專利名稱：：龜背竹凝集素基因及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及在龜背竹中表達(dá)的龜背竹凝集素基因、蛋白及其應(yīng)用。背暈技術(shù)蟲害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的重要因素之一，害蟲不僅對作物產(chǎn)生直接危害,還因攜帶各種植物病原體而造成間接危害。在全世界范圍內(nèi)，每年因各種蟲害造成的直接損失約占農(nóng)作物總收獲量的13%以上(Gatehouseefa/.，1992)，年損失約數(shù)千億美元。特別是針對同翅目害蟲(如釾蟲、褐K虱及葉蟬等在世界范圍內(nèi)危害都很嚴(yán)重)的抗蟲基因很少被分離。因此，分離克隆這類抗性基因以用于分子育種，對于減少病蟲危害帶來的損失，保證糧食的穩(wěn)定增產(chǎn)和衛(wèi)生品質(zhì)的改善具有重要意義(Kaiefa/.，2003)。近年來凝集素在生物學(xué)方面的應(yīng)用研究發(fā)展迅速，它最大的特點(diǎn)在于其能夠識別糖和糖類，每一種凝集素具有對某一種特殊的碳水化合物有專一結(jié)合的能力。并已有一些外源凝集素基因如雪花蓮?fù)庠茨?GNA)在提高作物抗同翅目害蟲方面體現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價值。在對現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，雖然"EuropeanJournalofBiochemisty(歐洲生物化學(xué)雜志)1991:202:23-30"和"DNAsequence(核苷酸序列)，2003:14:223-226"等先后報(bào)道了從雪花蓮及韭蓮等中分離克隆了單子葉甘露糖結(jié)合凝集素基因，但尚未有任何文獻(xiàn)報(bào)道從龜背竹(Monsterade/Zc/osa)中分離出單子葉甘露糖結(jié)合凝集素基因，至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系獻(xiàn)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種龜背竹凝集素基因及其編碼蛋白與用途，以填補(bǔ)尚未有任何文獻(xiàn)報(bào)道從龜背竹中分離出單子葉甘露糖結(jié)合凝集素基因的空白，及利用轉(zhuǎn)基因方法克服植物對同翅目害蟲如蚜蟲等的抗性較差的缺陷。提供一種龜背竹凝集素基因及其編碼蛋白序列。使其包含所說基因的融合基因構(gòu)建體、攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體、所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代(包括植物種子及植物組織)，以獲得對植物病蟲害具有增強(qiáng)的抗性的轉(zhuǎn)基因植物。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種龜背竹凝集素基因，具有SEQIDN0.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種龜背竹凝集素蛋白質(zhì)，由上述的基因序列所編碼。其優(yōu)選方案為，具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種含有上述技術(shù)方案之一的龜背竹凝集素基因全序列或部分片段的質(zhì)粒。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種含有上述技術(shù)方案之一的龜背竹凝集素基因全序列或部分片段的植物表達(dá)載體。本發(fā)明的技術(shù)方案之五是提供一種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有上述技術(shù)方案之一或之三或之四中任一項(xiàng)所述的基因序列。優(yōu)選所說的細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，或者優(yōu)選為農(nóng)桿菌細(xì)胞，或者優(yōu)選為煙草細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案之六是提供一種龜背竹凝集素基因的應(yīng)用，包括用技術(shù)方案之四所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞、或者用上述的農(nóng)桿菌與煙草細(xì)胞共培養(yǎng)、或者用權(quán)利要求9所述的煙草細(xì)胞培育煙草植株?；蛘?，技術(shù)方案之六也可以是提供一種轉(zhuǎn)基因煙草，該煙草含有所述的龜背竹凝集素基因序列。具體而言，本發(fā)明的技術(shù)方案中涉及的概念的定義如下在本發(fā)明所說的龜背竹凝集素基因的DNA分子包括編碼具有龜背竹凝集素蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第49-900位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40—55T:條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第49-900位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第49-900位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的龜背竹凝集素蛋白多肽包括具有SEQIDNO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佧地，該多肽是具有SEQIDNO.2序列的多肽。本發(fā)明DNA分子包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)K伴隨核酸的組分分開，而且己經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語"龜背竹凝集素蛋白(或多肽)的編碼基因"指編碼具有龜背竹凝集素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第49-900位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.1序列的編碼框第49-900位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.1中第49-900位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDN0.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第49-900位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQIDNO.1中從核苷酸第49-900位的核苷酸序列的同源性至少70。/。，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95Q/。的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的龜背竹凝集素蛋白相同功能的蛋白的SEQIDNQ.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若千個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"龜背竹凝集素蛋白或多肽"指具有龜背竹凝集素蛋白活性的SEQIDN0.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然龜背竹凝集素蛋白相同功能的、SEQIDN0.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括龜背竹凝集素蛋白的活性片段和活性衍生物，還包括能夠可操作地連于信號肽、啟動子或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列所組成的衍生物。本發(fā)明的龜背竹凝集素蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與龜背竹凝集素蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用龜背竹凝集素蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中,術(shù)語"龜背竹凝集素蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDN0.2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1.保守性變異多肽中的取代殘基<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>發(fā)明還包括龜背竹凝集素蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然凝集素多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的龜背竹凝集素蛋白時，可以將龜背竹凝集素蛋白的編碼基因的核酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成龜背竹凝集素蛋白表達(dá)載體。如本發(fā)明所用的"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連亍編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析龜背竹凝集素蛋白的編碼基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析龜背竹凝集素基因的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有龜背竹凝集素核苷酸編碼區(qū)序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼龜背竹凝集素蛋白的核酸分子。本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在龜背竹凝集素蛋白的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于龜背竹凝集素蛋白的核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的龜背竹凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選龜背竹凝集素蛋白源基醫(yī)或同源蛋白。為了得到與龜背竹凝集素基因相關(guān)的龜背竹cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選龜背竹cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用^P對龜背竹凝集素基因序列的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自龜背竹的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。這種篩選方法可以識別與龜背竹凝集素的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的龜背竹凝集素核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;Merrifield丄(1963)丄AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來自動合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的龜背竹凝集素蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與龜背竹凝集素蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。有益效果本發(fā)明提供的龜背竹單子葉甘露糖結(jié)合凝集素基因是首次從龜背竹中克隆制備的，可以通過基因工程技術(shù)用來提高植物對同翅目害蟲如蚜蟲等的抗性，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草在抗蟲性試驗(yàn)中具有明顯的作用，對保護(hù)植物的健康生長有所幫助。特別是許多農(nóng)作物在很多地區(qū)存在蟲害重、品質(zhì)差的問題，提高農(nóng)作物的抗蟲性是解決這一問題、減少農(nóng)藥殘留危害、降低農(nóng)業(yè)投資、提高種植業(yè)效益的有效方法，本發(fā)明的凝集素基因?qū)r(nóng)作物抗蟲、抗病以及抗菌等的改良具有廣泛的應(yīng)用價值。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于-說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1龜背竹凝集素蛋白的編碼基因的克隆1.組織分離(isolation)龜背竹幼嫩葉片來源于上海，采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。2.RNA的分離(RNAisolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mLEP管中，抽提總RNA(TRIzolReagents,G舊COBRL,USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測定RNA含量。3.基因的全長克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據(jù)雪花蓮及其它單子葉甘露糖凝集素氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個階段進(jìn)行0)3'-RACEPCR(UPM+F2)得到MDAF2'(0.6kb),回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL),知其核酸序列及編碼蛋白與已知單子葉甘露糖凝集素基因(如韭蓮和雪花蓮凝集素等)的同源性很高,故初步認(rèn)為它是一個凝集素基因。(2)5'陽RACE根據(jù)3'RACE結(jié)果，設(shè)計(jì)反向特異引物R2，經(jīng)PCR(UPM+R2)得到MDAR2'(0.75kb)(過程同(1))?；厥?，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，釆用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-曰mer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer,USA)上進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與3'RACE結(jié)果比序并進(jìn)行拼接，得到全長片段序列。(3)將5'RACE測序結(jié)果與3'RACE測序結(jié)果比序并進(jìn)行拼接，得到全長片段序列信息，并設(shè)計(jì)一對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增MDA編碼區(qū)(MDAKF1+MDAKR1)得到MDA編碼區(qū)(0.852kb)(過程同(1))。BLAST的結(jié)果及分子建模結(jié)果證明從龜背竹中新得到的基因確為一個植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素(GNA)基因具有較強(qiáng)的抗同翅目類昆蟲包括蚜蟲和飛虱功能(Hilder等，1995;Powell等，1993，1995;)，故推測此基因具有相同的功能。通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的龜背竹t-lectin蛋白的全長編碼基因的核酸序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物MDAF1:5'-TAGCAATAGTATTGTACACTAAC-3'(SEQIDN0.3)為正向引物，寡核苷酸MDAR1:5'-GGGGAAATGTTTCTAACGTTC-3'(SEQIDN0.4)為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，F(xiàn)1/R2的PCR條件為94°C5分鐘，隨之以94°C1分鐘、60。C1分鐘和72°C2分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72。C延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1186bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得SEQIDNO.1所示的序列。實(shí)施例2龜背竹凝集素基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的龜背竹凝集素全長cDNA的長度為1186bp，詳細(xì)序列見SEQIDN0.1，其中開放讀框位于49-900位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出龜背竹凝集素的氨基酸序列，共283個氨基酸殘基，分子量31.656KD，pl為8.34。詳細(xì)序列見SEQIDNO.2。將龜背竹凝集素的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與雪花蓮凝集素(GNA)基因存在一定的同源性。在氨基酸水平上，它與雪花蓮凝集素(GenBankAccessionNo丄07475)的第14-142位氨基酸殘基有36%的相同性和52%的相似性(見表2)。由上可見，龜背竹凝集素基因與雪花蓮凝集素基因在蛋白水平上存在較高的同源性，故可以認(rèn)為凝集素在提高植物的抗蟲性上也具有相似的作用。表2.本發(fā)明的龜背竹凝集素蛋白與雪花蓮凝集素氨基酸序列的同源比較(FASTA)表Query14LVLLHAVLLALLTPARAGEQVLIANRTLYAGQSLYSMNRNYRFIMQWDCSLALYEFQKPL73L++l_+l_++TP+E+1_+Tl_GSLS++FIMQDC+LLYKP+Sbjct6LLILTTIFLGVITPSCLSENILYSGETLPTGGSLTS——GSFVFIMQQDCNLVLYNVDKPI63Query74WISTTDRQPGTFCDATLDAGSARLAVTQRNTNKQVWSSTTSFYAFKYVLVLQTDLNWIY133W+TGD+++V+NK+W+STYV+LQDNWIYSbjct64WATNTG---GLSSDCSISLQTDGDLWYTPSNKPIWASNTDGQNGNYVCILQKDRNWIY120Query134SRPVWSTNT142W+TTSbjct121GTNRWATGT129其中，Query表示龜背竹m-lectin蛋白氨基酸序列；Sbict表示雪花蓮g隱Lectin蛋白氨基酸序歹U(GenBankAccessionNo.AAL07475);相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。實(shí)施例3龜背竹md-lectin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1.龜背竹md-lectin蛋白的氨基酸序列的前體蛋白和成熟蛋白分析。通過對龜背竹md-lectin蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)龜背竹md-lectin蛋白基因編碼一前體蛋白含有信號肽序列、成熟蛋白序列，按vanHeijne(1986)等預(yù)測凝集素蛋白信號肽的規(guī)則和對龜背竹md-lectin蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比較，鑒定出龜背竹md-lectin蛋白的信號肽剪切位點(diǎn)在第30氨基酸(A)和第31氨基酸(G)之間，該位置也符合目前已知的大多數(shù)甘露糖專一結(jié)合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA，VanDamme等，1991)、君子蘭凝集素(VanDamme等，1994)等的凝集素蛋白的信號肽剪切位點(diǎn)。2.龜背竹md-lectin蛋白的專一結(jié)合糖基化分析。通過對龜背竹md-lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素、水仙凝集素等的專一結(jié)合糖基化分析，發(fā)現(xiàn)龜背竹md-lectin蛋白同大多數(shù)甘露糖專一結(jié)合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)等相似，具有2個典型的甘露糖專一結(jié)合位點(diǎn)盒(QDNY)，見表3。因此證明龜背竹md-lectin蛋白也同雪花蓮凝集素(GNA)等類似，為甘露糖專一結(jié)合的凝集素蛋白。表3.龜背竹md-lectin蛋白甘露糖專一結(jié)合位點(diǎn)盒(表中甘露糖專一結(jié)合位點(diǎn)盒QDNY用方框框住)MAATSLLFSAAPLLVLLHAVLLALLTPARAGEQVLIANRTLYAGQSLYSMNRNYRFIMQW60DCSLALYEFQKPLWISTTDRQPGTFCDATLDAGSARLAVTQRNTNKQVWSSTTSFYAFKY120VLVL§T§L§VVlgSRPVWSTNTGVWDSVEFQNGDQILLSSGTLKVGQYLSNNELNFRF頂180QDDCDLVLYDDDRRIWSSETSGKGTGCNAKLNGLTGQL1VRDNNGRIVWSSKNRAVPIKK240HILLL|P§R§VV勢GRVWASDTSIPENQGGLQDAGRIEMVTN283實(shí)施例4龜背竹凝集素蛋白或多肽在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)及提純在該實(shí)施例中，將全長的龜背竹md-lectin編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。將龜背竹md-lectin多肽以融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)龜背竹md-lectin的氨基酸序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出切除信號肽后的蛋白編碼區(qū)的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pET32a(+)載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將龜背竹md-lectin基因在保證閱讀框正確的前提F克隆至pET32a(+廣體(Novagen)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，篩選鑒定得到含有pET32a(+)-md-lectin表達(dá)載體的工程菌BL21國pET32a(+)-md-lectin。表達(dá)Trx-md-lectin重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pET32a(+)-md-lectin工程菌于3ml含100|ig/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1:100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100ng/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至00600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37。C分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2xSDS上樣緩沖液50pl，蒸餾水45…，二巰基乙醇5nl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12%SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達(dá)Trx-md-lectin融合蛋白的工程菌。Trx-md-lectin融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)Trx-md-lectin融合表達(dá)蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-md-lectin，經(jīng)離心沉淀收集菌體，并根據(jù)廠家(Novagen)的說明書以BugBuster試劑和Benzonase核酸酶來純化包涵體。包涵體口J用溶解緩沖液(50mMCAPS,pH11.0,0.3Q/0N-lauroylsarcosine)來溶解，再用透析緩沖液(200mMTris-HCI,pH8.5)來透析。然后用組氨酸結(jié)合(His*Bind)樹脂進(jìn)行親和層析，并經(jīng)洗脫緩沖液(1Mimidazole,500mMNaCI，20mMTris-HCIpH7.9)洗脫來收集Trx-md-lectin融合蛋白。融合蛋白經(jīng)腸激酶2CTC酶切16小時后即可分離獲的md-lectin的表達(dá)蛋白。實(shí)施例5龜背竹凝集素蛋白或多肽在煙草中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性鑒定含目的基因(龜背竹凝集素基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建,根據(jù)龜背竹凝集素蛋白的全長基因序列(SEQIDNO.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將龜背竹凝集素基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架￡確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落,接種于2mlYEB液體(Sm+,Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；2.室溫下4，000g離心10min;3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600-0.5左右；4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)48小時；7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6—BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28°C光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。利用Westernblot檢測MDA蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)1.蛋白的提取a)取50mg葉片，加入100ul"PBS(KH2P040.2g/l，Na2HP041.15g/l,KCI0.2g/l，NaCI8g/l)于1.5mlEppendorf管中研磨；b)13000rpm，4。C離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過程于冰上進(jìn)行。2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford,1976)。取2ul蛋白樣品，加入1mlBradford試劑，混勻后，分光光度計(jì)測00595;蛋白含量計(jì)算1OD595=28.57|ag。3.SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989);a)加樣前，將樣品置于含50mmol/LDTT的加樣緩沖液(2*加樣緩沖液:甘油2.4g,1MTris-HCIpH6.81ml;溴酚蘭0.01%,H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；b)室溫100V電壓下聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部。4.蛋白質(zhì)向硝酸纖維膜上轉(zhuǎn)移a)轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmolTrisBase,0.037%SDS，20%甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；b)室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移1h,凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；5.膜上蛋白的檢測a)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37。C緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml1*PBS(含0.5g疊氮鈉)；b)再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37°C洗滌兩次，每次15分鐘；c)加入第一抗體(抗龜背竹md-Lectin的抗體)，37°C溫育30分鐘；d)同步驟b，洗滌三次；e)加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37°C溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌兩次；f)加入底物顯色觀察蛋白條帶。含龜背竹凝集素基因(MDA)的轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性鑒定鑒于編碼甘露糖專一結(jié)合的植物凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)的基W已被證明對病蟲害如刺吸式口器類昆蟲如蚜蟲(Hilder等，TransgenicRes，1995,4:1825)、飛虱(Tang等，PlantBreeding,2002，121:9395)及咀嚼式口器類昆蟲如番茄蛾Z_a/aAo/7/ao/emcea(Gatehouse等，MolecularBreeding,1997，3:4963)都具有抗性，而龜背竹凝集素(MDA)也為甘露糖專一結(jié)合的凝集素且與雪花蓮凝集素(GNA)具有較高的同源性，因此編碼龜背竹凝集素的基因(M/^)同雪花蓮凝集素基因(gna)相似，也應(yīng)具有抗蟲功能。我們進(jìn)一步對表達(dá)龜背竹凝集素基因(MDA)的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗蟲性鑒定。按Hilder等(TransgenicRes,1995,4:1825)的方法對表達(dá)龜背竹凝集素基因(Ma4)的轉(zhuǎn)基因煙草植株(20—30厘米高)進(jìn)行蚜蟲(桃蚜)抗性鑒定，研究其對蚜蟲存活率和發(fā)育進(jìn)度的影響。對蚜蟲存活率的研究中，在每株植株上接種10頭蚜蟲一齡若蟲后每2天測定魅蟲存活數(shù)(共測定14天)。對蚜蟲發(fā)育進(jìn)度的研究中，在每株植株上接種5頭蚜蟲一齡若蟲，13天后測定存活的蚜蟲成蟲數(shù)和若蟲數(shù)。結(jié)果表明，在表達(dá)龜背竹凝集素基因(MDA)的轉(zhuǎn)基因煙草植株上存活的蚜蟲數(shù)量同非轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈系南啾蕊@著減少(P<0.05)，同時，在表達(dá)龜背竹凝集素基因(MDA)的轉(zhuǎn)基因煙草植株h存活的蚜蟲其發(fā)育進(jìn)度同非轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈系南啾纫脖伙@著減緩(P<0.05)，其13天后發(fā)育成成蟲的數(shù)量也顯著減少(P<0.05)。因此抗蟲性結(jié)果證明，龜背竹凝集素基因(MDA)對昆蟲(如蚜蟲)確有抗性，龜背竹凝集素基因(MCW)可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制植物蟲害的研究和產(chǎn)業(yè)化中。核苷酸序列表SEQUENCELISTING〈110〉上海師范大學(xué)〈120〉龜背竹凝集素基因及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用<160>4〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211>1186〈212〉賺<213〉龜背竹(Monsteradeliciosa)<220>〈221〉CDS〈222〉(49)..(900)〈223><400>1tsgcaatagtattgtacactaacac犯gttcagatttggcattccccaatggcagcaact60tcccttcttttttcagcagctcctctcctcgtcctcctccstgcggtcctcctcgccctc120ttaacacccgccagggcgggggagcaggtcctcatcgccaaccgcacgttgtatgccgga180cagtccctgtacagcatgaaccgcaactac已ggttcatcatgc敏gggactgctccttg240gccctgtacgagttccagaagcccctctggatctcgaccaccgatcggcagccgggcac.t300ttctgcgacgccactctcgatgccggctccgcccgcctcgcggtcacgcagcggaacacc360tctggtcgagcaccacgagtttctacgcattcaagtacgtcctcgtcctg42021cagaccgacctgaacgtggtcatctacagcagacctgtctggtccaccaacacgggcgtc■tgggactccgtggagttccag組gg卿ccagatcttgttgtcctccggcacgctcaag540gttgggcagtacctgtccaac朋cgagctcaacttcsggtttattatgcaggacgactgc600gacctggtcctctacgacgacgaccggcgcatctggagctcggagacctccggcaagggc660accggctgcaacgcaaagttgaacggtctcaccggccagctcatcgtccgggacaacaac720ggcaggatcgtatggagcagcaagaaccgcgccgtcccaattaag犯gcacatcctgctg780ctgcagcccgatcggaacgttgtcgtctacaccggacgcgtctgggcctccgacacgagc840atcccggagaacca鄉(xiāng)agggctgcaggatgctgggcggatcg聊tggt900attagcgtgcctcgtgtactgctcatcgtgcggccaltt.gcgttatttac9603Ctt皿t3Ctgtcggggctggtgcgtcgtcacgtctgtatctcgttttcg1020cggccgtcatgata犯ctatcctttgtgcgatgtttctatggcgtgagct1080tcacttggcgtgtaccttgtccata犯g朋a已gtttgcatctgttcattt1140acgtacgaactttcccccaa1186〈210〉2<211〉283〈212〉PRT<213>龜背竹(Monsteradeliciosa)〈400>2MetAlaAlaThrSerLeuLeuPheSerAlaAlaProLeuLeuValLeu151015LeuHisAlaValLeuLeuAlaLeuLeuThrProAlaArgAlaGlyGlu202530GinValLeulieAlaAsnArgThrLeuTyrAlaGlyGinSerLeuTyr354045SerMetAsnArgAsnTyrArgPhelieMetGinTrpAspCysSerLeu505560AlaLeuTyrGluPheGinLysProLeuTrplieSer6570GinProGlyThrPheCysAspAlalieSerThrThr75AspA〗aG]ySerPheCysAspAlaThrLeu8590LeuAlaValThrGinArgAsnThrAsnLysGinValTrp100105Ser110AspArg80AlaArg95SerThrThrSerPheTyrAlaPheLysTyrValLeuVaJLeuGinThrAspLeu115120125AsnValVallieTyrSerArgProValTrpSerThrAsnThrGlyVal130135140TrpAspSerValGluPheGinAsnGlyAspGin〖LeLeuLeu145150155G丄yThrLeuLysValGlyGinTyrLeuSerAsnAsnGluLeuVal165ArgPhelieMetGinAspAspCysAspLeuValLeuTyrMet180ArgArglieTrpSerSerGluLeuSer170AspLeuValLeuTyrAsp18590SerGlyLysGlyThrGlyCysAsnSerSer160AsnPhe175AspAsplieTrpSerSerGluThrSerGlyLysGlyThr195200205AlaLysLeuAsnGlyLeuThrGlyGinLeulieValArgAspAsnAsn210215220GlyArglieValTrpSerSerLysAsnArgAlaValProlie225230235LysLys240HislieLeuLeuLeuGinProAspArgAsnValValValTyrThrGly245250255ArgValTrpAlaSerAspThrSerlieProGluAsnGinGlyGlyLeu260265270GinAspAlaGlyArglieGluMetValThrAsn275280<210>3〈211〉23<212>DNA〈213〉龜背竹(Monsteradeliciosa)〈400〉3tagcaatagtattgtacactaac23<210>4〈211〉21〈212〉腿〈213〉龜背竹(Monsteradeliciosa)<400〉4ggggaaatgtttctaacgttc2權(quán)利要求1.一種龜背竹凝集素基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。2.—種龜背竹凝集素蛋白質(zhì)，由權(quán)利要求1所述的基因序列所編碼。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的龜背竹凝集素蛋白質(zhì)，其特征在于，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。4.一種含有權(quán)利要求1所述的龜背竹凝集素基因全序列或部分片段的質(zhì)粒。5.—種含有權(quán)利要求1所述的龜背竹凝集素基因全序列或部分片段的植物表達(dá)載體。6.—種宿主細(xì)胞，該細(xì)胞含有權(quán)利要求1或4或5中任一項(xiàng)所述的基因序列，7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所說的細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所說的細(xì)胞為農(nóng)桿菌細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所說的細(xì)胞為煙草細(xì)胞。10.—種龜背竹凝集素基因的應(yīng)用，包括用權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞、或者用權(quán)利要求8所述的農(nóng)桿菌與煙草細(xì)胞共培養(yǎng)、或者用權(quán)利要求9所述的煙草細(xì)胞培育煙草植株。全文摘要本發(fā)明公開了一種龜背竹凝集素基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，以及由SEQIDNO.1所編碼或者有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的龜背竹凝集素蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了上述的龜背竹凝集素基因在煙草中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及在轉(zhuǎn)基因植株中提高抗蟲性的應(yīng)用，顯著地提高了植物的抗蟲性，可用于農(nóng)作物抗蟲的品種改良。文檔編號C12N15/29GK101597609SQ20061011892公開日2009年12月9日申請日期2006年11月30日優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日發(fā)明者偉周,周根余,開國銀,錢忠英,楊陸申請人:上海師范大學(xué)