專利名稱：一種能產(chǎn)生魔斑的高效毒死蜱降解菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是，涉及一種能產(chǎn)生魔斑的高效毒死蜱降解菌株。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)外已經(jīng)通過富集分離法分離了多株毒死蜱降解菌，如Anwar等人利用富集分離法從土壤中分離了一株短小芽孢桿菌C2A1 (Bacilluspumilus strain C2A1)， 能夠?qū)?100mg/L 的毒死蜱在 10 天內(nèi)降解 73% (J Hazard Mater, 2009,168 :400-405)； Xu Gangming等也采用富集分離法從農(nóng)藥廠活性污泥中分離了幾株毒死蜱降解菌并通過純培養(yǎng)或混合培養(yǎng)檢測(cè)了菌株對(duì)毒死蜱的降解(Biotechnol Lett, 2007, 29 :1469-1473 ； International Biodeterioration & Biodegradation, 2008,62 :51-56)。最近，已有關(guān)于魔斑積累和代謝調(diào)控的報(bào)道。在這些代謝調(diào)控的作用中，魔斑能夠直接或間接的激活某些特定基因的表達(dá)，如Kasai等人發(fā)現(xiàn)魔斑參與了氨基酸生物合成的調(diào)控，并使氨基酸生物合成的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)運(yùn)啟動(dòng)子的活性提高，最終使特定的基因呈上調(diào)表達(dá)(Nucleic Acids Res，2002，30 :4985-4992)。還有，Potrykus 等人證明在活體外，魔斑能夠直接調(diào)控噬菌體的XpaQ啟動(dòng)子的活性，從而使某些基因得到了上調(diào)表達(dá)(J Biol Chem，2004，279 :19860-19866)。但是，由于目前國內(nèi)外分離的菌株少，降解能力偏低、多次傳代后菌株降解能力易退化以及降解菌株代謝調(diào)控機(jī)理研究少等問題，到目前為止，實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥污染的生物修復(fù)還有一定的距離。因此，需要分離高效的毒死蜱降解新菌株并深入研究其生物降解的代謝調(diào)控機(jī)制，用理論指導(dǎo)實(shí)踐為更高效的實(shí)現(xiàn)環(huán)境污染的生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效毒死蜱降解菌株，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明的目的還在于提供該降解菌株的制備方法。本發(fā)明提供一種能產(chǎn)生魔斑的高效毒死蜱降解菌株Klebsiella sp.CPK，該菌株已于2010年9月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為 CGMCC，保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 4167。該菌株為桿狀，革蘭氏染色陰性，單個(gè)、成對(duì)或不規(guī)則狀排列，有莢膜，無運(yùn)動(dòng)性。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面生長(zhǎng)的單菌落，呈圓形，表面光滑，濕潤(rùn)，邊緣整齊，灰白色，半透明。該菌株能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧，不液化明膠，不產(chǎn)生&S，接觸酶陽性，氧化酶陰性。16S rDNA在Genebank中的注冊(cè)號(hào)⑶301269。功能特性該菌株能以毒死蜱為唯一碳源、能源生長(zhǎng)，是一株高效的毒死蜱降解菌株，用于農(nóng)藥殘留的去除。本發(fā)明還提供制備上述降解菌株的方法，包括如下步驟1)先將活性污泥放入到含有毒死蜱的富集培養(yǎng)液TYC中30°C富集培養(yǎng)，每隔七天更換新鮮的富集培養(yǎng)液并逐漸提高毒死蜱的濃度；2)富集培養(yǎng)后，吸取少量富集液轉(zhuǎn)接至以毒死蜱為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM 內(nèi)連續(xù)繼代培養(yǎng)篩選；3)然后用平板稀釋法將馴化后的菌液涂布到含有毒死蜱的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上， 選擇在含農(nóng)藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)好、傳代穩(wěn)定且降解能力較好的菌株進(jìn)行單菌落劃線分離和純化。其中，步驟1)所述的活性污泥由農(nóng)藥廠污水處理曝汽池中分離得到。優(yōu)選地，所述步驟1)中的富集培養(yǎng)基TYC包含以下成分胰蛋白胨5g/L，酵母膏提取物 5g/L, KH2PO4 lg/L 和瓊脂 15g/L，pH 7. 0。優(yōu)選地，所述步驟2)中的無機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM包含以下成分=NH4NO3 lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, (NH4)2SO4 0. 5g/L, KH2PO4 0. 5g/L, NaCl 0. 5g/L, K2HPO4 1. 5g/L, pH 7. 0。本發(fā)明還提供含有上述菌株的菌劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述菌株在降解毒死蜱中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述菌株在降解毒死蜱中的應(yīng)用。本發(fā)明以Klebsiella sp. CPK為實(shí)驗(yàn)菌株，通過將菌株接種到以毒死蜱為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時(shí)取樣，通過液液萃取的方法提取殘留農(nóng)藥，應(yīng)用紫外分光光度法和氣相色譜法檢測(cè)了該菌對(duì)毒死蜱的降解，并采用高效液相色譜法對(duì)毒死蜱可能的代謝途徑進(jìn)行了檢測(cè)。上述檢測(cè)結(jié)果表明CPK菌株能夠?qū)?0mg/L毒死蜱在5天內(nèi)降解 70%，在毒死蜱降解的過程中檢測(cè)到了三氯吡啶酚的積累。本發(fā)明以Klebsiella sp. CPK為實(shí)驗(yàn)菌株，將其在含有毒死蜱的TYC培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后，低溫超聲波破壁獲得其全細(xì)胞蛋白并對(duì)其進(jìn)行Native-PAGE檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在經(jīng)毒死蜱誘導(dǎo)的CPK菌株中，其全細(xì)胞蛋白中出現(xiàn)了毒死蜱誘導(dǎo)的特異蛋白條帶，該特異蛋白經(jīng)過TOF-MS測(cè)序表明為魔斑合成酶RelA。上述結(jié)果表明，Klebsiella sp. CPK菌株在毒死蜱誘導(dǎo)下，魔斑合成酶RelA呈誘導(dǎo)表達(dá)，即產(chǎn)生了典型的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)。而魔斑作為細(xì)菌嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)的常見調(diào)節(jié)因子可能參與調(diào)控了菌株CPK對(duì)毒死蜱的生物降解，從而為深入了解生物降解的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明以Klebsiella sp. CPK為研究對(duì)象，克隆到了 CPK菌株中的魔斑合成酶編碼基因relA，通過同源重組技術(shù)敲除了該菌中的relA基因，獲得了一株relA基因缺失的突變株ArelA。并采用氣相色譜檢測(cè)了野生型CPK菌株與ΔrelA菌株在相同條件下對(duì)毒死蜱的降解，結(jié)果表明ArelA菌株對(duì)毒死蜱的降解速率明顯弱于野生型的CPK菌株。從而表明了魔斑作為一種調(diào)節(jié)因子可能參與調(diào)控了菌株CPK對(duì)毒死蜱生物降解的代謝調(diào)控過程。總而言之，本發(fā)明具有以下有益效果1)本發(fā)明提供的毒死蜱高效降解菌克雷伯氏菌CPK菌株為非致病菌，以20 %的接種量接種含有50mg/L的毒死蜱為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天后，其對(duì)毒死蜱降解率達(dá)70%以上，該菌株可以廣泛的應(yīng)用于毒死蜱污染的殘留去除和生物修復(fù)。2)通過同源重組技術(shù)獲得魔斑合成酶編碼基因relA缺失的AreIA菌株，在相同條件下ArelA菌株對(duì)毒死蜱的降解速率明顯慢于野生型的CPK菌株，從而表明魔斑可能參與調(diào)控了 CPK菌株對(duì)毒死蜱的生物降解過程。
3)具有降解能力強(qiáng)、降解性能穩(wěn)定、代謝研究深入等優(yōu)勢(shì)。


圖1本發(fā)明的Klebsiella sp. CPK菌株在含600mg/L毒死蜱固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例所用的活性污泥來自于山東華陽農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司。實(shí)施例1菌株富集培養(yǎng)方法1)富集培養(yǎng)取農(nóng)藥污水處理池中的活性污泥1. 0克，加入到含有毒死蜱IOOmg/ L的富集培養(yǎng)基于30°C，200rpm富集培養(yǎng)7天；2)提高選擇壓將上述富集液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮富集培養(yǎng)基中并將農(nóng)藥濃度提高一倍，再繼續(xù)培養(yǎng)7天如此連續(xù)轉(zhuǎn)接6次，直至富集培養(yǎng)基中農(nóng)藥濃度提高到 800mg/Lo其中，所述步驟1)中的富集培養(yǎng)基TYC的組成如下胰蛋白胨5g/L，酵母膏提取物 5g/L，KH2PO4 lg/L 和瓊脂 15g/L，pH 7. 0實(shí)施例2菌株馴化分離方法1)馴化培養(yǎng)富集培養(yǎng)結(jié)束后，各取10%離心收集菌體，然后分別轉(zhuǎn)接到無機(jī)鹽培養(yǎng)基，添加600mg/L的毒死蜱，相同培養(yǎng)條件下馴化兩周；并更換不同溶劑(甲醇、丙酮、 乙醇、吡啶)的毒死蜱母液，以排除菌株對(duì)溶劑的依賴性。2)分離純化用平板稀釋法將馴化后的菌液涂布到含有300mg/L毒死蜱的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，選擇在含農(nóng)藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)好、傳代穩(wěn)定且降解能力較好的菌株進(jìn)行單菌落劃線分離，最終獲得純化的高效毒死蜱降解菌株Klebsiella sp. CPK(其保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 4167，下同)，(見圖 1)。3)菌種保存挑Klebsiella sp. CPK菌株單菌落，接種含有600mg/L毒死蜱的富集培養(yǎng)液30°C 200rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，然后液氮冷凍保存于-80°C恒溫冰箱。其中，所述步驟1)和2)中的無機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM的組成如下=NH4NO3 lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, (NH4)2SO4 0. 5g/L, KH2PO4 0. 5g/L, NaCl 0. 5g/L, K2HPO4 1. 5g/L, pH 7. 0。實(shí)施例3菌株降解毒死蜱檢測(cè)方法DTYC固體平板培養(yǎng)挑取實(shí)施例2得到的Klebsiella sp. CPK菌株單菌落在TYC 培養(yǎng)基上活化，30°C恒溫培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出可以挑取的單菌落。其中，富集培養(yǎng)基TYC同實(shí)施例12)種子液培養(yǎng)挑取上述活化的單菌落接種TYC培養(yǎng)基(同步驟1)，30°C恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3)降解取樣將上述種子液以20%的接種量接種到含有50mg/L的毒死蜱為唯一碳源的無機(jī)鹽MSM培養(yǎng)液中，30°C下培養(yǎng)，不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，分別取三個(gè)平行，用正己烷等體積旋渦振蕩萃取毒死蜱殘留，旋渦振蕩anin，4°C下靜置1小時(shí)，取上清液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水，將樣品用0. 22 μ m的有機(jī)系濾膜過濾后，樣品置于-20°C冰箱保存。4)檢測(cè)方法氣相色譜檢測(cè)方法島津GC-2010 SHIMADZU系統(tǒng)，RTX-1301毛細(xì)管柱，ECD檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度300°C，檢測(cè)器溫度330°C，柱升溫程序初始溫度150°C，保持2min，以8°C / min升溫至270°C，保持5min。載氣為高純氮?dú)猓?. 8ml/min，進(jìn)樣量為Iul。高效液相色譜檢測(cè)方法=Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱 Eclipse-C18(150X4.6mmX5ym)，流動(dòng)相為甲醇水=70 30 (ν/ν)，流速 1. OmL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm;進(jìn)樣量IOyL0檢測(cè)結(jié)果為5天內(nèi)、CPK菌株對(duì)50mg/L的毒死蜱降解率達(dá)70%以上。實(shí)施例4魔斑合成酶RelA誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)方法1)挑Klebsiella sp. CPK菌株單菌落接種TYC培養(yǎng)基在30°C下?lián)u床預(yù)培養(yǎng)。其中，所述TYC培養(yǎng)基的組成同實(shí)施例1。2)當(dāng)菌株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以相同的接種量下分別接種TYC培養(yǎng)基(同實(shí)施例1)、含甲醇的TYC培養(yǎng)基、含400mg/L毒死蜱(甲醇溶)的TYC培養(yǎng)基，其中前兩者為對(duì)照，甲醇在后兩者中的濃度一致。3)接菌后30°C培養(yǎng)一定時(shí)間，不同的取樣點(diǎn)取樣，然后用0.2MpH 7. O的磷酸鹽沖洗菌體兩次并重懸.低溫超聲波破壁，4°C離心除去細(xì)胞碎片，上清液即為全細(xì)胞蛋白液。4)用NanoDrop spectrophotometer ND-1000檢測(cè)全細(xì)胞蛋白的總濃度.將上述所獲得全細(xì)胞蛋白在相同的上樣量下進(jìn)行Native-PAGE電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為CPK菌株全細(xì)胞蛋白Native-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，在僅經(jīng)毒死蜱誘導(dǎo)的CPK菌株中，其全細(xì)胞蛋白中出現(xiàn)了特異的蛋白條帶，兩組對(duì)照中均無特異蛋白條帶，該蛋白經(jīng) TOF-MS質(zhì)譜檢測(cè)為魔斑合成酶RelA蛋白，從而說明CPK菌株在毒死蜱的誘導(dǎo)下，其魔斑合成酶RelA蛋白呈誘導(dǎo)表達(dá)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種能產(chǎn)生魔斑的高效毒死蜱降解菌株Klebsiella sp. CPK，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4167。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株的菌劑。
3.權(quán)利要求1所述菌株在降解毒死蜱中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述菌株在用于制備降解毒死蜱的菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能產(chǎn)生魔斑的高效毒死蜱降解菌株Klebsiella sp.CPK，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4167。本發(fā)明涉及該菌株的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的菌株可以廣泛的應(yīng)用于毒死蜱污染的殘留去除和生物修復(fù)，具有降解能力強(qiáng)、降解性能穩(wěn)定、代謝研究深入等優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)A62D101/28GK102399705SQ20101028241
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者史延華, 曲杰, 李康, 王圣惠, 翟逸, 閆艷春 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院