專利名稱：Il-18抑制劑在治療或預(yù)防膿毒癥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請享有2001年5月16日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/291,463的權(quán)益，其公開的內(nèi)容被納入作為參考。
本發(fā)明涉及IL-18抑制劑在治療和/或預(yù)防膿毒癥(sepsis)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1989年有人檢測到在感染小鼠的血清中用牛分枝桿菌誘導(dǎo)以及用脂多糖(LPS)攻擊的因子。這個因子在白介素-2(IL-2)存在下能夠誘導(dǎo)正常小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液的干擾素-γ(IFN-γ)(Nakamura等人，1989)。該因子所起的作用不是IFN-γ的直接誘導(dǎo)劑，而是與IL-2、抗CD3或有絲分裂原一起作為共刺激劑。有人嘗試由內(nèi)毒素后處理過的小鼠血清進一步鑒定這種活性，結(jié)果揭示了一種與上述活性相關(guān)、分子量為50-55kDa表觀均一的蛋白質(zhì)(Nakamura等人，1993)。由于其他細(xì)胞因子可以作為產(chǎn)生IFN-γ的共刺激劑，所以無法通過中和抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的抗體來阻斷血清活性，提示它是一種截然不同的因子。同一批科學(xué)家證實了以瘡皰棒狀桿菌(P.acnes)預(yù)處理的小鼠肝臟提取物中含有由內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的共刺激劑(Okamura等人，1995)。此實驗?zāi)Ｐ偷母闻K巨噬細(xì)胞群(Kupffer細(xì)胞)擴展，所以低劑量細(xì)菌脂多糖(LPS)是可致命的，但對未經(jīng)預(yù)處理的小鼠作類似處理是不致命的。該因子被命名為IFN-γ誘導(dǎo)因子(IGIF)，后來又被稱為白細(xì)胞介素-18(IL-18)，由這些經(jīng)瘡皰棒狀桿菌處理過的小鼠肝臟提純至均漿，獲得部分氨基酸序列。采用由純化IL-18的氨基酸序列所產(chǎn)生的簡并寡核苷酸來克隆小鼠IL-18cDNA(Okamura等人，1995)。IL-18的人cDNA序列在1996年已有報導(dǎo)。
白細(xì)胞介素IL-18(Tsutsui等人，1996；Nakamura等人，1993；Okamura等人，1995；Ushio等人，1996；)具有IL-1蛋白質(zhì)家族的結(jié)構(gòu)特征。與其他大多數(shù)具有四螺旋束結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子不同，IL-18全部為β-折疊結(jié)構(gòu)。IL-18與IL-1β相似，被合成為一種沒有生物活性的前體(proIL-18)，缺少信號肽(Ushio等人，1996)。IL-1β和IL-18前體由caspase 1(IL-1β轉(zhuǎn)化酶或ICE)在P1位置上天冬氨酸殘基之后割開。即使沒有信號肽，所得到的成熟細(xì)胞因子也可從細(xì)胞釋放出來(Ghayur等人，1997和Gu等人，1997)。
眾所周知，IL-18是一種通過T輔助I型(Th1)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的共刺激劑(Kohnoet等人，1997)，也是通過小鼠天然殺傷細(xì)胞克隆由FAS配體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的共刺激劑(Tsutsui等人，1996)。
白介素-12(IL-12)是一種由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。它是細(xì)胞介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)與后天性免疫反應(yīng)和諧結(jié)合的關(guān)鍵(Trinchieri，1998)。它由雜二聚體組成，而雜二聚體由二個分離基因的共價連接產(chǎn)物構(gòu)成重鏈(p40)和輕鏈(p35)。IL-12受某些細(xì)菌、細(xì)菌產(chǎn)物、胞內(nèi)寄生物和病毒刺激而產(chǎn)生。下列功能要歸因于IL-121)它是T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的IFN-γ的強誘導(dǎo)劑，2)它是這些細(xì)胞的共促有絲分裂因子，3)它對大多數(shù)系統(tǒng)的Th1反應(yīng)的發(fā)生起著關(guān)鍵的作用(繼而增加IFN-γ和TNF的產(chǎn)生及增強巨噬細(xì)胞的活化等)，4)它增強具有細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以及5)它是遲發(fā)型超敏反應(yīng)所必需的。已發(fā)現(xiàn)，IFN-α或IFN-β能抑制經(jīng)金黃色葡萄球菌Cowan 1株處理過的分離小鼠脾白細(xì)胞中IL-12的產(chǎn)生(Karp等人，2000)。
最近據(jù)報，IL-12參與器官特異性自身免疫炎癥疾病的致病機理，如多發(fā)性硬化癥(Karp等人，2000)和炎癥性腸胃疾病(IBD)(Blumberg和Strober，2001；Fiocchi，1999)，所以它被認(rèn)為是治療這些疾病的潛在藥靶。
IL-18和IL-12在誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ上有明顯的協(xié)同作用(Okamura等人，1998)。對這種協(xié)同作用的機理的研究顯示，IL-12能使產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞上IL-18受體的兩條鏈的表達上調(diào)(Kim等人，2001)。雖然IL-12和IL-18都能激活先天性免疫和后天性免疫，但受活化巨噬細(xì)胞刺激使它們的產(chǎn)生過量可誘導(dǎo)多種器官性疾病，包括免疫系統(tǒng)機能障礙(Seki等人，2000)。
細(xì)胞因子結(jié)合蛋白(可溶性細(xì)胞因子受體)通常是其各自細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。它們或通過可變換的剪接或通過細(xì)胞表面受體蛋白裂解而產(chǎn)生。過去已對這些可溶性受體進行了敘述，例如，IL-6和IFN-γ的可溶性受體(Novick等人，1989)、TNF(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990)、IL-1和IL-4(Maliszewski等人，1990)和IFN-α/β(Novick等人，1994；Novick等人，1992)。一種稱為骨保護素(OPG，也稱破骨抑制因子-OCIF)的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白是TNFR/Fas家族的成員，它似乎是僅作為分泌蛋白而存在的第一種可溶性受體(Anderson等人，1997；Simonet等人，1997；Yasuda等人，1998)。
通過在IL-18柱上進行親和純化從尿中得到了結(jié)合IL-18的蛋白質(zhì)(IL-18BP)(Novick等人，1999)。IL-18BP在體外消除了IL-18對IFN-γ的誘導(dǎo)以及IL-18對NF-κB的活化。另外，IL-18BP還通過注射LPS抑制了小鼠中IFN-γ的誘導(dǎo)。IL-18BP基因位于人染色體11上，在包括IL-18BP基因的8.3Kb基因組序列中沒發(fā)現(xiàn)編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的外顯子。迄今為止，在人身上發(fā)現(xiàn)通過變換剪接mRNA可產(chǎn)生IL-18BP的四種同種型。它們被命名為IL-18BP a、b、c和d，它們?nèi)烤蚕硐嗤腘末端，但C末端不同(Novick等人，1999)。這些同種型與IL-18的結(jié)合能力不同(Kim等人，2000)。在四種同種型中，人IL-18同種型a和c對IL-18具有中和能力已為人所知。最富含的IL-18BP同種型，即剪接變體同種型a，對IL-18具有高親和力，結(jié)合速率快，解離速率慢，解離常數(shù)(Kd)約為0.4nM(Kim等人，2000)。IL-18BP在脾中固有地表達，屬于免疫球蛋白超家族。有人利用計算機模型(Kim等人，2000)和基于類似蛋白IL-1β與IL-1R I型的相互作用(Vigers等人，1997)對參與IL-18和IL-18BP相互作用的殘基進行了闡述。根據(jù)IL-18與IL-18BP結(jié)合的模型，提出將IL-18的42位上Glu殘基和89位上Lys殘基分別與IL-18BP的Lys-130和Glu-114結(jié)合(Kim等人，2000)。
IL-18BP固有地存在于許多細(xì)胞中(Puren等人，1999)，并在健康人體內(nèi)循環(huán)(Urushihara等人，2000)，這是細(xì)胞因子生物學(xué)一種獨有現(xiàn)象。由于IL-18BP對IL-18具有高親和力(Kd＝0.4nM)以及在循環(huán)中IL-18BP的濃度較高(相對IL-18過量20倍摩爾)，故可以推測，在循環(huán)中即使不是全部但大部分IL-18分子與IL-18BP結(jié)合。與IL-18的細(xì)胞表面受體競爭的循環(huán)IL-18BP可用作天然消炎和免疫抑制分子。
如上所述，IL-18誘導(dǎo)IFN-γ，最近又有報導(dǎo)，IFN-γ反過來在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-18BPa mRNA(Muhl等人，2000)。所以，IL-18BPa可用作“中斷”信號，以終止炎癥反應(yīng)。
IL-18BP與由一些痘病毒編碼的蛋白質(zhì)家族高度同源(Novick等人，1999；Xiang和Moss，1999)。通過該推定病毒性IL-18BP抑制IL-18可減弱炎癥抗病毒性Th1反應(yīng)。
術(shù)語全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)是膿毒癥的一種常見臨床綜合征，與其病因無關(guān)。SIRS可由外傷、胰腺炎、藥物反應(yīng)、自身免疫疾病和其他疾病引起據(jù)說受感染時出現(xiàn)SIRS就會引起膿毒癥(Nathens和Marshall，1996)。
膿毒癥休克是內(nèi)科和外科深切治療部最常見的死因(Astiz和Rackow，1998)。用術(shù)語膿毒癥、重度膿毒癥和膿毒癥休克來區(qū)分受感染的連續(xù)臨床反應(yīng)。膿毒癥患者呈現(xiàn)感染癥狀和炎癥的臨床表現(xiàn)。重度膿毒癥患者可發(fā)展為灌注不足和器官性功能障礙。膿毒癥休克表現(xiàn)為灌注不足和永久性血壓過低。膿毒癥患者的死亡率為16％，膿毒癥休克患者的死亡率為40-60％。膿毒癥休克最常見的誘因是細(xì)菌感染。感染多發(fā)部位是肺、腹部和尿道。一般消炎法如采用皮質(zhì)類固醇療法不能提高膿毒癥和膿毒癥休克的生存率。在臨床試驗中曾測試了三種對內(nèi)毒素具有特異性的單克隆抗體，它們也不能提高生存率。采用腫瘤壞死因子拮抗劑、白介素1、緩激肽、布洛芬和血小板活化因子的療法也顯示對膿毒癥休克的生存率無任何改善(Astiz和Rackow，1998)。
膿毒癥特別是由革蘭氏陽性菌例如表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)引起的。脂磷壁酸和肽聚糖是葡萄球菌種細(xì)胞壁的主要成分，被認(rèn)為是在此條件下釋放細(xì)胞因子的誘導(dǎo)劑(Grupta等人，1996和Cleveland等人，1996)。然而，其他革蘭氏陽性成分也被認(rèn)為是細(xì)胞因子合成的刺激劑(Henderson等人，1996)。一般認(rèn)為，IL-1、TNF-α和IFN-γ的產(chǎn)生是膿毒癥休克發(fā)病的主要原因(Dinarello，1996和Okusawa等人，1988)。此外，趨化因子IL-8可由應(yīng)答表皮葡萄球菌的嗜中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)(Hachicha等人，1998)。調(diào)節(jié)由表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1、TNF-α和IFN-γ的主要因子是IL-18、IL-12、IL-1β和TNF-α。IL-1β和TNF-α可看成為由T淋巴細(xì)胞刺激產(chǎn)生IFN-γ的共刺激劑，方式與IL-18相似。這兩種細(xì)胞因子對位于IL-12附近的IFN-γ的產(chǎn)生或細(xì)菌刺激具有共刺激活性(Skeen等人，1995和Tripp等人，1993)。
Nakamura等人(2000)最近報導(dǎo)，把IL-18和IL-12一起給予小鼠，所得到的毒性與內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥休克中發(fā)現(xiàn)的毒性差不多一樣高。
已有證據(jù)顯示，膿毒癥患者的血清IL-18水平上升(Endo等人，2000)，但這種與肌酸酐水平相關(guān)的上升提示IL-18水平上升可能由腎衰竭造成。在另一項研究(Grobmyer等人，2000)中，9例膿毒癥患者在入院后最初96個小時期間的IL-18水平較高，但與肌酸酐水平無關(guān)。
由以上可見，IL-18是一種具有增強與減弱炎癥功能的多效白介素。一方面，它能增強促炎細(xì)胞因子如TNF-α的產(chǎn)生，因而起到促炎的作用。另一方面，它能誘導(dǎo)caspase-1抑制劑氧化氮(NO)的產(chǎn)生，因而阻斷IL-1β的成熟，從而可能減弱炎癥作用。IL-18的這種雙重作用使人們對IL-18抑制劑在治療炎癥疾病的功效提出一個很大的疑問。而且，因為調(diào)節(jié)炎癥時涉及到很多種不同細(xì)胞因子和趨化因子，不可能期望它在這樣一個復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)中僅阻斷一條通道就獲得有益的效果。
Netea等人(2000)報導(dǎo)，給予抗IL-18多克隆抗體能保護小鼠免于受到由測試大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏桿菌產(chǎn)生的兩種LPS所造成的不良影響，這證實了IL-18是致命內(nèi)毒素血癥發(fā)病的重要因素的理論。然而，新治療藥物基于給予IL-18抑制劑的功效的不確定性表現(xiàn)為IL-18剔除(knock out)小鼠與野生型動物相比更不易患上膿毒癥(Sakao等人，1999)，而最新報導(dǎo)提示IL-18的促炎活性是抗嚴(yán)重感染宿主防御的必要條件(Nakanishi等人，2001和Foss等人，2001)。
所以，盡管存在上述關(guān)于IL-18抑制劑的使用問題，但有必要提供膿毒癥的治療和/預(yù)防方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種IL-18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述的疾病選自重度膿毒癥和膿毒癥休克，所述的藥物也用于與膿毒癥相關(guān)的心功能不全。
更具體地說，本發(fā)明涉及IL-18抑制劑的應(yīng)用，所述的IL-18抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)、或其至少具有與IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)基本上相同活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。
本發(fā)明所用的IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)是它的同種型、突變蛋白、融合蛋白(例如與Ig融合)、功能性衍生物(例如與PEG結(jié)合)、活性片段或循環(huán)變換衍生物。
本發(fā)明所用的抗體可以是抗IL-18特異性抗體，選自嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。
另外，本發(fā)明涉及一種抑制劑在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物還包括IL-12抑制劑，優(yōu)選為IL-12中和抗體，干擾素，優(yōu)選為干擾素α或β，腫瘤壞死因子，抑制劑優(yōu)選為可溶性TNFR I或TNFR II和/或IL-1抑制劑，優(yōu)選為IL-1受體拮抗劑，可同時、先后或分開給予。
本發(fā)明還提供一種包括IL-18抑制劑編碼序列的表達載體在制備例如通過基因療法治療和/或預(yù)防膿毒癥的藥物中的應(yīng)用，所述的IL-18抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，其至少具有與IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)基本上相同活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白或循環(huán)變換衍生物。
本發(fā)明還提供一種能誘導(dǎo)和/或增強細(xì)胞中內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的載體在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種經(jīng)過基因改造產(chǎn)生IL-18抑制劑的細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
在另一實施例中，本發(fā)明涉及一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病，包括與膿毒癥相關(guān)的心功能不全的治療和/或預(yù)防方法，所述方法包括給予有需要的受試者藥學(xué)上有效量的IL-18抑制劑，所述的抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)、其至少具有與IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)基本上相同活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。這種方法可包括共同給予有效治療量的細(xì)胞因子抑制劑，所述的細(xì)胞因子抑制劑選自IL-12抑制劑，優(yōu)選為中和抗體，腫瘤壞死因子，優(yōu)選為TNFRI或TNFRII可溶性部分，IL-1抑制劑，優(yōu)選為IL-1受體拮抗劑與IL-8抑制劑，和/或干擾素，優(yōu)選為干擾素-α或干擾素-β。
此外，本發(fā)還提供一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的治療和/或預(yù)防方法，所述的方法包括給予有需要的受試者藥學(xué)上有效量的編碼IL-18抑制劑序列的載體，所述的抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)、其同種型、突變蛋白、融合蛋白或循環(huán)變換衍生物。
在另一實施例中，本發(fā)明涉及一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的治療和/或預(yù)防方法，所述的方法包括給予有需要的受試者藥學(xué)上有效量的能誘導(dǎo)和/或增強細(xì)胞中內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的載體。
本發(fā)明還提供一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的治療和/或預(yù)防方法，所述的方法包括給予有需要的受試者經(jīng)過基因改造產(chǎn)生IL-18抑制劑的細(xì)胞。


圖1所示為健康個體的血清IL-18BPa的分布圖。以特異性ELISA試驗分析年齡為20至60歲的男女健康個體血清中所含的IL-18BPa(n＝107)。
圖2A所示為膿毒癥患者與健康受試者的平均IL-18和IL-18BPa水平。測定健康受試者(參見圖1)與從42例膿毒癥患者剛住院時和住院期間采集到的198個樣本的血清IL-18和IL-18BPa。
圖2B所示為圖2A所述健康受試者與膿毒癥患者各自IL-18和IL-18BPa水平的分布圖。健康受試者的平均血清IL-18和IL-18BPa水平分別以垂直虛線和水平虛線表示。
圖3所示為住院后各膿毒癥患者的總IL-18與游離IL-18之間的比較。根據(jù)總IL-18(空心圓)與IL-18BPa的濃度，并考慮復(fù)合物中IL-18與IL-18BPa為1∶1的化學(xué)計量比以及已算出來的Kd值400pM而計算血清中游離IL-18(實心圓)的水平。每條垂直線將單個血清樣本的總IL-18與游離IL-18連接起來。
圖4所示為IL-18BP對表皮葡萄球菌在全血中誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的影響。單獨用表皮葡萄球菌或用表皮葡萄球菌與重組IL-18BP按照所示濃度刺激全血。培育48小時后，溶解血培養(yǎng)液，測量IFN-γ。結(jié)果以表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ的百分比表示。與單獨用表皮葡萄球菌比較P＜0.01。這些數(shù)據(jù)表示6個實驗的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。SEM表示一個樣本平均值的范圍。SEM給出平均值精確度的概念。SEM＝SD/(樣本大小的方根)。用配對Student’s test檢驗分析數(shù)據(jù)。
圖5所示為IL-18BPa與抗IL-12單克隆抗體的雙重活性對用表皮葡萄球菌處理過的全血產(chǎn)生IFN-γ的抑制效應(yīng)。在IL-18BPa(125納克/毫升)、IL-12單克隆抗體(2.5微克/毫升)及二者存在或不存在情況下用表皮葡萄球菌刺激全血。培育48小時后，溶解血培養(yǎng)液，測量IFN-γ。數(shù)據(jù)以誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的百分比表示。與單獨用表皮葡萄球菌比較P＜0.01。這些數(shù)據(jù)表示6個實驗的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。SEM表示一個樣本平均值的范圍。SEM給出平均值精確度的概念。SEM＝SD/(樣本大小的方根)。用配對Student’s test檢驗分析數(shù)據(jù)。
圖6所示為ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線反映的IL-18BPa定量結(jié)果。依次稀釋重組人IL-18BPa，并進行實施例3所述的ELISA試驗。數(shù)據(jù)以10個實驗的平均吸收度±SE(標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示。壓圖7所示為IL-18對ELISA試驗的IL-18BPa定量結(jié)果的抑制效應(yīng)。圖中示出信號被抑制的百分比。
圖8所示為人IL-18BP同種型的免疫交叉反應(yīng)。用IL-18BP的全部同種型(a-d)進行IL-18BP ELISA試驗。依次稀釋IL-18BP同種型的母液(3.2微克/毫升)，并在IL-18BPa ELISA試驗中測試。
圖9所示為給予LPS后心肌組織IL-18的含量。給小鼠注射大腸桿菌LPS(0.5毫克/千克，腹膜內(nèi)注射)。按X軸所標(biāo)時間將心臟勻漿。進行ELISA試驗以測定心肌IL-18的含量。(每組4-5個)。
圖10所示為抗IL-18抗體對LPS誘導(dǎo)的心功能不全的影響。給小鼠注射介質(zhì)(腹膜內(nèi)注射鹽水，n＝8)，或者注射大腸桿菌LPS(0.5毫克/千克，腹膜內(nèi)注射，n＝8)，通過離體灌流心臟在第6小時測定左室發(fā)展壓(LVDP)。在另一些實驗中，在給予LPS之前30分鐘用正常兔血清(n＝5)或者抗IL-18抗體(抗IL-18，n＝8)對小鼠進行預(yù)處理。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及給予IL-18抑制劑預(yù)防或治療膿毒癥并基于實施例中所述的研究結(jié)果。本發(fā)明得出，膿毒癥患者的血清中有效(游離)循環(huán)IL-18的水平比健康個體高，抑制IL-18可導(dǎo)致革蘭氏陽性菌表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ減少。
給予IL-18抑制劑與其他可能增強其效應(yīng)的細(xì)胞因子抑制劑可預(yù)防和治療膿毒癥。
本發(fā)明的膿毒癥包括SIRS、重度膿毒癥、膿毒癥休克、內(nèi)毒素性休克，可由革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌引起。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“IL-18抑制劑”，指能以減弱、降低或部分地、基本上或完全地防止或阻斷IL-18產(chǎn)生和/或作用的方式來調(diào)節(jié)IL-18的產(chǎn)生和/或作用的任何分子。
IL-18產(chǎn)生的抑制劑可以是任何一種對IL-18的合成、加工或成熟有負(fù)面影響的分子，例如ICE抑制劑。本發(fā)明考慮的抑制劑可以是，例如，白介素IL-18基因表達的抑制劑、降低或阻止IL-18mRNA轉(zhuǎn)錄的反義mRNA或?qū)е略搈RNA降解的核酶、損害正確折疊或部分或基本上阻止IL-18分泌的蛋白質(zhì)、能降解IL-18的蛋白酶等。
IL-18作用的抑制劑可以是IL-18拮抗劑，例如IL-18BP。拮抗劑可以以足夠親和力和特異性結(jié)合或隔離IL-18分子本身而部分或基本上中和負(fù)責(zé)IL-18與其配體結(jié)合的IL-18或IL-18結(jié)合位(例如，與其受體)。拮抗劑也可抑制在IL-18/受體結(jié)合后細(xì)胞中所激活的IL-18信號通道。
IL-18作用的抑制劑也可以是可溶性IL-18受體或仿真受體的分子，或阻斷IL-18受體或仿真受體的分子的物質(zhì)，或阻斷IL-18受體的物質(zhì)、IL-18抗體，如多克隆或單克隆抗體，或阻止IL-18與其靶結(jié)合，從而減弱或阻止由IL-18介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外反應(yīng)的觸發(fā)的其它物質(zhì)或分子。
本文所用的術(shù)語“IL-18結(jié)合蛋白”與“IL-18BP”同義。它包括WO 99/09063或Novick等人(1999)所限定的IL-18結(jié)合蛋白，包括Kim等人(2000)所限定的IL-18結(jié)合蛋白的剪接變體和/或同種型。具體地說，人IL-18BP同種型a和c可用在本發(fā)明中。本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)可以糖基化或非糖基化，它們可來自天然來源，如尿液，或者它們最好是重組產(chǎn)生。在原核生物如大腸桿菌表達系統(tǒng)，或真核生物優(yōu)選哺乳動物表達系統(tǒng)中進行重組表達。
本文所用的術(shù)語“突變蛋白”指IL-18BP的同類物，或病毒性IL-18BP的同類物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一個或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基所取代，或缺失，或IL-18BP、病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一個或多個氨基酸殘基，但所產(chǎn)生的產(chǎn)物的活性與野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比無顯著改變。這些突變蛋白由已知的合成和/或定點誘變技術(shù)，或任何適合的其它已知技術(shù)制備。
任何這樣一種突變蛋白最好具有IL-18BP充分復(fù)制、或病毒性IL-18BP充分復(fù)制的氨基酸序列，從而具有與IL-18BP基本上相似的活性。IL-18BP的一種活性是它能結(jié)合IL-18。只要該突變蛋白對IL-18具有很大的結(jié)合活性。它就可用于純化IL-18，如借助親和層析法，從而認(rèn)為其具有與IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常規(guī)實驗方法來確定任何一個給定突變蛋白是否具有與IL-18BP基本相同的活性，實驗方法包括對這樣一種突變蛋白進行簡單的夾心競爭試驗(simplesandwich competition assay)，以確定它是否能與被適當(dāng)標(biāo)記的IL-18結(jié)合，如放射免疫試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。
本發(fā)明可用的IL-18BP多肽突變蛋白或病毒性IL-18BP突變蛋白，或編碼它們的核酸，包括一組有限的基本上與取代肽或多核苷酸相應(yīng)的序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)本文所述的教導(dǎo)和指引用常規(guī)方法獲得，而無須進行過多實驗。
本發(fā)明突變蛋白中的優(yōu)選變化被稱為“保守性”取代。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸取代可包括一組內(nèi)同義氨基酸，其具有足夠相似的生理化學(xué)特性，該組原子之間的取代將保留該分子的生物功能(Grantham，1974)。
顯然，在上述序列中不改變其功能還可進行氨基酸的插入和缺失，特別是如果這種插入或缺失只涉及少數(shù)氨基酸時，如30個以下，最好為10個以下，而且不會移去或取代對功能性構(gòu)造起關(guān)鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失和/或插入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明范圍。
優(yōu)選同義氨基酸組是表1列出的那些組；更好的同義氨基酸組是表2列出的那些組；最好的同義氨基酸組是表3列出的那些組。
表1 優(yōu)選同義氨基酸組氨基酸 同義組Ser Ser，Thr，Gly，AsnArg Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，LeuPro Gly，Ala，Thr，ProThr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAla Gly，Thr，Pro，AlaVal Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly Ala，Thr，Pro，Ser，GlyIle Met，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePhe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCys Ser，Thr，CysHis Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsn Gln，Asp，Ser，AsnLys Glu，Gln，His，Arg，LysAsp Glu，Asn，AspGlu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMet Phe，Ile，Val，Leu，MetTrp Trp
表2更好的同義氨基酸組氨基酸 同義組Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp表3最好的同義氨基酸組氨基酸 同義組Ser SerArg ArgLeu Leu，Ile，MetPro ProThr ThrAla Ala
Val ValGly GlyIle Ile，Met，LeuPhe PheTyr TyrCys Cys，SerHis HisGln GlnAsn AsnLys LysAsp AspGlu GluMet Met，Ile，LeuTrp Met在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸取代的實施例可用來獲得本發(fā)明中所用的IL-18BP多肽或蛋白質(zhì)的突變蛋白，或病毒性IL-18BP的突變蛋白，其包括任何已知的方法步驟，如Mark等人的美國專利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691專利中提出的方法，以及美國專利4,904,584(Shaw等人)中提出的賴氨酸取代蛋白質(zhì)。
術(shù)語“融合蛋白”指一多肽包含IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突變蛋白或片段與另一蛋白質(zhì)，如在體液中停留時間延長的蛋白質(zhì)，融合。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可與另一蛋白質(zhì)、多肽等，如免疫球蛋白或其片段，融合。
本文使用的“功能性衍生物”，包括IL-18BP或病毒性IL-18BP衍生物及其突變蛋白和融合蛋白，它們可用本領(lǐng)域已知方法從殘基或N端或C端基團上以側(cè)鏈存在的功能性基團制備。只要它們?nèi)匀辉谒帉W(xué)上可接受，即它們沒有破壞與IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的蛋白質(zhì)活性，并且不會使含它的組合物具有毒性，均包括在本發(fā)明中。
這些衍生物例如可以包括聚乙二醇側(cè)鏈(與PEG結(jié)合)，其可遮蔽抗原位并延長IL-18BP或病毒性IL-18BP在體液中的停留時間。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠址肿?如烷?；蛱辑h(huán)芳?；?形成的N-酰基衍生物、或游離羥基(如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與酰基部分分子形成的O-?；苌铩?br> 本發(fā)明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突變蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括單獨蛋白分子多肽鏈的任何片段或前體，或蛋白分子與相關(guān)分子或與其相連的殘基，如糖或磷酸根殘基一起，或蛋白分子或糖殘基自身的聚集物，只要所述部分具有與IL-18BP基本上相似的活性。
可將IL-18BP的功能性衍生物與聚合物結(jié)合以改進該蛋白質(zhì)的性能，如穩(wěn)定性、半衰期、生物利用性、人體耐受性、或免疫原性。為達到此目的，可將IL-18BP與聚乙二醇(PEG)聯(lián)接。例如，按WO92/13095所述的已知方法進行聚乙二醇化。
因此，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，IL-18BP與聚乙二醇結(jié)合。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實施例中，IL-18抑制劑是融合蛋白，包含IL-18結(jié)合蛋白的全部或一部分，其與免疫球蛋白全部或一部分融合。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道本發(fā)明所產(chǎn)生的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，特別是結(jié)合IL-18的活性。這種融合可以是直接的，或通過一個短交聯(lián)肽相融合，長度短至1-3個氨基酸殘基或較長，如13個氨基酸殘基的長度。例如，所述交聯(lián)劑可以是序列E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽；或者是13個氨基酸的交聯(lián)劑序列的三肽，所述序列包括位于IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之間的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。所產(chǎn)生的融合蛋白具有改進的性能，如在體液的停留期(半衰期)延長，比活性提高，表達水平增加或有利于融合蛋白的純化。
IL-18BP融合于Ig分子的穩(wěn)定區(qū)。優(yōu)選融合于重鏈區(qū)，例如，人IgG1的CH2和CH3區(qū)。產(chǎn)生的特異性融合蛋白包括WO 99/09063的實施例11所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它同種型也適合用來產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白，例如，同種型IgG2或IgG4，或其它Ig類，如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異質(zhì)或同質(zhì)多聚體。
IL-18抑制劑可以是一種拮抗劑，例如是一種分子，其能與IL-18受體結(jié)合但不能觸發(fā)細(xì)胞因子與所述受體結(jié)合后所激活的信號通道(例如IL1-Ra，Dinarello，1996)。所有各組的拮抗劑都可單獨或與IL-18抑制劑結(jié)合用于治療膿毒癥。
IL-18抑制劑可以是抗IL-18特異性抗體?？笽L-18抗體可以是多克隆或單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或甚至完全人抗體。重組抗體及其片段的特征是在體內(nèi)能與IL-18高親和力結(jié)合，而且毒性低?？捎糜诒景l(fā)明的抗體應(yīng)具有的特征是對病人進行足夠時間的治療，它們能良好至優(yōu)異地減退或緩解病情或與病情相關(guān)的任何一種癥狀或一組癥狀，并且毒性低。
IL-18已顯示能延長由膿毒癥引起的心功能不全的病程。共同給予LPS與IL-18抑制劑如中和抗IL-18多克隆抗體可免于患上LPS誘導(dǎo)的心肌功能不全。
通過以IL-18免疫，易在兔、山羊或小鼠等動物中產(chǎn)生中和抗體。免疫小鼠特別適用于提供B細(xì)胞來源以制備雜交瘤細(xì)胞，進而培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量抗IL-18單克隆抗體。
嵌合抗體是具有來自不同動物物種的二個或多個節(jié)段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗體的可變區(qū)來自非人哺乳動物抗體，如小鼠單克隆抗體，而該免疫球蛋白的穩(wěn)定區(qū)來自人免疫球蛋白分子。這兩個區(qū)及其組合最好如常規(guī)方法測定那樣有低免疫原性(Elliott等人，1994)。人源化抗體是用基因工程技術(shù)構(gòu)建的免疫球蛋白分子，其中用人對比物置換小鼠穩(wěn)定區(qū)，而保留小鼠抗原結(jié)合區(qū)。所產(chǎn)生的小鼠-人嵌合抗體更好地降低了免疫原性，并改善了在人體中的藥物動力學(xué)(Knight等人，1993)。
因此，在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抗體是人源化IL-18抗體，例如，歐洲專利申請EP0974600敘述了人源化抗IL-18抗體的優(yōu)選例子。
在另一優(yōu)選實施例中，IL-18抗體是全人抗體。在WO 00/76310，WO 99/53049，US6,162,963或AU5336100中詳細(xì)敘述了產(chǎn)生人抗體的技術(shù)。全人抗體優(yōu)選是轉(zhuǎn)基因動物，例如包括全部或部分功能性人Ig基因座的異種小鼠中產(chǎn)生的重組抗體。
多肽抑制劑可在原核生物或真核生物重組系統(tǒng)中產(chǎn)生，或者可在為基因靶向(gene targeting)而設(shè)計的載體中編碼。
其他細(xì)胞因子抑制劑可與IL-18抑制劑一起用于治療膿毒癥。IL-18抑制劑可與IL-12抑制聯(lián)合使用。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“IL-12抑制劑”，指能以減弱、降低或部分地、基本上或完全地防止或阻斷IL-12產(chǎn)生和/或作用的方式來調(diào)節(jié)IL-12的產(chǎn)生和/或作用的任何分子。
IL-12產(chǎn)生的抑制劑可以是任何一種對IL-12合成例如干擾素α/β(Karp等人，2000)有負(fù)面影響的分子，或者對IL-12加工或成熟有負(fù)面影響的分子。本發(fā)明考慮的抑制劑可以是，例如，白介素IL-12基因表達的抑制劑、降低或阻止IL-12mRNA轉(zhuǎn)錄的反義mRNA或?qū)е略揑L-12mRNA降解的核酶、損害正確折疊或部分或基本上阻止IL-12分泌的蛋白質(zhì)、能降解IL-12的蛋白酶。
IL-12拮抗劑以幾種方式發(fā)揮其活性。拮抗劑能以足夠親和力和特異性結(jié)合或隔離IL-12分子本身，以致部分或基本上中和了IL-12表位或負(fù)責(zé)與IL-12受體結(jié)合的表位(下文稱為“遮蔽性拮抗劑”)。例如，一種遮蔽性拮抗劑可以是抗IL-12的抗體，它是IL-12受體的截短形式，包括受體或其功能性部分的胞外結(jié)構(gòu)域。一種拮抗劑也能抑制IL-12/受體結(jié)合后細(xì)胞中激活的IL-12信號通道(以下稱為“信號拮抗劑”)。所有各組拮抗劑可單獨或與IL-18抑制劑聯(lián)用治療膿毒癥。IL-12拮抗劑易于鑒定并通過常規(guī)方法篩選評價，即在體外敏感細(xì)胞系，如用佛波醇酯和IL-12能引起其增殖的小鼠脾細(xì)胞中用候選拮抗劑對天然IL-12活性的影響作評價。該試驗包括不同稀釋度，例如，試驗所用IL-12摩爾量的0.1倍到100倍，候選拮抗劑的IL-12制劑，對照組不用IL-12、或只用拮抗劑或佛波醇酯和IL-2(Tucci等人，1992)。
封蔽拮抗劑是本發(fā)明使用的優(yōu)選IL-12拮抗劑。在封蔽拮抗劑中，優(yōu)選使用中和IL-12活性的抗體。根據(jù)本發(fā)明，IL-18抑制劑與IL-12拮抗劑最好同時、先后或分開使用。抗IL-12是與IL-18抑制劑以及抗體衍生物、抗體的片段、區(qū)段和生物活性部分聯(lián)用的優(yōu)選IL-12拮抗劑。IL-18抑制劑可與IL-12抑制劑同時、先后或分開使用。
此外，IL-18抑制劑可與已知對膿毒癥休克起重要作用的其他細(xì)胞因子如IL-1、TNF、IL-8等的抑制劑聯(lián)用(Dinarello，1996和Okusawa等人，1998)。IL-1抑制劑的一個例子是IL-1受體拮抗劑，TNF抑制劑的一個例子是受體TNFR1和TNFR2的可溶性部分。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“細(xì)胞因子抑制劑”，指能以減弱、降低或部分地、基本上或完全地防止或阻斷所指細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或作用的方式來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生(例如對IL-1來說是ICE抑制劑)和/或作用的任何分子。
細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制劑可以是任何一種對所述細(xì)胞因子的合成、加工或成熟有負(fù)面影響的分子。本發(fā)明考慮的抑制劑可以是，例如，所述細(xì)胞因子基因表達的抑制劑、降低或阻止所述細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的反義mRNA或?qū)е耺RNA降解的核酶、損害正確折疊或部分或基本上阻止所述細(xì)胞因子分泌的蛋白質(zhì)、能降解所述細(xì)胞因子等的蛋白酶。
細(xì)胞因子拮抗劑以幾種方式發(fā)揮其活性。拮抗劑能以足夠親和力和特異性結(jié)合或隔離細(xì)胞因子分子本身，以致部分或基本上中和了細(xì)胞因子表位或負(fù)責(zé)與細(xì)胞因子受體結(jié)合的表位(下文稱為“遮蔽性拮抗劑”)。一種遮蔽性拮抗劑例如可以是抗細(xì)胞因子的抗體，它是細(xì)胞因子受體的截短形式(例如對TNF來說是可溶性受體TNFR I和TNFR II)，包括受體或其功能性部分的胞外結(jié)構(gòu)域。另一方面，細(xì)胞因子拮抗劑也能抑制細(xì)胞因子結(jié)合后由細(xì)胞表面受體激活的細(xì)胞因子信號通道(以下稱為“信號拮抗劑”)。抑制劑還可以是一種分子，其能與受體結(jié)合但不能觸發(fā)細(xì)胞因子與所述受體結(jié)合后所激活的信號通道(例如IL1-Ra，Dinarello，1996)。所有各組的拮抗劑都可單獨或與IL-18抑制劑結(jié)合用于治療膿毒癥。
IL-18抑制劑可與上述細(xì)胞因子抑制劑同時、先后或分開使用。
本發(fā)明還涉及包括IL-18抑制劑編碼序列的表達載體在制備預(yù)防和/或治療膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。所以，采用基因療法治療和/或預(yù)防該疾病。IL-18抑制劑的表達最好在原位置，以有效地直接阻斷該疾病感染的組織或細(xì)胞中的IL-18。
本發(fā)明還考慮在正常不表達IL-18抑制劑或表達抑制劑的量不充分的細(xì)胞中，使用能誘導(dǎo)和/或增強內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的載體。該載體可包括在所需表達IL-18抑制劑的細(xì)胞中起作用的調(diào)控序列。例如，這類調(diào)控序列可以是啟動子或增強子。然后，可通過同源重組將該調(diào)控序列導(dǎo)入基因組的正確基因座中，使調(diào)控序列與基因作可操作性相連，所需要的表達即被誘導(dǎo)或被增強。該技術(shù)通常稱為“內(nèi)源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所敘述。
本發(fā)明還包括給予經(jīng)基因改造能夠產(chǎn)生IL-18抑制劑的細(xì)胞治療或預(yù)防膿毒癥。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，也可用同一技術(shù)關(guān)閉IL-18的表達，即導(dǎo)入一個負(fù)調(diào)節(jié)元件如沉默元件到IL-18的基因座中，從而導(dǎo)致下調(diào)或防止IL-18的表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，IL-18表達的這種下調(diào)或沉默與使用IL-18抑制劑的效果相同，用于預(yù)防和/或治療疾病。
定義“藥學(xué)上可接受的”指包含不會干擾活性成分的生物活性效果，并對給予的宿主無毒性的任何載體。例如，為了在腸胃外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))，可將這些活性蛋白以注射用單位劑量形式配制在載體中，如鹽水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分可以以各種途徑給予個體。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(如緩釋制劑)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻內(nèi)等途徑。也可采用其它有效治療途徑給藥，例如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收或通過基因療法將編碼活性藥物的DNA分子給予病人(如通過載體)，導(dǎo)致該活性藥物在體內(nèi)表達和分泌。此外，可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)與生物活性藥物的其它組分，如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和介質(zhì)等，一起給予。
對于腸胃外(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))給藥，可將活性蛋白質(zhì)配制成溶液、懸浮液、乳液或與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體(如水、鹽水、葡萄糖液)以及能維持等滲性(如甘露糖醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖液)的添加劑一起制成凍干粉末。以常規(guī)技術(shù)給制劑滅菌。
本發(fā)明的活性蛋白質(zhì)也可用共軛方法增加分子在人體內(nèi)的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT專利申請WO 92/13095所述那樣，使分子與聚乙二醇結(jié)合。
活性蛋白的有效治療量是很多變量的函數(shù)，包括拮抗劑類型、拮抗劑對IL-18的親和力、拮抗劑顯示的殘留毒性、給藥途徑、病人的臨床狀態(tài)(包括維持內(nèi)源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)。
“有效治療量”是給藥時IL-18抑制劑抑制IL-18生物活性的量。給予個體單劑或多劑的劑量取決于各種因素，包括IL-18抑制劑的藥物動力學(xué)性能、給藥途徑、病人的病情和特征(性別、年齡、體重、健康狀況和身型大小)、癥狀輕重程度、并行治療、治療頻度和所要求的效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員都掌握了調(diào)整和操作已確定的劑量范圍以及在體內(nèi)外測定個體中IL-18被抑制的方法。
按照本發(fā)明，IL-18抑制劑可以以有效治療量先于、同時或依次與其它治療方案或藥物(如多種藥物方案)預(yù)防性或治療性地給予有需要的個體，特別是與IL-12抑制劑和/或IL-1抑制劑、干擾素和TNF拮抗劑結(jié)合?；钚运幬锟稍谙嗤虿煌慕M合物中與其它治療劑同時給予。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物的制備方法，所述的藥物組合物包括將有效量的IL-18抑制劑和/或IL-12拮抗劑和/或IL-1抑制劑、干擾素和/或TNF拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體混合。
現(xiàn)在對本發(fā)明進行敘述，結(jié)合下面實施例將會更容易理解本發(fā)明，但這些實施例只用于舉例說明，而對本發(fā)明沒有任何限制作用。
實施例實施例1 健康個體和膿毒癥患者的血清IL-18BPa和IL-18水平測量健康個體與患者的特異性循環(huán)細(xì)胞因子及其天然抑制劑可以獲得關(guān)于它們參與疾病的進展程度和病情的輕重程度等方面的信息。如背景技術(shù)部分所述，膿毒癥的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑是IFN-γ。因為IL-18是IFN-γ的共誘導(dǎo)劑，所以監(jiān)測膿毒癥患者的IL-18及其天然抑制劑、IL-18BP剪接變體a的水平，并用特異性ELISA試驗與健康受試者中發(fā)現(xiàn)的水平作比較(實施例3)。
健康受試者的IL-18和IL-18BPa水平用電化學(xué)發(fā)光法(ECL，Pomerantz等人，2001)測到107名健康受試者的平均IL-18水平是64±17皮克/毫升。用ECL法測試了相關(guān)蛋白質(zhì)的干擾程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成熟IL-1β或proIL-1β存在下它未受到任何影響，但pro-IL-18具交叉反應(yīng)性。故本項研究的人血清樣本中20％被檢測的成熟IL-18可能是pro-IL-18。濃度小于等于160納克/毫升的IL-18BPa不會影響用ECL法對IL-18進行的分析。
用ELISA試驗測試了107名健康個體血清中的IL-18BPa水平(實施例3)。IL-18BPa水平從0.5納克/毫升至最高7納克/毫升，平均水平為2.15±0.15納克/毫升(圖1)因為IL-18和IL-18BPa共存于血清中，一種復(fù)合物可以含有一些IL-18與IL-18BPa。基于總IL-18的平均水平計算游離IL-18的水平(2.15納克/毫升)。根據(jù)質(zhì)量作用定律測定游離IL-18。計算基于以下參數(shù)由ECL法測定的總IL-18濃度；由ELISA試驗測定的總IL-18BPa濃度；IL-18BPa和IL-18復(fù)合物的化學(xué)計量比1∶1以及解離常數(shù)(Kd)0.4nM(Novick等人，1999和Kim等人，2000)。下列公式適用平衡系統(tǒng)L+RLR，其中L表示IL-18，R表示IL-18BPKd＝[LR]/[Lfree][Rfree]Lfree＝Ltotal-LRRfree＝Rtotal-LR用數(shù)值Ltotal＝64±17皮克/毫升(平均水平)、Rtotal＝2.15±0.15納克/毫升(平均水平)和Kd＝0.4nM代入上面公式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康受試者中約51.2皮克/毫升(約占總數(shù)80％)IL-18是游離形式。
膿毒癥患者的IL-18和IL-18BPa水平從42例膿毒癥患者剛?cè)朐汉妥≡浩陂g取198個血清樣本，測試IL-18和IL-18BPa水平。膿毒癥患者的IL-18和IL-18BPa水平明顯較健康受試者高(圖2)，數(shù)值的分布范圍也較寬(圖2)。而且，這些患者入院那天的水平還更高，IL-18水平比健康個體高22倍(1.5±0.4納克/毫升對0.064±0.17納克/毫升)，IL-18BPa水平比健康個體高13倍(28.6±4.5納克/毫升對2.15±0.15納克/毫升，圖2A)。未發(fā)現(xiàn)血清中肌酸酐水平與IL-18或IL-18BPa的濃度的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義(以APACHEII score評估，Knaus等人，1993)，提示這些患者的IL-18和IL-18BPa水平并非由腎衰竭造成。
因為膿毒癥患者的血清IL-18和IL-18BPa水平變化很大(圖2B)，所以計算各個樣本的血清游離IL-18的水平。計算方法如前所述，用Kd、實驗所得的Ltotal和Rtotal值代入該三個公式。計算結(jié)果顯示IL-18BPa使大多數(shù)患者的游離IL-18水平降低(圖3)。值得注意的是，當(dāng)總IL-18水平很高時這種作用特別強烈。例如，有2名患者的血清IL-18高達0.5nM(10納克/毫升)，比健康個體高150倍。不過，考慮到與循環(huán)IL-18BPa(27納克/毫升和41.2納克/毫升)結(jié)合，這兩名患者的游離IL-18水平分別降低78％和84％(圖3)。所以，循環(huán)IL-18BPa阻斷了大部分血清IL-18。然而，根據(jù)這些計算，剩余的游離IL-18仍較健康個體高。因此，給予膿毒癥患者外源性IL-18BPa可使循環(huán)IL-18水平進一步下降，從而緩解了病情。
實施例2 IL-18BPa對健康受試者全血樣本所含細(xì)胞中表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的影響如背景技術(shù)部分所述，已知革蘭氏陽性菌表皮葡萄球菌能引起膿毒癥。這種疾病發(fā)病的主要原因是誘導(dǎo)諸如IL-1、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子。因為IL-18是IFN-γ的共誘導(dǎo)劑，故測試IL-18的抑制對表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的影響。IL-18BPa用作IL-18抑制劑，它是在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的一種帶組氨酸標(biāo)記的重組型式。
取0.5毫升血液與0.5毫升含表皮葡萄球菌(來自ATCC)與IL-18BP或僅含表皮葡萄球菌的RPMI生長培養(yǎng)液(Cellgro Mediatech，Hendon.VA，補充10mM L-谷氨酰胺、100U/毫升盤尼西林、100微克/毫升鏈霉素和10％FBS[Gibco BRL，GrandIsland，NY])在5毫升12×75毫米的圓底聚丙烯試管中混合。樣本在37℃(5％二氧化碳)培養(yǎng)48小時，再以終濃度為0.5％的triton X-100(Bio-Rad Labortories，Richmond，CA)處理用以溶解全血樣本中所含的細(xì)胞。多次倒轉(zhuǎn)裝有樣本的試管，直到這些血樣本變得澄清。按照Pomerantz等人(2001)所述的電化學(xué)發(fā)光法測定溶解后血樣本中IFN-γ的濃度，這一濃度表示細(xì)胞內(nèi)與分泌的細(xì)胞因子。
此項研究采用不吸煙健康志愿者的全血。靜脈穿刺抽取血液，保存于肝素化試管中。如Aiura等人(1993)所述，將表皮葡萄球菌在腦心浸液培養(yǎng)基中培育24小時，用不含鹽水的熱原洗滌，并煮沸。將熱殺死細(xì)菌的濃度調(diào)至每個白血細(xì)胞10個細(xì)菌。
圖4所示的結(jié)果表明IL-18BPa能夠抑制表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ。
因為公知IL-18和IL-12共刺激可誘導(dǎo)IFN-γ，故測試IL-18BPa和抗IL-12特異性抗體(抗人IL-12單克隆抗體11.5.14，Preprotech，Rocky Hill，NJ)組合對表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的影響。在125納克/毫升IL-18BPa(在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的帶組氨酸標(biāo)記的IL-18BPa，并經(jīng)過talon層析柱純化，如Novick等人所述，1999)和2.5微克/毫升抗人IL-12特異性抗體存在下測試這種誘導(dǎo)。圖5所示的結(jié)果提示抗IL-12特異性抗體加強了IL-18BPa對表皮葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的抑制效應(yīng)。
實施例3 IL-18BP特異性ELISA試驗的建立ELISA試驗比較了兩種抗IL-18BPa抗體小鼠單克隆抗體582.10，它是實施例4所述的單克隆抗體582的亞克隆，用作捕獲抗體，以及檢測用的兔多克隆抗體(實施例4)。將具有微滴定96孔的ELISA孔板(Maxisorb；Nunc A/S，Roskilde，Denmark)涂覆抗IL-18BPa單克隆抗體582.10(單克隆抗體582的亞克隆，在PBS中4微克/毫升)，在4℃下過夜?？装逵煤?.05％Tween 20的PBS(洗滌液)洗滌，用1∶10 BSA母液/水的稀釋液(KPL，Geithesburg，MD)阻斷(2小時，37℃)。用水將BSA母液稀釋至1∶15(稀釋劑)，用來稀釋所有測試樣本和檢測抗體。血清樣本用稀釋劑稀釋至少1∶5，向孔加入100微升等分試樣。以7個連續(xù)2倍稀釋的稀釋液(4至0.062納克/毫升)稀釋高度純化的人IL-18BPa(在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中制備，并用蛋白質(zhì)G純化的對IL-18BP具有特異性的單克隆抗體N 430免疫親和純化，見實施例4表1)，并加入到每塊ELISA孔板中，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線?？装逶?7℃下培養(yǎng)2小時，用洗滌液洗3次。加入兔抗IL-18BPa血清(稀釋至1∶5000，100微升/孔)，孔板在37℃下再培養(yǎng)多2小時。將孔板洗3次，加入山羊抗兔辣根過氧化物酶共軛物(HRP，Jackson ImmunoResearch Labs，用PBS稀釋至1∶10,000，100皮升/孔)，孔板在37℃下培養(yǎng)1小時。將這些孔板洗3次，加入鄰苯二胺過氧化物酶底物(鄰苯二胺二鹽酸化物小片，Sigma)在室溫下培育30分鐘。加入3N鹽酸(100微升)中止反應(yīng)。用ELISA讀數(shù)器測定492nm處的吸收度。以光密度(OD值)與IL-18BPa濃度的函數(shù)關(guān)系作曲線，發(fā)現(xiàn)線性度在0.12-2.00納克/毫升IL-18BPa之間(圖6)。
IL-18BPa的標(biāo)準(zhǔn)曲線在無血清或在高達20％人血清存在下是一樣的。因為IL-18BPa與IL-18以很高的親和力結(jié)合，所以有必要確定ELISA試驗是否能區(qū)分游離IL-18BPa與結(jié)合IL-18BPa。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-18會干擾IL-18的ELISA試驗，然而，這種干擾在血清樣本中并不明顯。90％膿毒癥患者的血清IL-18水平在4納克/毫升以下(見下文)。這些血清樣本所含的IL-18BPa較高，因而需要在測定IL-18BPa之前稀釋5至20倍。在這樣一些稀釋溶液中，IL-18對IL-18BPa ELISA試驗的干擾程度不到10％(圖7)。所用的其他相關(guān)細(xì)胞因子包括proIL-18相對IL-18BPa的摩爾量過量10倍，以及成熟IL-1β過量200倍就不會干擾ELISA試驗。
人IL-18BP數(shù)量最多的同種型是IL-18BPa，其他同種型b，c和d都是數(shù)量很少的剪接變體(Novick等人，1999和Kim等人，2000)。IL-18BPa對IL-18的親和力最高(Kim等人，2000)。IL-18BPc對IL-18的親和力低10倍，而同種型b和d不能結(jié)合或中和IL-18。所以，確定ELISA試驗中IL-18BPa與IL-18BP的其他同種型的交叉反應(yīng)性非常重要。如圖8所示，與人IL-18BPa比較并以重計，人IL-18BPc產(chǎn)生的信號減弱10倍，而人同種型b和d在ELISA試驗中產(chǎn)生的信號不明顯。
實施例4抗IL-18BP特異性抗體的產(chǎn)生給兔注射rIL-18BPa-His6，以產(chǎn)生多克隆抗體。
為了產(chǎn)生單克隆抗體，給雌性Balb/C小鼠注射5次10微克以組氨酸標(biāo)記的重組IL-18BPa(rIL-18BPa-His6)。通過逆放射免疫試驗(IRIA，實施例5)或者固相放射免疫試驗(sRIA，實施例5)測定小鼠的滴定度，選取顯示最高滴定度的小鼠，在融合前3和4天腹膜內(nèi)給予最后強化注射。準(zhǔn)備腎淋巴細(xì)胞，與NSO/1骨髓瘤細(xì)胞融合。以限度稀釋亞克隆能產(chǎn)生抗IL-18BPa抗體的雜交瘤細(xì)胞。用IRIA試驗(實施例5)分析所產(chǎn)生的克隆。表1列出有代表性的雜交瘤細(xì)胞。
表1 產(chǎn)生抗IL-18BPa的有代表性雜交瘤細(xì)胞


1涂覆山羊抗小鼠抗體的孔板，雜交瘤細(xì)胞用1251 IL-18BPa檢測2涂覆尿IL-18BP的孔板，雜交瘤細(xì)胞用125I山羊抗小鼠抗體檢測棄掉分泌抗組氨酸標(biāo)記抗體的雜交瘤細(xì)胞。用sRIA對抗體作進一步特性分析，以測定它們識別天然存在的IL-18BP(自尿中純化而來)的能力。表1列出的是一些陽性雜交瘤細(xì)胞的結(jié)合特性。雜交瘤細(xì)胞148、430、460和582對重組IL-18BP和尿IL-18BP均呈陽性。獲取適合蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、免疫親和純化以及適合建立特異性ELISA試驗的抗體。用姥鮫烷預(yù)引發(fā)Balb/C小鼠產(chǎn)生腹水，再向這些小鼠注射產(chǎn)生抗IL-18BP特異性抗體的陽性克隆。以抗小鼠IgG ELISA試驗(Amersham-Pharmacia Biotech)確定抗體的同種型。單克隆抗體582與重組和天然IL-18BP的反應(yīng)性最高(表1)，用它裝配IL-18BP特異性ELISA試驗(實施例3)。
在IL-18存在下通過sRIA試驗(實施例5)測試抗體識別IL-18BPa與IL-18復(fù)合物的能力。當(dāng)IL-18BP與IL-18組成復(fù)合物時，大多數(shù)抗體不能識別IL-18BP。所以，這些抗體似乎針對IL-18BPa的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
實施例5檢測產(chǎn)生細(xì)胞克隆的抗IL-18BP抗體的放射免疫試驗?zāi)娣派涿庖咴囼?IRIA)將PVC微滴定板(Dynatech Laboratories，Alexandria，VA)涂覆經(jīng)親和純化的山羊抗小鼠F(ab)2抗體(10微克/毫升，100微升/孔；Jackson ImmunoResearchLabs)，在4℃下過夜?？装逶儆煤?.05％Tween 20的PBS(洗滌液)洗2次，在37℃下用BSA(洗滌液中含0.5％BSA)阻斷2小時。加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(100微升/孔)，孔板在室溫下培育2小時。孔板洗3次，每個孔加入125I-rIL-18BPa-His6(100微升中105cpm)，孔板在22℃下培養(yǎng)5小時。再將孔板洗3次，用γ計數(shù)器計算各個孔。將結(jié)合放射反應(yīng)性比負(fù)對照高至少5倍、且產(chǎn)生上清液的雜交瘤細(xì)胞認(rèn)為呈陽性。
固相放射免疫試驗(sRIA)。
以rIL-18BPa(5微克/毫升)為捕獲抗原，用125I-山羊抗小鼠抗體(100微升，105cpm)作檢測。按以上所述程序進行阻斷和洗滌。通過sRIA試驗進一步篩選陽性克隆，以測定其識別由濃縮人尿分離而來的IL-18BP的能力(Novick等人，1999)。使微滴定板涂覆經(jīng)配體親和純化的尿IL-18BP(1微克/毫升)，按以上所述程序進行阻斷和洗滌。加入雜交瘤細(xì)胞上清液(100微升)，用125I-山羊抗小鼠抗體(100微升中105cpm)檢測。
對IL-18BP配體結(jié)合位具有特異性的抗體的sRIA試驗使微滴定板涂覆尿IL-18BP(0.5微克/毫升)或者重組IL-18BPa(5微克/毫升)，如sRIA那樣進行阻斷和洗滌程序。加入重組人IL-18(50微升)至終濃度1.5微克/毫升(室溫下15分鐘)，然后加入雜交瘤細(xì)胞上清液(50微升)，用125I-山羊抗小鼠抗體(100微升中105cpm，室溫下2小時)檢測。
實施例6給予LPS后心肌IL-18的含量膿毒癥期間的心功能不全涉及TNFα和IL-1β。因為IL-18是公知能介導(dǎo)TNFα和IL-1β的產(chǎn)生的一種促炎細(xì)胞因子，因此測試IL-18的濃度對LPS誘導(dǎo)的心功能不全的影響。
小鼠以介質(zhì)(鹽水)或LPS處理。給予LPS后2、4和6小時收獲心臟，均質(zhì)，通過ELISA試驗(購自R&D Systems(Minneapolis MN)的試劑盒)測定心肌IL-18的含量。圖9的結(jié)果顯示給予LPS后4小時心肌IL-18的含量增加2倍，這表示IL-18參與了膿毒癥期間的心功能不全。
實施例7 IL-18中和作用對LPS誘導(dǎo)的心肌功能不全的影響前一個實施例發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的心功能不全中IL-18的含量增加了。所以本實施例評估IL-18中和作用對LPS誘導(dǎo)的心功能不全的影響。
按Meng等人(1998)所述的等容nonrecirculating Langendorff技術(shù)確定心肌功能。用含11.0毫摩爾/升葡萄糖、1.2毫摩爾/升氯化鈣、4.7毫摩爾/升氯化鉀、25毫摩爾/升碳酸氫鈉、119毫摩爾/升氯化鈉、1.17毫摩爾/升硫酸鎂和1.18毫摩爾/升磷酸二氫鉀的常溫Krebs-Henseleit溶液灌流離體心臟。在與左心房相通的左心室插入乳膠球，充水達到10mmHg左室舒張末壓(LVEDP)。將測搏線(pacingwires)縛于右心房上，每分鐘測到心跳300拍。收集肺動脈的血液定量計算冠狀動脈血流。心肌溫度維持在37℃。用計算機化的壓力放大器數(shù)字轉(zhuǎn)換器(Maclab 8，AD Instrument Cupertino，CA)連續(xù)記錄左室發(fā)展壓(LVDP)、它的正負(fù)變化速率(+dp/dt，-dp/dt)和左室舒張末壓(LVEDP)。經(jīng)過20分鐘平衡期后，在不同LVEDP(10、15和20mmHg)水平下測定LVDP和+/-dp/dt。
給予LPS后，左室發(fā)展壓(LVDP)與鹽水對照組相比下降38％(36.3±1.9mmHg對59.1±m(xù)mHg，P＜0.001，圖10)。小鼠在給予LPS之前30分鐘用正常兔血清預(yù)處理，這樣對LPS誘導(dǎo)的心功能不全的影響最小，然而，以IL-18中和抗體預(yù)處理消除了心功能不全(圖10)。兩組之間的冠狀動脈血流并沒有不同(未示出)。
實驗結(jié)果顯示，IL-18中和作用免于患上LPS誘導(dǎo)的心功能不全。
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本處及說明書全文所引用的文獻均納入其整體內(nèi)容作為參考。
權(quán)利要求
1.一種IL-18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥及其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病選自重度膿毒癥和膿毒癥休克。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于用于治療和/或預(yù)防與膿毒癥相關(guān)的心功能不全。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，或其至少具有與IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)基本上相同活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑是IL-18結(jié)合蛋、或其同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)與聚二乙醇結(jié)合。
6.如權(quán)利要求3至5中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的融合蛋白包括一個免疫球蛋白(Ig)融合。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑是抗IL-18特異性抗體，選自嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。
8.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物還包括IL-12抑制劑，可同時、先后或分開給予。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-12抑制劑是中和抗體。
10.如權(quán)利要求1至9中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物還包括干擾素，可同時、先后或分開給予。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述的干擾素是干擾素-β。
12.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述的干擾素是干擾素-α。
13.如上述權(quán)利要求中任何一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物還包括細(xì)胞因子抑制劑，所述的細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1和IL-8，可同時、先后或分開給予。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于所述的TNF抑制劑是TNFR I或TNFRII的可溶性部分。
15.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-1抑制劑是IL-1受體拮抗劑。
16.一種包括IL-18抑制劑編碼序列的表達載體在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的IL-18抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，其至少具有與IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)基本上相同活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白或循環(huán)變換衍生物。
17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于用于基因療法。
18.一種能誘導(dǎo)和/或增強細(xì)胞中內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的載體在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
19.一種經(jīng)基因改造產(chǎn)生IL-18抑制劑的細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
20.一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述的方法包括給予有需要的受試者藥學(xué)上有效量的IL-18抑制劑。
21.如權(quán)利要求20所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述的抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)，其至少具有與IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)基本上相同活性的同種型、突變蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循環(huán)變換衍生物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述的方法還包括給予有效治療量的IL-12抑制劑。
23.如權(quán)利要求21和22中任何一項所述的方法，其特征在于所述的方法還包括給予細(xì)胞因子抑制劑，所述的細(xì)胞因子抑制劑選自由腫瘤壞死因子(TNF)抑制劑、IL-1抑制劑和IL-8抑制劑組成的組。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于所述的TNF抑制是TNFRI或TNFRII可溶性部分。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于所述的IL-1抑制劑是IL-1受體拮抗劑。
26.如權(quán)利要求20至25中任何一項所述的方法，其特征在于所述的方法還包括給予干擾素。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述的干擾素是干擾素-α。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述的干擾素是干擾素-β。
29.一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述的方法包括把藥學(xué)上有效量的編碼IL-18抑制劑序列的載體與藥學(xué)上可接受的載體給予有需要的受試者，所述的IL-18抑制劑選自caspase-1(ICE)抑制劑、抗IL-18抗體、抗任何一個IL-18受體亞基的抗體、IL-18信號通道抑制劑、能與IL-18競爭并阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑、IL-18產(chǎn)生的抑制劑以及IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)、其同種型、突變蛋白、融合蛋白或循環(huán)變換衍生物。
30.一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述的方法包括把藥學(xué)上有效量的能誘導(dǎo)和/或增強細(xì)胞中內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的載體與藥學(xué)上可接受的載體給予有需要的受試者。
31.一種膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述的方法包括把經(jīng)過基因改造產(chǎn)生IL-18抑制劑的細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的載體給予有需要的受試者。
32.如權(quán)利要求20至31中任何一項所述的方法，其特征在于所述的方法用于治療和/或預(yù)防與膿毒癥相關(guān)的心功能不全。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種IL－18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防膿毒癥和其他以全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)為特點的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述的疾病選自重度膿毒癥和膿毒癥休克，所述的藥物也用于與膿毒癥相關(guān)的心功能不全。
文檔編號A61P31/04GK1529611SQ02814060
公開日2004年9月15日 申請日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月16日
發(fā)明者C·A·迪納洛, C A 迪納洛, G·范土齊, 療, 金修鉉, 饒崢品, L·雷茲尼科夫, 鏊固, M·魯賓斯坦, 嘰牟嫉, D·諾維克, B·希瓦茨布德 申請人:耶達研究發(fā)展有限公司