專利名稱：金黃桿菌l31及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌株及其應(yīng)用，具體地說是一種金黃桿菌L31及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)外已經(jīng)篩選到的氯氰菊酯降解菌的種類還很少，已經(jīng)公布的氯氰菊 酯降解菌的降解效率不是很高，并且對降解菌細胞表面特征的研究更是少有報道，主要 集中在石油烴降解菌的研究中。Tallur等人于2008年通過富集馴化方法分離到一株 微球菌屬菌株CPN 1 (Micrococcus sp. CPN 1)能夠?qū)?00mg/L的氯氰菊酯在3天內(nèi)降 解 55% 左右(Biodegradation，19 :77-82，2008) ；Chen Zhang 等人于 2010 年通過富集 馴化的方法分離到兩株降解高效氯氰菊酯的沙雷氏菌菌株(Bioresource Technology 101 (2010) 3423-3429)，并測定了兩株菌的細胞表面疏水性差異。并通過薄層層析和高效液 相色譜技術(shù)測定了菌株對氯氰菊酯的降解能力和中間代謝產(chǎn)物，這對于實現(xiàn)環(huán)境中氯氰菊 酯農(nóng)藥的生物修復(fù)具有重要意義。然而，在微生物生物修復(fù)的實際應(yīng)用中，要設(shè)計有效的對菊酯類農(nóng)藥的修復(fù)策略， 不僅只需要有高的農(nóng)藥降解率和降解途徑的相關(guān)知識，更重要的是要考慮到所選的菌株本 身所具有內(nèi)在性質(zhì)，如細胞表面疏水性高低，這樣在實際的生物修復(fù)過程中才能實現(xiàn)高效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金黃桿菌新菌株及其在降解農(nóng)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明的菌株L31是從山東華陽農(nóng)藥廠的污水處理池的活性污泥樣品中分離得 到的金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)新菌株，在GenBank中16SrDNA序列的注冊號為 HM368664。該菌株已于2010年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 4137。該菌體短桿狀，無鞭毛，菌落呈圓形，邊緣光滑，表面突起，產(chǎn)生黃色素，有金黃色 光澤細菌。本發(fā)明還提供制備L31菌株的方法，包括下述步驟1)采集來自農(nóng)藥廠的污水處理池的活性污泥樣品接種于含有氯氰菊酯50mg/L的 富集培養(yǎng)基中于30°C 200rpm富集培養(yǎng)7天后，取10%轉(zhuǎn)接到新鮮富集培養(yǎng)基中并將農(nóng) 藥濃度提高一倍，再繼續(xù)培養(yǎng)7天，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接，直到富集培養(yǎng)基中的農(nóng)藥濃度提高到 800mg/L ；2)富集培養(yǎng)結(jié)束后，取10%離心收集菌體，然后轉(zhuǎn)接到含有800mg/L的氯氰菊酯 的無機鹽培養(yǎng)基中，在相同培養(yǎng)條件下再馴化兩周；3)在以氯氰菊酯為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基內(nèi)連續(xù)繼代培養(yǎng)篩選，然后用平板 稀釋法將馴化后的菌液涂布到含有氯氰菊酯300mg/L的無機鹽培養(yǎng)基平板；在降解菌篩選 初期，挑選農(nóng)藥耐受度高、生長較快、菌落較大的菌，單菌落進行劃線，直至分離獲得純化的菌株；純培養(yǎng)后采用紫外分光光度法初步檢測降解率，隨后，選擇降解率較高的菌株，采用 HPLC法定量分析各個菌株對高效氯氰菊酯的降解率；最后，選擇出一株在含農(nóng)藥培養(yǎng)基上 生長好、傳代穩(wěn)定且降解能力較強的菌株Chryseobacterium sp. L31。本發(fā)明進一步提供含有L31菌株的菌劑。本發(fā)明還提供L31菌株在降解農(nóng)藥中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述農(nóng)藥為氯氰菊酯。具體地，本發(fā)明通過富集馴化的方法從山東華陽農(nóng)藥廠的污水處理曝氣池中分離 到一株能夠高效降解氯氰菊酯菌株，通過菌株形態(tài)學(xué)特征，生理生化特征和16SrDNA序列 比對將菌株鑒定為金黃桿菌，命名為金黃桿菌L31 (Chryseobacterium sp. L31)，在GenBank 中16SrDNA序列的注冊號為HM368664。該菌體短桿狀，無鞭毛，菌落呈圓形，邊緣光滑，表面突起，產(chǎn)生黃色素，有金黃色 光澤細菌。本發(fā)明以金黃桿菌L31為實驗菌株，通過將菌株接種到僅以氯氰菊酯為唯一碳源 的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時取樣，通過液液萃取的方法提取殘留農(nóng)藥，應(yīng)用紫外分光 光度法，高效液相色譜法和氣相色譜法測定農(nóng)藥濃度，計算出菌株對農(nóng)藥的降解率。通過上 述方法測得L31菌株能夠?qū)?0mg/L氯氰菊酯農(nóng)藥在3天內(nèi)降解71 %左右，并且能夠維持穩(wěn) 定的降解能力。本發(fā)明應(yīng)用微生物粘著碳烴化合物法(MATH)法測定氯氰菊酯降解菌的細胞表面 疏水性。本發(fā)明對二甲苯_水和正辛醇_水兩相體系進行了比較，發(fā)現(xiàn)對于菌株的水相而 言，二甲苯-水兩相體系的分離速度要明顯快于正辛醇-水兩相體系，其穩(wěn)定性要強。因此 選用了二甲苯-水兩相體系，且在二甲苯-水相的比為1 4(v/v)時，菌株疏水率達到最 大值。本發(fā)明通過上述方法測定了菌株細胞表面疏水性與其降解能力的關(guān)系，結(jié)果表 面，隨著菌株疏水性的提高，菌株對農(nóng)藥的降解也在加速，農(nóng)藥的降解率與細胞表面疏水性 成正相關(guān)，菌株疏水性維持在高峰水平過程中時，基本完成了菌體對農(nóng)藥的降解。隨著農(nóng)藥 殘留的減少，菌體的細胞表面疏水性也隨之降低。說明該菌株的細胞表面疏水性會隨著農(nóng) 藥濃度的變化而變化，當(dāng)農(nóng)藥濃度高時該菌體可以調(diào)節(jié)細胞表面疏水性的高低來完成對疏 水農(nóng)藥的吸附降解。更具體地，本發(fā)明篩選到的高效降解氯氰菊酯的金黃桿菌菌株L31，在30°C恒溫 搖床培養(yǎng)下3天能夠?qū)?0mg/L的氯氰菊酯降解70%以上，可以用于環(huán)境的生物修復(fù)過程 中。并且該菌株的細胞表面疏水性很高，在二甲苯-水兩相體系體積比為1 4時，疏水率 達到68%。通過測定細胞表面疏水性與降解性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著菌株疏水性的提高，菌 株對農(nóng)藥的降解也在加速，并且隨著農(nóng)藥殘留的減少，菌體的細胞表面疏水性也隨之降低。 說明該菌株的細胞表面疏水性會隨著農(nóng)藥濃度的變化而變化，當(dāng)農(nóng)藥濃度高時該菌體可以 調(diào)節(jié)細胞表面疏水性的高低來完成對疏水農(nóng)藥的吸附降解。相比而言，目前國內(nèi)外已經(jīng)篩 選到的氯氰菊酯降解菌的降解效率不是很高，本發(fā)明中篩選的菌株能夠快速高效的降解氯 氰菊酯，并且對細胞表面疏水性的研究也是只限于石油烴降解菌的研究中，對農(nóng)藥降解菌 細胞表面特征的研究更是少有報道。因此，本發(fā)明提供了一株高效快速降解氯氰菊酯的菌株L31，且具有高的細胞表面疏水性，并且得出細胞表面疏水性與農(nóng)藥降解性之間的關(guān)系。在注重提高農(nóng)藥降解率的同 時，也考慮到了菌株本身具有的內(nèi)在性質(zhì)，這樣更有利于應(yīng)用到環(huán)境修復(fù)過程中。


圖1本發(fā)明金黃桿菌L31菌株在含400mg/L氯氰菊酯固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；圖2本發(fā)明金黃桿菌L31菌株的細胞表面疏水性曲線和氯氰菊酯降解曲線，其中 表示不接菌時氯氰菊酯的降解；X表示菌體細胞表面疏水性；■表示接 菌時氯氰菊酯的降解；圖3本發(fā)明金黃桿菌L31菌株在二甲苯_水體系中的細胞表面疏水性情況，其中，左不加二甲苯的對照菌液，右加二甲苯震蕩后菌液。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1菌株篩選方法1)降解菌的富集馴化將采集于山東華陽農(nóng)藥廠的污水處理池的活性污泥樣品Ig接種于含有氯氰菊酯 50mg/L的富集培養(yǎng)基中于30°C 200rpm富集培養(yǎng)7天后，取10%轉(zhuǎn)接到新鮮富集培養(yǎng)基中 并將農(nóng)藥濃度提高一倍，再繼續(xù)培養(yǎng)7天，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接4次，直到富集培養(yǎng)基中的農(nóng)藥濃 度提高到800mg/L。富集培養(yǎng)結(jié)束后，取10%離心收集菌體，然后轉(zhuǎn)接含有800mg/L的氯氰 菊酯的無機鹽培養(yǎng)基中，在相同培養(yǎng)條件下再馴化兩周。富集培養(yǎng)基TYC的組成如下胰蛋白胨5g/L，酵母膏提取物5g/L，KH2P04lg/L和瓊 脂 15g/L，pH 7.0。2)高效降解菌的篩選分離在以氯氰菊酯為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基內(nèi)連續(xù)繼代培養(yǎng)篩選，然后用平板稀釋 法將馴化后的菌液涂布到含有氯氰菊酯300mg/L的無機鹽培養(yǎng)基平板。在降解菌篩選初 期，挑選農(nóng)藥耐受度高、生長較快、菌落較大的菌，單菌落進行劃線，直至分離獲得純化的菌 株(見圖1)，純培養(yǎng)后采用紫外分光光度法初步檢測降解率。隨后，選擇降解率較高的菌 株，采用HPLC法定量分析各個菌株對高效氯氰菊酯的降解率。最后，選擇出一株含農(nóng)藥培 養(yǎng)基上生長好、傳代穩(wěn)定且降解能力較強的菌株L31，進行進一步研究。無機鹽培養(yǎng)基MSM 的組成如下=NH4NO3 lg/L，MgSO4 · 7H200. 5g/L，(NH4)2SO4 0. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L, NaCl 0. 5g/L, K2HPO4L 5g/L, pH 7. 0。實施例2降解菌的降解性能1)高效液相色譜檢測氯氰菊酯降解將菌株L31接種到不含農(nóng)藥的液體LB培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對數(shù)生長期，按照 20%接種量接種到含有50mg/L氯氰菊酯農(nóng)藥的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，30°C 200rpm搖床培養(yǎng)。液體LB培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨10g/L，酵母膏提取物5g/L，NaCl 10g/L, ρΗ7· 0?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基包含以下成分=NH4NO3lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，(NH4)2SO4 0. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L, NaCl 0. 5g/L, K2HPO4 1. 5g/L, pH7. 0。
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培養(yǎng)液中高氯的提取方法定時取樣后，加入等體積二氯甲烷，旋渦混合器上充分振蕩抽提2min，靜置一小 時，取下層將有機溶劑揮發(fā)干，用等體積的乙腈重溶，放置在-20°C冰箱保藏。將樣品用0. 22 μ m的有機系濾膜過濾后，進行HPLC-UV分析。HPLC-UV分析條件為=Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱 Eclipse-C18(150X4. 6mmX5ym)，流動相為乙腈水=70 30 (ν/ν)，流速 1. OmL/min ；檢 測波長230nm ；進樣量10 μ L。結(jié)果表明菌株L31能夠?qū)?0mg/L氯氰菊酯在6天降解90% 左右ο2)氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用檢測高效氯氰菊酯降解及代謝產(chǎn)物生成定時取樣后，加入等體積的正己烷，旋渦混合器上充分振蕩抽提2min，離心后靜置 分層，取上層有機相，0. 22 μ m的有機系濾膜過濾后，進樣分析。GC-ECD分析條件為SHMADZU GC-2010型氣相色譜儀，色譜柱 Rtx-1301(30mX0. 25mm)，采用程序升溫進樣口 280°C ；柱溫180°C持續(xù)2min，然后以 IO0C /min 升 280°C，維持 IOmin ；ECD 檢測器300°C ；載氣(氮氣)流速1. Oml/min ；進氧 量lul0結(jié)果表明菌株L31能夠?qū)?0mg/L氯氰菊酯在3天降解71 %左右(見圖2)。實施例3氯氰菊酯降解菌株L31細胞表面疏水性的測定本發(fā)明采用MATH法測定高效氯氰菊酯降解菌株L31的細胞表面疏水性 (Rosenberg et al. ，1980)。1)菌懸液的制備將氯氰菊酯降解菌L31接種于LB液體培養(yǎng)基中(組成同實施例2)，在30°C， 200rpm恒溫振蕩培養(yǎng)條件下過夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)液于6，OOOg 4°C離心IOmin收集菌體并用 50mM Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(pH 7.0)洗滌兩次，然后用同樣的緩沖液將菌體懸浮至細 胞濃度為0D600 = 0.6左右，制成菌懸液。2)兩相分離系統(tǒng)的選擇將4mL事先調(diào)整好濃度的菌懸液加入d= IOmm的圓底試管中，再按0.2、0. 5、1.0、 1. 5和2. OmL的梯度分別加入有機相，對照組不加有機相，用玻璃小塞封口，室溫劇烈震蕩 2min，靜置30min分層，觀察兩相界面的菌體分布情況。用無菌注射針頭快速吸取下相水溶 液，以Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液為空白對照，在600nm波長下測定A值。每個處理重復(fù)三次。 細菌細胞表面疏水率(CSH% )按下式計算CSH %=(對照組 A600nm-實驗組 A 600nm) / 對照組 A 600nmX 100 %本發(fā)明通過對二甲苯-水和正辛醇_水兩相體系進行了比較，發(fā)現(xiàn)對于菌株L31 的水相而言，二甲苯-水兩相體系的相分離速度要明顯快于正辛醇-水兩相體系且更穩(wěn)定， 因此本發(fā)明研究過程中采用二甲苯-水兩相體系。研究表明該菌株的細胞表面疏水性很高，在二甲苯-水兩相體系體積比為1 4 時，疏水率達到68% (見圖3)，并且此時農(nóng)藥的降解速度最快。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)L31菌株，其保藏編號為CGMCC No.4137。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株的菌劑。
3.權(quán)利要求1所述的菌株在降解農(nóng)藥中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的菌株在降解氯氰菊酯中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)L31菌株，其保藏編號為CGMCC No.4137，其通過富集馴化的方法從山東華陽農(nóng)藥廠的污水處理曝氣池中分離得到。該菌株能夠?qū)?0mg/L氯氰菊酯農(nóng)藥在3天內(nèi)降解71％左右，并能夠維持穩(wěn)定的降解能力。另外，該菌株的細胞表面疏水性很高，可以調(diào)節(jié)細胞表面疏水性的高低來完成對疏水農(nóng)藥的吸附降解。
文檔編號A62D101/04GK101948789SQ20101027785
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者史延華, 曲杰, 李康, 王圣惠, 翟逸, 閆艷春 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院