專利名稱：凋亡抑制因子survivin基因為靶標(biāo)的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其用途，具體地說涉及凋亡抑制因子survivin基因為靶標(biāo)的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)和用途。
背景技術(shù)：
腫瘤分子生物學(xué)研究表明，腫瘤是由于基因異常引起的疾病。致病機理包括癌基因的激活和抑癌基因的矢活以及細(xì)胞周期的異常。腫瘤發(fā)病分子機理的進一步闡明為腫瘤的基因治療提供了可靠的理論依據(jù)。近年來腫瘤研究的熱點是腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。反義技術(shù)是近十幾年興起的生物技術(shù)，用反義技術(shù)封閉和抑制特定基因的表達是基因治療的重要組成部分。1978年Stephenson和Zamenick用互補寡聚核苷酸特異性抑制Rous肉瘤病毒的復(fù)制，首次提出了反義寡聚脫氧核糖核苷酸(ASODN)抑制基因表達的概念。ASODN是根據(jù)Watson-Crick堿基配對原理能夠與mRNA的堿基對互補阻止其翻譯成蛋白質(zhì)的DNA。反義寡核苷酸具有定向合理設(shè)計，體內(nèi)外作用高效和能人工大規(guī)模合成等藥用特性，因而近年來成為治療病毒感染，腫瘤及其它由于基因表達異常引起的疾病的一類潛在型藥物，其中腫瘤相關(guān)基因可作為反義藥物作用的靶標(biāo)。
survivin是凋亡抑制因子，通過抑制細(xì)胞凋亡而調(diào)節(jié)組織細(xì)胞分化，促進突變發(fā)生，產(chǎn)生治療抗性，促進細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。survivin在胚胎發(fā)育中起重要作用，而在成熟分化組織中幾乎不表達，但在多種腫瘤組織中又呈現(xiàn)高表達。如肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌及50％的淋巴瘤等均可出現(xiàn)高表達。并且survivin的表達與癌癥病人的治療及預(yù)后呈現(xiàn)相關(guān)性。對于預(yù)測腫瘤病人的預(yù)后和早期癌癥診斷具有重要意義，它的抑制物可抑制腫瘤生長導(dǎo)致凋亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與凋亡抑制因子基因survivin互補、能抑制其表達的長度為20個堿基的反義寡核苷酸。
具體的說，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的根據(jù)一種腫瘤相關(guān)基因survivin基因，通過全長基因?qū)ぐ屑夹g(shù)(Full length gene targeting，F(xiàn)LGT)篩選靶向survivin基因的反義寡核苷酸序列，根據(jù)篩庫結(jié)果，設(shè)計15條寡核苷酸序列(見表1)。寡核苷酸序列采用PE公司產(chǎn)391A型DNA合成儀合成并采用硫代修飾，經(jīng)Micro Pure II反向柱(Solid PhaseScience)純化后，以此產(chǎn)物作為腫瘤的治療藥物。
表1 反義寡核苷酸序列及特征


在針對survivin基因的15條反義寡核苷酸中，A4、A6、A15的體外抑制細(xì)胞增殖作用最強。在0.8μM給藥濃度時，對腫瘤細(xì)胞(A549)增殖抑制率高于70％。A4、A6、A15藥物對人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的腫瘤生長具有明顯的抑制作用，抑制率可達50％左右；此三種藥對裸鼠的體重及生長狀態(tài)無明顯影響，無肉眼可見毒性。結(jié)果表明A4、A6、A15硫代寡核苷酸體內(nèi)外具有抑瘤率高，毒性低等優(yōu)點。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明中針對survivin基因治療腫瘤的優(yōu)選序列為A4、A6和A15三條序列。
上述反義寡核苷酸或其組合可用于制備抗腫瘤的藥物。將其采用本領(lǐng)域所知的介導(dǎo)方式或與適當(dāng)?shù)妮d體相結(jié)合后導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可顯著抑制survivin基因的表達，達到抑制腫瘤的目的。


圖1為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上的增殖抑制率；圖2為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上對靶基因survivin mRNA表達的抑制作用；圖3為反義寡核苷酸在細(xì)胞水平上對靶基因survivin蛋白表達的抑制作用；圖4為反義寡核苷酸對于人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的腫瘤體積的抑制情況；圖5為反義寡核苷酸對于人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的腫瘤重量的抑制情況；圖6為反義寡核苷酸對于人肝癌原位移植模型荷瘤裸鼠的抑制率。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施作詳細(xì)說明實施例一體外抗腫瘤活性ASODN篩選和評價材料和方法1.1反義寡核苷酸的設(shè)計本研究選取了survivin基因作為靶標(biāo)進行抗腫瘤反義寡核苷酸的篩選和評價，基因序列由Genbank獲得。首先，克隆靶基因survivin的全長序列，體外轉(zhuǎn)錄出大量的靶mRNA；將人工合成的隨機寡核苷酸庫與靶mRNA再進行雜交，通過從雜交液中提取與mRNA有結(jié)合活性的反義寡核苷酸得到分離；將這些結(jié)合序列擴增、克隆并測序，采用TargetFinder軟件(由本實驗室伯曉晨編程)將測序后的標(biāo)簽與靶mRNA序列進行比對分析，確定反義可接近位點。
1.2反義寡核苷酸的芯片篩選根據(jù)已確定的15個反義可接近位點，設(shè)計合成15個反義結(jié)合位點(A1-15)的寡核苷酸探針，制備芯片；同位素標(biāo)記的靶mRNA與芯片雜交，觀察雜交信號強弱；進一步用同位素標(biāo)記的靶mRNA與芯片雜交后RNase H原位切割，觀察其切割活性。
1.3反義寡核苷酸的合成根據(jù)已確定的15個反義可接近位點，合成15條(A1-A15)反義序列(具體序列見表1)。反義硫代寡聚核苷酸為無色粉末狀，合成后濃氨水55℃脫保護15小時，然后用反向柱(購自solid phase science公司)層析純化。體外實驗用無雙抗的1640培養(yǎng)基配制，體內(nèi)實驗用生理鹽水配制，保存于-20℃。
1.4細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及細(xì)胞增殖抑制活性測定人肺癌細(xì)胞株(A549)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液，于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將A549細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液100μL，含4×103細(xì)胞。待40-60％的細(xì)胞融合后，吸去培養(yǎng)液，用無血清無雙抗的1640培養(yǎng)基洗2次，在無血清狀態(tài)下，采用脂質(zhì)體Lipofectin(GIBCO，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進行硫代反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染。每條反義寡核苷酸設(shè)置0.2μM、0.4μM、0.8μM三個濃度，每個濃度重復(fù)3個孔，并設(shè)細(xì)胞和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染6小時后，換含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加20μl MTS(CellTiter96 Aqueous one solution cell proliferation assay，Promega)并繼續(xù)避光培養(yǎng)90min，在多標(biāo)記酶聯(lián)免疫檢測儀(VICTORTM Wallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上測定490nm處吸光值A(chǔ)，計算細(xì)胞增殖抑制率。
1.5反義寡核苷酸在體外對靶基因mRNA表達的影響選取細(xì)胞水平抑制效果較好的A2、A4、A6、A15硫代反義寡核苷酸，檢測其對靶mRNA表達的抑制作用。A549細(xì)胞培養(yǎng)條件同上。將A549細(xì)胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL，含1.5×105細(xì)胞。待40-60％的細(xì)胞融合后，吸去培養(yǎng)液，進行硫代反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.8μM，并設(shè)細(xì)胞對照和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染6h，換含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，TRIZOL法(Gibco)提細(xì)胞總RNA，紫外定量并將各組提取物調(diào)至相同濃度。采用Reverse transcription system(Promega)進行反轉(zhuǎn)錄，及PCR擴增靶基因survivin。以看家基因β-2M作為內(nèi)標(biāo)進行雙重PCR，設(shè)不加模板的空白對照。β-2M擴增片段317bp，靶基因survivin擴增片段200bp。擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖膠(Sigma)電泳檢查，利用ImageQuant軟件讀取各電泳條帶信號值，計算抑制率。
1.6反義寡核苷酸在體外對靶基因蛋白表達的影響選取RT-PCR實驗中，抑制效果較好的硫代反義寡核苷酸A4、A6、A9、A15，檢測其對靶蛋白表達的抑制作用，進一步篩選有效序列。A549細(xì)胞培養(yǎng)條件同上。將A549細(xì)胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL，含1.5×105細(xì)胞。硫代反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度為0.4μM，設(shè)細(xì)胞對照和脂質(zhì)體對照。轉(zhuǎn)染6h后，換含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，RIPA-PICT(Pharmacia)提細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調(diào)至相同濃度。每孔50μg總蛋白，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，并進行Western bloting觀察靶基因蛋白表達情況。
實驗結(jié)果2.1反義寡核苷酸作用靶位的篩選通過人工合成的隨機寡核苷酸庫與靶mRNA的雜交篩選和TargetFinder軟件的比對分析，并經(jīng)過芯片篩選，最后確定15條反義可接近位點，反義序列A1-A15(序列見表1)。圖1所示，A1、A5、A14以及隨機序列R對腫瘤細(xì)胞沒有明顯的抑制作用，而其余12條序列(A2-A4、A6-A11、A15)對細(xì)胞的生長均有不同程度的抑制作用，0.8μM給藥時，對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率高于70％。其中A2、A4、A9的IC50值與陽性對照(P)相當(dāng)。因此選擇A2、A4、A6、A15進行進一步的分子水平分析。
2.2反義寡核苷酸對靶基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的影響反義藥物是通過抑制其靶基因的表達來實現(xiàn)藥效作用，同時觀察靶基因的表達情況也是評價和衡量反義藥物作用特異性的一個重要指標(biāo)。由圖2可以看出，候選反義寡核苷酸A4、A6、A9、A15以及陽性對照P給藥后均能對靶基因mRNA的表達起到較好的抑制作用，且量效關(guān)系明顯。而A2抑制率很低，脂質(zhì)體對照(L)無顯著抑制效應(yīng)。
據(jù)此進一步選取在轉(zhuǎn)錄水平抑制效果較好的4條序列(A4、A6、A9、A15)，以P作為陽性對照，觀察候選反義寡核苷酸對靶基因蛋白表達的影響。由圖3可見，陽性對照P及A4、A15均可顯著抑制靶基因蛋白的表達，其中以A4抑制效果最好，而A6、A9較差。
實施例二動物體內(nèi)抗腫瘤活性ASODN的評價材料和方法1.1裸鼠的飼養(yǎng)，人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植模型HCM-Y89建立和給藥處理BALB/C-nu/nu裸鼠18-22g，雌雄各半，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院動物室提供。將BALB/C-nu/nu裸鼠飼養(yǎng)于恒溫(25℃-27℃)，恒濕(45-60％)，新鮮空氣除塵除菌，無特定病原菌(SPF)環(huán)境下(在中國人民解放軍第二零二醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物室)飼養(yǎng)，滅菌處理的水和飼料供動物自由攝入。人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植瘤株HCM-Y89(HepatocellularCarcinoma Models，建株時間1989年)由中國人民解放軍第二零二醫(yī)院人類消化系惡性腫瘤裸鼠原位移植瘤株庫提供。取人肝癌裸鼠原位移植瘤組織，剪切成1mm×1mm×1mm組織小塊，供移植用。裸鼠在0.5％硫噴妥鈉(30mg/kg)靜脈注射麻醉下，取腹正中切口，暴露肝臟，切開肝左葉被膜，將2粒瘤組織小塊移植在肝實質(zhì)內(nèi)，0/10無損傷縫合線縫合肝被膜，0/7絲線縫合腹膜，0/5絲線縫皮。整個手術(shù)過程在SPF條件手術(shù)室內(nèi)操作完成。術(shù)后不用抗菌素，精心飼養(yǎng)和觀察，自由進食。原位移植后第三天將荷瘤動物隨機分成六組模型對照組(生理鹽水)，5-氟尿嘧啶10mg/kg/次陽性對照組，針對survivin反義寡核苷酸A4、A6、A15、P(陽性對照)各組(50mg/kg/次)，各組動物數(shù)均為8只。采用靜脈注射給藥，注射藥物容量為每20克體重0.3ml。每天給藥一次，5天一個療程，間隔1天，共計5個療程25次。停藥3天后處死荷瘤動物，系統(tǒng)解剖，取出腫瘤，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，腫瘤體積的計算按下列公式進行V＝(L×S1×S2)/2，L＝腫瘤的長徑(mm)，S1＝腫瘤的短徑1(mm)，S2＝腫瘤的短徑2(mm)。稱量瘤塊重量并計算抑制率。
2實驗結(jié)果2.1反義寡核苷酸對人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植模型腫瘤生長的抑制情況經(jīng)反義寡核苷酸治療后，給藥治療組腫瘤體積明顯小于荷瘤裸鼠溶劑對照組(見圖4)。從圖5中可見溶劑對照組瘤塊體積在886.63±144.80mm3，反義治療組A4、A6、A15的瘤塊體積分別為689.25±110.39mm3、624.38±166.53mm3、667.00±81.74mm3，作t檢驗分析表明各給藥組與溶劑對照組比較P＜0.01，有顯著性差異。從瘤塊重量觀察，溶劑對照組瘤塊重量為1.39±0.22g，反義治療組A4、A6、A15的瘤塊重量分別為0.74±0.15g、0.68±0.05g、0.69±0.08g，作t檢驗分析表明各給藥組與溶劑對照組比較P＜0.01(見圖6)。各組瘤塊重量與溶劑對照組相比，反義治療組A4、A6、A15抑制率分別達46.76％、51.08％、50.36％，陽性對照P和5-Fu的抑制率分別為52.52、41.73％(見圖7)，但陽性對照P在實驗中觀察到藥物毒性比5-Fu還大，動物黃疸嚴(yán)重，消瘦，8只動物有4只死亡，故抑制率僅作參考。
核苷酸序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>凋亡抑制因子survivin基因為靶標(biāo)的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)和用途<160>15<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CAGGGGGCAA CGTGGGGGCA 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GGCCAGTTCT TGAATGTAGA 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3CGCAGTTTCC TCAAATTCTT 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4CAGAGGCCTC AATCCATGGC 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5CACCAGGGAA TAAACCCTGG 20
<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6TCCTAAGACA TTGCTAAGGG 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7GAAACATCTA ATTTGAAAAT 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8AGCTCTAGCA AAAGGGACAC 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9GTCATGCATC TACCAAAAAA 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10CAAACAAAAT AAGAAAGCCA 20<210>11<211>20<212>DNA
<213>人工序列<400>11AGGAGTATCT GCCAGACGCT 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12CCTGTCTAAT CACACAGCAG 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13CCATCATCTT ACGCCAGACT 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14TGACAGGGAG GAGGGCGAAT 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15GTAACAATCC ACCCTGCAGC 20
權(quán)利要求
1.一種與凋亡抑制因子基因survivin互補、能抑制其表達的長度為20個堿基的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸具有的序列選自下列之一，序列為5’到3’1)CAGGGGGCAACGTGGGGGCA；2)GGCCAGTTCTTGAATGTAGA；3)CGCAGTTTCCTCAAATTCTT；4)CAGAGGCCTCAATCCATGGC；5)CACCAGGGAATAAACCCTGG；6)TCCTAAGACATTGCTAAGGG；7)GAAACATCTAATTTGAAAAT；8)AGCTCTAGCAAAAGGGACAC；9)GTCATGCATCTACCAAAAAA；10)CAAACAAAATAAGAAAGCCA；11)AGGAGTATCTGCCAGACGCT；12)CCTGTCTAATCACACAGCAG；13)CCATCATCTTACGCCAGACT；14)TGACAGGGAGGAGGGCGAAT；15)GTAACAATCCACCCTGCAGC。
2.如權(quán)利要求1所述的反義寡核苷酸，其序列選自下列之一，序列為5’到3’1)CAGAGGCCTCAATCCATGGC；2)TCCTAAGACATTGCTAAGGG；3)GTAACAATCCACCCTGCAGC。3.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸或其組合在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途，具體地說是根據(jù)凋亡抑制因子腫瘤相關(guān)基因(survivin)設(shè)計并制備的反義寡核苷酸。采用人肺癌(A549)細(xì)胞株及人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植模型，對所設(shè)計、制備的15條反義寡核苷酸進行篩選及評價。體外實驗可有效抑制人肺癌細(xì)胞生長，并阻斷該基因表達；在人肝細(xì)胞癌裸鼠原位移植模型中亦有效抑制腫瘤的生長。本發(fā)明是針對腫瘤的反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)及其作為治療腫瘤、減少腫瘤及其相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號A61P35/00GK1869042SQ200510071569
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日
發(fā)明者王升啟, 孫玉寧, 林汝仙, 王丹, 梁乾德 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所