專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新的植物外源凝集素基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物抗蟲(chóng)基因工程及生物化學(xué)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一個(gè)新克隆的莧菜ACA基因及在植物中表達(dá)的重組質(zhì)粒，可進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化以構(gòu)建具有抗蚜蟲(chóng)特性的轉(zhuǎn)基因植物；同時(shí)通過(guò)構(gòu)建ACA基因高效，穩(wěn)定表達(dá)的微生物表達(dá)載體，可利用微生物獲得ACA蛋白。
ACA(Amaranthus caudatus agglutinin)是南美大陸一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的莧菜的種子[1]中存在的一種植物凝集素，是一種貯藏蛋白，在種子萌發(fā)時(shí)提供營(yíng)養(yǎng)。該蛋白只在胚乳形成時(shí)大量合成，在營(yíng)養(yǎng)器官中不合成。GenBank中已經(jīng)報(bào)道了ACA蛋白氨基酸序列(Accession No.g2781234)。用純化的蛋白在體外喂飼豌豆蚜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ACA對(duì)所試蚜蟲(chóng)有很高的抑制或毒殺作用[2]。該凝集素蛋白在腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別，組織化學(xué)鑒定及腫瘤的早期診斷上有重要作用[3]。隨著對(duì)植物凝集素的功能進(jìn)一步闡明及對(duì)其在醫(yī)學(xué)，生物學(xué)方面的潛在應(yīng)用價(jià)值的了解，克隆ACA基因?qū)ρ芯亢蛻?yīng)用該凝集素有重要意義。雖然在體外抗蟲(chóng)試驗(yàn)中，ACA表現(xiàn)出很好的抗蚜蟲(chóng)作用，但它在轉(zhuǎn)基因植物中是否有相同的功能還有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。另外ACA蛋白作為一種富含必需氨基酸的蛋白質(zhì)在改善作物品質(zhì)上也會(huì)有重要作用。同時(shí)體外方便地獲得大量的ACA蛋白可為腫瘤的檢測(cè)提供充足的材料。
基于以上情況，本發(fā)明的目的是提供一種可獲得ACA的新的結(jié)構(gòu)基因，重組質(zhì)粒，及在微生物和植物中表達(dá)的重組質(zhì)粒。
為了獲得ACA的基因組結(jié)構(gòu)基因，以莧菜總DNA為模板進(jìn)行PCR，首次獲得了ACA結(jié)構(gòu)基因。這個(gè)基因含有2628bp，有一個(gè)1716bp的內(nèi)含子和兩個(gè)分別為212bp和700bp的外顯子。由其核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與已發(fā)表ACA蛋白的序列相比有很高的同源性。構(gòu)建了能在植物體中具有組成型表達(dá)的重組質(zhì)粒。其優(yōu)點(diǎn)是在所得的轉(zhuǎn)基因植株各組織中能表達(dá)ACA蛋白。為特定的目的，也可用組織特異型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ACA基因在特定組織中表達(dá)。表達(dá)ACA蛋白的轉(zhuǎn)基因植株可能會(huì)獲得很好的抗蚜蟲(chóng)活性，同時(shí)由于ACA中必需氨基酸含量豐富，所以在植物中表達(dá)該蛋白還有助于改善植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。利用ACA基因構(gòu)建高效，穩(wěn)定表達(dá)的微生物表達(dá)載體，可利用微生物大量合成ACA，該蛋白在腫瘤的檢測(cè)中也會(huì)有一定的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明通過(guò)基因工程手段，首次克隆了ACA基因，從而為實(shí)現(xiàn)ACA的生產(chǎn)以及在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用提供可能。
為了達(dá)到上述目的，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下以莧菜品種Amaranthus caudatus的種子或葉組織提取的總DNA為模板，根據(jù)與ACA蛋白有高度同源的另一種莧菜Amaranthus hypochondriacus的AmA1蛋白基因的序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物[4]，通過(guò)PCR擴(kuò)增ACA結(jié)構(gòu)基因，并克隆了該基因。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pUC18載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia.coli)DH5α，獲得含ACA結(jié)構(gòu)基因的重組質(zhì)粒pACA及其大腸桿菌(e.coli)DH5α轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子(pACA/DH5α)已交中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心保存，保存的微生物命名為pACAg，編號(hào)為CGMCC NO.0438。以重組質(zhì)粒pACA為模板，利用反向PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異的引物，擴(kuò)增出ACA cDNA的編碼區(qū)DNA片段，與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α，獲得了重組質(zhì)粒pACAc及其大腸桿菌(E.coli)DH5α轉(zhuǎn)化子。從重組質(zhì)粒pACAc或pACA中分離出含有ACA結(jié)構(gòu)基因的DNA片段，分別連接到植物組成型表達(dá)載體pBin438，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α，獲得能在植物中組成型表達(dá)的重組質(zhì)粒pBACAc和pBACA及大腸桿菌(E.coli)DH5α轉(zhuǎn)化子。從上述轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒pBACAc和pBACA，轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌(Agrobacterium.tumefacieus)LBA4404。分別獲得土壤桿菌(A.tumefacieus)轉(zhuǎn)化子pBACAc/LBA4404和pBACA/LBA4404。同時(shí)從重組質(zhì)粒pACAc分離含有ACA結(jié)構(gòu)基因DNA片段，連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)，獲得能在大腸桿菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒pEACAc和大腸桿菌轉(zhuǎn)化子pEACAc/BL21(DE3)。對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子pEACAc/BL21(DE3)進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了特異的ACA蛋白。
實(shí)施例1.莧菜Amaranthus caudatus總DNA的提取植物材料為美國(guó)IOWA州立大學(xué)區(qū)域植物引種站提供的莧菜(Amaranthus caudatus)。DNA提取方法參照文獻(xiàn)5。取莧菜葉片或正在成熟種子200mg，液氮研磨后，加入1ml冰預(yù)冷的DNA提取緩沖液
，充分混勻后，4℃離心2700Xg 10分鐘，去上清。在沉淀中加入500ul細(xì)胞核裂解緩沖液
，重新懸浮沉淀物，于65℃水浴30分鐘。加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)抽提，10000rpm離心，取上清。加入0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇沉淀。12000rpm離心沉淀，70％乙醇洗一次，干燥后溶于50ul滅菌水中，-20℃保存。
2.ACA基因的PCR擴(kuò)增在20ul的PCR體系中，加入1ul約50ng莧菜總DNA，2ul 10x擴(kuò)增緩沖液，2ul dNTP(每種NTP終濃度為10mmol/L)，2ul引物(終濃度為10pmol/ul)Taq Plus I(2.5Units)，加水至20ul。在反應(yīng)混合物的液面上加適量礦物油以防止蒸發(fā)。
5’端引物序列5’GGAAGATCTACCATGGCGGGATTACCAGTG 3’3’端引物序列5’AGCGTCGACTTAGTTGTTGGATCCCAATTC 3’PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘預(yù)變性，然后以94℃1分鐘，49℃1分鐘，72℃1分30秒反應(yīng)，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物在電泳分析中有兩條DNA擴(kuò)增帶，分子量分別約為2.5kb和0.9kb。分別回收(用上海華順DNA回收試劑盒回收)，溶于30ul滅菌水中。
3.ACA基因的克隆及序列分析基因克隆和序列分析參照文獻(xiàn)6。取回收的PCR產(chǎn)物10ul與1ul來(lái)自于pUC18的T載體在20ul的連接體系中連接，其中含2ul 10x連接緩沖液，10ul PCR回收產(chǎn)物，1ul載體，1ul T4連接酶，6ul滅菌水。連接體系在14℃-16℃反應(yīng)12小時(shí)，取8ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，涂于含50mg/L Amp(氨芐青霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。利用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)于陽(yáng)性克隆用堿法提取質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切鑒定后，用Pharmacia T7測(cè)序試劑盒測(cè)序。結(jié)果顯示插入片段約2.6kb含ACA基因。質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)

圖1，質(zhì)粒命名為pACA。最后經(jīng)ABI377測(cè)序儀完成全序列測(cè)定，序列結(jié)果見(jiàn)圖2A-C。序列分析表明該基因共有2628bp，含1716bp內(nèi)含子和兩個(gè)分別為212bp和700bp的外顯子。ACA核基因的結(jié)構(gòu)見(jiàn)權(quán)利要求1和圖3。
4.反向PCR獲得編碼區(qū)ACA基因序列根據(jù)ACA基因的序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別與內(nèi)含子相鄰的外顯子互補(bǔ)，其序列為5’端序列5’GTGGTCTCCCAATCATTATTG 3’3’端序列5’CTAACCAAATATTTGTTAGTG 3’反向PCR體系含有1ul dNTP(每種dNTP各為10mmol/L)，5’端引物和3’端引物各1ul(25pmol/ul)；堿法制備的pACA質(zhì)粒稀釋500倍，取1ul做PCR模板；10X PCR緩沖液2ul，pfu Taq酶0.4ul(5Unit/ul)，加水至20ul.PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘預(yù)變性，94℃50秒，58℃50秒，72℃2.5分鐘，30個(gè)循環(huán)，最后72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物電泳分析顯示一條3.5kb的DNA片段，純化PCR產(chǎn)物，T4 DNA多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化，乙醇沉淀后溶于20ul滅菌水中。
5.ACA編碼區(qū)序列的克隆及序列分析取10ul上述純化產(chǎn)物，加入2ul 10x連接酶緩沖液，1ul T4 DNA連接酶(1Unit/ul)，7ul滅菌水至總體積20ul。連接反應(yīng)在14℃-16℃反應(yīng)12小時(shí)，取8ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，涂于含50mg/LAmp的LB固體培養(yǎng)基上，挑取轉(zhuǎn)化子，堿法制備質(zhì)粒，NcoI和SalI酶切，產(chǎn)物約為900bp。ABI 377測(cè)序儀測(cè)序結(jié)果證明拼接正確，質(zhì)粒命名為pACAc。在pACAc中ACA基因的序列見(jiàn)圖2A-C(大寫(xiě)字母表示)。ACA基因編碼的氨基酸序列與已發(fā)表的ACA序列的比較見(jiàn)圖4。
6.含ACA基因編碼區(qū)的植物表達(dá)載體和重組農(nóng)桿菌的制備。
BglII和SalI雙酶切質(zhì)粒pACAc，回收ACA結(jié)構(gòu)基因片段與BamHI酶切，SalI酶切的載體pBin438[7]片段連接，即得重組質(zhì)粒pBACAc，整個(gè)構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖5。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化凍存感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，涂于含50mg/L Kan(卡那霉素)的固體LB平板上。利用酶切和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒pBACAc。用堿法提純的質(zhì)粒pBACAc轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，涂于50ug/ul Kan，50ug/ul Rif(利福平)，50ug/ulStr(鏈霉素)的YEP固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)及酶切分析后獲得含pBACAc的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化子。
7.含ACA基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建。
外源基因?yàn)閬?lái)自pACA的ACA基因片段，NcoI酶切質(zhì)粒pACA，Klenow酶補(bǔ)平，SalI酶切，回收2.6kb的基因片段，與BamHI酶切，Klenow酶補(bǔ)平，SalI酶切的載體pBin438片段連接即得重組質(zhì)粒pBACA，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，利用酶切和PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒pBACA。根癌土壤桿菌制備方法同以上6中所述。除利用CaMV 35S啟動(dòng)子外，還可以利用組織特異性的啟動(dòng)子或其它類(lèi)型的啟動(dòng)子與ACAc或ACA構(gòu)建植物表達(dá)載體。pBACA的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖6。
8.含ACAc基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)NcoI，SalI酶切質(zhì)粒pACAc，回收約0.9kb片段與同樣雙酶切的表達(dá)載體pET30a(+)連接。轉(zhuǎn)化篩選重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，該重組質(zhì)粒命名為pEACAc。按文獻(xiàn)[8]提供的方法誘導(dǎo)表達(dá)。細(xì)菌接種于卡那霉素濃度為50ug/ul的LB培養(yǎng)基中于37℃，250rpm條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)達(dá)到OD＝0.2時(shí)，加入IPTG，終濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為BioLab公司的預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。大腸表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳[9]結(jié)果顯示在含有重組質(zhì)粒pEACAc的大腸表達(dá)產(chǎn)物中有一條分子量為36KD的特異的蛋白(1泳道)，而對(duì)照菌中則無(wú)此蛋白(2泳道)。說(shuō)明該蛋白在大腸桿菌中獲得表達(dá)。表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)掃描后計(jì)算約占總蛋白的35％。電泳結(jié)果如圖7。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述。
圖1ACA基因重組質(zhì)粒pACA構(gòu)建模式圖(Amp氨芐青霉素抗性)圖2A-CACA基因全序列，小字母代表內(nèi)含子的堿基序列圖3ACA基因結(jié)構(gòu)示意圖，圖上方的數(shù)字表示有關(guān)部分的大小(以bp表示)圖4ACA基因推導(dǎo)的氨基酸序列和ACA蛋白測(cè)序所得氨基酸序列同源性比較(ACA.PROACA蛋白質(zhì)氨基酸序列；ACAc.PRO本發(fā)明克隆的ACA基因推導(dǎo)的氨基酸序列；方框內(nèi)氨基酸表示兩序列中不同的氨基酸)圖5ACA植物表達(dá)載體pBACA構(gòu)建模式圖(NPTII新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因35S帶雙增強(qiáng)子的CaMV35S啟動(dòng)子；NOS胭脂堿合成酶基因轉(zhuǎn)錄終止子LBTi質(zhì)粒左邊界序列；RBTi質(zhì)粒右邊界序列)圖6ACA基因編碼區(qū)植物表達(dá)載體pBACAc構(gòu)建模式圖(KlKlenowDNA聚合酶)圖7ACA蛋白大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖(M分子量標(biāo)準(zhǔn)；1pEACAc/BL21(DE3)；2對(duì)照pET30a/BL21(DE3)；箭頭所指示的帶為表達(dá)的目的蛋白ACA)附注LB培養(yǎng)基5g/NaCl；10g/Trypton；5g/Yeast extract；PH7.0；12g/L瓊脂；15磅滅菌30分鐘
YEP培養(yǎng)基5g/L NaCL；10g/L Trypton；10g/L Yeast Extract；PH7.0，12g/L瓊脂，15磅滅菌30分鐘主要參考文獻(xiàn)1.Vietmeyer，N et al(1986).Sciences 232，1379-13842.Rahbe Y，Sauvion N，F(xiàn)ebvay G et al 1995，Ento Exp App，76143-1553.Boland，C et al.(1991).Cancer Res.51，657-6654.Anjana R et al.(1992).PNAS.Vol(89).11774-117785.Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF et al Plant Mol.Biol.Reporter，(1993)11(2)122-1276.薩姆布呂克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，北京科學(xué)出版社，19937.李太元等，中國(guó)科學(xué)B輯，(1994)24276-2828.A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-Tagedprotein。Qiagene Company9.Laemmli UK.1970.Nature 227680-68權(quán)利要求
1.一種莧菜凝集素ACA結(jié)構(gòu)基因，其特征在于該基因含有一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)外顯子。具有如下式所示的2628bp的核苷酸序列。1ATGGCGGGATTACCAGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAATATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTTAGATCCATTAGCTCAATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTACACTAACAAATATTTGGTTAGgtacgttttttttcgcgtttatacttcctccgtttcaatatagtcgcaatatatcgaaaataaacactattcacttatctcctttaatttgtgattgataagtaatttataagttaaaacatagtcaactgagatcttgtttgattcatctcgacgtaaagattattaatatcaaatttttataattttatattatacataattgtagttattaatgattgaattagtacattagactgcgtgaaaaaggcatatgttgtaagtattttggaacgaaggtagtgttatatttcttctgttagtctatttaaaatttgcgatatttaaattaaatatttaagatttttttgagttacatgtttcaaattctggagtgagtacgtactttaagtatacttttgtactagctaccatttgattgacataattaataaatgggaaattccacatggtagcatctagttttgatgaaatgccagtggtgacacttttttaagaaaattccacatgctagcattcagtttatacactatctaattgccgtagcattttccgttaagttcttgttaaattccactaaatttatcattttgtaagtttttttccacatggtagtatccagtttttgttaatttatcattttaactcttaattcaccattttaatgtttaattcactatttaattcattaacgctcataagtgttagatatttttattgaaaaattataagaaactatctaatcgggtcgaaacaagaacttattcgcctatttttcgatacgtaaaccggaaaagatatttggcgtcatttttacctatcataacgatttttttcaataaacggacgttgcaattacccttatgggataactctttcgaaaatccggtcgaaacaagtacttattcgcctattttccgatagatgtgttcaagaaaatgggacaactaaatagattcagagggagtatttcggagtaattatgttgacaaaattatacttgaactaatagctacggtgatgcttgttcaatttcactgattttgtacaatcataaagtttcttgatcacatttccaaaaaaatgaaagttaagtggcaaaaaatatgtgaatataaaatttgacaagtctaatttaaaattttcactaattttttttaataaaacgaaatacaacataatatatttttattgagatatattttgtgaaatttaatttaaatgtcaccactataaatttgtaatggtacatatagttgatttagttacatttattagaccttctagctgcataattaaaatcatactaaagctttttcctgagatagaatctaatgatatttctcatatgccggcatgcaaccaaataaagtgttactatataaattactaaagtagcgacattttttaatgttgcaaaaagaaaattttgtttagtgacggtcttatagtgtgactatctctattgggcagacatatgtacatttagtatgaaatgatcacttataattttaaagtaatacaattacagagtgacttgtttacaatgaatttgtgtttttgtccagcaagtcttttaatgagagacgtctcttagatctaatccattagagtttaattcttactcttattctatatttttctttatgggtcacccaattagagttggtatctcaaagagaccgtctctcacaagaatttgcgtttttgtcttagGTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGAACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGAAGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACACAGAATTATACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGGCTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAAGATATGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCCATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATGAAATGTTTGTCACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCACTTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTCTACGGATGATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCAGCGTTGTTTAGGTCAGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAACTTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGGGTTTATAAATTGTATGAATGCAGCTACTCAAAATGTTGATGAAACT2628GCTATTTTAGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAAC
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩個(gè)外顯子外顯子1和外顯子2，分別具有如下式所示的212bp和700bp的核苷酸序列。外顯子11ATGGCGGGATTACCAGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAATATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTTAGATCCATTAGCTCAATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTAC212ACTAACAAATATTTGGTTAG外顯子21929GTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGAACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGAAGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACACAGAATTATACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGGCTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAAGATATGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCCATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATGAAATGTTTGTCACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCACTTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTCTACGGATGATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCAGCGTTGTTTAGGTCAGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAACTTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGGGTTTATAAATTGTATGAATGCAGCTACTCAAAATGTTGATGAAACTGCTATTTT2628AGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAAC
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩個(gè)外顯子推測(cè)其編碼的氨基酸序列如下1M A G L P V I M C L K S N N N Q K Y L R Y Q S D N I Q Q Y GL L Q F S A D K I L D P L A Q F E V E P S K T Y D G L V H IK S R Y T N K Y L V R W S P N H Y W I T A S A N E P D E N KS N W A C T L F K P L Y V E E G N M K K V R L L H V Q L G HY T Q N Y T V G G S F V S Y L F A E S S Q I D T G S K D V FH V I D W K S I F Q F P K R Y V T F K G N N G K Y L G V I TI N Q L P C L Q F G Y D N L N D P K V A H E M F V T S N G TI C I K S T Y M N K F W R L S T D D W I L V D G N D P R E TN E A A A L F R S D V H D F N V I S L L N M Q K T W F I K RF T S G K P G F I N C M N A A T Q N V D E T A I L E I I E L304G S N N
4.一種重組質(zhì)粒，它是含有權(quán)利要求1所述的ACA基因序列的pACA質(zhì)粒。
5.一種重組質(zhì)粒，它是含有權(quán)利要求2所述的ACA基因僅含外顯子序列的pACAc質(zhì)粒。
6.一種重組微生物，它含有權(quán)利要求4，5所述的重組質(zhì)粒pACA或pACAc。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物，它是大腸桿菌Escherichia.coliDH5αCGMCCNo.0438。
8.一種重組質(zhì)粒，它是由權(quán)利要求1或2所述的ACA基因序列與二元表達(dá)載體pBin438構(gòu)建而成的植物表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物表達(dá)載體，它們分別是如圖5或圖6所示的pBACA和pBACAc。
10.一種重組質(zhì)粒，它是由權(quán)利要求2所述的ACA外顯子序列ACAc與大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)構(gòu)建而成。
11.一種按權(quán)利要求10所述的重組質(zhì)粒是pEACAc。
12.一種重組微生物，含有pBACA重組質(zhì)?；騪BACAc重組質(zhì)粒。
13.一種重組微生物，含有pEACA重組質(zhì)粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組微生物是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefacieus)LBA4404或大腸桿菌Escherichia.coliDH5α。
15.由權(quán)利要求9所述的植物表達(dá)載體pBACA或pBACAc在轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
16.由含ACA編碼區(qū)序列的大腸桿菌表達(dá)載體pEACAc在細(xì)菌中表達(dá)產(chǎn)生的ACA凝集素蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供來(lái)源于Amaranthus caudatus含有內(nèi)含子的莧菜凝集素ACA(Amaranthus caudatus agglutinin)基因的克隆及編碼ACA蛋白的編碼區(qū)基因序列。將上述的ACA編碼區(qū)基因序列轉(zhuǎn)化到高效、穩(wěn)定表達(dá)的微生物表達(dá)載體中,可利用微生物大量合成ACA蛋白。ACA基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因植物獲得抗蚜蟲(chóng)作用,同時(shí)提高其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),在植物抗蟲(chóng)基因工程和品質(zhì)改良中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1353187SQ0013342
公開(kāi)日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者田穎川, 周永剛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所