纖維化的柚皮素和積雪草酸組合治療的制作方法
【專利說明】纖維化的柚皮素和積雪草酸組合治療
[0001]相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求2012年10月26日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/719，107號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)的內(nèi)容為了所有目的通過引用整體并入。
[0003]發(fā)明背景
[0004]纖維化為涉及在通常響應(yīng)于損傷、疾病或其它外部刺激的器官中或解剖位置處纖維結(jié)締組織過量形成的過程。此類過量的纖維組織傾向于破壞或甚至替換原始組織正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致正常組織或器官嚴(yán)重削弱或完全喪失生理功能。因?yàn)槔w維化可在幾乎所有器官中發(fā)生并且可顯著地影響個(gè)體健康或甚至由于器官衰竭而引起死亡，所以在持續(xù)的醫(yī)學(xué)研宄中已經(jīng)進(jìn)行了許多努力致力于治療或預(yù)防纖維化。
[0005]由于人體健康中纖維化的醫(yī)學(xué)普遍性和重要性，仍急切需要開發(fā)新的且有效的用于治療和預(yù)防纖維化的方法。本發(fā)明滿足了該點(diǎn)和其它相關(guān)需求。
[0006]發(fā)明概述
[0007]柚皮素和積雪草酸已經(jīng)單獨(dú)地被認(rèn)為參與和組織纖維化的形成相關(guān)的不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本發(fā)明人做出了令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柚皮素和積雪草酸一起施用時(shí)，在抑制纖維化中實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。雖然柚皮素和積雪草酸的每一種在調(diào)節(jié)纖維化-相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)中的作用為先前已知的，但是兩種化合物組合使用的此類協(xié)同效應(yīng)直到現(xiàn)在才被認(rèn)識(shí)到。因此，本發(fā)明提供有效治療和預(yù)防纖維化的新型方法和組合物。
[0008]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供抑制組織纖維化的新的方法。所述方法包括使組織與有效量的柚皮素和積雪草酸接觸的步驟。組織可以為器官，諸如肝、腎或肺的一部分。在一些實(shí)施方案中，接觸步驟包括皮下施用、肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用或口服施用。在一些實(shí)施方案中，有效量為約5mg/kg體重至250mg/kg體重的柚皮素和lmg/kg體重至50mg/kg體重的積雪草酸。在一些實(shí)施方案中，柚皮素和積雪草酸以約10:1的重量比施用。在一些實(shí)施方案中，柚皮素和積雪草酸以單一組合物施用。在其它實(shí)施方案中，柚皮素和積雪草酸以兩種單獨(dú)的組合物施用。柚皮素和積雪草酸以任何適當(dāng)?shù)男问绞┯?，包括但不限于溶液、粉劑、片劑或膠囊。
[0009]在另一方面，本發(fā)明提供新的組合物，所述組合物包含(I)有效量的柚皮素和積雪草酸以及(2)藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，柚皮素和積雪草酸以約10:1的重量比存在。在一些實(shí)施方案中，配制所述組合物用于皮下施用、肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)或口服施用。例如，組合物可以呈溶液、粉劑、片劑或膠囊的形式。
[0010]在另一方面，本發(fā)明提供用于抑制纖維化的試劑盒。試劑盒含有至少兩個(gè)容器:第一容器含有第一組合物，其包含柚皮素；第二容器含有第二組合物，其包含積雪草酸。在一些實(shí)施方案中，配制第一組合物用于皮下施用、肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用或口服施用。在一些實(shí)施方案中，配制第二組合物用于皮下施用、肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用或口服施用。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于施用第一組合物和第二組合物的說明書。
[0011]在上述方面的任一者中，柚皮素和積雪草酸的協(xié)同療效通過用積雪草酸的兩種已知類似物---羥基積雪草酸和積雪草苷替代積雪草酸與柚皮素組合使用來實(shí)現(xiàn)。
[0012]附圖簡(jiǎn)述
[0013]圖1.積雪草酸和柚皮素的組合進(jìn)一步減弱UUO-誘導(dǎo)的腎膠原蛋白I沉積。A.免疫組織化學(xué)結(jié)果表明單獨(dú)的積雪草酸或柚皮素治療減少梗阻性腎中的膠原蛋白I沉積，積雪草酸和柚皮素的組合進(jìn)一步抑制蛋白質(zhì)水平的UUO-誘導(dǎo)的膠原蛋白產(chǎn)生。B.實(shí)時(shí)PCR結(jié)果確認(rèn)積雪草酸和柚皮素的組合很大程度上下調(diào)梗阻性腎病中的mRNA水平的膠原蛋白I合成。數(shù)據(jù)表示6-8只小鼠的平均值土SEM。對(duì)比假手術(shù)組，*#P〈0.001 ;對(duì)比UU0+DMS0組，#P<0.05，###P<0.0Olo AA:積雪草酸治療；Nar:柚皮素治療；CB:組合治療。
[0014]圖2.積雪草酸和柚皮素的組合進(jìn)一步降低UUO-誘導(dǎo)的a -SMA+肌成纖維細(xì)胞滲入。Α.免疫組織化學(xué)結(jié)果表明單獨(dú)的積雪草酸或柚皮素治療降低梗阻性腎中的a-SMA+肌成纖維細(xì)胞滲入，積雪草酸和柚皮素的組合進(jìn)一步減少滲透的α -SM+肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目；Β.實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示積雪草酸和柚皮素的組合大體上下調(diào)梗阻性腎病中的mRNA水平的α-SMA。數(shù)據(jù)表示6-8只小鼠的平均值土SEM。對(duì)比假手術(shù)組，#*P〈0.001;對(duì)比UU0+DMS0組，#P<0.05，###P<0.001。Μ:積雪草酸治療；Nar:柚皮素治療；CB:組合治療。
[0015]圖3.積雪草酸和柚皮素的組合降低梗阻性腎中的Smad3信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)增加Smad7水平。A.蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果表明積雪草酸和柚皮素的組合進(jìn)一步降低UUO-誘導(dǎo)的Smad3磷酸化同時(shí)拮抗蛋白質(zhì)水平的UUO-誘導(dǎo)的Smad7降解；B.實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示積雪草酸和柚皮素的組合下調(diào)梗阻性腎病中的mRNA水平的Smad3同時(shí)誘導(dǎo)Smad7合成。數(shù)據(jù)表示6-8只小鼠的平均值土SEM。對(duì)比假手術(shù)組，*P〈0.05, #P〈0.01 ;對(duì)比UU0+DMS0組，##P<0.01o AA:積雪草酸治療；Nar:柚皮素治療；CB:組合治療。
[0016]圖4.積雪草酸和柚皮素的組合進(jìn)一步降低體外肝星狀細(xì)胞和腎管狀上皮細(xì)胞中TGF-β 1-誘導(dǎo)的纖維化響應(yīng)。Α.積雪草酸和柚皮素的組合進(jìn)一步下調(diào)肝星狀細(xì)胞中響應(yīng)于TGF-β I的Col.1和a -SMA mRNA水平蛋白質(zhì)印跡分析和半定量數(shù)據(jù)顯示積雪草酸和柚皮素的組合阻斷腎管狀上皮細(xì)胞中TGF-β 1-誘導(dǎo)的Col.1產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示3-4個(gè)體外獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土SEM。僅對(duì)比DMSO組，*P〈0.05，#P〈0.01，*#P〈0.001 ;對(duì)比TGF-β I+DMSO 組，#Ρ<0.05，##Ρ<0.01，###Ρ<0.001。AA:積雪草酸治療；Nar:柚皮素治療；CB:組合治療。
[0017]定義
[0018]本文使用的術(shù)語(yǔ)“抑制(inhibiting) ”或“抑制(inhibit1n) ”是指對(duì)革E標(biāo)生物過程或病理過程，諸如纖維化的開始或進(jìn)展的任何可檢測(cè)的不利作用或抑制作用。通常，當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)，抑制體現(xiàn)在靶標(biāo)過程特有的特征(如纖維結(jié)締組織的存在或新形成)減少至少 10%、20%、30%、40%或 50%。
[0019]術(shù)語(yǔ)“纖維化”描述在修復(fù)過程或反應(yīng)過程中過量的纖維結(jié)締組織在器官或組織中形成。纖維化不同于作為器官或組織的正常組分的纖維組織的形成。疤痕形成為消滅潛在的器官或組織的結(jié)構(gòu)的融合性纖維化。纖維化可在幾乎所有器官和組織類型中發(fā)生。纖維化的實(shí)例包括:肺纖維化(肺)；肝硬化(肝)；心內(nèi)膜纖維化(心臟)；縱隔纖維化(縱隔的軟組織)；骨髓纖維化(骨髓)；腹膜纖維化(腹膜的軟組織)；進(jìn)行性大塊纖維化(肺)；腎源性系統(tǒng)性纖維化(腎)；克羅恩病(腸)；瘢痕疙瘩(皮膚)；陳舊性心肌梗塞(心臟)；和硬皮病/系統(tǒng)性硬化癥(皮膚，肺)。
[0020]本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指施用物質(zhì)而產(chǎn)生療效的物質(zhì)的量。效果包括預(yù)防、校正或抑制疾病或病患癥狀的進(jìn)展和相關(guān)并發(fā)癥進(jìn)展至任何可檢測(cè)的程度。在兩種或更多種物質(zhì)用于期望效果的情況下，“有效量”可以以多于一種方式表示。例如，“有效量”可以以所有活性成分的總量表示，或以每種活性成分的單獨(dú)的量表示，或以一種成分與另一種成分的比(如，重量比或體積比)表示?！坝行Я俊钡木_量將取決于治療目的以及活性物質(zhì)的形式和身份，并且將由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的技術(shù)確定(參見，如，Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(第 1-3卷，1992) ；Lloyd, The Art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)； 以及 Pickar,DosageCalculat1ns(1999))。
[0021]“柚皮素”為系統(tǒng)(IUPAC)名稱為5，7- 二羥基_2_(4_羥基苯基)色滿_4_酮和異名為4’，5，7-三羥基黃烷酮(CAS編號(hào)480-41-1)的黃烷酮。其化學(xué)式為(:15氏205并且分子量為272.257。實(shí)際上，柚皮素最豐富地存在于葡萄柚、橙子和西紅柿外皮中。高純度的柚皮素可購(gòu)自多個(gè)商業(yè)供應(yīng)商。
[0022]“積雪草酸”為來源于植物積雪草(Centella asiatica)，通常被稱為雷公根(GotuKola)的古老的、常規(guī)的中藥提取物。其還被稱為達(dá)瑪醇酸(CAS編號(hào)464-92-6)。其化學(xué)式(Hill Notat1n)為C3tlH48O5，并且分子量為488.70。積雪草酸與其類似物---羥基積雪草酸和積雪草苷共有許多相似性。其可通過商業(yè)供應(yīng)商諸如Sigma-Aldrich獲得。
[0023]本文使用的術(shù)語(yǔ)“施用”涵蓋將物質(zhì)，如具有治療效果或預(yù)防效果的藥劑遞送至受試者的任何方式，所述方式可以包括但不限于全身應(yīng)用、區(qū)域應(yīng)用和局部應(yīng)用?！笆┯谩钡膶?shí)例為注射(諸如通過皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)方式)、口服攝取、通過鼻腔或通過眼睛或耳朵攝入、吸入、透皮遞送以及肛門或陰道沉積等。
[0024]術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的賦形劑”和“生理上可接受的賦形劑”可以互換使用，是指包含在含有實(shí)現(xiàn)某些特性的活性成分的組合物的制劑中，而本身不會(huì)不利影響活性成分的預(yù)期治療效果或預(yù)防效果的惰性物質(zhì)，所述某些特性為諸如更期望的PH、溶解度、穩(wěn)定性、生物利用率、質(zhì)地、一致性、外觀、風(fēng)味/味道、粘度等。
[0025]本文使用的術(shù)語(yǔ)“組織”是指其生物屬性，諸如形態(tài)學(xué)和生物活性相似并且來自相同來源使得這些細(xì)胞一起執(zhí)行特定功能的全體細(xì)胞?！捌鞴佟睘橐越Y(jié)構(gòu)單元連接的行使共同功能的不同組織的集合。
[0026]本文使用的術(shù)語(yǔ)“約”描述引用值的正或負(fù)10%的范圍。例如，“約10”的數(shù)值可為10±1范圍內(nèi)的任何數(shù)值，即9至11。
[0027]發(fā)明詳述
[0028]1.導(dǎo)言
[0029]器官(肝、腎、肺和心臟等)纖維化或疤痕形成為導(dǎo)致晚期器官衰竭的主要原因和最終途徑。組織纖維化的特征為肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚。然而，至今纖維化的治療很大程度上仍為無(wú)效的和非特異性的。因此，迫切需要搜尋和開發(fā)抗纖維化策略以便防止、停止或逆轉(zhuǎn)纖維化。通常認(rèn)為TGF-β/Smads介導(dǎo)纖維化。本研宄中的發(fā)現(xiàn)示出TGF- β I通過其下游被稱為Smad3的介質(zhì)積極地介導(dǎo)組織癥痕形成，但通過Smad7消極地介導(dǎo)組織疤痕形成。在多種慢性器官疾病中，纖維化隨著TGF-β/Smads的失衡而出現(xiàn)，如通過Smad3的過度活化而Smad7的損失所顯示。因此，鑒定特異性藥劑以特異性地抑制Smad3活性同時(shí)增強(qiáng)Smad