專利名稱：一種層析用硅膠及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種層析用硅膠及其制法；本發(fā)明還涉及超氧化物歧化酶(SOD)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)的提純方法。
超氧化物歧化酶SOD(superoxide dismufase)j存在于備注血液中的一種酶，能歧化分解超氧自由基O2-以保護機體，目前已作為系列化藥物，用于防治癌、輻射、病及抗衰老，一些高級護膚品中也加入SOD，SOD可由牛身、豬血和人身的紅細胞提取。人絨毛膜促性腺激素，HCG(human chorionic gonadofropin)是存在于孕婦尿中的一種激素，用于孕娠和某些腫瘤的診斷，不孕癥的治療和避孕等。HCG可從孕婦尿中提取。
目前SOD和HCG的提取國內(nèi)都采用DEAE纖維素(DEAE-Cellulose 32)，一般均用進口產(chǎn)品，價格昂貴，須回由反復(fù)使用，因此SOD和HCG的生產(chǎn)流程長，生產(chǎn)成本高。市售的層析硅膠都不能代替DEAE纖維素，用于SOD和HCG的分離提純。
本發(fā)明的目的在于提供一種能替代DEAE纖維素用作SOD、HCG分離提純吸附劑的，成本較低的層析用硅膠。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明的層析硅膠是在硅酸溶液中加入尿素和甲醛溶液，加咸在油狀有機介質(zhì)中縣乳聚合得到硅膠與聚脲醛的″共聚物″，沖洗除去有機介質(zhì)后，灼燒除去聚脲醛，得到孔徑為55-90A的均勻球狀顆粒硅膠。
本發(fā)明的層析硅膠的制法是在硅酸水溶液中，加入尿素，溶解后加入甲醛溶液，攪攔均勻，加入咸溶液，混勻后將此溶液立即倒入高速攪拌的、溶有非離子型表面活性劑的油狀有機介質(zhì)中，進行縣涂聚合、沉淀出球狀粒硅膠，沖洗除去有機介質(zhì)，低溫烘干，高溫灼燒。得到具有規(guī)則層狀微晶結(jié)構(gòu)的、孔徑為55-90A的層析用硅膠。
硅酸溶液與尿素和甲醛溶液用量的比例是150ml硅酸溶液(比重1.05-1.07)加入1-6克尿素，1.68-10.1ml36％甲醛溶液。
懸浮聚合，優(yōu)選的油狀有機介質(zhì)是石蠟油。所用的非離子型表面活性劑，可以是甘油單硬脂酸酯，span60，丙二醇油酸酯等。
沉淀出的球狀顆粒硅膠，用水沖洗，除去有機介質(zhì)，在50-80℃烘干，然后在600-700℃灼燒1.5-3小時。
本發(fā)明的層析用硅膠，可替代DEAE纖維素提純80D和HCG。即將本發(fā)明的層析用硅膠裝柱，SOD或HCG經(jīng)柱導(dǎo)析，由于雜蛋白被較強地吸附在層析硅膠上，而SOD或HCG光被洗脫下來達到純化的目的，活力回收率分別達到90％以上和80％以上。
本發(fā)明的層析用硅膠制作比較簡易，與DEAE纖維素相比成本比較低，因此用于提純SOD或HCG可以不需要回收，減少了提純SOD或HCG的工藝流程，降低了SOD和HCG的成本。
以下實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例1.用水玻璃制取硅酸水溶液。
工業(yè)水玻璃加水，使其比重為1.07，每升此溶液加工業(yè)濃氨水30ml，攪拌5分鐘以上，然后放置2天以上，這時水玻璃中的泥沙、重金屬雜質(zhì)等逐漸沉淀下來，傾泌出上層清液。
將陽離子交換樹脂用水洗多次后，裝入離子交換柱，用1.5MH2so4淋洗，等流出液PH為2左右為止，此時樹脂已轉(zhuǎn)化為H+型，再用水洗至中性。
取上述凈化過的水玻璃溶液流過H+型陽離子交換柱，等流出液的PH＜5時開始收集，直至PH＝3為止，即得硅酸水溶液，其比重為1. 05-1.07。
實施例2.本發(fā)明的層析用硅膠的制取取實施例1的方法得到的硅酸水溶液150毫升，加入工業(yè)尿素2.85克，溶解后再加入36％甲醛水溶液4.8毫升，攪拌30分鐘后，加入10％碳酸氫銨(化學(xué)純)水溶液30毫升，混合后將此溶液迅速倒入高速攪拌的200毫升石蠟油中(石蠟油中溶有某油單硬酯酸酯400毫克，)繼續(xù)攪拌40分鐘，此時沉淀出圓珠形小顆粒狀的硅膠，濾出硅膠，洗去石蠟油，在60℃烘干，然后在600℃灼燒1.5小時，得到本發(fā)明的層析用硅膠，其孔徑為60-70A。
實施例3.本發(fā)明的層析用硅膠的制取取實施例1的方法得到的硅酸水溶液150毫升，加入工業(yè)尿素5.7克，溶解后再加入36％甲醛水溶液9.6毫升，其它步驟同實施例2.制得本發(fā)明的層析用硅膠，其孔徑為55-65A。
實施例4.本發(fā)明的層析用硅膠的制取取實施例1的方法得到的硅酸水溶液150毫升，加入工業(yè)尿素1.42克，溶解后再加入36％甲醛水溶液2.4毫升，其它步驟同實施例2， 但石蠟油中含丙二醇油酸酯450豪克作為表面活性劑，制得本發(fā)明的層析用硅膠，其孔徑為55-65A。
實施例5.本發(fā)明的層析用硅膠的制取步驟用量同實施例2.但最后在80℃烘干，700℃灼燒3小時，制得本發(fā)明的層析用硅膠，其孔徑為70-90A。
實施例6.用本發(fā)明的層析用硅膠純化SOD將實施例2所得本發(fā)明的層析用硅膠用蒸餾水洗滌，再用磷酸鹽緩沖液洗滌后裝入5毫升玻璃析管中。將透析后的粗SOD溶液通過層析柱，分部接收，每管約3毫升，第一管接收通過層析柱的SOD原液，然后用磷酸鹽緩沖液淋洗，最后用濃度為0-200mmol/l的氯化鈉溶液梯度洗脫，每管接收液分別取出適當(dāng)體積以測活力和蛋白量，其結(jié)果見表1。
用實施例2-4制得的層析用硅膠提純SOD，分部接收液的活力回收率和蛋白回收率見表2。
實施例7.用本發(fā)明的層析用硅膠純化HCG將孕婦尿用尼龍網(wǎng)紗過濾，每升孕婦尿加入苯甲酸鈉25-30克，完全溶解后加入冰醋酸約15毫升，當(dāng)PH達4.5-4.0時，尿內(nèi)蛋白質(zhì)(包括HCG)附著在苯甲酸上一起沉淀析出，繼續(xù)攪拌15分鐘后靜置2小時，抽濾、壓干，將濾餅加到100-150毫升預(yù)冷的丙酮中，使苯甲酸溶解而蛋白質(zhì)呈絮狀沉淀，離心或過濾，用丙酮洗滌后干燥，一般每升孕婦尿得干品0.4-0.5克。
將此粗HCG用0.004M磷酸鹽緩沖液溶解(PH7.0)，將本發(fā)明的層析用硅膠用水洗后裝柱，裝柱量為2克，用0.005M磷酸鹽緩沖液淋洗達平衡后，將含HCG80000單位的HCG粗品溶液緩緩?fù)ㄟ^吸附柱，孕蛋白被吸附，HCG通過，流出液用截留分子量30000的超濾膜超濾，至體積為1/3，以除去磷酸鹽并提高HCG濃度，用2倍體積-20℃無水乙醇沉淀，離心分出沉淀，真空干燥，得HCG純品。用放射免疫測定法(radioimmunoassay RIA)分析，其結(jié)果列于表3。表1.管號 接收體積 A280 蛋白濃度 蛋白質(zhì) 抑制率 總活力比重 活力百分?jǐn)?shù)(ml)(mg)(mg) (％) (1000U) (1000U/mg) (％)13.000.2380.401.20047.69.3607.800 10.1223.001.0281.685.04041.861.500 12.202 66.5633.160.1610.270.81040.78.57110.581 9.2843.000.0750.130.39030.25.29413.574 5.7353.100.0450.070.217 - -- -63.100.0350.060.186 - -- -73.000.0240.050.150 - -- -83.000.0200.040.120 - -- -93.000.0030.000.000 - -- -粗SOD溶液3.00ml，蛋白總重量11.760mg，總活力92.40(1000U)，比活7.857(1000U/gm)表2層析硅膠純化SOD時分部接收液的活力回收率和蛋白回收率前4管活力百分?jǐn)?shù)(％)原液 回收 活力 原始總回收 前4管總活力 總活力 回收率 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) 蛋白回1 2 3 4 (1000U) (1000U) (％) (mg)(mg) 收率(％)例2硅膠 10.12 66.56 9.28 5.73 92.400 84.725 91.7 11.760 8.113 63.3例3硅膠 9.42 70.86 10.35 5.10 23.352 22.290 95.5 14.713 11 004 81.9例4硅膠 7.48 46.38 35.22 7.52 23.424 22.619 96.6 30.744 22.477 63.6表3 用層析硅膠純化HCG的結(jié)果上柱 得純 得純 得純回收率HCG量HCG重HCG比活 HCG量iu (mg) (iu/mg) (iu) (％)例2硅膠 80000105.0618 6489081.1例3硅膠 8000090.5 612 5538669.2例4硅膠 8000057.3 864 4950761.9例5硅膠 8000044.6 550 2453030.權(quán)利要求
1.一種層析硅膠，具有規(guī)則的層狀微晶結(jié)構(gòu)，其特征是在硅酸溶液中加入尿素和甲醛溶液，加堿在油狀有機介質(zhì)中縣乳聚合，然后灼燒除去聚脲醛，得到的孔徑為55-90A的均勻球狀顆粒硅膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析用硅膠的制法，其特征是在硅酸水溶液中，加入尿素，溶解后加入甲醛溶液，攪拌均勻，加入堿溶液，將此溶液立即倒入高速攪拌的、溶有非離子型表面活性劑的油狀有機介質(zhì)中，進行縣涂聚合，沉淀出球狀粒硅膠，沖洗除去有機介質(zhì)，低溫烘干，高溫灼燒，得到具有規(guī)則層狀微晶結(jié)構(gòu)的、孔徑為55-90A的層析用硅膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析用硅膠的制法，其特征是有機介質(zhì)是石蠟油，非離子型表面活性劑是某油單硬脂酸酯，span60，丙二醇油酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析用硅膠的制法，其特征是在50-80℃烘干，在600-700℃灼燒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析用硅膠的用途，其特征是用于分離提屯氧化物歧化酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析用硅膠的用途，其特征是用于分離提純?nèi)私q毛膜促性腺激素。
全文摘要
一種層析用硅膠，它是在硅酸溶液中加入尿素和甲醛溶液，加堿在油狀有機介質(zhì)中縣乳聚合得到硅膠與聚脲醛的“共聚物”，沖洗除去有機介質(zhì)后，灼燒除去聚脲醛，得到孔徑為55-90A的均勻球狀顆粒硅膠。此硅膠可替代DEAE纖維素超氧化物歧化酶和人絨毛膜促性腺激素，有很好的提純效果和活力回收率。
文檔編號C01B33/16GK1163796SQ96116910
公開日1997年11月5日 申請日期1996年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月30日
發(fā)明者羅勤慧, 沈孟長 申請人:南京大學(xué)