專利名稱：凋亡抑制因子api4基因?yàn)榘袠?biāo)的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及其用途，具體地說涉及凋亡抑制因子基因靶標(biāo)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。
腫瘤分子生物學(xué)研究表明，腫瘤是由于基因異常引起的疾病。致病機(jī)理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及細(xì)胞周期的異常。腫瘤發(fā)病分子機(jī)理的進(jìn)一步闡明為腫瘤的基因治療提供了可靠的理論依據(jù)。近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)是腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。反義技術(shù)是近十幾年興起的生物高技術(shù)，用反義技術(shù)封閉和抑制特定基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分。1978年Stephenson和Zamenick用互補(bǔ)寡聚核苷酸特異性抑制Rous肉瘤病毒的復(fù)制，首次提出了反義寡聚脫氧核糖核苷酸(ASODN)抑制基因表達(dá)的概念。ASODN是根據(jù)Watson-Crick堿基配對(duì)原理能夠與mRNA的堿基對(duì)互補(bǔ)阻止其翻譯成蛋白質(zhì)的DNA。反義寡核苷酸具有定向合理設(shè)計(jì)，體內(nèi)外作用高效和能人工大規(guī)模合成等藥用特性，因而近年來成為治療病毒感染，腫瘤，及其它由于基因表達(dá)異常引起的疾病的一類潛在型藥物，其中腫瘤相關(guān)基因可作為反義藥物作用的靶標(biāo)。
本發(fā)明的目的是根據(jù)腫瘤相關(guān)基因API4設(shè)計(jì)12條寡核苷酸序列(見表1)，采用PE公司產(chǎn)391A型DNA合成儀合成并采用硫代修飾，經(jīng)Micro PureII反向柱(Solid PhaseScience)純化后，以此產(chǎn)物作為腫瘤的治療藥物。
表1 反義寡核苷酸序列及性質(zhì)序號(hào) 靶位(nt)長度(nt) 特性 序列(5’-3’)1644-663 20AGCAGAAGCACCTCTGGTGCC2748-767 20ATTCTCACCTGGTAAGCCCGG3916-935 20AGATAAGGAACCTGCAGCTCA41002-1021 20ACACACAAGTCATGCATCTAC51403-1422 20ACCGTGTGGAGAACGTGACAG612-31 20AGCCAACGGGTCCCGCGATTC733-52 20ACATGCCGCCGCCGCCACCTC838-57 20AGCACCCATGCCGCCGCCGCC946-65 20AAACGTCGGGGCACCCATGCC10 36-55 20AACCCATGCCGCCGCCGCCAC11 29-48 20ACCGCCGCCGCCACCTCTGCC12 42-61 20ACGGGGCACCCATGCCGCCGC本發(fā)明的主要內(nèi)容是選取了API4基因作為靶標(biāo)進(jìn)行抗腫瘤反義寡核苷酸的篩選和評(píng)價(jià)，API4是凋亡抑制因子(IAP)，IAP抑制細(xì)胞凋亡可調(diào)節(jié)組織分化，促進(jìn)突變發(fā)生和產(chǎn)生治療抗性而促進(jìn)新生物中細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。API4在胚胎發(fā)育中起作用，在成熟發(fā)育的組織中則不出現(xiàn)，而在最終發(fā)展成腫瘤的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)。人類許多腫瘤如肺癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，前列腺癌，乳癌及50％的淋巴瘤均可出現(xiàn)較高表達(dá)。
在針對(duì)API4基因的12條反義寡核苷酸中，10#的體外抑制細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)且具有持續(xù)性，在用藥后的4天內(nèi)細(xì)胞增殖抑制率持續(xù)上升，第四天抑制率達(dá)到97％的峰值，至第5天開始緩慢下降，第六天降至82.4％。10#序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)由內(nèi)環(huán)-莖-內(nèi)環(huán)-莖-膨脹環(huán)-莖-發(fā)夾部組成(A＝3，T＝1，C＝12，G＝4)。
10#藥物對(duì)荷HepG2人肝細(xì)胞癌(接種的細(xì)胞數(shù)為3×106個(gè)/只)裸鼠的腫瘤生長具有明顯的抑制作用，抑瘤率可達(dá)63.9％；此藥物對(duì)裸鼠的體重及生長狀態(tài)無明顯影響，無肉眼可見的毒性。瘤組織的病理切片表明，用藥組瘤組織大片壞死，組織間有纖維化，瘤周多為淋巴細(xì)胞浸潤，而對(duì)照組以彌漫性點(diǎn)狀，片狀壞死為主，瘤周炎細(xì)胞浸潤以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主。結(jié)果證明10#硫代寡核苷酸體內(nèi)外具有抑瘤率高、持續(xù)時(shí)間長、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明中所涉及的寡核苷酸或其修飾組成物可用于治療肝癌。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明中針對(duì)API4基因治療腫瘤的優(yōu)選序列為10#序列。下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施作詳細(xì)說明

圖1為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上的增殖抑制率；圖2為反義寡核苷酸序列的優(yōu)化；圖3為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上作用時(shí)間的持續(xù)性；圖4為反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤體積的抑制情況；圖5為反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠體重的抑制情況；圖6為反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤重量的影響。
實(shí)施例一體外抗腫瘤活性ASODN篩選和評(píng)價(jià)1.材料和方法1.1 反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)和合成本研究選取了API4基因作為靶標(biāo)進(jìn)行抗腫瘤反義寡核苷酸的篩選和評(píng)價(jià)，基因序列由Genbank獲得，通過國際互聯(lián)網(wǎng)引入RNAStructure 3.2分析軟件，選擇RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中膨脹環(huán)，內(nèi)環(huán)，發(fā)夾，多分支連接部等結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的區(qū)域作為反義藥物作用的靶點(diǎn)，針對(duì)API4 mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了5條針對(duì)3’非編碼區(qū)的序列和4條針對(duì)5’非編碼區(qū)的序列1-9(具體序列見表1)。反義硫代寡聚核苷酸為無色粉末狀，合成后濃氨水55℃脫保護(hù)15小時(shí)，然后用反相柱(購自solid phase sciense公司)層析純化。體外實(shí)驗(yàn)用無雙抗的DMEM培養(yǎng)基配制，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用生理鹽水配制，保存于-20℃。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定人肝癌(HepG2)細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。將其用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種5×103細(xì)胞/0.2ml。待50-60％細(xì)胞融合后，在無血清狀態(tài)下，采用lipofectin(GIBCO，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行硫代反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染。每條硫代反義寡核苷酸設(shè)置3個(gè)濃度，分別為0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L.每個(gè)濃度3孔，每孔總體積為100μl，并設(shè)置細(xì)胞和脂質(zhì)體對(duì)照。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，換含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)19小時(shí)，于培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加20μl MTS(Promega)，并繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘，于492nm測(cè)定光吸收，計(jì)算抑制率。1.3 10#作用持續(xù)時(shí)間測(cè)定HepG2細(xì)胞接種于96孔板(3000/孔)，待50-60％細(xì)胞融合后，轉(zhuǎn)染10#一次，終濃度為0.2μmol/L。分別于轉(zhuǎn)染后第1-6天，各取3孔細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞增殖抑制情況，觀察其作用持續(xù)時(shí)間。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1反義寡核苷酸作用靶位的選擇針對(duì)API4mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了5條針對(duì)3’非編碼區(qū)的序列和4條針對(duì)5’非編碼區(qū)的序列1-9(序列見表1)。圖1所示，針對(duì)5’編碼區(qū)的7#序列在0.2μM時(shí)抑制率是68.5％，0.4μM時(shí)抑制率是79.7％，0.8μM時(shí)抑制率是89.1％。它的細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)。2.2 反義寡核苷酸序列的優(yōu)化在反義寡核苷酸設(shè)計(jì)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)有效的序列后，往往對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。觀察堿基的移動(dòng)對(duì)其作用的影響。因此我們以7#序列為中心進(jìn)行優(yōu)化，向其5’端，3’端移動(dòng)幾個(gè)堿基設(shè)計(jì)了3條反義寡核苷酸，在96孔板上評(píng)價(jià)體外對(duì)HepG2細(xì)胞生長的抑制，目的是篩選出更加有效的藥物。7#序列向3’端移動(dòng)3個(gè)堿基的10#序列對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率高于其它3條序列。因此選擇10#序列為體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的藥物，從12條序列中篩選出了一條序列。10#的IC50是0.039μM。10#序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)由序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)由內(nèi)環(huán)-莖-內(nèi)環(huán)-莖-膨脹環(huán)-莖-發(fā)夾部組成。A＝3，T＝1，C＝12，G＝4。2.3 反義寡核苷酸作用的持續(xù)時(shí)間作用的持續(xù)時(shí)間不僅是評(píng)價(jià)反義核酸藥物的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)對(duì)于給藥方案具有重要的參考價(jià)值。圖3可以看出在肝癌細(xì)胞(HepG2)中，終濃度0.2μmol/L的10#脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染給藥1次后，1-4天抑制活性逐漸增加，第4天達(dá)到97％的峰值，然后緩慢下降，到第6天抑制率為82.4％。實(shí)施例二動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性ASODN的評(píng)價(jià)1.材料和方法1.1 裸鼠的飼養(yǎng)，移植瘤的接種和藥物處理Balb/c(nu/nu)裸鼠18-22克，雌性由北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。將Balb/c(nu/nu)裸鼠飼養(yǎng)于二級(jí)動(dòng)物房的層流柜中，自由攝取食物和水，大量擴(kuò)增HepG2腫瘤細(xì)胞，用0.2％胰酶溶液消化和收集細(xì)胞，用PBS清洗兩次后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.5×107個(gè)細(xì)胞/毫升，于每個(gè)裸鼠左后肢腋窩皮下接種0.2毫升。接種細(xì)胞后第5日，確認(rèn)腫瘤細(xì)胞生長并可觸及后，給裸鼠分為兩組，給藥組每日腹腔注射藥物一次0.1毫升的10#，(25mg/kg)，對(duì)照組給予相應(yīng)量的生理鹽水，每周測(cè)量兩次腫瘤的重量觀察記錄腫瘤的大小(用游標(biāo)卡尺)，按下列公式計(jì)算腫瘤的相對(duì)體積V＝L×W2×1/2，式中V為腫瘤體積(mm3)；L、W分別為瘤體最長和最短的兩個(gè)徑(mm)。待裸鼠行動(dòng)困難時(shí)，處死。用藥共28天，稱量瘤重量制備病理切片。1.2光鏡病理檢查標(biāo)本的制備標(biāo)本在10％福爾馬林溶液固定72小時(shí)，經(jīng)石蠟包埋切片，H-E染色，在光鏡下閱片。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 反義寡核苷酸對(duì)于荷肝細(xì)胞癌裸鼠腫瘤生長的抑制情況荷瘤裸鼠在接種腫瘤的第三天即可見其生長，第五天可觸及腫瘤并開始用藥，在用藥的四天內(nèi)用藥組與對(duì)照組相比，腫瘤體積無差異，第八天時(shí)出現(xiàn)差別，第15天后兩者差別顯著，從圖4中可見對(duì)照組體積增長迅速而用藥組體積增長緩慢。10#藥物使瘤體積倍增22.16倍，而對(duì)照組瘤體積倍增了81.55倍。從用藥期間裸鼠體重的變化曲線看，所有裸鼠體重均呈增長趨勢(shì)，作方差分析表明10#組與對(duì)照組相比有顯著性差異，10#組抑制率達(dá)63.9％。腫瘤的病理切片顯示兩組腫瘤均有變性和壞死，程度以用藥組嚴(yán)重，10#組腫瘤中心部有囊腔形成，炎細(xì)胞浸潤用藥組以淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞為主，對(duì)照組以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，兩組均有部分裸鼠呈現(xiàn)纖維組織增生。
權(quán)利要求
1.與凋亡抑制因子基因5’和3’非編碼區(qū)及翻譯起始區(qū)互補(bǔ)、長度為10-30個(gè)堿基并包含下列序列的寡核苷酸(序列為5’到3’)1〕GCAGAAGCACCTCTGGTGCC；2〕TTCTCACCTGGTAAGCCCCG；3〕GATAAGGAACCTGCAGCTCA；4〕CACACAAGTCATGCATCTAC；5〕CCGTGTGGAGAACGTGACAG；6〕GCCAACGGGTCCCGCGATTC；7〕CATGCCGCCGCCGCCACCTC；8〕GCACCCATGCCGCCGCCGCC；9〕AACGTCGGGGCACCCATGCC；10〕ACCCATGCCGCCGCCGCCAC；11〕CCGCCGCCGCCACCTCTGCC或12〕CGGGGCACCCATGCCGCCGC。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的反義寡核苷酸，其特征在于含下列序列6〕GCCAACGGGTCCCGCGATTC；7〕CATGCCGCCGCCGCCACCTC；10〕ACCCATGCCGCCGCCGCCAC或11〕CCGCCGCCGCCACCTCTGCC。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的反義寡核苷酸，經(jīng)化學(xué)修飾后在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及用途,具體地說是根據(jù)凋亡抑制因子腫瘤相關(guān)基因(APl4)設(shè)計(jì)并制備的反義寡核苷酸。采用人肝癌(HepG2)細(xì)胞株及Balb/c(nu/nu)裸鼠接種肝癌細(xì)胞為模型,對(duì)所設(shè)計(jì)、制備的12條反義寡核苷酸進(jìn)行篩選及評(píng)價(jià)。體外實(shí)驗(yàn)可有效地抑制人肝癌細(xì)胞生長,且呈劑量依賴性關(guān)系;在荷瘤裸鼠模型中亦有效地抑制了腫瘤的生長。故本發(fā)明是針對(duì)腫瘤的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其作為治療腫瘤、減少腫瘤及其相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1358857SQ0013453
公開日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月11日
發(fā)明者王升啟, 林莉, 管偉, 王小紅 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所