheGlnLeu LeuSerAsnAlaGlu265 270 275 280ValIleAlaValAsn GlnAspLysLeuGly ValGlnGlyAsnLys ValLysThrTyrGly285 290 295 300AspLeuGluValTrp AlaGlyProLeuSer GlyLysArgValAla ValAlaLeuTrpAsn305 310 315 320ArgGlySerSerThr AlaThrIleThrAla TyrTrpSerAspVal GlyLeuProSerThr325 330 335 340AlaValValAsnAla ArgAspLeuTrpAla HisSerThrGluLys SerValLysGlyGln345 350 355 360IleSerAlaAlaVal AspAlaHisAspSer LysMetTyrValLeu ThrProGln***365 370 375 378
權(quán)利要求
1.一種具有α-半乳糖苷酶活性的分離的多肽，其特征在于(1)所述多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，(2)該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性更高。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的多肽，其由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其亞序列組成。
6.權(quán)利要求1的多肽，其可得自小果咖啡。
7.權(quán)利要求1的多肽，其可得自小果咖啡Catimor栽培品種。
8.權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的多肽，該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性高約25％。
9.權(quán)利要求8的多肽，該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性高約50％。
10.權(quán)利要求8的多肽，該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少比具有SEQ ID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性高75％。
11.權(quán)利要求8的多肽，該多肽的α-半乳糖苷酶活性比具有SEQID NO3所示序列之多肽的α-半乳糖苷酶活性至少高約100％。
12.一種包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
13.一種具有α-半乳糖苷酶活性的分離的多肽，其特征在于(1)所述多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且(2)將該多肽與對-硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷1.25mmol/L，pH6.5混合，26℃溫育1小時(shí)后，測得的α-半乳糖苷酶活性至少高于30U/mg。
14.權(quán)利要求13的多肽，其特征在于該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少約40U/mg所述純多肽。
15.權(quán)利要求13的多肽，其特征在于該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少約50U/mg。
16.權(quán)利要求13的多肽，其特征在于該多肽的α-半乳糖苷酶活性至少約62U/mg。
17.包含編碼權(quán)利要求1多肽的核酸序列和/或其互補(bǔ)序列的分離的多核苷酸。
18.包含在SEQ ID NO1的多肽編碼核酸序列中有至少一個(gè)突變的核酸序列和/或其互補(bǔ)序列的分離的多核苷酸，其中所述突變核酸序列編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
19.包含權(quán)利要求17或18的多核苷酸，以及與之可操作連接、可指導(dǎo)多肽在適當(dāng)表達(dá)宿主中生產(chǎn)的一或多個(gè)控制序列的核酸構(gòu)建體。
20.一種重組表達(dá)載體，其中包含權(quán)利要求19的核酸構(gòu)建體。
21.一種重組宿主細(xì)胞，其中包含權(quán)利要求19的核酸構(gòu)建體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的重組宿主細(xì)胞，它是巴氏畢赤酵母。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的重組宿主細(xì)胞，它是CGMCC No.0479。
24.生產(chǎn)權(quán)利要求1或13的多肽的方法，包括從小果咖啡中純化該多肽。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述小果咖啡是Catimor栽培品種。
26.生產(chǎn)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的多肽的方法，包括(a)在適于產(chǎn)生該多肽的條件下，培養(yǎng)含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼該多肽的核酸序列；和(b)回收該多肽。
27.由權(quán)利要求24或25的方法生產(chǎn)的多肽。
28.由權(quán)利要求26的方法生產(chǎn)的多肽。
29.權(quán)利要求1-16、27和28中任何一項(xiàng)的多肽在B→O血型轉(zhuǎn)換中的應(yīng)用。
30.一種B→O血型轉(zhuǎn)換方法，該方法包括以下步驟(1)分離B型血細(xì)胞，(2)用適當(dāng)?shù)牡葷B緩沖液洗滌B型血細(xì)胞，，(3)加入權(quán)利要求1-16中任何一項(xiàng)所述的多肽，(4)在20-26℃溫育一至數(shù)小時(shí)，(5)用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有較高α－半乳糖苷酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及含有該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)這些多肽的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述多肽在B→O血型轉(zhuǎn)換中的應(yīng)用。本發(fā)明另外涉及一種B→O血型轉(zhuǎn)換方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1338466SQ0012273
公開日2002年3月6日 申請日期2000年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日
發(fā)明者楊軍, 章?lián)P培 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所