(4) :140-52, 2011)。在 現(xiàn)有技術(shù)中，可以找到下列抑制策略：
[0010] 1-配體的中和，其中使用其受體的細胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性形式（US 2002/0004037 和 US 2007/0244042)、抗-TGF 0 抗體（US 2002/076858、US 2005/0276802)或阻斷所述細 胞因子的基因的翻譯的寡核苷酸（US 2004/0006036和US 2007/0155685);
[0011] 2-信號傳導的阻斷，其中使用與T0RI/ALK5的激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的小分子（US 2006/0057145、US 2005/0136043、US 2006/0234911);
[0012] 3-受體II的阻斷，其中采用識別其細胞外結(jié)構(gòu)域的抗體（US 2010/0119516、US 2009/7579186)〇
[0013] 迄今為止還沒有報道過使用配體TGF0的突變蛋白作為信號傳導的拮抗劑的抑 制策略。
[0014] 發(fā)明簡述
[0015] 本發(fā)明基于這樣的科學發(fā)現(xiàn)：TGFMTGFM、TGF0 2和TGF0 3)家族的突變型變 體可以抑制其天然同源物的功能。發(fā)明人首次在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，TGF0的突變型變體可 以相當大程度地抑制由天然變體誘導的信號傳導并由此中和其生物學效應。該發(fā)現(xiàn)為在其 中配體TGF 0具有有害活性的疾病例如癌癥、纖維化或慢性感染中調(diào)節(jié)TGF 0信號傳導的 新策略奠定了基礎。
[0016] 本發(fā)明涉及這樣的多肽，其與人TGF0共享一級序列，除了一些氨基酸被突變，以 消除或相當大程度地降低其通過I型受體ALK5進行信號傳導的能力。這些TGF0的突變 型變體保持了其以高親和力與受體T 0 RII和T 0 RIII結(jié)合的能力，但不能夠進行信號傳 導，因為其不與I型受體ALK5相互作用，從而通過經(jīng)由與高親和力受體Tf3 RII和Tf3 RIII 的結(jié)合而與天然變體競爭來負地調(diào)節(jié)天然變體的信號傳導。本發(fā)明還包括這些突變型變體 (單獨地或者與疫苗或其他治療形式相組合地）用于治療其中TGF0經(jīng)證明是重要的疾病 例如癌癥、纖維化或慢性感染的治療應用。
[0017] 本發(fā)明的新穎性在于提供了一種新的治療策略，以在其中TGF0的功能降低了保 護性免疫應答（要么是天然的，要么是由疫苗接種誘導的）或者誘導了過量的組織修復和 纖維化的疾病中，調(diào)節(jié)TGF0信號傳導并因此調(diào)節(jié)一些腫瘤的侵入和轉(zhuǎn)移能力以及一些免 疫系統(tǒng)和結(jié)締組織細胞的活性。上面所提及的抑制策略中沒有一個使用配體TGF0的突 變蛋白作為信號傳導的拮抗劑。本發(fā)明的TGF0的突變體是實際上自身的蛋白質(zhì)并因此 具有低的免疫原性，這使得針對其的抗體應答的風險降低至最小。對于受體系統(tǒng)的高度特 異性降低了不希望的毒性（這是在基于小尺寸的抑制劑的策略中所共同的）。這些TGF0 的突變型變體保持了至少天然TGFM和TGF0 3的親和力（6-10pM)這樣的級別的與受體 T 0 RII的結(jié)合親和力。該親和力是用受體或配體抑制策略、單克隆抗體或其他藥物難以超 過的。令人驚訝地，本發(fā)明的作者發(fā)現(xiàn)，這些TGF0的突變型變體保留了與受體T0RIII和 T 0 RII相互作用的能力，這構(gòu)成了超過抗受體T 0 RII的抗體的優(yōu)點，因為所述突變蛋白阻 斷了天然配體與細胞表面的所有可能的結(jié)合位點。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 本發(fā)明涉及多肽，其拮抗由受體ALK5介導的天然配體TGF e的活性，并且具有大 于90%的相對于天然配體TGF0的氨基酸序列而言的同源性。本發(fā)明的多肽在其一級氨 基酸序列中具有至少一個在選自下列的殘基之一處的突變 ：￥6、130、132、151、151、067和 LlOl。在本發(fā)明的一個特別的實施方案中，原始氨基酸殘基突變?yōu)檫x自下列的氨基酸殘基 之一：
[0020] 對于位置6 :A ;
[0021] 對于位置 30 :N、R、K、D、Q、L、S、P、V、I、G、C、T、A、E ;
[0022] 對于位置32 :A ;
[0023] 對于位置 51 :Q、W、Y、A ;
[0024] 對于位置 67 :H、F、Y、W ;和
[0025] 對于位置 101:A、E。
[0026] 本發(fā)明的另一個目標為多肽，其中在與受體TGF 0 RII和/或TGF 0 RIII的相互作 用界面處添加突變，以增加其與所述受體的親和力。
[0027] 此外，本發(fā)明還涉及用于治療癌癥、伴有纖維化的疾病和慢性感染性疾病的藥物 組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含有在本發(fā)明中所描述的多肽或多肽混合物和用 于其應用的藥學上合適的載料。所述多肽可以共價地連接至載體蛋白，并且該蛋白可以為 白蛋白或人免疫球蛋白的Fc區(qū)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽可以被PEG化。
[0028] 最后，本發(fā)明涉及所描述的多肽在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物在 治療癌癥、伴有纖維化的疾病和慢性感染性疾病中有用，以及對于代替天然TGF0來增強 對疫苗的細胞和/或體液應答來說有用，尤其是當待增強的疫苗為用于癌癥的治療性疫苗 時。
[0029] TGF 0的類似多肽的獲得
[0030] 本發(fā)明涉及大小為112個氨基酸的多肽。這些多肽保持高的與各種不同的天然 TGF 0分子的序列同一性，大于90%的同一性。在其序列的一個區(qū)域中包括1至6個突變， 相對于天然TGF0而言。選擇置換原始殘基的殘基，以便具有與原始氨基酸非常不同的物 理化學特性，非極性殘基置換成極性殘基、帶電荷電的殘基置換成不帶電荷的殘基、大殘基 置換成小殘基、酸性殘基置換成堿性殘基的改變。
[0031] 從在與其受體T 0 RII和ALK5的復合物中的天然TGF 0 I、TGF 0 2和TGF 0 3的三維 結(jié)構(gòu)（存放在數(shù)據(jù)庫TOB中）開始來設計這些多肽（也可以稱為TGF0的突變蛋白）。僅 在這樣的TGF0的位置處引入突變，所述位置相應于明顯暴露于溶劑的氨基酸并且構(gòu)成與 受體ALK5(但不是T 0RII)的結(jié)合區(qū)域的一部分。通過使用公有領(lǐng)域的生物信息學程序， 這些殘基被預測為在與ALK5的相互作用中是重要的。下表顯示了被預測為在相互作用中 重要的與ALK5的結(jié)合界面的殘基和影響結(jié)合的可能突變。用這些結(jié)果制作了理論突變蛋 白的數(shù)據(jù)庫并且選擇了具有最高體外拮抗劑效力的突變蛋白。
[0032] 表1 :對于與T 0 RI/ALK5的相互作用來說重要的TGF 0序列的氨基酸和根據(jù)理論 預測將會使結(jié)合不穩(wěn)定的突變。
[0033]
[0034] 本發(fā)明的多肽可以通過各種不同的途徑來獲得，尤其是通過蛋白質(zhì)的化學合成。 還可以通過基因工程技術(shù)來獲得，例如在細菌例如大腸桿菌（E. coli)中作為內(nèi)含體或者 在哺乳動物細胞例如CHO和HEK293中表達它們，其中使用在現(xiàn)有技術(shù)中所積攢的任何轉(zhuǎn)染 方案。還可以通過借助于聚合酶鏈式反應的定向誘變技術(shù)來獲得在特定位置處的點突變。
[0035] 通過其生物學活性來選擇天然TGF 0的類似多肽
[0036] 從體外和體內(nèi)實驗開始來選擇本發(fā)明的多肽，以同時具有下列特性：
[0037]-這些TGF0的突變型變體（在本發(fā)明中也稱為突變蛋白）保持了其與受體 T0RII結(jié)合的能力。該結(jié)合能力可以通過商購可得的針對受體T0RII的鏈的ELISA測定 法直接地來進行評價，或者在對于該受體來說陽性的細胞群上間接地來進行評價。對于受 體T0RII的識別水平應當與天然TGF0相當。
[0038] -這些突變蛋白應當阻斷配體TGF 0 (TGF0 1、TGF 0 2、TGF 0 3)與受體T 0 RII的 結(jié)合。這可以通過競爭性ELISA直接地來進行測量，其中用配體TGF0中的每一種（商購 可得的）包被平板并評價所述突變蛋白抑制T 0 RII與所述配體結(jié)合的能力。
[0039]-這些TGF 0的突變型變體喪失了或相當大程度地降低了其通過受體T 0 RI進行 信號傳導的能力。該特性可以在通過Western的免疫檢測測定法中直接地進行評價，其中 定量在用所述突變蛋白或用天然TGF0進行處理的鼠類譜系腫瘤細胞4T1和人類譜系腫瘤 細胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。這些突變蛋白應當誘導比 天然TGF 0小至少100倍的Smad2和Smad3的磷酸化。所提及的特性還可以在體外在對于 細胞系CTLL-2的由IL-2誘導的增殖的抑制測定法中來進行評價。這些突變體應當具有比 天然TGF 0低至少100倍的抑制活性。
[0040] -這些TGF 0的突變型變體具有抑制由配體TGF 0中的每一種（TGF0 1、TGF 0 2、 TGF0 3)誘導的信號傳導的能力。該特性可以在通過Western的免疫檢測測定法中直接地 進行評價，其中定量在用所述突變蛋白或用天然TGF0進行處理的鼠類譜系腫瘤細胞4T1 和人類譜系腫瘤細胞MDA-MB231的裂解液中的磷酸化的Smad2和Smad3的水平。在50ng/ mL-10yg/mL的突變蛋白濃度的范圍內(nèi)，所述突變蛋白應當展現(xiàn)出至少100倍地抑制由商 業(yè)配體誘導的信號傳導的能力。
[0041] -這些TGF0的突變型變體具有體外抗腫瘤效應。它們可以抑制用天然配體進行 處理或未處