專利名稱：一種產β-D-半乳糖苷酶的菌株及用該酶生產低聚半乳糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能夠生產β -D-半乳糖苷酶的一種新微生物菌株及其培養(yǎng)發(fā)酵生產β -D-半乳糖苷酶，并將該酶用于生物制備低聚半乳糖的方法，屬于食品生物技術領域。更 具體的說本發(fā)明涉及來源于土壤的克魯維酵母(Kluyveromycessphaeroides)SK 16. 001， 保藏編號為CCTCC NO =M 2010073，它能夠產生β-D-半乳糖苷酶，并利用該酶催化乳糖合
ISIK^iLH (galacto-oligosaccharides)。
背景技術：
近年來，功能食品成為廣大消費者關注的熱點，更是廣大食品從業(yè)者研發(fā)的焦點。 糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低齡化，使得低熱量、具有更多功能營養(yǎng)特性 的功能性甜味劑成為關注的熱點。低聚半乳糖是由半乳糖基和葡萄糖基構成的聚合度為2 6的寡糖，低聚半乳糖 具有甜度低，水分活度低，對酸、熱穩(wěn)定等理化性質。低聚半乳糖還具有非致齲齒性、非消化 性(具有類似膳食纖維的生理功能)、促進腸道雙岐桿菌增殖等功能。因此，低聚半乳糖作為一種功能性食品添加劑廣泛應用于乳制品、糖果、罐頭等食
P
ΡΠ O酶法合成是工業(yè)化生產低聚半乳糖的主要途徑。β -D-半乳糖苷酶屬于水解酶類， 同時具有轉移酶類性質。一方面，β-D-半乳糖苷酶可以催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳 糖，另一方面，還可以催化半乳糖基轉移至乳糖等受體上的轉移反應。酶法合成低聚半乳糖的產率受多種因素影響，酶的來源直接影響酶法合成的低聚 半乳糖的結構和產率。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種微生物可以產生此酶，其中主要集中在米曲霉 (A. Oryzae)、黑曲霉(A. niger)和乳酸克魯維酵母(K. Iactis)。本發(fā)明人深入調查和研究了現(xiàn)有技術并對各種高收率生產低聚半乳糖的方法進 行了研究，最終我們篩選到一株能產生β -D-半乳糖苷酶的新微生物，證明了通過此酶與 高濃度的乳糖反應能得到高轉化率的低聚半乳糖，并通過濃縮干燥等手段得到低聚半乳糖 的糖漿或粉末?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)提出了本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的微生物，它能夠生產高酶活的β -D-半乳糖苷酶。本發(fā)明的另一個目的是提供一種該β -D-半乳糖苷酶與高濃度乳糖溶液反應的 方法，以得到高轉化率的低聚半乳糖。本發(fā)明的再一個目的是提供一種低聚半乳糖提純與精制的方法，以得到高低聚半 乳糖糖漿或粉末。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種來源于土壤的克魯維酵母(Kluyveromyces sphaeroides)SK 16. 001，其為能夠產生β _D_半乳糖苷酶的菌株，并利用該β-D-半乳糖苷酶轉化乳糖生成低聚半乳糖。本發(fā)明的技術方案一株產β-D-半乳糖苷酶的菌株，其分類命名為克魯維酵母(Kluyveromyces sphaeroides) SK 16.001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號 為 CCTCC NO :M 2010073。用所述的微生物克魯維酵母SK 16. 001，即CCTCC NO =M 2010073菌株發(fā)酵生產 β -D-半乳糖苷酶的方法，步驟為⑴種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l_40g/L，pH5. 5-8. 0，去離 子水配制；種子培養(yǎng)條件菌株于28-30°C、100-250rpm的振蕩速度下在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng) 10-20h來活化該微生物；⑵發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨 l-20g/L，乳糖 l_30g/L，pH5. 5-8. 0 ；發(fā)酵條件25-30°C、攪拌速度400-700rpm、空氣流量0. 5-1. Ovvm的條件下在發(fā)酵 培養(yǎng)基中發(fā)酵10_48h生產β -D-半乳糖苷酶；(3)發(fā)酵后處理發(fā)酵液經冷凍離心后收集濕菌體，用pH7. 0的0. lmol/L磷酸鹽緩沖液制成菌懸 液，然后菌體細胞破壁提取出β-D-半乳糖苷酶。冷凍離心后，收集的上清液即為粗酶液， 經檢測酶活達到2-100U/mL ；所得粗酶液進一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到 β-D-半乳糖苷酶的粗酶粉。用制備的β-D-半乳糖苷酶轉化乳糖生產低聚半乳糖的方法，向質量濃度 20% -80%乳糖溶液中添加β-D-半乳糖苷酶催化轉化生產低聚半乳糖，轉化條件為底物 乳糖濃度范圍為20% _80%，酶對底物用量為0. l_30U/g乳糖干基計，ρΗ4. 0-8. 0，轉化反應 溫度為30-50°C，轉化反應時間3-36h，轉化率可達30%以上，得到含有低聚半乳糖的酶反 應液，進一步加工處理用于制備低聚半乳糖糖漿或低聚半乳糖粉末。低聚半乳糖糖漿的制備方法，步驟為(1)脫色在含有低聚半乳糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量0.2% -2.0%的 活性炭，在50-8(TC下溫育10-60min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質量含量為20% _70%，即得低聚半乳糖糖漿。低聚半乳糖糖粉末的制備方法，步驟為(1)脫色同以上所述脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質量含量為20% -40%的濃縮液；(3)噴霧干燥將麥芽糊精與低聚半乳糖濃縮液以固形物含量干基計，按照質量比1 1-1 5的比例混合，控制進風溫度170-180°C、出風溫度70-80°C，噴霧干燥，得到含麥芽糊精的低 聚半乳糖粉末。低聚半乳糖含量測定方法樣品預處理將酶反應液稀釋至總固形物含量為10%，經0.45 μ m超濾膜過濾。 濾液上HPLC分析。HPLC條件=Agilent 1200系列，配有Shodex RI-101示差折光檢測器 和Agilent數(shù)模轉換器。色譜柱NH2P-504. 6mm i. d. X 250mm氨基柱；流動相乙腈/水 65/35 (V/V)，流速lmL/min ；溫度35°C ；進樣量10yL。低聚半乳糖含量為轉移二糖與三 糖的數(shù)量之和。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明涉及一株從土壤中篩選而來的克魯維酵母 (Kluyveromyces sphaeroides) SK 16. 001，保藏編號為 CCTCC NO :M 2010073，以此酵母菌 為發(fā)酵菌株，以乳糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產β-D-半 乳糖苷酶，發(fā)酵后經檢測，在發(fā)酵液中酶活達到2-100U/mL。將β-D-半乳糖苷酶添加到 20% -80%乳糖溶液中催化合成低聚半乳糖，轉化3-36h，轉化率達30%以上。本發(fā)明方法 生產的低聚半乳糖產品安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性甜味劑。
生物材料樣品保藏一株用于微生物轉化發(fā)酵生產β -D-半乳糖苷酶的菌株，其 分類命名為克魯維酵母(Kluyveromyces sphaeroides) SK 16. 001，已保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2010073，保藏日期為2010年4月2日。


圖1實施例2中低聚半乳糖的高效液相色譜圖。
具體實施例方式以下是克魯維酵母SK16. 001進行發(fā)酵生產β -D-半乳糖苷酶及酶法轉化生產低 聚半乳糖的實施例，但本發(fā)明并不限于所列出的幾個實例。實施例1微生物發(fā)酵產酶用SK 16. 001進行培養(yǎng)發(fā)酵，按說明書所述的發(fā)酵條件，通過對不同發(fā)酵時間產 酶的檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵15h后酶活已經趨于平穩(wěn)，故確定發(fā)酵時間為15h左右。發(fā)酵時間對產 β -D-半乳糖苷酶的影響如表1所示。酶活力定義為ImL酶液Imin催化鄰硝基酚β -D-半 乳糖苷(ONPG)水解生成Iymol鄰硝基酚(ONP)為一個酶活力單位。表1發(fā)酵時間對產β -D-半乳糖苷酶的影響
~時間(h)Γ~6 Γ~912 ~~15 ~~18 21 24
~0 -D-半乳糖苷酶酶活(U/mL) 0 77 7Γ86 11. 49 ~11. 22 ~10. 60 ~11. 41 ~11. 02實施例2酶法轉化乳糖生成低聚半乳糖向質量濃度40%乳糖溶液中添加β -D-半乳糖苷酶催化轉化，轉化條件為底物 乳糖質量濃度為40%，酶對底物用量為10U/g乳糖干基計，pH7. 0，轉化反應溫度為40°C，轉化反應時間20h，得到含有30%低聚半乳糖的酶反應液。實施例3酶法轉化乳糖生成低聚半乳糖向質量濃度80%乳糖溶液中添加β -D-半乳糖苷酶催化轉化，轉化條件為底物 乳糖質量濃度為80%，酶對底物用量為30U/g乳糖干基計，pH7. 0，轉化反應溫度為50°C，轉 化反應時間36h，得到含有32%低聚半乳糖的酶反應液。實施例4低聚半乳糖糖漿的制備(1)脫色在含有低聚半乳糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量0.2% -2.0%的 活性炭，在80°C下溫育30min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質量含量為20% _70%，即得低聚半乳糖糖漿。實施例5低聚半乳糖粉末的制備(1)脫色同實施例4所述脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質量含量為20% -40%的濃縮液；(3)噴霧干燥將麥芽糊精與低聚半乳糖濃縮液以固形物含量干基計，按照質量比1 1-1 5 的比例混合，控制進風溫度170-180°C、出風溫度70-80°C，噴霧干燥，得到含麥芽糊精的低 聚半乳糖粉末。
權利要求
一株產β-D-半乳糖苷酶的菌株，其分類命名為克魯維酵母(Kluyveromycessphaeroides)SK16.001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOM 2010073。
2.用權利要求1所述的CCTCCNO :M 2010073菌株發(fā)酵生產3-D-半乳糖苷酶的方法， 其特征在于步驟為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH5. 5-8. 0，去離子水 配制；種子培養(yǎng)條件菌株于28-30°C、100-250rpm的振蕩速度下在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng) 10-20h活化該菌株；(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏l(xiāng)_20g/L，蛋白胨l-20g/L，乳糖l-30g/L，pH5. 5-8. 0 ；發(fā)酵條件25-30°C、攪拌速度400-700rpm、空氣流量0. 5-1. Ovvm的條件下在發(fā)酵培養(yǎng) 基中發(fā)酵10_48h生產3 -D-半乳糖苷酶；(3)發(fā)酵后處理發(fā)酵液經冷凍離心后收集濕菌體，用PH7. 0的0. lmol/L磷酸鹽緩沖液制成菌懸液，然 后菌體細胞破壁提取出3 -D-半乳糖苷酶；冷凍離心后，收集的上清液即為粗酶液，經檢測 酶活達到2-100U/mL ；所得粗酶液進一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到3 -D-半 乳糖苷酶的粗酶粉。
3.用權利要求2所述方法制備的3-D-半乳糖苷酶轉化乳糖生產低聚半乳糖的方法， 其特征在于向底物乳糖溶液中添加3 -D-半乳糖苷酶進行催化轉化生產低聚半乳糖，轉化條件 為乳糖溶液的乳糖質量濃度為20% -80%，酶對底物用量為0. l-30U/g乳糖干基計， PH4. 0-8.0，轉化反應溫度為30-50°C，轉化反應時間3_36h，轉化率達30%以上，得到含有 低聚半乳糖的酶反應液，進一步加工處理用來制備低聚半乳糖糖漿或低聚半乳糖粉末。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于低聚半乳糖糖漿的制備方法，步驟為(1)脫色在含有低聚半乳糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量0.2% -2.0%的活性 炭，在50-80°C下溫育10-60min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質量含量為20% _70%，即得低聚半乳糖糖漿。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于低聚半乳糖粉末的制備方法，步驟為(1)脫色同權利要求4所述脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發(fā)濃縮至固形物質量含量為20% -40%的濃縮液；(3)噴霧干燥將麥芽糊精與低聚半乳糖濃縮液以固形物含量干基計，按照質量比1 1-1 5的比例混合，控制進風溫度170-180°C、出風溫度70-80°C，噴霧干燥，得到含麥芽糊精的低聚半 乳糖粉末。
全文摘要
一種產β-D-半乳糖苷酶的菌株及用該酶生產低聚半乳糖的方法，屬于食品生物技術領域。本發(fā)明涉及一株從土壤中篩選而來的克魯維酵母(Kluyveromycessphaeroides)SK 16.001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 2010073，以此酵母菌為發(fā)酵菌株，以乳糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源等組成發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產β-D-半乳糖苷酶，發(fā)酵后經檢測，在發(fā)酵液中酶活達到2-100U/mL。將β-D-半乳糖苷酶添加到20％-80％乳糖溶液中轉化乳糖生產低聚半乳糖，轉化3-36h，轉化率達30％以上。本發(fā)明方法生產的低聚半乳糖產品安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性甜味劑。
文檔編號C12P19/14GK101831389SQ20101016076
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月19日 優(yōu)先權日2010年4月19日
發(fā)明者劇淑君, 張濤, 江波, 繆銘 申請人:江南大學