抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病之一。血管抑素受體(Ang1statinReceptor FlFO-ATP合成酶)對(duì)腫瘤細(xì)胞中ATP合成起重要作用。在正常人體組織中，血管抑素受體主要在線粒體內(nèi)膜上定位，但也有少量存在于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。相對(duì)而言，很多腫瘤細(xì)胞超量表達(dá)血管抑素受體，并大量定位于細(xì)胞膜上。因而腫瘤細(xì)胞膜上的血管抑素受體是一個(gè)潛在的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。
[0003]單克隆抗體市場作為制藥行業(yè)中增長最快、獲利最大的市場之一，其2003和2004年間的增長率已經(jīng)達(dá)到了 48.1%。由于受從嵌合體、人源化到完全人源化抗體等一系列技術(shù)發(fā)展的推動(dòng)，這一市場份額在未來6年內(nèi)有可能上升三倍。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體經(jīng)歷了從鼠源單抗、人源化/嵌合單抗、人單抗和全人單抗四個(gè)主要發(fā)展階段。單克隆抗體的上述四個(gè)發(fā)展階段使鼠源性蛋白成分分別從100%，下降至33%，乃至0%，成為真正的全人抗體。目前治療性單克隆抗體藥物的臨床指征覆蓋了惡性腫瘤、自身免疫性疾病、傳染性疾病，尤其是在癌癥和疑難雜癥的治療方面療效突出。
[0004]全人抗體藥物是利用人一人雜交瘤技術(shù)開發(fā)的單克隆抗體藥物，與現(xiàn)有藥物比較具有以下優(yōu)點(diǎn):1、全人抗體，無副作用；2、技術(shù)更為簡便，高通量篩選，開發(fā)周期短。3、生產(chǎn)工藝簡單，抗體產(chǎn)量高；4、與人體內(nèi)天然產(chǎn)生的抗體完全一致。截至2006年，美國FDA已批準(zhǔn)35個(gè)抗體藥物，其中，人源化抗體占60%，全人抗體占20%，全人抗體已成為治療類抗體在抗體類型上必然趨勢。
[0005]納米生物技術(shù)是國際生物技術(shù)領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)問題，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和明確的產(chǎn)業(yè)化前景，特別是納米藥物載體。這種技術(shù)是以納米顆粒作為藥物載體，將藥物等治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，同時(shí)也在顆粒表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，如單克隆抗體等，通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性藥物和基因治療。目前美國生物科學(xué)公司已研制出了一種紫杉醇白蛋白納米懸浮液(AB1-007)，已經(jīng)在歐美上市并應(yīng)用于臨床。雖然臨床研究結(jié)果顯示，AB1-007所引起的毒副反應(yīng)明顯輕于同劑量的注射液，但ABI — 007還是會(huì)引起骨髓抑制，粒細(xì)胞減少等副反應(yīng)。因此，對(duì)紫杉醇納米制劑做更進(jìn)一步的改進(jìn)，開發(fā)一種具有靶向治療效果的紫杉醇納米制劑將可提高靶細(xì)胞的藥物濃集、增加藥物療效具有更重要意義和廣泛的臨床應(yīng)用前景。
[0006]傳統(tǒng)的治療模式(手術(shù)、放療、化療)依然是腫瘤治療的主要手段。然而，臨床絕大多數(shù)抗癌制劑仍不能區(qū)分癌細(xì)胞與正常細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致了系統(tǒng)性的毒性與嚴(yán)重副作用。所以提高藥物的腫瘤選擇性，減少其在非靶向部位的聚集是提高抗腫瘤藥物療效的關(guān)鍵。靶向抗腫瘤納米藥物的研究正日益受到人們的普遍關(guān)注和重視。納米技術(shù)和納米生物學(xué)研究的進(jìn)一步深入已對(duì)醫(yī)藥業(yè)產(chǎn)生了巨大的影響，特別是納米藥物載體在藥物傳遞系統(tǒng)(DDS)可發(fā)揮重要作用。目前研究的熱點(diǎn)和已有較好基礎(chǔ)及做出實(shí)質(zhì)性成果的是藥物納米載體和納米顆?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)。這種技術(shù)是以納米顆粒作為藥物和基因轉(zhuǎn)移載體，將藥物、DNA和RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，同時(shí)也在顆粒表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，如特異性配體、單克隆抗體等，通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性藥物和基因治療。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物是一類新型的納米載體，它同時(shí)具有親水性基團(tuán)及疏水性基團(tuán)，在水中溶解后自發(fā)形成高分子膠束，并完成對(duì)藥物的增溶和包裹它具有親水性外殼及疏水性內(nèi)核，適合于攜帶不同性質(zhì)的藥物，且可使藥物能逃避單核巨噬細(xì)胞吞噬。因此，推進(jìn)靶向治療的有效靶點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)具有重要意義，結(jié)合納米技術(shù)研究新一代治療藥物與治療方法，具有重大的科學(xué)意義與社會(huì)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束及其制備與應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束及其制備與應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明一方面提供了一種抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束，該納米膠束是將抗血管抑素受體單克隆抗體與羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物連接后形成。該納米膠束為具有親水端和疏水端的兩親性納米膠束。
[0010]較佳的，上述納米膠束中，抗血管抑素受體單克隆抗體與羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩爾比為1:500-1:10000。
[0011]本發(fā)明第二方面，提供了抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束的制備方法，步驟如下:
[0012]I)羰基化嵌段聚合物P123 (CT-P123)的合成與表征；
[0013]2) CT-P123與抗血管抑素受體單克隆抗體的連接。
[0014]本發(fā)明第三方面，提供了抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束用作藥物載體。
[0015]本發(fā)明的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束可以用作藥物載體，使得被包裹的藥物能夠更加準(zhǔn)確地識(shí)別靶位，因此在提高藥物治療效果的同時(shí)，也降低了藥物的毒副作用。
[0016]本發(fā)明第四方面，提供了一種包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束，該免疫膠束是以上述抗血管抑素受體單克隆抗體納米膠束作為載體，在該載體中包裹有紫杉醇。
[0017]較佳的，上述免疫膠束中，抗血管抑素受體單克隆抗體納米膠束與紫杉醇的質(zhì)量比為 40-400:1。
[0018]本發(fā)明第五方面，提供了包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束的制備方法，步驟如下:采用星點(diǎn)法將紫杉醇包裹進(jìn)抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束中。
[0019]本發(fā)明第六方面，提供了包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明中包裹了紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束既能使藥物送到一定的靶位，發(fā)揮紫杉醇與抗血管抑素受體單克隆抗體的抗腫瘤作用，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，并延長藥物在腫瘤部位的作用時(shí)間；顯示出更優(yōu)越的抗腫瘤活性和更小的毒副作用。同時(shí)，本發(fā)明的免疫膠束采用納米粒子制備技術(shù)，表面改性等技術(shù)，在體內(nèi)減輕納米載藥顆粒與血清成分的相互作用，減小其被清除系統(tǒng)吞噬的概率，延長在血液循環(huán)系統(tǒng)中的時(shí)間，同時(shí)又實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)緩釋的目的，避免了抗體半衰期短的缺點(diǎn)，在保持其抗體活性的同時(shí)，使之更適合體內(nèi)應(yīng)用。與現(xiàn)有的單抗藥物相比，可以大大降低用藥頻率。
【附圖說明】
[0021]圖1抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束的制備方法流程圖
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明用二維液相色譜分離技術(shù)獲得了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白HA1-178，該蛋白為ATP合成酶的同源物，然后利用高效與高通量(HET-FAT)全人抗體技術(shù)，獲得高表達(dá)工程細(xì)胞株，制備出抗血管抑素受體人源化單克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，將羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物與抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合制得抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束。然后采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化將廣譜抗癌藥紫杉醇包裹于上述納米膠束中，制得抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束。
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆:試驗(yàn)手冊(cè)(New York:Cold Spring Har