理的數(shù)種腫瘤細(xì)胞系的迀移。這些腫瘤細(xì)胞系的例子為鼠類細(xì)胞系4T1和人類 細(xì)胞系MDA-MB231。在細(xì)胞迀移測定法中，這些突變蛋白應(yīng)當(dāng)能夠顯著地（從統(tǒng)計學(xué)觀點(diǎn)來 看）抑制腫瘤細(xì)胞的迀移。
[0042]-這些TGF0的突變型變體喪失了或相當(dāng)大程度地降低了其分別在IL-2或IL-6 和IL-23存在下誘導(dǎo)CD4+幼稚T細(xì)胞向Treg foxp3+或TH17表型進(jìn)行分化的能力。該特 性可以在Treg和TH17細(xì)胞的體外誘導(dǎo)測定法中直接地來進(jìn)行評價。這些突變體應(yīng)當(dāng)具有 比天然TGF 0低至少100倍的誘導(dǎo)活性。
[0043]-這些TGF0的突變型變體具有抑制由其天然同源物誘導(dǎo)的⑶4+幼稚T細(xì)胞向 Treg foxp3+或TH17表型進(jìn)行分化的能力。該特性可以在Treg和TH17細(xì)胞的體外誘導(dǎo)測 定法中直接地來進(jìn)行評價。在50ng/mL-10 y g/mL的突變蛋白濃度的范圍內(nèi)，所述突變蛋白 應(yīng)當(dāng)展現(xiàn)出至少100倍地抑制由商業(yè)配體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的能力。
[0044] -這些TGF0的突變型變體具有體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。它們可以在可移植腫瘤模型中 在體內(nèi)抑制數(shù)種腫瘤品系的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移能力。該特性可以通過使用在BALB/c小鼠中 的乳腺細(xì)胞系4T1的正位原發(fā)性腫瘤模型和在免疫缺陷小鼠中的人腫瘤細(xì)胞系MDA-MB231 的正位原發(fā)性腫瘤模型來進(jìn)行評價。相比于用PBS進(jìn)行處理的對照組而言，這些突變蛋白 應(yīng)當(dāng)引起腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移數(shù)目的在統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低。
[0045]-這些TGF0的突變型變體具有在可移植腫瘤模型中在體內(nèi)增加天然的或由疫苗 接種誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力。該特性可以通過使用在BALB/c小鼠中的乳腺細(xì)胞系 4T1的正位原發(fā)性腫瘤模型和結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系CT26的皮下原發(fā)性腫瘤模型來進(jìn)行評價。這 些突變蛋白應(yīng)當(dāng)增加天然殺傷細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的溶細(xì)胞活性和細(xì)胞因子分泌。它們 應(yīng)當(dāng)增加樹突細(xì)胞和THl型CD4+T細(xì)胞的活性，并且應(yīng)當(dāng)顯著地減小調(diào)節(jié)T細(xì)胞和骨髓抑 制細(xì)胞的數(shù)目以及其促腫瘤活性。
[0046] 本發(fā)明包括所述TGF0的突變蛋白的額外修飾，其可以意味著產(chǎn)生缺乏LAP的 成熟結(jié)構(gòu)域，而不影響其分泌。這暗示，所述突變蛋白可以以其活性形式來獲得以用于與 T 0 RII的相互作用。這結(jié)果導(dǎo)致生產(chǎn)過程的簡單化。
[0047] 在另一個方面，本發(fā)明涉及所述TGF0的突變蛋白的額外修飾，其增加所述突變 蛋白的半壽期。在這些修飾之中，尤其包括任一種上面所描述的免疫調(diào)節(jié)多肽與載體蛋白 (其可以為白蛋白或人免疫球蛋白的Fc區(qū)）的融合、PEG化。
[0048] 在一個更特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與人IgGl的Fc片段相融合的TGF 0的 突變型變體（在表2中所提及的特定突變），其經(jīng)過選擇以顯示上面所提及的特性。被選擇 用于進(jìn)行偶聯(lián)的Fc區(qū)在結(jié)構(gòu)域C Y 2中具有一組突變（ala234、ala235)，其阻止與Fe Y受 體相互作用（除了新生兒Fc受體），由此使其誘導(dǎo)免疫效應(yīng)機(jī)制的能力沉默（Labrijn AF 等人，Curr Opin Immunol.，Aug, 20 (4) : 479-85, 2008, Epub 2008 年 7 月 9 日）。
[0049] 這些突變蛋白包括多個氨基酸置換，其顯著地降低了它們通過ALK5進(jìn)行信號傳 導(dǎo)的能力。然而，它們完整地保持了其與T 0 RII結(jié)合和與T 0 RIII結(jié)合的能力，從而取得 了天然TGF0的活性的抑制能力。
[0050] 表2 :構(gòu)建出的突變體，其中根據(jù)人TGF0的編號來提及突變。
[0051]

[0052] 在另一個方面，本發(fā)明還包括所述TGF0的突變蛋白的額外修飾，其要么用于增 加所述突變蛋白對于T0RII和T0RIII的親和力，但不影響或甚至改善其抑制特征，要么 用于通過增加壽命來改善所述突變蛋白的體內(nèi)藥效動力學(xué)。這些額外的突變可以通過用生 物信息學(xué)工具進(jìn)行合理設(shè)計，或者通過使用具有各種不同性質(zhì)的組合分子文庫（噬菌體文 庫，在酵母或細(xì)菌中的基因表達(dá)文庫）來獲得。
[0053] TGF0的類似多肽的治療應(yīng)用
[0054] 本發(fā)明還包括包含由本發(fā)明所公開的TGF0的突變蛋白和其類似物或融合蛋白 作為活性成分的藥物組合物，以及其可能的治療應(yīng)用，目的是在其中TGF0的功能降低了 保護(hù)性免疫應(yīng)答（要么是天然的，要么是由疫苗接種誘導(dǎo)的）或者誘導(dǎo)了過量的組織修復(fù) 和纖維化的疾病中，調(diào)節(jié)一些腫瘤的侵入和轉(zhuǎn)移能力以及一些免疫系統(tǒng)和結(jié)締組織細(xì)胞的 活性。
[0055] 關(guān)于其治療用途，應(yīng)當(dāng)向攜帶所述疾病的受試者施用本發(fā)明的多肽，獨(dú)立地或者 與其他多肽或有利于或增強(qiáng)其治療作用的其他物質(zhì)相組合地。施用途徑可以為在現(xiàn)有技術(shù) 中被描述用于腸胃外施用藥物的任何施用途徑?？梢詢?yōu)選地通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或腫瘤 內(nèi)途徑進(jìn)行施用。
[0056] 由本發(fā)明所描述的多肽或融合蛋白還可以通過成為在治療癌癥、伴有纖維化的疾 病和慢性感染性疾病中有用的藥物組合物的一部分來進(jìn)行施用。優(yōu)選地，本發(fā)明包括包含 藥學(xué)上可接受的載料的組合物，包括藥物組合物。
[0057] 所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體。在所述藥學(xué)上可接受的載體中包括但不限 于：鹽水、無菌水、磷酸鹽緩沖鹽水等。適合于給予患者的其他緩沖劑、分散劑和非毒性惰性 物質(zhì)可以包括在本發(fā)明的組合物中。所述組合物可以為適合于施用的溶液，并且通常是無 菌的且沒有不希望的顆粒。
[0058] 在一個方面，本發(fā)明還涉及治療方法，其包括向具有癌癥、伴有纖維化的疾病或慢 性感染性疾病的受試者施用治療有效量的在本發(fā)明中所描述的多肽、融合蛋白或組合物。 在一個特別的實(shí)施方案中，所述受試者為人。
[0059]由本發(fā)明所描述的多肽或融合蛋白還可以與傳統(tǒng)腫瘤學(xué)療法（化學(xué)療法和放射 療法）（作為其效應(yīng)的增強(qiáng)劑）相組合地進(jìn)行施用。
[0060] 為了獲得所希望的治療效果，本發(fā)明的多肽應(yīng)當(dāng)以對于確保其在淋巴結(jié)或?qū)λ?宄的疾病而言重要的外周位點(diǎn)處的濃度來說足夠高的劑量進(jìn)行施用，所述濃度在這樣的濃 度范圍內(nèi)，對于所述濃度范圍，所述突變蛋白顯示出抑制天然TGF0的效應(yīng)。因此，所考慮 的劑量應(yīng)當(dāng)進(jìn)行調(diào)整以適合于所研宄的疾病類型和施用途徑。例如，在腫瘤治療的情況下， 應(yīng)當(dāng)調(diào)整劑量以便達(dá)到確保其抑制效應(yīng)的所述突變體在腫瘤內(nèi)部和/或在局部區(qū)域淋巴 結(jié)中的濃度。待探察的劑量范圍可以為I. 25-20mg/Kg/周劑量或半月劑量。
[0061] 待應(yīng)用的施用次數(shù)也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行調(diào)整以適合于所考慮的突變蛋白的生物分布。通 常，應(yīng)當(dāng)達(dá)到使上面提及的有效濃度持續(xù)2個至30個連續(xù)天的時間。如果所述突變蛋白與 載體蛋白相偶聯(lián)，那么其施用頻率應(yīng)當(dāng)因此進(jìn)行調(diào)整。
[0062]當(dāng)將本發(fā)明的化合物或組合物與其他抗癌生成試劑相組合地進(jìn)行使用時，本發(fā)明 提供了例如同時的、分階段的或交替的治療。因此，本發(fā)明的化合物可以在分開的藥物組合 物中同時施用，并且其中本發(fā)明的化合物可以在其他抗癌生成試劑之前或之后施用，例如 相差數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天或數(shù)周。
[0063] 治療作用應(yīng)當(dāng)被理解為疾病癥狀的完全或部分緩解。在癌癥中，腫瘤體積的減小 或復(fù)發(fā)時間的增加尤其是疾病緩解的標(biāo)準(zhǔn)。
[0064] 相對于其他用于調(diào)節(jié)TGF0信號傳導(dǎo)的建議而言，該新的治療策略的優(yōu)點(diǎn)是多重 的。例如：
[0065] ?所述TGF0的突變體是實(shí)際上自身的蛋白質(zhì)（除了很少的突變外）并因此具有 低的免疫原性。該因素使得針對其的抗體應(yīng)答的風(fēng)險降低至最小。
[0066] ?對于受體系統(tǒng)的高度特異性降低了不希望的毒性（這是在基于小尺寸的抑制劑 的策略中所共同的）。
[0067] ?這些TGF0的突變型變體保持了至少天然TGFM和TGF0 3的親和力（6-10pM) 這樣的級別的與受體Te RII的結(jié)合親和力。該親和力是用受體或配體抑制策略、單克隆抗 體或其他藥物難以超過的。
[0068] ?這些TGF 0的突變型變體具有比單克隆抗體和與Fc相偶聯(lián)的受體更小的尺寸。 這在腫瘤學(xué)疾病的治療情形下確保了比上面所描述的抑制TGF0信號傳導(dǎo)的藥物更大的 對腫瘤的滲透性。
[0069] ?這些16?0的突變型變體抑制通過受體系統(tǒng)!'01?11/1'|3 1?1仏〇(5)進(jìn)行信號傳導(dǎo) 的任何配體的信號傳導(dǎo)，這是超過泛配體抗體（pan-ligand antibody)的理論優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@ 些突變型變體僅針對已知的TGF0同種型，如果存在其他同種型，這些抗體可以不抑制它 們。
[0070] ?這些TGF0的突變型變體保留了與受體Tf3 RIII相互作用的能力。這構(gòu)成了超 過抗受體Tf3 RII的抗體的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗鐾蛔兊鞍鬃钄嗔颂烊慌潴w與細(xì)胞表面的所有可 能的結(jié)合位點(diǎn)。
[0071] ?與Fc片段相連接增加了所述突變蛋白的半壽期，這賦予其相對于小尺寸的藥物 而言的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閯┝亢推漕l率將會更少。這降低了不希望的毒性。
[0072] ?與不與Fe Y受體（除了新生兒Fc受體）相互作用的人IgGl的Fc片段相連接 避免了引發(fā)對于非腫瘤宿主細(xì)胞的免疫效應(yīng)機(jī)制，從而相比于抗受體II的抗體（其完整地 保持了其與Fcy受體相互作用的能力）而言降低了不希望的毒性潛力。
[0073] 將用下列實(shí)施例