和厚樸酚在急性髓細(xì)胞白血病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及了一種中藥在白血病中的應(yīng)用，尤其是設(shè)及了一種和厚樸酪在急性髓 細(xì)胞白血病中快速降解AMLl-ETO融合蛋白的應(yīng)用及其泛素化機(jī)制，和厚樸酪是能夠特效祀 向降解AMLl-ETO蛋白的化學(xué)藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性髓細(xì)胞白血病是髓系造血干細(xì)胞惡性疾病。W骨髓與外周血中原始和幼稚髓 性細(xì)胞異常增生為主要特征，傳統(tǒng)治療W聯(lián)合化療為主，患者的完全緩解率和長(zhǎng)期無(wú)病生 存率均不高。
[0003] M2型AMLl-ETO陽(yáng)性的急性髓細(xì)胞白血?。ˋcute myeloid Ie址emia，AML)約占所 有AML的10-15% 型AML存在特異的染色體易位t(8;21)。該易位使21號(hào)染色體上的AMLl 和8號(hào)染色體上的ETO融合形成AMLl-ETO融合基因。AMLl-ETO融合蛋白是染色體易位t(8; 21)(q22; q22)的產(chǎn)物，見(jiàn)于15 %的急性髓細(xì)胞性白血病。該融合蛋白全長(zhǎng)含有752個(gè)氨基 酸，其N端為RUNXUrunt-related hanscription factor 1)也稱為AML1，由染色體21q22 編碼，是造血分化過(guò)程中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，含有結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域。C端為RUN XlTl [runt-rel曰ted transcription factor I;translocated to,!(cyclin D-rel曰te d)]，由 染色體8q22編碼，也稱為ETO。目前普遍認(rèn)為，AMLl-ETO蛋白主要通過(guò)抑制野生型AMLl的轉(zhuǎn) 錄激活功能，阻斷正常的造血干細(xì)胞分化，從而促進(jìn)白血病的發(fā)生。用特異性SiRNA抑制 AMLl-ETO表達(dá)后，白血病細(xì)胞增殖減少，同時(shí)伴隨分化增多。因此，AMLl-ETO融合蛋白是M2 型白血病最主要的致病因素，抑制或快速降解AMLl-ETO蛋白具有重要的臨床治療意義。
[0004] 泛素-蛋白酶體通路是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的重要途徑，泛素啟動(dòng)酶系統(tǒng)負(fù)責(zé)活化泛 素，并將其與待降解的蛋白結(jié)合，形成祀蛋白多聚泛素鏈，即泛素化。蛋白酶體系統(tǒng)可W識(shí) 別已泛素化的蛋白并將其降解。其中，泛素連接酶E3具有底物的多樣性和選擇性，決定了蛋 白降解的特異性。泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Kramer等報(bào) 道:組蛋白去乙酷化酶抑制劑丙戊酸(valproic acid,VPA)通過(guò)增強(qiáng)UBC冊(cè)和SIAH-I表達(dá)降 解AMLl-ETO蛋白。冬凌草甲素(Oridonin)通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)亡，快速剪切并降解AMLl-ETO融合蛋 白，呈現(xiàn)出良好的體外抗白血病活性。
[0005] 前期實(shí)驗(yàn)也證明和厚樸酪通過(guò)抑制組蛋白去乙酷化酶活性，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞調(diào) 亡，抑制白血病細(xì)胞增殖。和厚樸酪在急性髓細(xì)胞白血病中通過(guò)上調(diào)胞質(zhì)酪氨酸憐醋酶 (SHPl)表達(dá)水平，抑制JAK2/STAT信號(hào)通路。同樣，在實(shí)體腫瘤中，和厚樸酪通過(guò)多種機(jī)制抑 制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。然而，和厚樸酪在細(xì)胞內(nèi)的獨(dú)特祀標(biāo)至今未有報(bào)道。和厚樸酪 作為木蘭科植物厚樸的主要活性成分，歷代主要本草中所載正品厚樸其藥用部位均為樹(shù) 皮。然而據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)大量厚樸葉未加利用，任其調(diào)落腐爛。
[0006] 和厚樸酪具有多種藥理作用，包括抗炎，抗屯、律失常，抗癒痛，抗血小板，抑制肌肉 收縮和抗菌，此外還抑制腫瘤壞死因子a的表達(dá)活性等。由于上述藥理作用，現(xiàn)有技術(shù)中和 厚樸酪常用于直接和間接治療癌癥，國(guó)內(nèi)外均有許多針對(duì)和厚樸酪的抗腫瘤作用進(jìn)行的研 究，但現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有人提出將和厚樸酪在細(xì)胞內(nèi)的獨(dú)特祀標(biāo)設(shè)及用于疾病等領(lǐng)域的應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決【背景技術(shù)】中存在的問(wèn)題，本發(fā)明所提供了一種和厚樸酪在急性髓細(xì)胞白 血病中的應(yīng)用和用途，在急性髓細(xì)胞白血病中快速降解AMLl-ETO融合蛋白。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] -、和厚樸酪在治療或預(yù)防白血病和制備白血病藥物中的應(yīng)用。
[0010]所述和厚樸酪在白血病中快速降解AMLl-ETO融合蛋白的應(yīng)用和用途。
[0011]所述和厚樸酪用于特效祀向降解AMLl-ETO蛋白來(lái)治療或預(yù)防白血病。
[001。具體地，所述和厚樸酪通過(guò)UBC冊(cè)泛素化途徑特效祀向降解AMLl-ETO蛋白。
[0013] 所述和厚樸酪為CAS號(hào)35354-74-6，全稱為3 '，5-二-2-丙締基-1，1' -聯(lián)苯-2，4 ' -二酪，5,3 ' -Dial Iy 1-2,4 ' -dihy 化 oxybipheny 1，分子式為 Cl 抽 18〇2，分子量為 266.33。
[0014] 上述，所述白血病為M2型急性髓細(xì)胞白血病，和厚樸酪針對(duì)于M2型急性髓細(xì)胞白 血病通過(guò)UBC冊(cè)泛素化途徑特效祀向治療。
[0015] 二、一種治療白血病的藥物，其成份中包含和厚樸酪。
[0016] 所述白血病為M2型急性髓細(xì)胞白血病，和厚樸酪針對(duì)于M2型急性髓細(xì)胞白血病通 過(guò)UBC冊(cè)泛素化途徑特效祀向治療。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 多種研究證明AMLl-ETO融合蛋白是M2型白血病發(fā)病的關(guān)鍵因素。然而，目前為止， 能夠特效祀向降解AMLl-ETO蛋白的化學(xué)藥物未能進(jìn)入臨床實(shí)踐。和厚樸酪作為中藥小分子 常用于治療癌癥，由于其多重藥理功能，和厚樸酪被認(rèn)為是一種功能眾多，祀點(diǎn)"模糊"的活 性小分子。而本發(fā)明將和厚樸酪用于快速特效祀向降解AMLl-ETO融合蛋白，提出其作用及 其泛素化機(jī)制，具有降低急性髓細(xì)胞白血病的發(fā)病和致病幾率的作用。
[0019] 本發(fā)明的和厚樸酪是一味具有廣泛藥效作用的中藥厚樸的主要作用成分，在國(guó)內(nèi) 外用于多種疾病的治療，新的藥效又不斷被發(fā)現(xiàn)尤其是其較好的抗病毒、抗腫瘤、防離、抗 菌的藥效，越來(lái)越受到人們的重視，且厚樸的分布地區(qū)較廣，栽培簡(jiǎn)便，資源豐富。
[0020] 本發(fā)明通過(guò)在體外篩選系列小分子天然化合物后發(fā)現(xiàn)和厚樸酪化onokiol，HNK) 能夠快速降解內(nèi)源及外源表達(dá)的AMLl-ETO融合蛋白，并進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)譜基因忍片發(fā)現(xiàn)和 厚樸酪明顯增強(qiáng)E2泛素結(jié)合酶UBC冊(cè)表達(dá)水平。通過(guò)UBC冊(cè)敲除實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞株、原代細(xì)胞、 動(dòng)物模型全方位驗(yàn)證和厚樸酪降解AMLl-ETO融合蛋白的機(jī)制。
[0021] 本發(fā)明的和厚樸酪特效祀向降解AMLl-ETO融合蛋白，并在細(xì)胞株、原代細(xì)胞、動(dòng)物 模型全方位驗(yàn)證和厚樸酪降解AMLl-ETO融合蛋白的機(jī)制。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例的邏輯框架。
[0023] 圖2為實(shí)施例1不同時(shí)間40測(cè)HNK處理KASUMI-I細(xì)胞后，western blotting(WB)檢 測(cè)AMLl-ETO融合蛋白。
[0024] 圖3為實(shí)施例1不同濃度HNK處理KASUMI-I細(xì)胞24和48小時(shí)后，WB檢測(cè)AMLl-ETO融 合蛋白。
[0025] 圖4為實(shí)施例1中40yM HNK處理KASUMI-I細(xì)胞24或48小時(shí)后，RT-PCR法檢測(cè)AMLl-ETO轉(zhuǎn)錄水平。
[00%] 圖5為實(shí)施例1中扣M Pon A誘導(dǎo)U937T細(xì)胞24和48小時(shí)后，WB檢測(cè)AMLl-ETO融合蛋 白。
[0027] 圖6為實(shí)施例1不同時(shí)間40yM HNK處理U937T后，WB檢測(cè)AMLl-ETO融合蛋白。
[002引圖7為實(shí)施例1中Pon A誘導(dǎo)表達(dá)的U937T細(xì)胞經(jīng)40yM HNK24和48小時(shí)后，WB檢測(cè) AMLl-ETO融合蛋白。
[0029] 圖8為實(shí)施例2中40iiM HNK處理兩位臨床M2型白血病患者原代細(xì)胞24小時(shí)后，WB檢 測(cè)AMLl-ETO融合蛋白。
[0030] 圖9為實(shí)施例2中40iiM HNK處理兩位臨床M2型白血病患者原代細(xì)胞24小時(shí)后，RT-PCR法檢測(cè)AMLl-ETO轉(zhuǎn)錄水平。
[0031] 圖10為實(shí)施例3中不同濃度HNK處理KASUMI-I后，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)早期調(diào)亡信號(hào) Annexin V水平。
[0032] 圖11為實(shí)施例3中不同濃度HNK處理KASUMI-I細(xì)胞24小時(shí)后，WB檢測(cè)capaseS蛋白。
[0033] 圖12為實(shí)施例3中化M蛋白酶體抑制劑MG132和40咖HNK同時(shí)處理KASUMI-I后，WB 檢測(cè)AMLl-ETO融合蛋白。
[0034] 圖13為實(shí)施例4中40測(cè)HNK處理KASUMI-I細(xì)胞和如M Pon A誘導(dǎo)后的U937T細(xì)胞24 小時(shí)后，WB檢測(cè)UBC冊(cè)融合蛋白。
[0035] 圖14為實(shí)施例4中40iiM HNK處理原代細(xì)胞24小時(shí)后，WB檢測(cè)UBC冊(cè)蛋白。
[0036] 圖15為實(shí)施例4中40測(cè)HNK處理KASUMI-I細(xì)胞和如M Pon A誘導(dǎo)后的U937T細(xì)胞24 小時(shí)后，RT-PCR法檢測(cè)UBC冊(cè)轉(zhuǎn)錄水平。
[0037] 圖16為實(shí)施例4中40咖HNK處理特異性ShRNA抑制UBC服表達(dá)的KASUMI-I細(xì)胞后， WB檢巧陽(yáng)BC冊(cè)和AMLl-ETO融合蛋白。
[003引圖17為實(shí)施例4中IiiM HNK處理斑馬魚(yú)白血病模型48小時(shí)后，斑馬魚(yú)血管增生情 況。
[0039] 圖18為實(shí)施例4中化M HNK處理斑馬魚(yú)白血病模型48小時(shí)后，KASUMI-I細(xì)胞在斑馬 魚(yú)體內(nèi)遷移情況。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并 不僅限于此。
[0041] 本發(fā)明的內(nèi)容為發(fā)現(xiàn)和厚樸酪快速特效降解AMLl-ETO蛋白及其泛素化機(jī)制，是能 夠特效祀向降解AMLl-ETO蛋白的化學(xué)藥物，為治療AMLl-ETO陽(yáng)性的急性髓細(xì)胞白血病提供 相關(guān)藥物依據(jù)。
[0042] 和厚樸酪，3'，5-二-2-丙締基-1,1 聯(lián)苯-2,4'-二酪，5,3'-Diallyl-2,4'-dihyhowb i地eny 1分子式及分子量Cl抽18〇2，266.33，溶于DMS0。
[0044] 本發(fā)明實(shí)施