S Lett.1977 Dec.15；84(2)：323-6；Couvreur,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.l988；5 (I)：l-20；Lasic,Trends Biotechnol.1998 July；16(7)：307-21；Gabizon& Papahadjopoulos，Proc Natl Acad Sci USA.1988 September;85(18):6949-53;Allen和 Chonn，F(xiàn)EBS Lett · 1987 Oct · 19; 223(I): 42-6;U· S · Pat · No · 5，741，516，其全文通過引用并 入本文）。此外，已經(jīng)綜述了各種將脂質(zhì)體和脂質(zhì)體樣制劑用作潛在藥物載體的方法 (Takakura，Nippon Rinsho,1998 March;56(3):691-5;Chandran等，Indian J Exp Biol.1997 August；35(8)：801-9；Margalit,Crit RevTher Drug Carrier Syst.l995；12 (2-3):233-61;美國專利號5,567,434;美國專利號5,552，157 ;美國專利號5,565,213;美國 專利號5，738，868和美國專利號5，795，587，其全文通過引用并入本文）。
[0228] 脂質(zhì)體由在水性介質(zhì)中分散并自發(fā)形成多層同心雙層囊泡（也稱為多層囊泡 (MLV))的磷脂形成。MLV的直徑通常為25nm-4ym。超聲MLV導致形成直徑為200-500.人的核 心包含水性溶液的小單層囊泡(SUV)。
[0229] 脂質(zhì)體與細胞膜相似，預期用作本發(fā)明中試劑的載體。它們廣泛適用，因為可以捕 獲水溶和脂溶物質(zhì)，例如分別在水性空間和本身的雙層內(nèi)。
[0230] 除了Couvreur等FEBS Lett · 1977 Dec · 15;84(2):323-6;和Couvreur等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1): 1-20的教導，可以使用以下信息制備脂質(zhì)體制劑。當 在水中分散時，取決于脂質(zhì)與水的摩爾比，磷脂可以形成除脂質(zhì)體之外的各種結(jié)構(gòu)。在低比 例時，脂質(zhì)體是典型的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體的物理特性取決于PH、離子強度和二價陽離子的存在。 脂質(zhì)體可以降低離子和極性物質(zhì)的滲透性，但當溫度升高時，其經(jīng)歷顯著改變其滲透性的 相變。相變涉及從緊密堆積的有序結(jié)構(gòu)(稱為凝膠態(tài))到松散堆積的較無序的結(jié)構(gòu)(稱為流 體態(tài))的變化。這在特征性的相變溫度發(fā)生，導致對離子、糖和藥物的滲透性增加。
[0231] 除了溫度，對蛋白質(zhì)的暴露可以改變脂質(zhì)體的滲透性。一些可溶蛋白，例如細胞色 素 C結(jié)合雙層膜、使其變形并滲透雙層膜，從而造成滲透性的改變。膽固醇明顯通過將磷脂 更緊密地堆積來抑制蛋白質(zhì)的這種滲透。預期最典型的用于抗生素和抑制劑遞送的脂質(zhì)體 形式將包含膽固醇。
[0232] 捕獲溶質(zhì)的能力在不同類型的脂質(zhì)體之間不同。例如，MLV在捕獲溶質(zhì)上中等有 效，但SUV極度無效。SUV在尺寸分布上提供均勻性和再現(xiàn)性的優(yōu)勢，但大單層囊泡(LUV)提 供尺寸和捕獲效率之間的平衡。這些通過蒸發(fā)來制備，在溶質(zhì)捕獲上比MLV有效3-4倍。
[0233] 除了脂質(zhì)體的特征，捕獲化合物的一個重要決定因素是化合物本身的理化性質(zhì)。 極性化合物被捕獲于水性空間中，非極性化合物與囊泡的脂雙層結(jié)合。極性化合物通過滲 透或當雙層膜被破壞時釋放，但非極性化合物仍然與雙層膜相連，除非雙層膜被溫度破壞 或暴露于脂蛋白。兩種類型均在相變溫度顯示最大釋放率(efflux rate)。
[0234] 或者，可以使用藥學上可接受的納米膠囊制劑以穩(wěn)定和可再現(xiàn)的方式捕獲試劑 ((Henry-Michelland等，J Pharm Pharmacology.1987 December;39(12):973-7; Quintanar-Guerrero等，Drug Dev Ind Pharm.1998 December;24(12):1113_28;Douglas 等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.l987;3(3):233_61，其通過引用并入本文）。為了 避免細胞內(nèi)聚合物超載引起的副作用，應當用體內(nèi)能夠降解的聚合物設計這種超細顆粒 (大小約0.1M1)。例如預期在本發(fā)明中使用滿足這些要求的生物可降解的聚烷基-氰基丙烯 酸酯納米顆粒。這種顆?？扇缢枋龅娜菀椎刂苽?Couvreur等，1980,以上和1988,以上； zur Muhlen等，Eur J Pharm Biopharm.1998 March;45(2):149-55;Zambaux等J Control Release.1998 Jan.2;50(l-3):31_40;Pint〇-Alphandry等，1995 J Drug Target.l995;3 (2): 167-9和美國專利號5,145,684,其全文通過引用并入本文）。
[0235]當然，試劑的治療有效劑量將根據(jù)以下因素變化:所討論的特定試劑、待治療(包 括預防）的病理病癥、施用方法、涉及的任何共療法、受試者的年齡、重量、總體醫(yī)療狀況、病 史等，其施用在執(zhí)業(yè)醫(yī)師的能力范圍內(nèi)。因此，臨床醫(yī)生有必要根據(jù)需要滴定劑量并改變施 用途徑以獲得最大療效。臨床醫(yī)生將施用試劑直到達到治療所討論病癥獲得期望效果的劑 量。例如，如果目的是治療膿毒癥，在一個方面，量將是改善膿毒性狀況的量。
[0236]根據(jù)以上指導，有效劑量一般是約1.2-約24mg/kg、更通常約2.4-約24mg/kg、最通 常約 2 · 4-約 4mg/kg。
[0237] 對于非口服用途，可以注射形式以每kg體重約2_24mg、通常約2.4-約24mg、最通常 約2.4-約4mg施用試劑，靜脈注射每天1-2次。應當理解，應當將內(nèi)毒素污染保持在最小安全 水平，例如小于約〇. 5ng/mg蛋白。此外，對于人施用，制劑通常滿足FDA辦公室和生物標準所 要求的無菌性、致熱原性、一般安全性和純度。
[0238] -些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量，包括但不限于疾病或病癥的嚴重 程度、之前的治療、受試者的總體健康和/或年齡，和存在的其他疾病。還將理解，用于治療 的試劑的有效劑量可以在具體治療過程中增加或減少。劑量變化可以從診斷分析結(jié)果中得 出并變得明顯。例如，可以在施用本文所述的試劑后監(jiān)控受試者?；诒O(jiān)控信息，可以施用 額外量的試劑。
[0239] 劑量取決于待治療疾病狀況的嚴重程度和反應性，治療過程持續(xù)幾天至幾個月或 直到有效治愈或達到疾病狀態(tài)減少?？梢詼y量患者體內(nèi)藥物累積來計算最佳劑量方案。普 通技術(shù)人員可以容易確定最佳劑量、給藥方法和重復頻率。最佳劑量可以根據(jù)單個化合物 的相對功效變化，且通?？梢曰隗w外和體內(nèi)動物模型中發(fā)現(xiàn)有效的EC 5Q來估計。
[0240]有助于治療疾病的劑量水平范圍為每次施用約lyg/kg-100mg/kg體重。本領域技 術(shù)人員還可以容易確定將公開的向指定受試者使用的合適的劑量方案。例如，可以向受試 者單次施用，例如單次注射本文所述的試劑?；蛘撸诩s3-約28天或約7-約10天期間，每天 一次或兩次向受試者施用試劑。
[0241] 因此，可以以單位劑量施用試劑，所述單位劑量小于約75mg/kg體重，或小于約70、 60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.000511^/1^體重，并小于 20011111〇1試劑/1^體重，或小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、 0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015歷〇1試劑/1^體重。
[0242] 向器官直接遞送(例如直接遞送至肝臟)本文所述的試劑例如antagomir的劑量范 圍可以是約0 · OOOOlmg-約3mg/器官、或通常約0 · 0001-0 · OOlmg/器官、約0 · 03-3 · Omg/器官、 約0 · 1-3 · Omg/器官或約0 · 3-3 · Omg/器官。
[0243] 當劑量方案包含多次施用時，應理解向受試者施用的試劑的有效量可以包括在整 個劑量方案中施用的試劑總量。本領域技術(shù)人員將理解，可以根據(jù)各種因素在一定程度上 調(diào)節(jié)精確的個人劑量，所述因素包括施用的具體試劑、施用時間、施用途徑、制劑性質(zhì)、排泄 率、治療的具體疾病、疾病的嚴重度、寡核苷酸試劑的藥代動力學和患者的年齡、性別、體重 和總體健康。鑒于各種施用途徑的效率不同，可以預計必要劑量水平內(nèi)的大差異。例如，口 服施用將需要比靜脈注射施用更高的劑量水平?？梢允褂帽绢I域公知的標準的憑經(jīng)驗的優(yōu) 化途徑來調(diào)節(jié)這些劑量水平的差異。精確的治療有效劑量水平和模式通常由主治醫(yī)師考慮 以上鑒定的因素來確定。在一個方面，使用單位劑量的頻率少于每天一次，例如少于每2、4、 8或30天一次。在另一個方面，不以某個頻率施用單位劑量(即不是固定頻率）。例如，可以單 次施用單位劑量。因為在施用antagomir組合物后，寡核苷酸介導的沉默可以持續(xù)幾天，在 很多情況下，可能以少于每天一次的頻率施用組合物，或在一些情況下，整個治療方案僅施 用一次。
[0244] 在一些方面，向受試者施用初始劑量和一次或多次維持劑量的本文所述的試劑。 維持劑量通常低于初始劑量，例如低于初始劑量的一半。維持方法可以包括用〇.〇lg_75mg/ 1^體重/天，例如70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或 0.000511^/1^體重/天的劑量治療受試者。維持劑量的施用通常不超過每5、10或30天一次。 此外，治療方案可以持續(xù)一段時間，其取決于具體疾病的性質(zhì)、其嚴重程度和患者的總體狀 況。在一個典型的方面，劑量的遞送不超過每天一次，例如不超過每24、36、48或更多小時一 次，例如不超過每5或8天一次。治療之后，可以監(jiān)控患者的病癥變化以及疾病狀態(tài)的癥狀緩 解。如果患者對目前的劑量水平?jīng)]有明顯反應，可以增加化合物的劑量，或如果觀察到疾病 狀態(tài)的癥狀緩解，如果疾病狀態(tài)已經(jīng)消除或如果觀察到不良副作用，可以減少劑量。
[0245] 根據(jù)需要或在具體環(huán)境下認為合適，有效劑量可以以單次劑量或兩次或多次劑量 施用。如果需要促進重復或頻繁輸注，可以建議植入遞送裝置，例如栗、半永久性支架(例如 靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦池內(nèi)或中央囊內(nèi)）或儲液器。成功治療之后，可能需要讓患者進行維持治 療以預防疾病狀態(tài)的復發(fā)，其中本發(fā)明化合物以〇.〇lyg-l〇〇g/kg體重的維持劑量施用。
[0246] 除了治療已有的疾病或病癥，還可以預防性地施用本文所述的試劑以預防或減緩 具體疾病或病癥的發(fā)生。在預防性應用中，向容易患或者有風險患特定病癥（例如與目標 miRNA的異常或多余表達相關(guān)的疾病)的患者施用antagomir。
[0247] 施用途徑按照已知的方法，例如通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腦內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦脊液內(nèi)、皮下、 眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)口、局部或吸入途徑、或通過緩釋系統(tǒng)注射或輸注。
[0248] 試劑預防或治療討論疾病的功效可以通過與對類似目的有效的另一種藥劑連續(xù) 或組合施用(在相同組合物內(nèi)或作為不同組合物)來改進。
[0249] 例如，可以將治療膿毒癥的試劑與抗生素療法組合，且與這種其他療法協(xié)同或累 加起作用。與本文所述的試劑組合施用的治療劑的有效量將由醫(yī)生或獸醫(yī)決定。進行劑量 施用和調(diào)節(jié)以獲得對待治療病癥的最大管理。劑量還取決于待使用的治療劑的類型和治療 的具體患者這些因素。通常，如果指定的治療劑不與本文所述的試劑一起施用，所用的量將 與已用的劑量相同。
[0250] 可以將本文所述的試劑與另一種試劑，例如穩(wěn)定寡核苷酸試劑的試劑，如與寡核 苷酸試劑復合的蛋白質(zhì)組合配制。其他試劑還包括螯合劑，例如Η)ΤΑ(即去除二價氧離子如 Mg2+ )、鹽和RNA酶抑制劑(例如廣泛特異性RNA酶抑制劑如RNAsin)。
[0251 ] 在一個方面，當試劑是antagomir時，antagomir制劑包括另一種antagomir，即可 以下調(diào)第二種miRNA的第二antagomir。在一些方面，試劑革El向同一革El核酸但不同革El序列。在 另一個方面，各antagomir革El向不同革巴標。
[0252] -種化合物可以與一種或多種其他化合物，尤其是涉及膽固醇合成或攝入的其他 化合物，例如他汀類、膽汁酸螯合劑、膽固醇吸收抑制劑如貝特類、煙酸等組合配制。
[0253] 使用miRNA抑制劑治療的方法
[0254] 本文所述的在體內(nèi)和/或體外分析中具有活性的試劑可能在與膿毒癥、炎癥、器官 保護、微血管功能和/或細胞凋亡相關(guān)的各種疾病中有治療用途。
[0255] 膿毒癥和隨后的多個器官衰竭仍然是重癥監(jiān)護病房中發(fā)病率和死亡率的主要原 因。膿毒癥是患者對重度感染的反應。革蘭氏陰性菌的細胞壁成分（內(nèi)毒素或脂多糖)是引 起膿毒癥開始的優(yōu)勢種。膿毒癥的病理生理學是對消除病原體的反應的不恰當調(diào)節(jié)。在正 常情況下，與炎癥系統(tǒng)接觸的第一個病原菌將消除微生物感染并使宿主快速恢復體內(nèi)平 衡。在膿毒癥中，炎癥系統(tǒng)常常是過度活化，從而加速對感染的反應。快速的淋巴細胞凋亡、 延遲的中性粒細胞凋亡和增強的細胞/組織的細胞凋亡和壞死均是膿毒癥和多個器官衰竭 的發(fā)病機制。因此，消除細胞凋亡保護器官，并代表對膿毒癥及其相關(guān)的多個器官衰竭的潛 在治療策略。這樣，抑制miR-15家族可以上調(diào)抗細胞凋亡蛋白（和/或防止細胞凋亡蛋白的 下調(diào)），從而保護器官不受膿毒癥誘導的凋亡性細胞死亡。
[0256] 以上公開總體上描述了本發(fā)明。參照以下具體實施例可以獲得更完整的理解。這 些實施例僅為說明目的描述，不意欲限制本發(fā)明的范圍。認為在等同物的形式和取代上的 變化是可以建議的情況或是權(quán)宜之計。盡管本文中使用特定術(shù)語，這些術(shù)語意欲是描述性 的含義，而不是為限制的目的。
【具體實施方式】
[0257] 材料和方法：
[0258] 1.材料
[0259]從Invitrogen購買原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞，并根據(jù)制造商的說明培養(yǎng)。從Sigma購 買脂多糖(LPS)。
[0260] 2.轉(zhuǎn)染
[0261 ] 分別使用化學修飾的反義寡核苷酸(antagomir，GenePharm Co . Ltd)和合成的 miR-195模擬物（Qiagen)抑制和過表達miR-195的表達。使用錯義寡核苷酸(GenePharm Co .Ltd)作為對照。根據(jù)制造商的說明使用TransMessenger轉(zhuǎn)染試劑(Qtagen)對人臍靜脈 肉皮細胞進行轉(zhuǎn)染。
[0262] 3.半胱天冬酶-3活性
[0263] 如之前詳述，使用半胱天冬酶-3焚光分析試劑盒（BI0M0L Research Laboratories)測量半胱天冬酶-3的活性。簡言之，將組織或培養(yǎng)細胞均質(zhì)化，使用 Bradford方法測定蛋白濃度。將兩次重復的樣品（200-400yg蛋白質(zhì)）與半胱天冬酶-3底物 Ac-DEVD-AMC或Ac-DEVD-AMC加上抑制劑AC-DEVD-CH0于37°C孵育2小時，然后用熒光分光光 度計(激發(fā)波長是380nm，發(fā)射波長是405nm)進行測量。來自抑制劑處理的樣品的信號作為 背景。
[0264] 4 ·測量細胞DNA片段化
[0265] 預先用BrdU標記細胞，然后與棕櫚酸鹽一起孵育。用細胞DNA片段化ELISA試劑盒 (Roche Applied Science)根據(jù)制造商的說明測量DNA片段化。
[0266] 5.凋亡細胞的原位檢測
[0267] 為了定位組織中正在進行核DNA片段化的細胞，如之前所述，使用原位細胞凋亡檢 測試劑盒(Roche Biochemicals)進行原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標 記(TUNEL)。
[0268] 6.測定肝臟損傷
[0269]使用來自BioAssay Systems的分析試劑盒根據(jù)制造商的說明測量丙氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作為肝臟損傷的指標。
[0270] 7.評估腎功能
[0271 ]使用尿素氮檢測試劑盒根據(jù)制造商的說明測定血尿氮。
[0272] 8 .MPO 活性
[0273] 作為中性粒細胞滲透的指數(shù)，測定組織中的髓過氧化物酶(MPO)活性。簡言之，切 除組織，將其置于磷酸鹽緩沖液中并均質(zhì)化。將1:10稀釋的均質(zhì)物（10%wt/v 〇l)于4_8°C在 6000g下離心20分鐘。將沉淀再次均質(zhì)化并在包含0.5%CET0H洗滌劑的lml50mM乙酸 (pH6.0)中超聲處理10秒。制備的樣品在MPO活性的反應中使用，所述MPO活性用分光光度法 (650nm)通過測量3.3V，5.5V-四甲基聯(lián)苯胺的過氧化氫依賴性氧化來測定。
[0274] 9.TNF-a和iNOS mRNA表送的實時RT-PCR
[0275] 按照制造商的說明使用Trizol Reagent(Gibco-BRL)從新鮮或冷凍組織中提取總 RNA。對小鼠 TNF-a、iN0S和甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)mRNA進行實時RT-PCRJNF-a、 iNOS和GAPDH的引物如之前所述。
[0276] 10. LPS誘導的膿毒癥小鼠模型
[0277] 成年雄性小鼠（C57BL/6,2個月大)接受LPS(4mg/kg，i .p.)。在LPS處理后的不同時 間點(6、12和30小時），殺死小鼠并收集組織。
[0278] 11.腹膜中的糞便-誘導的膿毒癥小鼠模型
[0279] 如之前所述通過將糞便注射入腹腔在成年雄性C57BL/6小鼠（2個月大）中誘導膿 毒癥。從供體小鼠的盲腸收集奠便，以最高75mg/ml的濃度與無菌鹽水混合，然后以50mg/kg 腹腔注射。對照小鼠用無菌鹽水進行腹腔注射(50ml/kg)。
[0280] 12. DNA質(zhì)粒和寡核苷酸的遞送
[0281 ]根據(jù)制造商的說明，將質(zhì)粒DN