取IOmL 80 %水合阱溶液逐滴加入反 應(yīng)瓶中，室溫?cái)埌?，然后加熱回流，此時(shí)反應(yīng)物全部溶解呈無(wú)色澄清溶液。TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程 (展開(kāi)劑為乙酸乙醋:石油酸=1:2)，直至原料點(diǎn)少，7-二氧乙酸乙醋異黃酬基本消失時(shí)，停 止加熱，繼續(xù)攬拌直至自然冷卻至室溫，然后減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑乙醇及未反應(yīng)完的水合阱， 此時(shí)阱不能完全蒸干除去，最后得到無(wú)色透明油狀物；向此油狀物中加入蒸饋水洗涂，立即 有大量白色固體生成，靜置過(guò)夜，W使其沉淀完全;然后真空抽濾，蒸饋水洗涂，干燥，得到 粗產(chǎn)品2.503g;將所得粗產(chǎn)品用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得到白色粉末狀固體2.2336g，產(chǎn)率為 80.2% 〇m.p. :132.2~133. rC; IR(邸r，u，cm-1):3452,3315,2927,1640,1626,1572,1365， 1240,920;iHMffi(DMS0,500Hz，S):8.09(2H，s，N-H)，7.68(lH，d，Ar-H)，7.54aH，s，-0CH =),7.31(2H,d,Ar-H),7.06(2H,d,Ar-H),6.78(2H,d,Ar-H),4.70(4H,s,-CH2-),2.0(4H, s，-NH2).Anal.Calcd for Cl訊isN4〇6(F.W. = 398.37)(%) :C，57.28;H，4.55;N, 14.06; 化 und(%):C，57.19;H，4.61;N，14.15。
[0047] 實(shí)施例2
[004引來(lái)自實(shí)施例1制備的少，7-二氧乙酷阱異黃酬對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(CCC-HPF-I)和 人肺腺癌細(xì)胞(A549)的增殖的影響實(shí)驗(yàn)。
[0049] (1)細(xì)胞復(fù)蘇
[0050] 實(shí)驗(yàn)操作前，將水浴鍋調(diào)至37°C，從液氮罐中取出凍存好的細(xì)胞系（CCC-HPF-I與 A549)放入水浴鍋l-2min，融化后移至超凈工作臺(tái)，采用酒精棉球擦拭凍存管口，采用移液 槍將細(xì)胞移至離屯、管，離屯、(4°C、1000巧m、5min)，棄上清液，加1血PBS將細(xì)胞吹散，離屯、(4 °C、1000巧m、5min)，棄上清液，加ImL完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10 %胎牛血清+1 %青霉素/ 鏈霉素)將細(xì)胞吹散移至培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中加2~5mL完全培養(yǎng)基(根據(jù)培養(yǎng)皿大小決定 體積），做好標(biāo)記放置37°C含二氧化碳培養(yǎng)箱(后簡(jiǎn)稱(chēng)培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)。
[0051] (2)細(xì)胞傳代
[0052] 當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞達(dá)到80%~90%時(shí)就要進(jìn)行細(xì)胞傳代，否則細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)因接觸抑 制而停止。具體為:將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后， 移至超凈工作臺(tái)，棄培養(yǎng)基，向其中加2mL 0.05 %膜蛋白酶(后簡(jiǎn)稱(chēng)膜酶），在37°C培養(yǎng)箱中 消化2min，棄膜酶后加入2mL完全培養(yǎng)基將消化后的細(xì)胞吹散分散成單個(gè)細(xì)胞，將分散好的 細(xì)胞分裝兩個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿再加入2~5mL完全培養(yǎng)基，做好標(biāo)記放置在37°C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。
[0053] (3)細(xì)胞接種
[0054] 細(xì)胞傳至第3代或第4代時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好，可用于接種。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞達(dá)到80% ~90% (處于對(duì)數(shù)期增長(zhǎng))時(shí)，用2mL 0.05%膜酶在37°C培養(yǎng)箱中消化2min，棄膜酶后加2mL 完全培養(yǎng)基將消化后的細(xì)胞吹散分散成單個(gè)細(xì)胞后再加2mL完全培養(yǎng)基成細(xì)胞懸液，然后 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，步驟如下：
[0055] 酒精棉擦拭計(jì)數(shù)板，取細(xì)胞懸液少許(約25化)滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央，將蓋玻片從 細(xì)胞計(jì)數(shù)板的邊緣緩緩蓋上，避免出現(xiàn)氣泡，在倒置顯微鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì) 算細(xì)胞濃度(公式如下）：
[0056] 細(xì)胞濃度(個(gè)/mU =計(jì)數(shù)區(qū)細(xì)胞個(gè)數(shù)巧*104
[0057] 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)得到細(xì)胞濃度將細(xì)胞進(jìn)行稀釋?zhuān)玫郊?xì)胞濃度為IO4個(gè)/mL的細(xì)胞懸 液。
[0058] 細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻。注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的 過(guò)程中要反復(fù)多次混勻，本實(shí)驗(yàn)每加6個(gè)孔(就混勻一次，W確保接種的細(xì)胞密度在各孔之 間完全相同），向96孔板每孔加入IOOuU邊緣孔用無(wú)菌PBS填充），空白不加。將接種好細(xì)胞 的96孔板放置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0059] (4)加藥
[0060] 當(dāng)細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板），加入濃度梯度的異黃酬衍生物(5 X l(T6mol/ L、l〇-5mol/L、2.5 X l〇-5mol/L、4.5 X l〇-5mol/L、6 X l〇-5mol/L、7 X l〇-5mol/L、8 X l〇-5mol/L、 9Xl(^5mol/L、l(^4mol/L，用無(wú)血清培養(yǎng)基配制），每孔加100uL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，空白 只加PBS。
[0061] 將加好樣品的96孔板放置在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察樣品的 作用效果。
[00創(chuàng) （5)細(xì)胞染色
[0063] 取出96孔板，棄培養(yǎng)基，包括空白，每孔加IOOuL PBS洗涂，棄PBS后每孔加入10化 MlT溶液(5mg/mL，即0.5 % MTT)，再向每孔加190uL無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0064] (6)終止培養(yǎng)，溶解結(jié)晶
[00化]MTT加入培養(yǎng)4h后，將上層清液去掉。每孔加入IOOuL DMSO(變?yōu)樽仙?，置?7°C 培養(yǎng)箱中20min，然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490nm處的OD值。
[0066] (7)細(xì)胞抑制率的計(jì)算按照下述公式進(jìn)行：
[0067] 根據(jù)OD值按照W下公式，計(jì)算細(xì)胞抑制率S= (1-實(shí)驗(yàn)組（OD)/對(duì)照組（OD)) X 100%。如表1和表2所示，表1與表2分別為異黃酬衍生物對(duì)A549細(xì)胞與CCC-HPF-I細(xì)胞的抑 制率與濃度關(guān)系的數(shù)據(jù)表。
[006引表1異黃酬衍生物對(duì)A549細(xì)胞抑制率與濃度關(guān)系數(shù)據(jù)表
[0070] 表2異黃酬衍生物對(duì)CCC-HPF-I細(xì)胞抑制率與濃度關(guān)系
[0072] 將上述表1與表2數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，得到如圖1所示的曲線圖，圖1中曲線為異黃酬 衍生物在不同濃度下對(duì)CCC-HPF-I細(xì)胞的抑制率曲線，?曲線為異黃酬衍生物在不同濃度 下對(duì)A549細(xì)胞的抑制率的曲線，由該圖可W看出，所合成的異黃酬化合物對(duì)人肺腺癌A549 細(xì)胞有選擇性，且細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與化合物有濃度依賴(lài)性，而在相同條件下，化合物對(duì)CCC-HPF-I細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎沒(méi)什么影響。
[0073] W上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì) 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 若干改進(jìn)和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0074] 對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的上述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對(duì)運(yùn)些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的 一般原理可W在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會(huì)被限制于本文所示的運(yùn)些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物在抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖上的應(yīng)用；2. -種具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物，3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的異黃酬衍生物，其特征在于，所述具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍 生物的制備方法包括W下步驟： 將具有式（n)結(jié)構(gòu)的大豆武元與漠乙酸乙醋在無(wú)水碳酸鐘的作用下反應(yīng)，得到具有式 (虹）結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物； 將所述具有式（m)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物與水合阱在溶劑中反應(yīng)，得到具有式（I)結(jié)構(gòu) 的異黃酬衍生物；4. 一種具有式（I)結(jié)構(gòu)的I異黃酬衍生物在制備抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖藥物上的應(yīng) 用，5. -種具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物在制備預(yù)防和/或治療肺腺癌藥物和/或保健品 上的應(yīng)用，6. -種制劑，其特征在于，包括具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物與藥學(xué)上可接受的輔 料，7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制劑，其特征在于，所述制劑的劑型為顆粒劑、片劑、膠囊劑或 丸劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種具有式(Ⅰ)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖上的應(yīng)用；本申請(qǐng)的異黃酮衍生物是一種異黃酮的酰胺類(lèi)衍生物，其對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖具有較好的抑制能力，可以作為具有抗肺癌細(xì)胞增殖的黃酮類(lèi)新藥的基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】A23L33/10, A61P35/00, A61K31/352, C07D311/36
【公開(kāi)號(hào)】CN105497009
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610051311
【發(fā)明人】延璽, 劉會(huì)青, 劉紅
【申請(qǐng)人】北京師范大學(xué), 北京師大科技園科技發(fā)展有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日