專利名稱：高分子量多環(huán)芳烴降解菌株及其混合菌系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及高分子量多環(huán)芳烴降解菌株 及其混合菌系，本發(fā)明還涉及該些菌株以及其混合菌系的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAHs)是一種由兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)以線狀、角狀和簇狀排列的稠 環(huán)型化合物。由于多環(huán)芳烴具有毒性、生物蓄積性和半揮發(fā)性，并能在環(huán)境中持久存在，被 列入典型持久性有機(jī)污染物(POPs)，受到國(guó)際上科學(xué)界的廣泛關(guān)注。PAHs在其生成、遷移、 轉(zhuǎn)化和降解過(guò)程中，通過(guò)呼吸道、皮膚、消化道進(jìn)入人體，極大地威脅著人類的健康。微生物 降解被認(rèn)為是PAHs污染土壤修復(fù)的重要途徑，具有成本低、效率高、不易造成二次污染等 優(yōu)點(diǎn)。但PAHs隨著分子量的增加，其水溶性急劇減小，毒性也越來(lái)越高，研究發(fā)現(xiàn)苯環(huán)數(shù)量 越多越難被微生物所降解利用。從受污染的地區(qū)土壤中篩選分離出PAHs的降解優(yōu)勢(shì)菌株， 再將其投回到污染環(huán)境，是進(jìn)行修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近幾年隨著城市化進(jìn)程發(fā)展迅速，許多城市的發(fā)展極為迅速，原先位于郊區(qū)的一 些化工類企業(yè)周圍都逐漸成為人口聚集的市區(qū)，例如北京市在最近幾年將五環(huán)內(nèi)的工業(yè)企 業(yè)都進(jìn)行了搬遷，這些工業(yè)用地都將進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)榫幼?、商業(yè)或娛樂(lè)用地，但由于其 過(guò)去生產(chǎn)過(guò)程中的廢水、廢渣及化學(xué)品的影響，其廠區(qū)或附近區(qū)域的土壤受到了嚴(yán)重的污 染，在開(kāi)發(fā)過(guò)程或開(kāi)發(fā)后帶來(lái)了一系列環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題，因此，有必要對(duì)其污染進(jìn)行必 要的評(píng)估和修復(fù)。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，焦化煤氣、有機(jī)化工、石油工業(yè)、煉鋼煉鐵等工業(yè)所排放的 廢棄物中有相當(dāng)高濃度的多環(huán)芳烴，其中焦化廠是多環(huán)芳烴污染排放最嚴(yán)重的一類企業(yè)。近年來(lái)，能夠降解低分子量PAHs的微生物被大量報(bào)道，如假單胞菌屬、分枝桿菌 屬、芽孢桿菌屬等，但關(guān)于高分子量PAHs降解菌的報(bào)道還相對(duì)較少。事實(shí)上，環(huán)境中PAHs 通常以多種組分同時(shí)存在，呈現(xiàn)為復(fù)合污染現(xiàn)象，其中包含大量難降解的高分子量PAHs，因 此，篩選能同時(shí)降解多種高分子量PAHs的微生物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有的降解高分子量多環(huán)芳烴存在的難題，提供一種高 效的降解菌系及其應(yīng)用，主要是在土壤或廢水的生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中用于降解高分 子量多環(huán)芳烴的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的降解菌系從受多環(huán)芳烴污染的土壤中經(jīng)過(guò)人工富集培養(yǎng)、分離純 化得到，來(lái)源于北京焦化廠廠區(qū)內(nèi)受多環(huán)芳烴污染的土壤。該混合菌系包括四株不同種屬的純菌Methylobacterium sp. lxb_3、 Burkholderia sp. Ixb一5、Rhodococcus sp. Ixb一6、Phyllobacterium sp.Ixb一9。其中，Methylobacterium sp. lxb_3為甲基桿菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落較 小，呈淡粉色，表面光滑不透明，邊緣整齊；其16S rDNA的GenBank登錄號(hào)為GQ249213，序 列如SEQ ID NO :1所示；該菌株于2010年4月8日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通
3微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏， 編號(hào)為CGMCCNo. 3713，其分類學(xué)命名為甲基桿菌(Methylobacterium sp.)。Burkholderia sp. lxb_5為伯克霍爾德氏菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈白 色，半透明，邊緣不整齊，不易挑??；其16S rDNA的GenBank登錄號(hào)為GQ249215，序列如SEQ ID NO :2所示；該菌株于2010年4月8日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心保藏，編號(hào)為CGMCC No. 3714，其分類學(xué)命名為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)。Rhodococcus sp. lxb_6為紅球菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈紅色，邊緣整 齊，菌落較大，濕潤(rùn)；其16S rDNA的GenBank登錄號(hào)為GQ249216，序列如SEQ ID N0:3所示； 該菌株于2010年4月8日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為 CGMCC No. 3715，其分類學(xué)命名為紅球菌(Rhodococcus sp.)。Phyllobacterium sp. lxb_9為葉桿菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈乳白色， 不透明，邊緣整齊；其16S rDNA的GenBank登錄號(hào)為GQ249219，序列如SEQ ID NO :4所示； 該菌株于2010年4月8日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為 CGMCC No. 3716，其分類學(xué)命名為葉桿菌(Phyllobacterium sp.)。該四株單菌均對(duì)五種高分子量多環(huán)芳烴，即苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k] 熒蒽、苯并[a]芘和茚并[l，2，3_cd]芘具有降解作用。包括該四株單菌的混合菌系對(duì)這五種PAHs有更好的降解效果，其中 Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp. lxb_5、Rhodococcus sp. lxb_6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb_9四株純菌的混合比例可優(yōu)選1 2 1 2 1 2 1 2，更優(yōu)選 1 1 1 1。該、混合菌系的制備方法包括 M Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderiasp. lxb_5、Rhodococcus sp. lxb-6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb_9 分別接種至牛肉膏蛋白月東液 體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心后棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖液洗滌，再次離心后棄上清液，收獲 菌體，然后將四種菌懸液混合制得菌系。該混合菌系在土壤中的最適宜降解條件為溫度20 30°C，土壤含水率15% 35%，營(yíng)養(yǎng)鹽比例(C N P)為 100 120 10 1。該混合菌系還有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，可用于修復(fù)受高分子量PAHs污染的土壤 或水體。


圖1為菌系BJHl對(duì)土壤中PAHs的降解率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施 歹|J IMethylobacterium sp. lxb~3>Burkholderia sp. lxb-5>Rhodococcussp. lxb-6、Phyllobacterium sp. lxb-9的分離與降解高分子量PAHs的性能現(xiàn)場(chǎng)采集北京焦化廠廠區(qū)內(nèi)某車間附近受PAHs污染較嚴(yán)重處土壤，稱取IOg新 鮮土壤樣品，加入裝有IOOml無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，在室溫下振蕩一周，取IOmL土壤溶液轉(zhuǎn) 接至新鮮的含PAHs的選擇性無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。馴化時(shí)采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、間歇式逐步提高 PAHs濃度的方法(苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、茚并[l，2，3_cd]芘的初始濃度均為lmg·!/1)，室溫下150rpm培養(yǎng)一周，按10%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的選擇 性無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每轉(zhuǎn)接一次，各PAHs的濃度提高Img · L—1，如此反復(fù)5次，最后各PAHs 的濃度提高至5mg · L—1。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)成分=KH2PO45. 5g、K2HPO4 6. 0g、KCl 2. 0g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、Na2SO4 2. 0g、微量金屬鹽 1. Oml (MnSO4 39. 9mg, ZnSO4 · H2O 42. 8mg, (NH4)MoO24 · 4H20 34. 7mg，蒸餾水1000ml)、瓊脂15g(固體培養(yǎng)基)、蒸餾水1000ml、pH7. 0。經(jīng)過(guò)五個(gè)階段的培養(yǎng)馴化，將馴化的最后一階段的培養(yǎng)液稀釋至不同的梯度，涂 布于表面涂有該五種PAHs的選擇性無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后挑取單菌落至牛肉 膏蛋白胨固體平板，經(jīng)反復(fù)劃線分離得到多株純菌，純菌經(jīng)過(guò)接種至液體培養(yǎng)基中驗(yàn)證 其降解五種高分子量PAHs的能力，最終得到四株高分子量PAHs的降解菌lxb-3、lxb_5、 lxb-6、lxb-9。經(jīng)過(guò) 16S rDNA 鑒定，菌株 lxb_3 屬于甲基桿菌屬(Methylobacterium sp.)， lxb-5屬于{白克霍爾德氏菌屬(Burkholderia sp. ), lxb_6屬于紅球菌屬(Rhodococcus sp.), lxb-9 屬于葉桿菌屬(Phyllobacterium sp.)。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基成分牛肉膏3. Og、蛋白胨10. Og.NaCl 5. Og、瓊脂15g、 蒸餾水 IOOOml、ρΗ7· O。將 Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp. lxb_5、Rhodococcussp. lxb-6,Phyllobacterium sp. lxb-9分別接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離 心后棄去上清液，加入20ml磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再次離心后棄去上清液，收獲菌體，將 其菌懸液在600納米的吸光度值(OD6tltl)均調(diào)整成為0. 5-1之間的數(shù)值，以使四種菌懸液中 的菌濃度達(dá)到幾乎相同的數(shù)量級(jí)。此處的濃度并沒(méi)有限制，將四種菌懸液調(diào)整成近似濃度， 僅僅是為了方便菌系的配制。將所得純菌種的菌懸液分別接種于含苯并[a]芘、苯并[a] 蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、茚并[l，2，3-cd]芘的MSM液體培養(yǎng)基中，接種量為10%， 每個(gè)測(cè)定設(shè)兩個(gè)重復(fù)，同時(shí)做對(duì)照樣只加PAHs不加菌液。培養(yǎng)基中茚并[l，2，3-cd]芘的 初始濃度為2mg · L—1，苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽的初始濃度為 3!^·!^。搖瓶避光振蕩培養(yǎng)12天后測(cè)試殘余PAHs的濃度，計(jì)算降解率。降解率測(cè)試結(jié)果 見(jiàn)表1。將搖瓶中的整瓶樣品進(jìn)行提取殘留的多環(huán)芳烴，加入等體積的丙酮和二氯甲烷溶 液(體積比為1 1)，用超聲波清洗器超聲萃取20min，靜置分層后用分液漏斗進(jìn)行分離有 機(jī)相，共萃取兩次后，合并萃取液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用甲醇定容至lmL，過(guò)濾后待HPLC 測(cè)定。分析儀器為德國(guó)戴安公司U3000液相色譜儀(配有自動(dòng)進(jìn)樣器)，采用多環(huán)芳烴專用 液相色譜分析柱(250mmX4. 6mm, 5 μ m)，流動(dòng)相為甲醇/水(90 10)，流速為ImL · min—1， 檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫30°C，進(jìn)樣體積為20 μ L。表1各菌株對(duì)五種高分子量PAHs的12天降解率
權(quán)利要求
Methylobacterium sp.lxb 3菌，為甲基桿菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落較小，呈淡粉色，表面光滑不透明，邊緣整齊，保藏編號(hào)為CGMCCNo.3713。
2.Burkholderia sp. lxb_5菌，為伯克霍爾德氏菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈白 色，半透明，邊緣不整齊，不易挑取，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3714。
3.Rhodococcus sp. lxb_6菌，為紅球菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈紅色，邊緣整 齊，菌落較大，濕潤(rùn)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3715。
4.Phyllobacterium sp. lxb_9菌，為葉桿菌屬，在牛肉膏蛋白胨平板上菌落呈乳白色， 不透明，邊緣整齊，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3716。
5.一種如權(quán)利要求1所述的Methylobacterium sp. lxb-3菌，其特征在于，其菌株的 16S rDNA的序列如SEQ ID NO 1所示。
6.一種如權(quán)利要求2所述的Burkholderia sp. lxb-5菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO 2所示。
7.一種如權(quán)利要求3所述的Rhodococcus sp. lxb-6菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO 3所示。
8.一種如權(quán)利要求4所述的Phyllobacterium sp. lxb_9菌，其特征在于，其菌株的16S rDNA的序列如SEQ ID NO 4所示。
9.一種高分子量多環(huán)芳烴降解菌系，包括如權(quán)利要求1至4中的Methylobacterium sp.lxb~3>Burkholderia sp.lxb-5>Rhodococcus sp. Ixb一6 禾口Phyllobacterium sp. Ixb一9 四株純菌。
10.一種如權(quán)利要求9所述的高分子量多環(huán)芳烴降解菌系，其特征在于， Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp.lxb_5、Rhodococcus sp. lxb_6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb_9四株純菌的混合比例為1 2 1 2 1 2 1 2，優(yōu) 選 1 1 1 1。
11.一種如權(quán)利要求9所述的高分子量多環(huán)芳烴降解菌系的制備方法包括將 Methylobacterium sp. lxb_3、Burkholderia sp. lxb_5、Rhodococcussp. lxb~6 禾口 Phyllobacterium sp. lxb-9分別接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心后棄去上清 液，加入磷酸鹽緩沖液洗滌，再次離心后棄上清液，收獲菌體，然后將四種菌懸液混合制得 菌系。
12.—種如權(quán)利要求1至4、9中任一項(xiàng)所述的菌或菌系應(yīng)用于同時(shí)降解五種高分子量 多環(huán)芳烴苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘和茚并[l，2，3_cd]芘。
13.一種如權(quán)利要求1至4、9中任一項(xiàng)所述的菌或菌系在土壤或廢水的生物處理和環(huán) 境污染修復(fù)的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的菌或菌系在降解受污染的土壤的應(yīng)用，其特征在于，降解 土壤的條件為溫度20 30°C，土壤含水率15% 35%，營(yíng)養(yǎng)鹽比例(C N P)為100 120 10 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及四種高分子量多環(huán)芳烴高效降解菌株以及其混合菌系，該四種菌株包括Methylobacterium sp.lxb-3、Burkholderia sp.lxb-5、Rhodococcussp.lxb-6和Phyllobacterium sp.lxb-9四株純菌，保藏編號(hào)分別為CGMCCNo.3713，CGMCC No.3714，CGMCC No.3715，CGMCC No.3716。本發(fā)明還涉及該高分子量多環(huán)芳烴降解菌系在土壤或廢水的生物處理和環(huán)境污染修復(fù)的應(yīng)用。利用本發(fā)明的菌可實(shí)現(xiàn)對(duì)五種高分子量PAHs的有效降解，利用該混合菌系可實(shí)現(xiàn)對(duì)高分子量PAHs的高效降解，并且該菌系在受污染的土壤或水體中可有效實(shí)施修復(fù)。
文檔編號(hào)A62D3/02GK101974445SQ20101018798
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者孫寓姣, 李曉斌, 王紅旗 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)