專(zhuān)利名稱(chēng)：具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是含有具有免疫調(diào)節(jié)作用的戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)的組合物。
背景技術(shù)：
眾所周知，乳酸菌具有整腸作用和免疫賦活作用等有益生理活性。具有上述有益生理活性的乳酸菌，大多是分離自發(fā)酵乳制品和腸管等的動(dòng)物性乳酸菌，但在植物性乳酸菌中也發(fā)現(xiàn)了具有免疫賦活作用的菌株。
例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載了具有免疫賦活作用的乳酸菌植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L-137株。另外，已知分離自京都傳統(tǒng)咸菜“酸蘿卜咸菜”的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)Labre株、分離自“紫蘇腌茄子”的戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)DA74N株等也具有免疫賦活作用(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2)。
日本特開(kāi)平10-167972號(hào)公報(bào)(
公開(kāi)日平成10年6月23日)[非專(zhuān)利文獻(xiàn)1]岸惇子、小久保AOI(日語(yǔ)原名；小久保あおい)、赤谷薰、扇谷ERI子(日語(yǔ)原名；扇谷えり子)、藤田晢也、岸田綱太郎選擇有用乳酸菌的篩選①人末梢血中植物性乳酸菌的體外免疫賦活效果、Pasken Journal 15.21-26，2002[非專(zhuān)利文獻(xiàn)2]赤谷薰、岸惇子、扇谷ERI子(日語(yǔ)原名；扇谷えり子)、小久保AOI(日語(yǔ)原名；小久保あおい)、藤田晢也、岸田綱太郎第6回腸內(nèi)細(xì)菌學(xué)會(huì)(2002.05.30-31)要旨從日本國(guó)京都的傳統(tǒng)咸菜中，可分離出多種菌類(lèi)，除上述Labre株外，還存在具有免疫賦活作用等有用生理活性的菌株。上述咸菜中分離的菌株中，分離頻率最高的菌株為植物乳桿菌和戊糖乳桿菌，但以往對(duì)分離自咸菜的菌類(lèi)的功效，并未作深入研究。此外，由于分離自咸菜的乳酸菌原本即為食品中含有的菌類(lèi)，因此，即使將其攝入體內(nèi)，安全性也很高。所以，只要從咸菜中分離有用性高的乳酸菌，即可構(gòu)成含有該乳酸菌的有用組合物。
鑒于上述問(wèn)題完成了本發(fā)明，其目的在于提供含有分離自日本國(guó)京都傳統(tǒng)咸菜的具有有用生理活性的乳酸菌且安全性高的飲食品和醫(yī)藥品等。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述課題，本發(fā)明者等以分離自咸菜的16種乳酸菌為對(duì)象，研究其免疫調(diào)節(jié)作用，并對(duì)從中選擇的屬于戊糖乳桿菌的乳酸菌的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將該乳酸菌與飲用水混合讓動(dòng)物攝取時(shí)，或給與動(dòng)物該乳酸菌的懸浮液時(shí)，發(fā)現(xiàn)具有免疫賦活作用和抗過(guò)敏作用等免疫調(diào)節(jié)作用，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明組合物的特征在于，含有屬于戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)且無(wú)甘油同化性或甘油同化性較弱的乳酸菌。本乳酸菌優(yōu)選具有免疫調(diào)節(jié)作用，另外，優(yōu)選細(xì)胞外多糖產(chǎn)生株。
作為優(yōu)選的乳酸菌，可列舉戊糖乳桿菌S-PT84株。本戊糖乳桿菌S-PT84株是本發(fā)明者等從紫蘇腌茄子中分離并發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用的菌株。本菌也被稱(chēng)為DS84C株。本菌保藏于日本國(guó)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(Lactobacillus pentosus SAM 2336)，其保藏編號(hào)為FERMABP-10028。因此，本發(fā)明的組合物，優(yōu)選含有上述戊糖乳桿菌S-PT84株的組合物。
本發(fā)明的組合物是含有上述乳酸菌的組合物，是具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物。另外，本發(fā)明的組合物是含有上述乳酸菌的組合物，是具有抗過(guò)敏作用的組合物。此外，本發(fā)明的組合物也可以是以活菌形式含有乳酸菌的組合物。上述組合物可有效用于具有免疫調(diào)節(jié)作用和/或抗過(guò)敏作用的飲食品和醫(yī)藥品。
本發(fā)明的其他目的、特征及優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)以下說(shuō)明可充分了解。此外，參照附圖，結(jié)合以下說(shuō)明，可明白本發(fā)明的有益效果。


圖1所示為16種乳酸菌體外刺激對(duì)巨噬細(xì)胞IL-12誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖2所示為S-PT84腹腔內(nèi)給與后血清IL-12濃度隨時(shí)間的變化。
圖3所示為16種乳酸菌腹腔內(nèi)給與后小鼠血清IL-12濃度的測(cè)定結(jié)果。
圖4(a)～(c)所示為淋巴細(xì)胞因S-PT84刺激而產(chǎn)生的細(xì)胞因子的分析結(jié)果的流式細(xì)胞儀圖表，(a)所示為培養(yǎng)基中不添加任何物質(zhì)時(shí)的結(jié)果，(b)所示為培養(yǎng)基中添加S-PT84死菌時(shí)的結(jié)果，(c)所示為培養(yǎng)基中添加刀豆素A時(shí)的結(jié)果。
圖5(a)～(c)所示為S-PT84刺激對(duì)CD4+、CD8+以及CD69+細(xì)胞的影響的分析結(jié)果的流式細(xì)胞儀圖表。(a)所示為培養(yǎng)基中不添加任何物質(zhì)時(shí)的結(jié)果，(b)所示為培養(yǎng)基中添加S-PT84死菌時(shí)的結(jié)果，(c)所示為培養(yǎng)基中添加刀豆素A時(shí)的結(jié)果。
圖6所示為S-PT84腹腔內(nèi)給與后肝淋巴細(xì)胞的NK活性的測(cè)定結(jié)果。
圖7(a)·(b)所示為S-PT84腹腔內(nèi)給與對(duì)肝淋巴細(xì)胞的CD4+、CD8+以及CD69+細(xì)胞的影響的分析結(jié)果的流式細(xì)胞儀圖表。(a)所示為對(duì)照的結(jié)果，(b)所示為S-PT84給與后的結(jié)果。
圖8所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠的血清IL-12濃度測(cè)定結(jié)果。
圖9所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠的脾細(xì)胞NK活性測(cè)定結(jié)果。
圖10所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠的脾細(xì)胞Th1/Th2比測(cè)定結(jié)果。
圖11所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠在環(huán)磷酰胺給與后的體重變化。
圖12所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠在環(huán)磷酰胺給與后的血清IL-12濃度測(cè)定結(jié)果。
圖13所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠在OVA給與后OVA特異性IgE濃度的變化。
圖14所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠在OVA給與3周后總IgE濃度測(cè)定結(jié)果。
圖15所示為S-PT84經(jīng)口攝取后的小鼠對(duì)應(yīng)激時(shí)免疫低下的抑制效果。
圖16所示為4種乳酸菌(DB22C、DS51C、DS2C、DS84C(S-PT84))過(guò)熱死菌或活菌腹腔內(nèi)給與后的小鼠的血清IL-12濃度測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面，對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施形態(tài)進(jìn)行說(shuō)明。另外，本發(fā)明不限于此。
本發(fā)明的組合物中含有的乳酸菌，只要是屬于戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)且無(wú)甘油同化性或甘油同化性較弱的乳酸菌即可。含有上述乳酸菌的組合物，能夠發(fā)揮該乳酸菌所具有的有用生理活性，其價(jià)值很高。其中，優(yōu)選具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物。具有免疫調(diào)節(jié)作用意為具有下述至少任意一方面的作用當(dāng)穩(wěn)態(tài)和免疫功能低下時(shí)使其活化的作用(免疫賦活作用)、當(dāng)免疫功能過(guò)度亢進(jìn)時(shí)進(jìn)行抑制使其處于適宜免疫狀態(tài)的作用(免疫抑制作用)、使細(xì)胞免疫和體液免疫處于最佳平衡的作用。免疫調(diào)節(jié)作用，可列舉促進(jìn)或抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生、活化淋巴細(xì)胞、增強(qiáng)NK(natural killer)活性、改善Th1/Th2平衡、抑制免疫低下、抗過(guò)敏等作用，但不限于這些。
本發(fā)明的組合物中含有的乳酸菌，還優(yōu)選細(xì)胞外多糖(ExtracellulerPolysaccharide以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“EPS”)產(chǎn)生株。根據(jù)菌屬、菌種、菌株不同，EPS的性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)也各不相同，本乳酸菌的EPS是附著于菌體表面的莢膜多糖，利用墨汁染色，即可鑒別。EPS產(chǎn)生株與非產(chǎn)生株相比，親水性高，因此易于在食品中應(yīng)用。
作為本發(fā)明組合物中含有的乳酸菌的代表性菌株，可列舉戊糖乳桿菌S-PT84株。本菌保藏于日本國(guó)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心，其保藏編號(hào)為FERM ABP-10028。下面，對(duì)戊糖乳桿菌S-PT84株(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“S-PT84”)進(jìn)行說(shuō)明。
本發(fā)明者等設(shè)定如下基準(zhǔn)，選擇出16種從紫蘇腌茄子中分離的乳酸菌(Lactobacillus plantarum 4種、Lactobacillus pentosus 12種)。即，從植物性乳酸菌中，選擇出16種符合下述四個(gè)基準(zhǔn)的乳酸菌，即是乳桿菌屬(Lactobacillus)、分離出多株具有相同性狀的菌株、在培養(yǎng)基中顯示良好的增殖情況、是咸菜的特征菌。
以上述16種乳酸菌為對(duì)象，比較白細(xì)胞介素12(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為“IL-12”)誘導(dǎo)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)向小鼠腹腔內(nèi)給與菌體后，戊糖乳桿菌S-PT84株使血清IL-12濃度上升最顯著。
然后，詳細(xì)探討了該S-PT84的免疫調(diào)節(jié)作用，得到以下發(fā)現(xiàn)。
(1)對(duì)從小鼠制備的脾細(xì)胞進(jìn)行體外處理后，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ(干擾素γ)以及TNF-α(腫瘤壞死因子α)產(chǎn)生，使CD4+CD69+細(xì)胞以及CD8+CD69+細(xì)胞增加，即S-PT84具有活化輔助性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞的作用。
(2)向小鼠腹腔內(nèi)給與后，具有增強(qiáng)肝淋巴細(xì)胞NK活性的作用。另外，使CD8+細(xì)胞以及CD8+CD69+細(xì)胞增加，增強(qiáng)細(xì)胞免疫。
(3)讓小鼠經(jīng)口攝取后，使血清IL-12濃度上升，使脾細(xì)胞的CD4+、CD8+以及CD3+的細(xì)胞數(shù)增加，使脾細(xì)胞的NK活性增強(qiáng)，使脾細(xì)胞的Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)向Th1優(yōu)勢(shì)。
(4)讓小鼠經(jīng)口攝取后，抑制因環(huán)磷酰胺給與而引起的體重下降，抑制免疫反應(yīng)的低下。
(5)讓小鼠經(jīng)口攝取后，即使用卵白蛋白(OVA)致敏，也可抑制OVA特異性IgE以及總IgE的上升。
(6)讓小鼠經(jīng)口攝取后，抑制應(yīng)激引起的NK活性的下降。
由此表明，S-PT84是具有免疫調(diào)節(jié)作用的菌株。
S-PT84的菌學(xué)性質(zhì)見(jiàn)表1。


眾所周知，通常戊糖乳桿菌的甘油同化性高，但由表1可知，S-PT84的甘油同化性較弱，不同于迄今為止已知的戊糖乳桿菌。
從S-PT84提取DNA后，用Microseq Full Gene 16S rDNA kit(AppliedBiosystems公司生產(chǎn))對(duì)16SrRNA基因整個(gè)區(qū)域約500bp進(jìn)行解讀。經(jīng)解讀的S-PT84的16SrRNA基因序列(序列號(hào)1)與戊糖乳桿菌JCMT(D79211)的16SrRNA基因序列具有100％同源性，因此鑒定為戊糖乳桿菌。
S-PT84與不產(chǎn)生EPS的菌相比，親水性高，幾乎不粘附于塑料表面。另外，幾乎沒(méi)有酵母凝集作用。
本發(fā)明的組合物，只要是含有屬于戊糖乳桿菌且無(wú)甘油同化性或甘油同化性較弱的乳酸菌的組合物即可，優(yōu)選具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物，或具有抗過(guò)敏作用的組合物。當(dāng)然，若是兼具免疫調(diào)節(jié)作用和抗過(guò)敏作用的組合物，則更加有用。
本發(fā)明的組合物可作為具有免疫調(diào)節(jié)作用和/或抗過(guò)敏作用的飲食品和醫(yī)藥品，得到有效利用。即，優(yōu)選作為具有免疫調(diào)節(jié)作用和/或抗過(guò)敏作用的藥學(xué)組合物使用。
上述組合物中含有的乳酸菌可以是乳酸菌(活菌和死菌)、乳酸菌含有物、乳酸菌處理物等。從該乳酸菌培養(yǎng)液等乳酸菌含有物中，可得到活菌。通過(guò)對(duì)活菌進(jìn)行加熱、紫外線(xiàn)照射、福爾馬林處理等，可得到死菌。得到的活菌、死菌進(jìn)一步通過(guò)磨碎和破碎等處理，可制成處理物。
即，本發(fā)明的組合物，只要含有乳酸菌、乳酸菌含有物、乳酸菌處理物中的至少任意一種即可。上述乳酸菌可以是活菌體、濕菌、干菌等。上述乳酸菌含有物可以是例如，乳酸菌懸浮液、乳酸菌培養(yǎng)物(包含菌體、培養(yǎng)上清、培養(yǎng)基成分)、乳酸菌培養(yǎng)液(從菌培養(yǎng)物中除去固體成分后的物質(zhì))、乳酸菌發(fā)酵乳(乳酸菌飲料、乳清、酸奶(yoghurt)等)。另外，乳酸菌處理物可以是例如，磨碎物、破碎物、液狀物(提取液等)、濃縮物、糊化物、干燥物(噴霧干燥物、冷凍干燥物、真空干燥物、鼓式干燥物等)、稀釋物等。由于本發(fā)明組合物中含有的S-PT84原本即為從發(fā)酵食品紫蘇腌茄子中分離的菌株，因此，含有果蔬類(lèi)和谷物類(lèi)經(jīng)S-PT84發(fā)酵后的發(fā)酵物的物質(zhì)也是本發(fā)明組合物的優(yōu)選形態(tài)之一。如上所述，由于S-PT84原本即為從食品中分離的菌株，因此，含有S-PT84的組合物的安全性高。
本發(fā)明的組合物，優(yōu)選作為上述飲食品和醫(yī)藥品等、即具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥學(xué)組合物使用。用于飲食品中時(shí)，優(yōu)選作為具有免疫調(diào)節(jié)作用的健康食品使用。另外，也可以與公知的甜味料、酸味料、維生素等各種成分混合，制成符合消費(fèi)者口味的產(chǎn)品。例如，可以以片劑、膠囊劑、保健營(yíng)養(yǎng)液、酸奶或乳酸菌飲料等乳制品、調(diào)味料、加工食品、甜點(diǎn)類(lèi)、糕點(diǎn)等形態(tài)提供。
作為醫(yī)藥品時(shí)，可列舉免疫賦活劑和抗過(guò)敏藥。另外，也可以在主藥中添加賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、矯味矯臭劑、助溶劑、懸浮劑、包衣劑等醫(yī)藥制劑技術(shù)領(lǐng)域中常用的公知輔助劑，制成制劑。劑型可以是片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑、栓劑、注射劑等，無(wú)特殊限制。作為本醫(yī)藥品的給與途徑，可列舉經(jīng)口給與、直腸給與、經(jīng)腸給與等，并無(wú)特殊限制。
[使用的乳酸菌株]從日本國(guó)京都傳統(tǒng)咸菜紫蘇腌茄子中，分離出4種Lactobacillusplantarum、12種Lactobacillus pentosus，用于比較白細(xì)胞介素12(IL-12)誘導(dǎo)能力的實(shí)驗(yàn)，以選擇Th1型免疫賦活能力高的菌株。表2中顯示使用菌株的株名、種名以及EPS的有無(wú)。比較IL-12誘導(dǎo)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DS84C株(S-PT84)的活性特別強(qiáng)，因此，之后的實(shí)驗(yàn)僅用S-PT84來(lái)進(jìn)行。

向BALB/c小鼠(7周齡·雄性)腹腔內(nèi)給與4.05％硫乙醇酸鈉，4天后，用PBS回收腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞，用含10％FBS的RPMI培養(yǎng)基調(diào)整到2×106cells/mL后，加入24孔板內(nèi)，每孔0.5mL。向各孔中添加各菌株的加熱死菌(10μg/mL)，培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定培養(yǎng)上清中的IL-12濃度。由于活性IL-12是由p35和p40亞單位結(jié)合的p70，因此測(cè)定IL-12(p70)即可。另外，用OptEIA mouse IL-12測(cè)定試劑盒(BD Pharmingen公司生產(chǎn))測(cè)定IL-12。
結(jié)果在圖1中顯示。由圖1可知，即使是菌種和親株相同的菌株，IL-12的誘導(dǎo)能力也各不相同，DW69N、S-PT84(DS84C)、DS25C表現(xiàn)出特別高的活性。
向BALB/c小鼠(7周齡·雄性)腹腔內(nèi)給與各菌株的加熱死菌(500μg/0.2mL/小鼠)懸浮液(溶劑生理鹽水)，6小時(shí)后，進(jìn)行頸椎脫臼，然后，從心臟采血。另外，向control的小鼠等量給與生理鹽水。之所以在給與后6小時(shí)采血，是因?yàn)槭孪扔肧-PT84探討的結(jié)果顯示死菌給與后血清IL-12濃度的峰值出現(xiàn)在給與后6小時(shí)(參照?qǐng)D2)。采血后，通過(guò)離心分離，收集血清，用OptEIA mouseIL-12測(cè)定試劑盒(BD Pharmingen公司生產(chǎn))測(cè)定血清中的IL-12濃度。
結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，給與S-PT84(DS84C)、DS51C以及DS25C這3株菌株后的血清IL-12濃度高于control。其中，給與S-PT84(DS84C)后的血清IL-12濃度最高，因此，之后的實(shí)驗(yàn)僅采用S-PT84。
從BALB/c小鼠(7周齡·雄性)中取出脾臟，按常法制備脾細(xì)胞。在含有上述S-PT84加熱死菌(1μg/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。將在不添加任何物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脾細(xì)胞(control)和添加刀豆素A(2.5μg/mL)培養(yǎng)的脾細(xì)胞(ConA)設(shè)為對(duì)照。為了弄清因S-PT84死菌的刺激而產(chǎn)生的細(xì)胞因子，用CBAkit(BD Pharmingen公司生產(chǎn))測(cè)定各培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子濃度。另外，回收脾細(xì)胞，用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD4抗體(CY-CHCROMETM標(biāo)記、BD bioscience公司生產(chǎn))、抗CD8抗體(FITC標(biāo)記、Immunotech公司生產(chǎn))、抗CD69抗體(PE標(biāo)記、BD bioscience公司生產(chǎn))標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司生產(chǎn))測(cè)定CD4、CD8以及CD69陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
細(xì)胞因子的生成結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4(a)所示為培養(yǎng)基中不添加任何物質(zhì)時(shí)(control)的結(jié)果，圖4(b)所示為培養(yǎng)基中添加S-PT84死菌時(shí)(S-PT84)的結(jié)果，圖4(c)所示為培養(yǎng)基中添加刀豆素A時(shí)(ConA)的結(jié)果。由圖4可知，通過(guò)S-PT84的刺激，誘導(dǎo)IFN-γ(干擾素γ)以及TNF-α(腫瘤壞死因子α)產(chǎn)生，而在control中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)上述細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子是Th1型細(xì)胞因子，認(rèn)為S-PT84特異性誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子。另一方面，沒(méi)有產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-5。另外，用刀豆素A刺激后，產(chǎn)生另一種Th1型細(xì)胞因子IL-2(白細(xì)胞介素2)。
對(duì)CD4+、CD8+以及CD69+細(xì)胞的影響的結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5(a)所示為培養(yǎng)基中不添加任何物質(zhì)時(shí)(control)的結(jié)果，圖5(b)所示為培養(yǎng)基中添加S-PT84死菌(1μg/ml)時(shí)(S-PT84)的結(jié)果，圖5(c)所示為培養(yǎng)基中添加刀豆素A時(shí)(ConA)的結(jié)果。另外，圖5中，箭頭越往上或越往右，表示各表面抗原的陽(yáng)性細(xì)胞越多。由圖5可知，S-PT84活化輔助性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞。
向C57BL/6小鼠(7周齡·雄性)腹腔內(nèi)給與S-PT84加熱死菌(500μg/0.2mL/小鼠)懸浮液(溶劑生理鹽水)，24小時(shí)后，取出肝臟，用離心法制備肝淋巴細(xì)胞。作為對(duì)照(control)，腹腔內(nèi)只給與生理鹽水。用PINK法測(cè)定制備的肝淋巴細(xì)胞的NK活性。PINK法即用疏水性膜系熒光色素3，3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)標(biāo)記靶細(xì)胞Yac-1，然后用膜不透過(guò)性核酸嵌入型熒光色素propidium iodide(PI)對(duì)死細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行雙重染色，未被殺傷的Yac-1為Dio單染色，被殺傷的Yac-1為雙重染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢出，算出小鼠淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。另外，用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD4抗體(CY-CHCROMETM標(biāo)記、BD bioscience公司生產(chǎn))、抗CD8抗體(FITC標(biāo)記、Immunotech公司生產(chǎn))、抗CD69抗體(PE標(biāo)記、BD bioscience公司生產(chǎn))標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司生產(chǎn))測(cè)定CD4、CD8以及CD69陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
NK活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6中，NK activity(％)表示小鼠肝淋巴細(xì)胞對(duì)Yac-1的細(xì)胞毒活性，E:T ratio表示反應(yīng)的肝淋巴細(xì)胞數(shù)Yac-1數(shù)。由圖6可知，與control相比，從給與S-PT84后的小鼠制備的肝淋巴細(xì)胞的NK活性明顯上升。
CD4+、CD8+以及CD69+細(xì)胞的結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7(a)所示為對(duì)照(control)的結(jié)果，圖7(b)所示為給與S-PT84后的結(jié)果。另外，圖7中，箭頭越往上或越往右，表示各表面抗原的陽(yáng)性細(xì)胞越多。由圖7可知，CD8+的細(xì)胞明顯增加，CD8+CD69+的細(xì)胞也有所增加，由此可知，通過(guò)給與S-PT84，肝臟中殺傷性T細(xì)胞增加，而且，活化的殺傷性T細(xì)胞也增加。
讓6只BALB/c小鼠(7周齡·雄性)通過(guò)飲水1周(相當(dāng)于2mg/day)自由攝取S-PT84(死菌體)。另外，設(shè)置不攝取S-PT84的對(duì)照組(6只)。1周后，從心臟采血，然后取出脾臟。通過(guò)離心分離，從血液收集血清，用OptEIA mouseIL-12測(cè)定試劑盒(BD Biosciences公司生產(chǎn))測(cè)定血清中的IL-12濃度。另外，按常法從取出的脾臟中制備脾細(xì)胞，測(cè)定脾淋巴細(xì)胞的CD4+、CD8+以及CD3+細(xì)胞數(shù)(采用各自的標(biāo)記抗體，用流式細(xì)胞儀測(cè)定)，用PINK法測(cè)定NK活性，以及測(cè)定Th1/Th2的比(使刀豆素A 2.5μg/mL作用于小鼠脾細(xì)胞5×106個(gè)24小時(shí)，測(cè)定上清中產(chǎn)生的IL-4以及IFN-γ濃度。Th1/Th2比為IFN-γ濃度比IL-4濃度的值)。
血清IL-12濃度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，與對(duì)照組(Cont)相比，經(jīng)口攝取S-PT84后的小鼠的血清IL-12濃度顯著上升。
CD4+、CD8+以及CD3+細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，脾T淋巴細(xì)胞亞群有增加的趨勢(shì)。


NK活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9。圖9中，NK activity(％)表示小鼠脾細(xì)胞對(duì)Yac-1的細(xì)胞毒活性，E:T ratio表示反應(yīng)的脾細(xì)胞數(shù)Yac-1數(shù)。由圖9可知，與對(duì)照組(Cont)相比，從經(jīng)口攝取S-PT84后的小鼠制備的脾細(xì)胞的NK活性顯著上升。
Th1/Th2比的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，與對(duì)照組(Cont)相比，從經(jīng)口攝取S-PT84后的小鼠制備的脾細(xì)胞的Th1細(xì)胞因子生成率顯著增加。
如上所述，經(jīng)口攝取S-PT84后的小鼠，其Th1型細(xì)胞因子被誘導(dǎo)，Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)向Th1優(yōu)勢(shì)，NK活性增加。由此可知S-PT84具有Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)作用以及免疫賦活作用。
將20只BALB/c小鼠(7周齡·雄性)分成2組，各組平均體重大致相等，分別為S-PT84攝取組和S-PT84非攝取組(對(duì)照組)。對(duì)S-PT84攝取組，使其通過(guò)飲水22天(相當(dāng)于2mg/day)自由攝取S-PT84(死菌體)。攝取開(kāi)始的第8天，以200mg/kg的劑量，向全體小鼠腹腔內(nèi)給與作為癌癥化療藥物的烷化劑環(huán)磷酰胺(CyclophosphamideCY)。在CY給與后第1、2、3、5、8、12及15天，測(cè)定各個(gè)體的體重。
兩組的平均體重的變化見(jiàn)圖11。由圖11可知，與對(duì)照組(Control)相比，S-PT84攝取組抑制因CY給與而引起的體重下降。
將BALB/c小鼠(7周齡·雄性)分成5組。組的構(gòu)成無(wú)處置組(5只)、S-PT84非攝取·CY非給與組(10只)、S-PT84非攝取·CY給與組(10只)、S-PT84攝取·CY非給與組(10只)以及S-PT84攝取·CY給與組(11只)。對(duì)攝取S-PT84的2組，使其通過(guò)飲水12天(相當(dāng)于2mg/day)自由攝取S-PT84(死菌體)。攝取開(kāi)始的第7天，以200mg/kg的劑量，向CY給與組小鼠腹腔內(nèi)給與作為癌癥化療藥物的烷化劑環(huán)磷酰胺(CyclophosphamideCY)。CY給與后第5天，除無(wú)處置組外，對(duì)其他4組小鼠腹腔內(nèi)給與S-PT84加熱死菌(500μg/0.2mL/小鼠)懸浮液(溶劑生理鹽水)。S-PT84死菌給與后第6小時(shí)，對(duì)包括無(wú)處置組在內(nèi)的全體小鼠進(jìn)行心臟采血。采血后，通過(guò)離心分離，收集血清，用OptEIAmouse IL-12測(cè)定試劑盒(BD Pharmingen公司生產(chǎn))測(cè)定血清中的IL-12濃度。
結(jié)果見(jiàn)圖12。由圖12可知，通過(guò)給與CY，S-PT84非攝取組的血清IL-12濃度顯著降低，而S-PT84攝取組則顯著抑制因CY給與而引起的血清IL-12濃度的降低，與對(duì)照組的血清IL-12濃度幾乎相同。
上述結(jié)果表明S-PT84抑制由CY引起的體重下降以及免疫低下，即具有免疫賦活作用。
將36只BALB/c小鼠(7周齡·雄性)分成4組。組的構(gòu)成無(wú)處置組(5只)、對(duì)照組(10只)、S-PT84組(11只)、Dex攝取組(10只)，對(duì)S-PT84組，使其通過(guò)飲水7周(相當(dāng)于2mg/day)自由攝取S-PT84(死菌體)，對(duì)Dex攝取組，以0.5mg/kg的劑量，7周強(qiáng)制經(jīng)口給與。對(duì)無(wú)處置組和對(duì)照組，使其自由攝取自來(lái)水7周。另外，Dex是具有消炎、抗過(guò)敏作用的類(lèi)固醇制劑，作為陽(yáng)性對(duì)照藥使用。S-PT84攝取或Dex給與開(kāi)始1周后和2周后，將20μg卵白蛋白(OVA)與2mg氫氧化鋁凝膠混合，除無(wú)處置組外，向其余3組小鼠腹腔內(nèi)給與。從第2次的給與日(第0周)開(kāi)始，每隔1周對(duì)全體小鼠進(jìn)行采血，直至第5周，合計(jì)6次，測(cè)定OVA特異性IgE濃度。OVA特異性IgE濃度測(cè)定時(shí)，通過(guò)改良OptEIA mouse IgE測(cè)定試劑盒(BD Pharmingen公司生產(chǎn))，采用包被OVA以代替補(bǔ)足用抗體的ELISA法進(jìn)行測(cè)定。另外，用第3周的血液樣品，測(cè)定總IgE?？侷gE測(cè)定時(shí)，采用OptEIA mouse IgE測(cè)定試劑盒(BD Pharmingen公司生產(chǎn))，用ELISA法測(cè)定。
圖13所示為OVA特異性IgE濃度的變化，圖14所示為總IgE濃度的測(cè)定結(jié)果。由圖13可知，S-PT84組與對(duì)照組(Control)相比，顯著抑制OVA特異性IgE濃度的上升。Dex組雖然顯示抑制趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。另外，由圖14可知，與對(duì)照組(Control)相比，S-PT84組和Dex組顯著抑制總IgE濃度的上升。
以上結(jié)果表明S-PT84具有抗過(guò)敏作用。
將9只C57BL/6小鼠(6周齡·雄性)分成3組，各組平均體重大致相等。組的構(gòu)成對(duì)照組(3只)、應(yīng)激組(3只)以及S-PT84攝取+應(yīng)激組(3只)。對(duì)S-PT84攝取組，使其通過(guò)飲水7天(相當(dāng)于2mg/day)自由攝取S-PT84(死菌體)。攝取開(kāi)始的第8天，將應(yīng)激組和S-PT84攝取+應(yīng)激組的6只小鼠水浸一次后，放入頂端開(kāi)有空氣孔的50mL聚乙烯管中，束縛24小時(shí)。對(duì)照組則絕水絕食24小時(shí)。然后，從動(dòng)物中取出脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞，測(cè)定NK活性。
NK活性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖15。與對(duì)照組相比，應(yīng)激組的NK活性顯著下降。但是，S-PT84攝取+應(yīng)激組維持與對(duì)照組相同的NK活性，與應(yīng)激組相比，呈顯著高值。由此表明S-PT84抑制由應(yīng)激引起的免疫低下。
以圖3中通過(guò)腹腔內(nèi)給與使小鼠血清IL-12濃度增加的乳酸菌為對(duì)象，比較死菌與活菌之間的免疫賦活作用。
制備4種乳酸菌(DB22C、DS51C、DS2C、DS84C(S-PT84))過(guò)熱死菌或活菌(均為500μg(2.5×108個(gè))/0.2ml/小鼠)的懸浮液，向BALB/c小鼠(7周齡·雄性)腹腔內(nèi)給與，6小時(shí)后，使小鼠頸椎脫臼，從心臟采血。另外，作為Control，以生理鹽水代替乳酸菌向小鼠等量給與。
采血后，通過(guò)離心分離，收集血清，用Opt EIA(BD Pharmingen公司生產(chǎn))測(cè)定血清中的IL-12濃度。結(jié)果如圖16所示。
與圖3同樣，DS84C(S-PT84)給與組的IL-12生成量最高。此外，從圖16可知，DS84C(S-PT84)活菌給與組的IL-12生成量高于死菌給與組。
按下述方法，制造含有S-PT84的醫(yī)藥品(片劑)。
將S-PT84的干燥粉碎物66.7g與乳糖232.0g以及硬脂酸鎂1.3g混合，用單沖式打片機(jī)打片，制造直徑10mm、重量300mg的片劑。
將乳固體成分21％的S-PT84發(fā)酵乳添加到市售牛奶中，靜置3天，制備酸奶。得到的酸奶呈現(xiàn)良好香味。
按表4所示的組成，用S-PT84制備乳酸菌飲料。得到的乳酸菌飲料呈現(xiàn)良好香味。


另外，具體實(shí)施方式
中的具體實(shí)施形態(tài)或?qū)嵤├?，只是?duì)本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容的闡明，不應(yīng)局限于上述具體例子進(jìn)行狹義解釋?zhuān)诒景l(fā)明的主旨和權(quán)利要求項(xiàng)的范圍內(nèi)，可進(jìn)行各種變形。
本發(fā)明的組合物作為飲食品攝取或作為醫(yī)藥品給與時(shí)，通過(guò)賦活免疫功能，可抑制免疫功能低下，此外，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能的平衡，可抑制對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響的免疫功能過(guò)度亢進(jìn)。
本發(fā)明的組合物可作為具有免疫調(diào)節(jié)作用的健康食品和醫(yī)藥品使用。因此，本發(fā)明可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥品工業(yè)。
序列表<110>三得利株式會(huì)社(SUNTORY LIMITED)<120>具有免疫調(diào)節(jié)作用的組合物(A Composition Having Immunoregulating ActivitiesComprising Lactobacillus Pentosus)<130>FP2005-040<140>PCT/JP2005/006585<141>2005-03-29<150>JP 2004-159461<151>2004-05-28<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1519<212>DNA<213>乳酸菌(Lactobacillus pentosus)<400>1gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gaactctggt attgattggt 60gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc 120tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac 180cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta 240ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg 300taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac 480ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac 780aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt 840ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag 900gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac 1020gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattatc agttgccagc attaagttgg 1140gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac 1260tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1320cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1380cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg 1440gtaacctttt aggaaccagc cgcctaaggt gggacagatg attagggtga agtcgtaaca 1500
aggtagccgt aggagaacc 1519
權(quán)利要求
1.組合物，其特征在于，其含有屬于戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)且無(wú)甘油同化性或甘油同化性較弱的乳酸菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述乳酸菌具有免疫調(diào)節(jié)作用和/或抗過(guò)敏作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述乳酸菌是細(xì)胞外多糖產(chǎn)生株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述乳酸菌是戊糖乳桿菌S-PT84株(FERM ABP-10028)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，其具有免疫調(diào)節(jié)作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，其具有抗過(guò)敏作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，其以活菌形式含有乳酸菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，其是飲食品或醫(yī)藥品。
全文摘要
本發(fā)明是含有具有免疫調(diào)節(jié)作用的新型乳酸菌的組合物。更具體而言，本發(fā)明含有分離自日本國(guó)京都傳統(tǒng)咸菜紫蘇腌茄子的新型乳酸菌，用于具有免疫調(diào)節(jié)作用的飲食品和醫(yī)藥品等。另外，本乳酸菌的特征在于，屬于戊糖乳桿菌，且無(wú)甘油同化性或甘油同化性較弱。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1984665SQ20058001728
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月28日
發(fā)明者野中裕司, 出云貴幸, 飯?zhí)锕鹱?申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社